具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體及其製備方法和用途的製作方法

2023-05-29 06:00:06 2

專利名稱：具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體，本發明還涉及該微小纖溶酶原突變體的製備方法以及在製備預防和治療血栓性疾病藥物和眼科疾病藥物方面的用途。
背景技術：
人纖溶酶原(Plasminogen，Plg)是人體纖溶系統的關鍵成分之一，經纖溶酶原激活劑(PA)激活，轉變為纖溶酶(Plasmin，Plm)後，不僅發揮纖溶作用，溶解血栓，而且參與體內一系列與蛋白質水解有關的生理、病理過程。天然的Glu-Plg是具有多個結構域的糖蛋白，由N端多肽(NTP)、5個同源的三角區(K1-K5)、絲氨酸酶活性中心區(SP)組成， 經PA激活後，在Arg560-Val561特異性裂解，形成由二硫鍵維繫的活性雙鏈纖溶酶。人微小纖溶酶原(Microplasminogen，mPlg)是纖溶酶原被彈性蛋白酶在531-791位胺基酸間降解的261個胺基酸組成的多肽，含6個二硫鍵，不包括Plg的N端、五個同源三角區 (Kl-肪)，但保留了絲氨酸蛋白酶活性中心區(SP)，可被纖溶酶原激活劑激活後形成微小纖溶酶原，具有纖溶酶的纖溶活性。微小纖溶酶原分子量較小，較易製備晶體，且保留了纖溶酶原的活性區，因此適合作為臨床使用的溶栓藥物。近年來，研究表明，人纖溶酶可作為玻璃體切割手術的一種有效的輔助藥物，應用纖溶和抗凝藥物在分子水平上改變玻璃體的組成，可促成玻璃體後脫離的形成，成為當今眼科疾病臨床研究的熱點。在凝血過程中，血小板粘附和聚集是一個重要步驟，而含R⑶序列的整合素受體配基(纖維蛋白原)同其受體(GP IIbIIIa)的作用，又是血小板粘附所必不可少的，而纖維蛋白原通過其Y鏈C端的R⑶序列與GP nbllla等受體相互識別並發揮其功能的。在發現具有RGD序列的去整合素能與血小板糖蛋白GP IIbIIIa結合、有效抑制血小板聚集後， 為了更好的研究RGD序列的活性構象，人們合成了各種含RGD序列的小肽，如RGDS、RGDff, GRGDS等。它們均具有抑制纖維蛋白原與血小板的結合和抑制血栓形成等作用。但其抑制活性比含同樣序列的天然蛋白要低的多，且半衰期較短。隨後又有各種環化的R⑶肽被相繼合成，通過不同形式的環化後，可以提高其抑制活性。這可能是由於線狀肽中的天冬氨酸 (Asp)容易被降解，而環化肽的剛性保證了天冬氨酸(Asp)的穩定性；環化可以束縛含RGD 序列的片段，以形成局域構象，同時RGD殘基形成一個突出的環狀loop，這使它能夠更容易插入到整合素GP IIbIIIa,所以具有比較強的抑制血小板聚集作用。研究表明與R⑶相比，K⑶具有同樣抑制血小板凝集功能，並且對GP IIbIIIa具有更好的專一性。RGD或KGD序列可與纖維蛋白原競爭結合與血小板聚集相關的膜受體GP II bill a，而血小板活化後依靠其膜受體GP lib IIIa與纖維蛋白結合是血栓形成的最後共同通路，因而，含RGD/KGD肽類具有比其它藥物更強的抗血栓功能。基於RGD/KGD序列的許多化學模擬物，如 Lamifiban、Lefradafiban、Orbofiban、Xenmilofiban、Integrilin 等均能封閉GP lib IIIa受體，與溶栓藥物合用，血栓再形成發生率顯著降低。
實驗表明，人微小纖溶酶原具有強烈而快速的纖溶活性，在體內和體外都能有效的溶解血栓，具有很好的應用前景，但卻沒有抗血小板凝集的功能，所以如果能通過一些手段引入這種性質，使其同時具有溶纖和抑制血小板凝集功能，將更有利於開發和利用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體，同時本發明還提供該微小纖溶酶原突變體的製備方法以及在製備預防和治療血栓性疾病藥物和眼科疾病藥物方面的用途。為實現上述目的，本發明可採取下述技術方案
本發明所述的具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體的胺基酸序列是 KLYDYCK⑶WPCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTA AHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRT ECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYIL QGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN。上述微小纖溶酶原突變體的製備方法是將微小纖溶酶序列的7-10位的D (天冬氨酸)-V (纈氨酸)-P (脯氨酸)-Q (穀氨醯胺)序列替換為K (賴氨酸)-G (甘氨酸)-D (天冬氨酸)-W (色氨酸)-P (脯氨酸)序列，K-G-D兩邊的半胱氨基可以形成二硫鍵，替換後的序列形成突出的Loop結構，並使K-G-D序列置於Loop結構的頂端。上述的微小纖溶酶原是指從人纖溶酶原的Arg530-Lys531之間的肽鍵被限制性降解，生成含261個胺基酸殘基的微小纖溶酶原，該微小纖溶酶原的胺基酸序列為
KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAA HCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTE CFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQ⑶SGGPLVCFEKDKYILQ GVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN。經驗證表明，上述製備的的微小纖溶酶原突變體同時具有溶解纖溶蛋白和抑制血小板凝集的雙重功能，能夠在製備預防和治療血栓性疾病藥物方面以及製備預防和治療眼科疾病藥物方面中應用。將本發明的微小纖溶酶原突變體的DNA片段與表達載體重組，形成重組表達質粒。本發明不限於特定的表達載體，只要它能夠與所述DNA片段重組，形成適宜表達的質粒即可。上述重組表達載體可按常規方法導入適宜宿主細胞。本發明不局限於任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。在優選實施方案中，本發明使用畢赤酵母菌株如GS115，KM71等。所述表達載體可以是常規的酵母表達載體，如商業PIC系列載體。本發明的具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體DNA與pPICZaA相連接，在畢赤酵母GS115中實現了高效表達。通過鹽析、凝膠過濾和離子交換純化，得到了純度很高的同時具備溶栓活性和抑制血小板凝集兩種功能的微小纖溶酶原突變體。本發明的優點在於採用上述製備方法得到的具備溶栓活性和抑制血小板凝集兩種功能的微小纖溶酶原突變體，在製備預防和治療血栓性疾病藥物方面以及製備預防和治療眼科疾病藥物方面中更有利於開發和應用。


圖1是本發明微小纖溶酶原突變體的胺基酸序列。圖2是微小纖溶酶原的胺基酸序列。圖3是本發明微小纖溶酶原突變體的核苷酸序列。圖4顯示微小纖溶酶原三級結構。圖5顯示本發明微小纖溶酶原突變體的三級結構預測結果。圖6顯示了本發明的微小纖溶酶原突變體在畢赤酵母中表達的SDS-PAGE電泳照片。其中 1 :Marker ；2/3 :KGD_mPlg。圖7顯示了微小纖溶酶原突變體純化的SDS-PAGE結果。圖8顯示了微小纖溶酶原突變體和微小纖溶酶原纖維平板法溶栓活性測定結果。 其中1 微小纖溶酶原；2 微小纖溶酶原突變體。圖9顯示了微小纖溶酶原突變體和微小纖溶酶原的抗ADP誘導的血小板聚集試驗結果。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明。本發明的微小纖溶酶原突變體，在合成微小纖溶酶原突變體基因時將含KGD序列的多肽編碼序列融合在微小纖溶酶原基因中。根據微小纖溶酶原的結構特點和作用方式，設計具有溶解血栓和抑制血小板聚集的雙功能微小纖溶酶原突變體分子，並利用基因工程手段生產，所得產品除了具有高效、特異溶解血栓功能外，還具有抗血小板聚集的新特性，並且製備工藝簡便、安全。從微小纖溶酶原的三維結構上看，7-10位胺基酸位於分子結構的外部，呈一個突出的Loop狀，遠離己知的活性中心。在該位置上引入KGD序列既能使KGD較好的發揮抗凝功能，又對微小纖溶酶原的活性沒有影響，很好的保持微小纖溶酶原突變體的溶栓活性。本發明的微小纖溶酶原突變體，是將微小纖溶酶原N末端的7-10位D-V-P-Q序列替換為K-G-D-W-P。在該位置上引入KGD序列不僅保持了微小纖溶酶原的溶栓活性，同時具有較好的抑制血小板凝集的功能。1、突變位點的選擇
由於KGD序列在處於loop位置時抑制血小板凝集能力最強，並為了最大限度的不破壞微小纖溶酶原有的纖溶酶活性，按照以下原則選擇突變位點處於loop位置、遠離微小纖溶酶活性中心、儘量少的改變胺基酸。最後選取7-10位作為突變位點，將D-V-P-Q序列替換為K-G-D-W-P，微小纖溶酶原突變體的胺基酸序列見圖1，微小纖溶酶原的胺基酸序列見圖2。將上述設計好的突變體的胺基酸序列提交SWISS-MODEL伺服器，以微小纖溶酶原三級結構為模板，按照同源建模方式，對微小纖溶酶原突變體進行三級結構的預測並進行分析。預測結果顯示，微小纖溶酶原突變體三級結構沒有大的改變，符合預期要求(參見圖 4和圖5)。2、溶栓/抑制血小板凝集的雙功能分子的合成與表達載體構建CN 102154253 A
說明書
4/5頁
根據密碼子表設計微小纖溶酶原突變體的核苷酸序列，用重疊引物延伸PCR法合成微小纖溶酶原突變體DNA。設計了 16段平均60bp左右的片段，該長度可以保證化學合成的準確率和高產率，兩個相鄰片段之間的重疊區域為13 bp左右，Tm值在40°C 45°C之間，並在 5』-端依次加上酶切位點損ο I，3』-端加上終止密碼子TAA和酶切位點Λ^ I。在進行循環PCR合成全長微小纖溶酶原突變體基因時，兩個臨近的片段互為引物進行第一輪PCR擴增，再以兩個臨近的PCR產物為模板，以這兩個PCR產物的最外側的兩個DNA片段為引物進行下一輪擴增，以此類推，最後通過5輪PCR合成全長微小纖溶酶原突變體DNA (如圖3)。 PCR產物經ZAo I / Λ^ I雙酶切連接進表達載體pPICZaA中，並轉化大腸桿菌DH5a，提取質粒測序。3、微小纖溶酶原突變體的表達與純化 (1)微小纖溶酶原突變體的表達
經測序，序列正確的表達載體用Mc I線性化進行線性化，通過電轉化法使重組表達載體轉入畢赤酵母宿主菌GS115 (his4)。固體YPDZ培養平板(含kocin濃度分別為100 Ug/ml,200 yg/ml,300 μ g/ml的YPD平板)梯度篩選後獲得的轉化子，並進行PCR鑑定。挑取鑑定後的GS115陽性轉化子分別接種於BMGY液體培養基中，於28 °C，200 r/min搖床上振蕩培養至0D600為2-6，3000 r/min離心5 min回收菌體後按1 5 (BMGY BMMY)重懸於BMMY液體培養基(pH為6. 0)中至0D600約為1. 0，然後於沘"C，200 r/min 搖床上振蕩培養5 d，每天流加1.0 %的甲醇來誘導表達。( 2)微小纖溶酶原突變體的純化
取篩選出的高表達轉化子在優化條件下進行誘導表達，收集到的培養液上清用0. 45 μπι濾器過濾後，用40%的硫酸銨沉澱後，離心後目的蛋白用檸檬酸緩衝液溶解沉澱。將濃縮液進行kphacryl 100凝膠過濾層析，用pH6. 0的0. 025mol/L檸檬酸緩衝液洗脫，按吸收峰收集各組分，檢測活性、SDS-PAGE分析。凝膠過濾得到的純化產物，再用SP Sepharose FF離子交換層析柱進行純化。層析柱先用PH6. 0的0. 025mol/L檸檬酸緩衝液平衡後，上樣，目的蛋白掛在柱上後，用上述檸檬酸緩衝液洗至基線平後，再淋洗10個柱體積，然後用含lm0l/LNaCl、pH6. 0的0. 025mol/ L枸椽酸緩衝液洗脫，收集含目的蛋白的洗脫峰，流速為lmL/min。(3)分子篩脫鹽、凍幹
用Superdex G-25柱(Φ IOmmX 400mm)脫鹽，緩衝液為Buffer C，收集活性峰待分析測定，其SDS-PAGE分析結果如圖7，純度達95%以上。加3%的賦形劑甘露醇，以0. 22 μ m的膜濾過除菌，分裝，凍幹，4°C冰箱保存。4、微小纖溶酶原突變體活性測定 (1)纖維平板法纖溶活性測定
取 2 %瓊脂溶液(pH7. 4，含 0. lSmoVLNaCUOmmolA^ris^Cl) 5ml，鋪板前加入 Iml 含10單位凝血酶溶液，在45°C 50°C水浴中與0. 4%纖維蛋白原溶液(pH7. 4，含0. 15mol/ LNaCl，50mmOl/LTriS*Cl) 5ml，混合後倒入無菌培養皿中，室溫凝固。在平板上打直徑3mm 的小孔，每孔加10//L通過尿激酶激活的微小纖溶酶原突變體，置37°C保溫18h，取出觀察結果。(2)抗血小板聚集活性的測定
6血小板聚集實驗使用富血漿血小板(PRP)和貧血漿血小板(PPP)進行測定。取新鮮的鼠血以9 :l(v :v)加入3. 8%的檸檬酸鈉做抗凝劑，緩慢顛倒混均。SOOrpm離心10分鐘，小心吸取上層富含血小板的懸液，即為PRP(Platelet Rich Plasma)。剩餘部分再以3000rpm 離心10分鐘，吸出上層液體，即為PPP (Platelet Pool Plasma)。將300ul的PRP按100 1的比例與待測樣品或對照緩衝液混合，在37°C保溫3分鐘，用PPP調節零點，加入誘導劑 ADP (終濃度Kfomol/L)，記錄3分鐘內的聚集波形，血小板聚集的抑制率=(對照的最大聚集一樣品的最大聚集率)/對照的最大聚集率。5、結果分析
採用纖維蛋白溶圈法(平板法)測定結果如圖8，無論野生型微小纖溶酶原還是其突變體都具有明顯的纖溶酶活性，從溶圈大小看不出明顯差異。從圖9可以看出野生型微小纖溶酶原幾乎沒有抑制ADP誘導的血小板聚集的生物活性，而微小纖溶酶原突變體則明顯具有抑制血小板聚集的功能。
權利要求
1.一種具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體，其特徵在於所述微小纖溶酶原突變體的胺基酸序列是KLYDYCKGDWPCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSffPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEffVLTA AHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRT ECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYIL QGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN。
2.根據權利要求1所述的微小纖溶酶原突變體的製備方法，其特徵在於它是將微小纖溶酶原序列的7-10位的D-V-P-Q序列替換為K-G-D-W-P序列，替換後的序列形成突出的 Loop結構，並使K-G-D序列置於Loop結構的頂端。
3.根據權利要求1所述的微小纖溶酶原突變體作為製備預防和治療血栓性疾病藥物方面的應用。
4.根據權利要求1所述的微小纖溶酶原突變體作為製備預防和治療眼科疾病藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有抑制血小板凝集功能的微小纖溶酶原突變體，其胺基酸序列是KLYDYCKGDWPCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN，其製備方法是將微小纖溶酶原序列的7-10位的D-V-P-Q序列替換為K-G-D-W-P序列，替換後的序列形成突出的Loop結構，並使K-G-D序列置於Loop結構的頂端；同時提供了該微小纖溶酶原突變體作為製備預防和治療血栓性疾病及眼科疾病藥物方面的應用。
文檔編號C12N9/68GK102154253SQ201110001748
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者盧萍, 張守濤, 方惠敏 申請人:鄭州大學