脂肪酸去飽和酶家族成員fad4、fad5、fad5-2和fad6及它們的應用的製作方法

2023-05-28 17:25:01

專利名稱：脂肪酸去飽和酶家族成員fad4、fad5、fad5-2和fad6及它們的應用的製作方法
脂肪酸去飽和酶家族成員FAD4、FAD5、FAD5-2和FAD6及它
們的應用本申請是以下申請的分案申請申請日2001年9月28日；申請號 01819633. 0(PCT/IB01/02346)；發明名稱同上。相關申請本申請要求2000年9月28日申請的美國臨時申請序號60/236，303和2001年6 月12日申請的美國臨時申請序號60/297，562的優先權，所述臨時申請的完整內容特此通 過引用完整地結合到本文中。所述臨時申請所引用的所有參考文獻的完整內容也特此通過 引用結合到本文中，成為本申請的一部分。
背景技術：
脂肪酸是具有長鏈碳氫側鏈基團的羧酸，在許多生物過程中起主要作用。脂肪酸 在自然中很少是游離的，而是作為脂類的主要成分以酯化形式存在。脂類/脂肪酸是能量 的來源(如b_氧化)，並且是加工生物學或生物化學信息不可缺少的細胞膜的組成部分。脂肪酸可以分為兩類飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸在順式構 型內包含一個或多個碳雙鍵。不包含脂肪酸由屬於非血紅素-鐵酶家族的末端去飽和酶產 生。每種這樣的酶都是電子轉運系統的一部分，而電子轉運系統包含兩種其它蛋白，即細胞 色素b5和NADH-細胞色素b5還原酶。明確地說，所述酶催化脂肪酸分子中碳原子之間雙 鍵的形成。人和其它哺乳動物體內催化不飽和脂肪酸中特定雙鍵形成所需的這些去飽和 酶的種類有限。因此，人必須通過膳食攝取一些脂肪酸。所述必需脂肪酸有，例如，亞油酸 (C18:2)；亞麻酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)。與此不同，昆蟲和植物能夠合成更多種類 的不飽和脂肪酸及它們的衍生物。長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)如二十二碳六烯酸(DHA，22:6(4，7，10，13，16， 19))是哺乳動物體內各種組織和細胞器(神經、視網膜、腦和免疫細胞)的細胞膜的必需 成分。例如，腦磷脂中超過30%的脂肪酸是22:6(n-3)和20:4(n-6)。(Crawford,M. A.等 (1997)Am. J. Clin. Nutr. 66 1032S-1041S) 在視網膜中，DHA佔感光細胞的感光部分杆 外節段中總脂肪酸超過 60%。(Giusto, N. M.等(2000)Prog. Lipid Res. 39 :315_391)。 臨床研究已經顯示DHA對於嬰兒腦部的生長和發育以及維持成人正常腦功能是必需的 (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120 :S129_S138)。DHA 對於涉及信號傳導過程、視紫紅 質激活以及視杆細胞和視錐發育的感光細胞功能也有顯著影響(Giusto，N.M.等(2000) Prog. Lipid Res. 39 :315-391)。此外，在如高血壓、關節炎、動脈粥狀硬化、壓抑、血栓形成 和癌症等疾病的治療中也發現DHA的一些積極效應(Horrocks，L. A.和Yeo，Y. K. (1999) Pharmacol. Res. 40 :211_215)。因此，通過膳食適當供應脂肪酸對於人維持健康是重要的。 對於嬰兒、年紀小的兒童和年長的公民來說，從膳食攝取足夠這些脂肪酸尤其重要，因為他 們在體內不能有效合成這些脂肪酸，必須通過食物補充(Spector，A. A. (1999) Lipids 34: S1-S3)。根據甲基端最後一個雙鍵的位置，DHA是n-3系列的脂肪酸。它通過去飽和以及延 長的交替步驟合成。DHA的生物合成從18:3(9，12，15)開始，涉及A 6去飽和形成18:4(6，9，12，15)，然後延長到 20:4(8，11，14，17)，隨後 A5 去飽和形成 20:5(5,8,11，14，17)。此 後，對於所述生物合成存在一些爭議。傳統觀點是20:5(5，8，11，14，17)延長成為22:5(7， 10，13，16，19)，然後通過最後的 A 4 去飽和轉化成為 22:6(4,7,10，13，16，19) (Horrobin， D.F. (1992) Prog. Lipid Res. 31 163-194)。然而，Sprecher 等最近提出 DHA 生物合成另一 個可能的途徑，該途徑不依賴於A 4去飽和酶，涉及兩次連續的延長、一次A6去飽和以及 一次通過在過氧化物酶體中的限制性氧化縮短兩個碳(SpreCher，H.等(1995) J. Lipid Res. 36 2471-2477 ；Sprecher, H.等(1999)Lipids 34 :S153_S156)。由於DHA對人類健康的有益作用，因此DHA的生產是重要的。目前DHA的主要來 源是魚和藻類的油。魚油是該脂肪酸的主要和傳統來源，但是，到銷售時，通常發生了氧化。 另外油的供應極不穩定，並且由於魚量縮減，其來源處於危險中，而藻類來源由於產量低和 提取的高額費用而昂貴。EPA和AA都是A5必需脂肪酸。它們形成人和動物的食物和飼料組成部分的一個 獨特種類。EPA屬於n-3系列，在醯基鏈中有五個雙鍵，EPA在海洋食物中發現，在來自北大 西洋的富含脂肪的魚中很豐富。AA屬於n-6系列，帶有四個雙鍵。AA在(0-3位置缺少一 個雙鍵，這賦予它與EPA不同的特性。從AA生產的類二十烷酸有強烈的炎症和血小板凝集 特性，而從EPA生產的類二十烷酸有抗炎和抗血小板凝集特性。也可以從一些食物如肉、魚 和蛋獲得AA，但濃度較低。亞麻酸(GLA)是在哺乳動物中發現的另一種必需脂肪酸。GLA是超長鏈n-6 脂肪酸和各種活性分子的代謝中間體。在哺乳動物體內，長鏈多不飽和脂肪酸的形成受到 A6去飽和的速度限制。已經顯示許多生理學和病理學狀況如衰老、應激、糖尿病、溼疹和 一些感染抑制A6去飽和步驟。此外，GLA容易受到來自與某些疾病如癌症或炎症的氧化 和快速細胞分裂的催化。因此，在膳食中補充GLA能夠降低這些疾病的風險。臨床研究已 經顯示在膳食中補充GLA有效治療一些病理狀況，如變應性溼疹、經前症候群、糖尿病、高 膽固醇血症以及炎症和心血管疾病。GLA的主要來源是植物油和微生物，植物如月見草(Oenotherabiermis)、琉璃苣 (Borago officinalis L.)、紅酯慄(Ribes nigrum)，微生物如被孢黴屬菌(Mortierella sp.)、毛黴菌屬菌(Mucor sp.)和藍細菌(Cyanobacteria)。然而，由於這些GLA來源的可得 性有巨大波動以及與提取過程有關的費用，因此這些GLA來源對於膳食補充不是理想的。發明簡述脂肪酸的生物合成是植物和微生物的主要活動。然而，人合成必需脂肪酸如長鏈 多不飽和脂肪酸(LCPUFA)的能力有限。長久以來，人們一直認為生物技術是在植物和微生 物中操作生產脂肪酸的過程的有效方法。它節省成本、可再生並且副效應小。因此，已經 進行大量的艱苦的努力，意圖通過操作植物、動物和微生物細胞生產各種化合物，包括特殊 脂肪酸和藥用多肽。因此，生物技術是以安全成本_效益方式生產不飽和脂肪酸、尤其是 LCPUFA的誘人途徑，以從這些脂肪酸獲取最大治療價值。本發明基於(至少部分基於)發現編碼新型去飽和酶的核酸分子家族。尤其是 本發明的發明人已經鑑定涉及長鏈多不飽和脂肪酸DHA(二十二碳六烯酸，22:6，n-3)和 DPA ( 二十二碳五烯酸，22 5，n-6)生物合成的Fad4 ( A 4去飽和酶)、Fad5和Fad5_2 ( A 5去 飽和酶)以及Fad6 ( A 6去飽和酶)；更具體地說，Fad4使22 5 (n-3)和22 4 (n-6)去飽和，導致DHA和DPA ；Fad5和Fad5_2使20 4 (n_3)和20 3 (n_6)去飽和，導致EPA和AA ；以及 Fad6去飽和酶18 2 (n-6)和18 3 (n-3)，導致GLA ( Y _亞麻酸)和SDA (十八碳四烯酸)。在一個實施方案中，本發明提供一種分離的核酸分子，所述核酸分子包括在SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ IDNO 7中陳述的核苷酸序列。在另一實施方 案中，本發明提供一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼一種多肽，該多肽包括SEQ ID NO 2、4、6或8中陳述的胺基酸序列。在又一實施方案中，本發明提供分離的核酸分子，所述核酸分子包括與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7陳述的核苷酸序列基本相同(如70%相 同)的核苷酸序列。本發明還提供分離的核酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 7陳述的核苷酸序列的至少30個連續核苷酸。在另 一實施方案中，本發明提供分離的核酸分子，所述核酸分子編碼包括胺基酸序列的多肽，所 述胺基酸序列與SEQ ID NO :2、4、6或8陳述的胺基酸序列基本相同(如50%相同)。還提 供核酸分子，所述核酸分子編碼具有SEQ ID N0:2、4、6或8陳述的胺基酸序列的多肽的等 位基因變異體。除編碼全長多肽的分離核酸分子外，本發明還提供編碼本發明所述全長多 肽的片段(如生物活性片段)(如包括SEQ ID N0:2、4、6或8的胺基酸序列的至少10個連 續胺基酸殘基的片段)的核酸分子。在另外的其它實施方案中，本發明提供與本文所述的 分離的核酸分子互補、或在嚴格條件下雜交的核酸分子。在相關方面，本發明提供包括本文所述的分離的核酸分子(如編碼去飽和酶的核 酸分子)的載體。還提供包括這樣的載體的宿主細胞(如包括適於生產去飽和酶核酸分子 和多肽的載體的宿主細胞)。在再一方面，本發明提供分離的去飽和酶多肽和/或其生物活性片段。示範性的 實施方案提供包括SEQ ID NO :2、4、6或8陳述的胺基酸序列的多肽、包括與SEQ ID NO :2、 4、6或8陳述的胺基酸序列至少50%相同的胺基酸序列的多肽、由包括核苷酸序列的核酸 分子編碼的多肽，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :5或SEQ ID NO :7陳述的核苷酸序列至少70%相同。還提供本文所述全長多肽的片段(如包括SEQ ID NO :2、4、6或8陳述的序列的至少10個連續胺基酸殘基的片段)以及具有SEQ ID NO 2、4、6或8陳述的胺基酸序列的多肽的等位基因變異體。在一個實施方案中，去飽和酶多肽或其片段具有去飽和酶活性。在另一實施方案 中，去飽和酶多肽或其片段具有N-末端血紅素結合基序，如在前端(front-end)去飽和酶 中發現的細胞色素b5樣結構域。在另一實施方案中，去飽和酶多肽或其片段具有在所有微 粒體去飽和酶中發現的至少兩個、最好約三個連續的組氨酸殘基，並且可選地具有去飽和 酶活性。在一個優選實施方案中，所述去飽和酶多肽或其片段具有約三個組氨酸基序。包含所述去飽和酶基因的構建物可以用於包含任何表達系統的植物、動物和微生 物，以產生能夠生產LCPUFA如DHA、EPA、AA、SDA和GLA的細胞。用於表達本發明的去飽 和酶的植物的例子其中包括來自油料種子作物的植物和植物種子，例如亞麻(Linum sp.)、 油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine 和 So ja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花 (corron) (Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、撤攬(Olea sp.)、紅花(Carthamus sp.)、可 可(Theobroma cacoa)和花生(Arachis sp.)。在一個相關方面，本發明提供使用細胞(如植物細胞、動物細胞和/或微生物細胞)生產不飽和脂肪酸(如LCPUFA)和不飽和脂肪酸生物合成途徑中其它關鍵化合物的新 型改良方法，在所述細胞中已經操作所述不飽和脂肪酸生物合成途徑，以便生產LCPUFA或 其它所需的不飽和脂肪酸化合物。本發明所述新型改良方法包括在細胞中生產不飽和脂肪酸(如DHA)的方法，所述 細胞中含有已經操作的不飽和脂肪酸生物合成途徑的至少一種脂肪酸去飽和酶，以便生產 不飽和脂肪酸(如以高水平生產)。例如，本發明提供在包含如上文所述的至少一種分離的 去飽和酶核酸分子(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)或其部分的細胞中生產不飽和脂 肪酸(如DHA)的方法，以便生產不飽和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))。所述方法可以另外 包括回收所述LCPUFA的步驟。在另一實施方案中，本發明提供生產不飽和脂肪酸(如LCPUFA(如DHA))的方法， 該方法包括在一定條件下，使包含至少一種上文定義的去飽和酶靶分子的組合物與至少一 種如上文定義的分離的去飽和酶多肽(如Fad4、Fad5、Fad5-2和/或Fad6)或其部分接觸， 從而生產不飽和脂肪酸(如LCPUFA (如DHA))。所述方法還可以包括回收所述LCPUFA的步
馬聚o上文所述的核酸、蛋白和載體尤其可用於本發明的方法中。特別地，本發明提供增 強不飽和脂肪酸生產(如DHA生產)的方法，所述方法包括在一定條件下培養包含去飽和 酶核酸(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)的重組植物、動物和/或微生物，從而增強脂
肪酸生產。在另一實施方案中，本發明提供產生能夠生產不飽和脂肪酸的細胞的方法。所述 方法包括將編碼蛋白的分離的核酸分子引入細胞(如植物細胞)，所述蛋白具有催化脂肪 酸分子中雙鍵形成的活性。在又一實施方案中，本發明提供調節脂肪酸生產的方法，所述方法包括培養包含 分離的核酸分子的細胞，以便調節脂肪酸的生產，其中所述分離的核酸分子編碼具有催化 雙鍵形成的活性的多肽。在再一實施方案中，本發明包括組合物，所述組合物包含本文所述的不飽和脂肪 酸核酸或多肽。本發明的組合物還可以包含能夠生產如上文所述脂肪酸的細胞，並且可選 地還包括藥學上可接受的載體。在另一實施方案中，本發明的組合物在如動物飼料中用作食品添加劑，或用作保 健品(neutraceutical)。本發明的組合物也用於治療患有疾病的患者，包括給予所述組合 物以便治療患者。所述方法包括的疾病包括，例如，應激、糖尿病、癌症、炎症和心血管疾病。本發明的其它特徵和益處將隨後的詳細描述和權利要求而變得顯而易見。附圖簡述

圖1顯示來自破囊壺菌屬菌(Thraustochytrium sp.)的Fad4DNA序列和蛋白序 列；(A)可讀框的cDNA序列(SEQ ID NO 1)；和(B)翻譯的蛋白序列(SEQ ID NO 2)。圖2顯示來自破囊壺菌屬菌的Fad5的DNA序列和蛋白序列；(A)可讀框的cDNA序 列(SEQ ID NO 3)；和(B)翻譯的蛋白序列(SEQ IDN0 4)。圖3顯示來自破囊壺菌屬菌的Fad4和Fad5蛋白序列(分別是SEQID NO 2和4) 的比較。垂直條指示胺基酸同一性。突出顯示保守基序如細胞色素b5血紅素結合基序和 組氨酸豐富基序。兩個箭頭指示兩個簡併引物的結合位置。
圖4顯示來自畸雌腐黴(Pythium irregulare)的Fad5_2的DNA序列和蛋白序列； (A)可讀框的cDNA序列(SEQ ID NO 5)；和(B)翻譯的蛋白序列(SEQ ID NO 6)。圖5顯示來自畸雌腐黴的Fad6的DNA序列和蛋白序列；(A)可讀框的cDNA序列 (SEQ ID NO 10)；禾口 (B)翻譯的蛋白序列(SEQ IDN0:11)。圖6顯示來自畸雌腐黴的Fad5_2和Fad6蛋白序列(分別是SEQ IDN0 :6和8)的 比較。垂直條指示胺基酸同一性。突出顯示保守基序如細胞色素b5血紅素結合基序和組 氨酸豐富基序。兩個箭頭指示兩個簡併引物的結合位置。圖7是來自表達Fad4的酵母菌株IrwSC2的脂肪酸甲基酯(FAME)以及外源底物 22:5(n-3)的氣相色譜(GC)分析。圖8是圖7中新峰的FAME的氣相色譜/質譜(MS)分析；(A)Fad4產物；⑶ DHA(22:6, n-3)標準。圖9是來自表達Fad4的酵母菌株Invsc2的FAME以及外源底物22 4 (n_6)的GC 分析。 圖 10 是圖 9 中新峰 FAME 的 GC/MS 分析；(A) Fad4 產物；(B) DPA (22:5，n_6)標準。圖11是來自表達Fad5的酵母菌株Invsc2的FAME以及外源底物20 3 (n_6)的GC 分析。圖 12 是圖 11 中新峰 FAME 的 GC/MS 分析；(A)Fad5 產物；(B)AA(20:4_5，8，11，14) 標準。圖13是來自表達Fad5_2的酵母菌株AMY2 a的FAME分別與外源底物18 1_9 (上 部分)和18:1-11 (下部分)的GC分析。圖14是來自表達Fad6的酵母菌株Invsc2的FAME與外源底物18:2(9，12)的GC 分析。圖15是圖14中新峰的衍生物的MS分析。顯示所述新脂肪酸的二乙基醯胺的結 構，其中m/z值代表包括醯胺部分的離子。在m/zl56/168、196/208和236/248的三對離子 分別鑑定為在A6、A9和A 12位置的雙鍵。圖16是來自在35S啟動子控制下表達Fad4的芥菜(Brassicajuncea)的葉的FAME 以及外源提供的底物22:5 (n-3)的GC分析。圖17顯示在35S啟動子控制下表達Fad5_2的一個轉基因T1系的營養組織(葉、 莖和根)的脂肪酸組成。脂肪酸水平顯示為芥菜總脂肪酸的重量百分比。圖18是表達Fad5_2的芥菜的根FAME以及外源底物高Y -亞麻酸 (homo-y-linolenic acid，HGLA，20 3-8，11，14)的 GC 分析。圖19是從在napin啟動子控制下表達Fad5_2的芥菜的種子製備的FAME的GC分 析。圖20是來自表達Fad6的芥菜的種子FAME的GC分析。三個新峰指出在轉基因種 子中有三種A 6去飽和脂肪酸。圖21顯示在芥菜的Fad6轉基因種子中積累的GLA( Y _亞麻酸)和SDA(十八碳 四烯酸)的重量百分比。圖22顯示來自五個轉基因系的種子脂類的脂肪酸組成，所述五個轉基因系表達 Fad6 ；SA =硬脂酸；0A =油酸；LA =亞油酸；GLA = y-亞麻酸；ALA = a-亞麻酸；SDA =十八碳四烯酸。圖23是一個表，顯示破囊壺菌屬菌的脂肪酸分布。
表1.破囊壺菌屬菌(Thraustochytrium sp.)的脂肪酸分布(w% )圖24是一個表，顯示畸雌腐黴的脂肪酸分布。
表2.畸雌腐黴(Pythium irregulare)的脂肪酸分布)圖25是一個表，顯示外源脂肪酸在酵母AMY-2 a /pFad5-2中的轉化。 表3.在酵母AMY-2 a pFad5-2中外源脂肪酸的轉化圖26是一個表，顯示在napin(Napin)和亞麻種子特異性(Cln)啟動子控制下表 達Fad5_2的轉基因亞麻籽中A5-不飽和聚甲烯中斷的脂肪酸(A5-UPIFA)的積累。脂肪 酸水平顯示為總脂肪酸的重量百分比。
表4 在napin(Napin)和亞麻種子特異性(Cnl)啟動子控制下表述Fad5_2的轉基因 亞麻子中A5-UPIFA的積累。脂肪酸水平顯示為佔總脂肪酸的重量百分比。圖27是一個表，顯示在napin啟動子控制下表達Fad6的轉基因亞麻籽(Solin和 Normandy)中A6去飽和脂肪酸的積累。脂肪酸水平顯示為總脂肪酸的重量百分比。
表5 在napin啟動子控制下表達Fad6的轉基因亞麻籽(Sol in和Normandy)中A6不 飽和脂肪酸的積累。脂肪酸水平顯示為佔總脂肪酸的重量百分比。 注S，Solin型亞麻；N，Normandy-傳統型亞麻發明詳述本發明基於(至少部分基於)脂肪酸去飽和酶家族新成員的發現，所述新成員在 本文中稱為「去飽和酶」核酸和蛋白分子(如Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad_6)。這些新分子 是脂肪酸去飽和酶家族的成員，在生產LCPUFA的生物中表達，所述生產LCPUFA的生物例如 破囊壺菌屬、畸雌腐黴、Schizichytrium 禾口 Crythecodinium。本文所用術語「脂肪酸」是本領域內公知的，包括基於長碳氫鏈的羧酸。脂肪酸是 許多脂類(包括甘油酯)的成分。最常見的天然脂肪酸是具有偶數碳原子(16或18)並且 飽和或不飽和的單羧酸。「不飽和」脂肪酸在碳原子之間包含順式雙鍵。本發明包括的不飽 和脂肪酸包括，例如，DHA、GLA和SDA。「多不飽和」脂肪酸包含多於一個雙鍵，並且雙鍵以 一種亞甲基間斷的系統(-CH = CH-CH2-CH = CH-)排列。本文中通過一種編號系統描述脂肪酸，在該編號系統中，冒號前的數字指示所述 脂肪酸中碳原子的數目，而冒號後的數字是存在雙鍵的數目。在不飽和脂肪酸的情況下，隨 後是圓括號內的數字，指示雙鍵的位置。圓括號內的每個數字是雙鍵連接的兩個碳原子中 編號較低的碳原子。例如，油酸可以描述為18:1(9)，亞油酸可以描述為18:2(9，12)，這些 編號指出有18個碳原子，一種在碳原子9有一個雙鍵，另一種在碳原子9和12有兩個雙鍵。生產不飽和脂肪酸(即不飽和脂肪酸生物合成途徑)中的控制步驟由膜結合的 脂肪酸去飽和酶(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)催化。明確地說，所述酶催化脂肪 酸分子碳原子間雙鍵的形成。本文所用術語「不飽和脂肪酸生物合成途徑」指在體內或體 外導致不飽和脂肪酸合成的一系列化學反應。所述途徑包括一系列去飽和以及延長步驟， 產生不飽和脂肪酸，並最終產生長鏈多不飽和脂肪酸。所述不飽和脂肪酸可以包括GLA 18:3(6,9，12)、SDA 184(6，9，12，15)、AA 20:4(5,8，11，14)、EPA 205 (5，8，11，14，17)和 DPA 22:5(4,7，10，13，16)以及 DHA 22 6 (4，7，10，13，16，19)。
去飽和酶可以包括一個血紅素結合基序和/或約三個保守組氨酸基序，不過可以 存在其它結構域。脂肪酸去飽和酶家族的成員轉化飽和脂肪酸成為不飽和脂肪酸，即長鏈 多不飽和脂肪酸(LCPUFA)，長鏈多不飽和脂肪酸是哺乳動物體內各種組織和細胞器(神 經、視網膜、腦和免疫細胞)的細胞膜的組成成分。LCPUFA的例子其中包括二十二碳六烯酸 (DHA, 22 6 (4，7，10，13，16，19))。臨床研究已經顯示:DHA對於嬰兒腦部的生長和發育以及 維持成人正常腦功能是必需的(Martinetz，M. (1992) J. Pediatr. 120 :S129_S138)。DHA 對 於涉及信號傳導過程、視紫紅質激活以及視杆細胞和視錐發育的感光細胞功能也有顯著影 響(Giusto，N.M.等(2000)Prog. Lipid Res. 39 :315_391)。此外，在如高血壓、關節炎、動脈 粥狀硬化、抑鬱、血栓形成和癌症等疾病的治療中也發現DHA的一些積極效應(Horrocks， L.A.和Yeo，Y.K. (1999)Pharmacol. Res. 40 :211_215)。因此，去飽和酶分子可以用於生產 在治療疾病中應用的LCPUFA，所述疾病的特徵在於異常調節性生長、增殖或分化。所述疾病 包括癌症，如癌、肉瘤或白血病；腫瘤血管發生和轉移；骨骼發育異常；肝病；脊髓發育不良 症候群；以及造血疾病和/或骨髓增生疾病。其它與血管發生有關並因此與去飽和酶有關 的疾病包括1型遺傳性出血性毛細管擴張(hereditary hemorrhagictelangiectasia type 1)、進行性纖維發育不良骨化、特發性肺纖維變性和Klippel-Trenaunay-Weber症候群。術語「家族」當指本發明的蛋白和核酸分子時，意味著具有共同結構域或基序並具 有本文定義的足夠胺基酸序列或核苷酸序列同源性的兩種或多種蛋白或核酸分子。所述家 族成員可以是天然的或非天然的，並且可以來自同一物種或不同物種。例如，一個家族可以 包括人類來源的第一種蛋白和人類來源的其它不同蛋白，或者可以包括非人類來源的類似 物(如大鼠或小鼠蛋白)。一個家族的成員也可以具有共同的功能特性。例如，本發明的去飽和酶蛋白家族包括一個細胞色素b5血紅素結合基序。本文所 用術語「血紅素結合基序」是在前端去飽和酶中存在的細胞色素b5樣結構域的N末端延伸 結構。在另一實施方案中，蛋白的去飽和酶家族的成員在蛋白中包括「組氨酸基序」，最 好包括約三個或四個組氨酸基序。本文所用術語「組氨酸基序」包括具有至少約兩個組氨 酸殘基、最好約三個或四個組氨酸殘基的蛋白結構域，並且一般在所有微粒體去飽和酶中 作為第三個保守組氨酸基序出現。細胞色素b5血紅素結合基序和組氨酸基序的例子包括SEQ IDN0:2的胺基酸殘基 41-44、182-186、216-223 和 453-462，SEQ ID NO 4 的胺基酸殘基 40-43、171_175、207_213 和 375-384，SEQ ID NO 6 的胺基酸殘基 40-45,171-176,208-213 和 395-400，SEQ ID NO 8的胺基酸殘基42-47,178-183,215-220和400-405，如圖3和6所示。本發明的分離的去飽和酶蛋白具有與SEQ ID N0:2、4、6和8的胺基酸序列足夠 同源的胺基酸序列，或者由與SEQ ID N0:l、3、5或7足夠同源的核苷酸序列編碼。本文所 用術語「足夠同源」指第一種胺基酸序列或核苷酸序列具有與第二種胺基酸序列或核苷酸 序列足夠或最小數目的相同或同等(如具有相似側鏈的胺基酸殘基)胺基酸殘基或核苷 酸，使得所述第一種和第二種胺基酸序列或核苷酸序列具有共同結構域或基序和/或共同 功能活性。例如，本文定義下面這樣的胺基酸或核苷酸序列是足夠同源的所述胺基酸序 列或核苷酸序列具有共有結構域並包含至少一個、最好兩個結構域或基序，其中所述序列 的共有結構域在所述結構域的胺基酸序列上具有至少50 %、55 %、60 %、65%、70 %、75 %、80%、85%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性或同一性。此外，本文 定義下面這樣的胺基酸或核苷酸序列是足夠同源的所述胺基酸序列或核苷酸序列具有至 少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同源性或同一性，並且具有共有功能活性。在一個優選實施方案中，去飽和酶蛋白包括至少一種或多種下面結構域或基序 血紅素結合基序和/或組氨酸基序，並且所述去飽和酶蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO 2、4、6 或 8 的胺基酸序列具有至少約 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,85%, 90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性或同一性。在又一優選實施方案中，去飽 和酶蛋白包括至少一種或多種下面結構域血紅素結合基序和/或組氨酸基序，並且由具 有以下核苷酸序列的核酸分子編碼，所述核苷酸序列在嚴格雜交條件下與包含SEQ ID NO 1、3、5或7的核苷酸序列的核酸分子互補物雜交。在再一實施方案中，去飽和酶蛋白包括至 少一個血紅素結合基序和/或至少約三個組氨酸基序，並且具有去飽和酶活性。在本文中「去飽和酶活性」、「去飽和酶的生物活性」或「去飽和酶的功能活性」可 以互換使用，這些術語包括根據標準技術在體內或體外測定，由去飽和酶蛋白、多肽或核酸 分子在去飽和酶效應細胞或去飽和酶底物上施加或介導的活性。在一個實施方案中，去飽 和酶活性是直接活性，例如與去飽和酶的靶分子結合。本文所用的「靶分子」或「結合配偶 體」是一種分子，如涉及不飽和脂肪酸(如中間體脂肪酸)合成的分子，去飽和酶蛋白天然 能夠與所述分子結合或相互作用，完成去飽和酶介導的功能。去飽和酶的直接活性還包括 在脂肪酸分子的碳原子之間形成雙鍵，以形成不飽和脂肪酸分子。分離的破囊壺菌屬菌A 4去飽和酶Fad4的核苷酸序列、cDNA以及由Fad4 cDNA編 碼的預期胺基酸序列分別顯示於圖1和SEQ IDN0 :1和2。破囊壺菌屬菌Fad4基因(可讀 框)約1560個核苷酸長，編碼一種分子量約為59. lkD、長約519個胺基酸殘基的蛋白。破囊壺菌屬菌A 5去飽和酶Fad5的核苷酸序列、cDNA以及由Fad4 cDNA編碼的 預期胺基酸序列分別顯示於圖2和SEQ ID NO 3和4。破囊壺菌屬菌Fad5基因約1320個 核苷酸長，編碼一種分子量約為49. 8kD、長約456個胺基酸殘基的蛋白。畸雌腐黴A 5去飽和酶Fad5_2的核苷酸序列、cDNA以及由Fad5_2cDNA編碼的預 期胺基酸序列分別顯示於圖4和SEQ ID NO 5和6。畸雌腐黴Fad5_2基因約1371個核苷 酸長，編碼一種長約456個胺基酸殘基的蛋白。畸雌腐黴A 6去飽和酶Fad6的核苷酸序列、cDNA以及由Fad6cDNA編碼的預期氨 基酸序列分別顯示於圖5和SEQ ID NO 7和8。畸雌腐黴Fad6基因約1383個核苷酸長， 編碼一種長約460個胺基酸殘基的蛋白。本發明的各方面將在下面的小節中進一步詳細描述I.分離的核酸分子本發明的一個方面涉及編碼去飽和酶蛋白或其生物活性部分的分離的核酸分子、 足以用作鑑定編碼去飽和酶的核酸分子(如去飽和酶mRNA)的雜交探針的核酸片段、以及 用作PCR引物以擴增或突變去飽和酶核酸分子的片段。本文所用術語「核酸分子」包括DNA 分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸類似物產生的DNA或 RNA類似物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但最好是雙鏈DNA。術語「分離的核酸分子」包括這樣的核酸分子所述核酸分子與其天然來源中存在的其它核酸分子分離。例如，在基因組DNA的情況下，術語「分離的」包括這樣的核酸分子 所述核酸分子與所述基因組DNA天然結合的染色體分離。「分離的」核酸最好不含獲得所述 核酸分子的生物的基因組DNA中所述核酸側翼的序列(即在所述核酸5'和3'末端的序 列)。例如，在不同實施方案中，所述分離的去飽和酶核酸可以包含獲得所述核酸的細胞基 因組DNA中天然出現在所述核酸分子側翼的少於約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. lkb 的核苷酸序列。此外，「分離的」核酸分子(如cDNA分子)可以基本不含其它細胞物質，或 者在用重組技術生產的情況下不含培養基，或者在化學合成的情況下基本不含化學前體或 其它化學物質。可以使用標準分子生物學技術和本文提供的序列信息分離本發明的核酸分子，所 述核酸分子例如具有SEQ ID N0:l、3、5、7的核苷酸序列或其部分的核酸分子。用SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的全部或部分作為雜交探針，可以使用標準雜交和克隆技術 (如下面文獻所述:Sambrook, J.等 Molecular Cloning :A Laboratory Manual.第二版， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989)分離去飽和酶核酸分子。此外，使用根據SEQ ID NO :1、3、5或7的序列設計的合成寡核苷酸引物，通過聚合 酶鏈反應(PCR)可以分離包含SEQ ID NO :1、3、5或7的全部或部分的核酸分子。使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板以及合適的寡核苷酸引物，根據PCR擴 增技術，可以擴增本發明的核酸。可以將如此擴增的核酸克隆進合適載體並通過DNA序列 分析進行鑑定。此外，可以通過標準合成技術(如使用自動化DNA合成儀)製備對應於去 飽和酶核苷酸序列的寡核苷酸。在另一實施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID N0:l、3、5或7陳述的核苷酸序列。在又一實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO :1、3、5或7所示核苷酸序列或者任何一種上述核苷酸序列的一部分的互補物。與SEQ ID NO :1、3、5或7所示核苷酸序列互補的核酸分子是與SEQ ID NO :1、3、5或7所示的核苷 酸序列足夠互補的核酸分子，以便它能夠與SEQ ID N0:l、3、5或7所示的核苷酸序列雜交， 由此形成穩定的雙鏈體。在再一實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括與SEQ IDN0:1、3、5或7所示核 苷酸序列(例如完整長度的所述核苷酸序列)或者任何一種上述核苷酸序列的一部分或互 補物有至少約 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%, 99%或更高同一性的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發明的核酸分子包含一段核苷酸 序列，所述核苷酸序列長至少(或不多於)50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、 1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、 2750-3000,3250-3500,3500-3750或更多個核苷酸，並且在嚴格雜交條件下與SEQID N0 1、3、5或7的核酸分子的互補物雜交。此外，本發明的核酸分子可以僅包含SEQ ID N0:l、3、5或7的部分核酸序列，例如 可以用作探針或引物的片段或編碼部分去飽和酶蛋白的片段，如去飽和酶蛋白的生物活性 部分。根據克隆所述去飽和酶基因確定的核苷酸序列允許產生探針和引物，所述探針和引 物設計用於鑑定和/或克隆其它去飽和酶家族成員以及其它物種的去飽和酶類似物。所述 探針/引物(如寡核苷酸)一般包括基本純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包括在嚴格條件下與下面序列雜交的核苷酸序列區SEQ ID NO :1、3、5或7的有義鏈或SEQ ID N0:1、 3、5或7的反義鏈或SEQ ID NO :1、3、5或7的天然等位基因變異體或突變異體的至少約12 或15、優選約20或25、更優選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個連續核苷酸。示例性的探針或引物長至少(或不高於)為12或15,20或25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75或更多核苷酸，和/或包含本文所述分離的核酸分子的連續核苷酸。本發 明的範圍內還包括下述探針和引物，所述探針或引物包含本文所述分離的核酸分子的連續 核苷酸，但在所述探針或引物序列內有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鹼基的差異。基於所述 去飽和酶核苷酸序列的探針可以用於檢測(如特異性檢測)編碼同樣或同源蛋白的轉錄物 或基因組序列。在優選實施方案中，所述探針還包括與其連接的標記基團，如所述標記基團 可以是放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。在另一實施方案中，提供一組引物，如適 於在PCR中應用的引物，所述引物可以用於擴增去飽和酶序列的選定區，所述區如本文所 述的結構域、區、位點或其它序列。所述引物應該至少長5、10或50鹼基對，並且少於100 鹼基對，或者少於200鹼基對。所述引物在與本文所述序列或天然出現變異體的序列進行 比較時，應該相同，或者差異不大於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鹼基。所述探針可以用作 診斷測定試劑盒的一部分，以鑑定錯誤表達去飽和酶蛋白的細胞或組織，例如通過測量來 自受試驗者的細胞樣品中編碼去飽和酶的核酸，如檢測去飽和酶mRNA水平或測定基因組 去飽和酶基因是否已經突變或缺失。可以如下製備編碼「去飽和酶蛋白生物活性部分」的核酸片段分離SEQ ID NO :1、 3、5或7的核苷酸序列部分，該部分編碼具有去飽和酶生物活性的多肽(所述去飽和酶蛋白 的生物活性如本文所述)，然後表達所編碼的部分去飽和酶蛋白(如通過體外重組表達)， 隨後評價所編碼的部分去飽和酶蛋白的活性。在一個示例性的實施方案中，所述核酸分子 至少長 50-100、100-250、250-500、500-700、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、 1750-2000,2000-2250,2250-2500,2500-2750,2750-3000,3250-3500,3500-3750 或更多核 苷酸，並且編碼具有去飽和酶活性(如本文所述)的蛋白。本發明還包括這樣的核酸分子所述核酸分子由於遺傳密碼的簡併性與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列不同，因此它們編碼的去飽和酶蛋白與SEQ ID NO :1、3、5或7 所示核苷酸序列編碼的去飽和酶蛋白相同。在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子 具有編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白的胺基酸序列與SEQ ID N0:2、4、6或8所示的氨基 酸序列有至少1個、但不多於5個、10個、20個、50個或100個胺基酸殘基不同。在又一實 施方案中，所述核酸分子編碼人去飽和酶的胺基酸序列。假如需要進行對比排列，則排列序 列的最大同一性。核酸變異體可以是天然的或非天然的，天然變異體例如等位基因變異體(相同座 位)、同系物(不同座位)和直向同源物(orthologue)(不同生物)。可以通過誘變技術制 造非天然出現的變異體，所述誘變技術包括那些應用於多核苷酸、細胞或生物的技術。所 述變異體可以包括核苷酸置換、缺失、倒位和插入。變異可以出現在編碼區或非編碼區，或 者同時出現在編碼區和非編碼區。所述變異可以產生保守胺基酸取代和非保守胺基酸取代 (所編碼產物的比較)。等位基因變異體源於，例如，群體(如人類群體)內的DNA序列多態性，所述DNA 序列多態性導致所述去飽和酶蛋白的胺基酸序列的變化。去飽和酶基因內的所述遺傳多態
14性可以由於天然等位基因變異而存在於群體的個體內。本文所用的術語「基因」和「重組基因」指這樣的核酸分子所述核酸分子包括編 碼去飽和酶蛋白(如油籽去飽和酶蛋白)的可讀框，並且可以還包括非編碼的調節序列和 內含子。因此，在一個實施方案中，本發明提供分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼 多肽的天然出現的等位基因變異體，所述多肽包含SEQ ID N0:2、4、6或8的胺基酸序列，其 中所述核酸分子在例如嚴格雜交條件下與包含SEQ ID N0:l、3、5或7的核酸分子的互補物 雜交。去飽和酶的等位基因變異體(如Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6)包括有功能的或 無功能的去飽和酶蛋白。有功能的等位基因變異體是去飽和酶蛋白天然出現的胺基酸 序列變異體，所述變異體保持下面能力，如(i)與去飽和酶底物或靶分子(如脂肪酸如 22:5(n-3))相互作用；和/或(ii)在去飽和酶底物或靶分子的碳原子之間形成雙鍵。由本 發明的核酸和蛋白分子生產的脂肪酸也可用於治療疾病如衰老、應激、糖尿病、癌症、炎症 性疾病(如關節炎、溼疹)和心血管疾病。有功能的等位基因變異體一般將僅包含SEQ ID NO :2、4、6或8的一個或多個胺基酸的保守取代，或包含所述蛋白非關鍵區中非關鍵殘基的 取代、缺失或插入。無功能的等位基因變異體是所述去飽和酶蛋白天然出現的胺基酸序列變異體 (如Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6)，所述變異體不具有下面能力，如(i)與去飽和酶底物或 靶分子(如中間體脂肪酸如22:5(n-3))相互作用；和/或(ii)在去飽和酶底物或靶分子 的碳原子之間形成雙鍵。無功能的等位基因變異體一般將包含SEQ ID N0:2、4、6或8的氨 基酸序列中的非保守取代、缺失或插入，或者成熟前切短所述序列，或者包含在所述蛋白關 鍵區或關鍵殘基的取代、插入或缺失。本發明還提供直向同源物(如所述去飽和酶蛋白的人直向同源物)。破囊壺菌屬 和畸雌腐黴去飽和酶蛋白的直向同源物是從其它生物分離的蛋白，並具有同樣的去飽和酶 底物或靶分子結合機制、雙鍵形成機制、對嬰兒腦部生長和發育的調節機制、對成人正常腦 功能的維持機制、影響涉及信號轉導過程的感光功能的能力、影響視紫紅質激活的能力、視 杆細胞和/或視錐的發育機制、和/或對非人去飽和酶蛋白的細胞生長和/或增殖的調節 機制。破囊壺菌屬和畸雌腐黴去飽和酶蛋白的直向同源物可以容易地鑑定為包含與SEQ ID NO :2、4、6或8基本同源的胺基酸序列。此外，本發明的範圍內包括編碼其它去飽和酶家族成員、並因此與SEQ ID N0:U 3、5或7的去飽和酶序列不同的核苷酸序列的核酸分子。例如，可以根據Fad4、Fad5、Fad5-2 或Fad6的核苷酸序列鑑定另一種去飽和酶cDNA。此外，本發明的範圍內包括編碼不同物 種的去飽和酶、並因此與SEQ ID NO :1、3、5或7的去飽和酶序列不同的核苷酸序列的核酸 分子。例如，可以根據Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6的核苷酸序列鑑定Schizochytrium或 Crythecodinium 白勺禾cDNA。可以使用本文公開的cDNA或其部分作為雜交探針，依照標準雜交技術，在嚴格雜 交條件下根據對應於本發明去飽和酶cDNA天然等位基因變異體和同系物的核酸分子與本 文公開的去飽和酶核酸的同一性，分離所述變異體和同系物。可以使用本領域內已知的方法(如在嚴格雜交條件下與本發明的分離的核酸分子雜交)，鑑定orhtologue、同系物和等位基因變異體。在一個實施方案中，本發明的分 離的核酸分子至少長15、20、25、30或更多個核苷酸，並在嚴格條件下與包含SEQ ID NO 1、3、5或7的核苷酸序列的核酸分子雜交。在其它實施方案中，所述核酸至少長50-100、 100-250、250-500、500-700、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、 2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750 或更多核苷酸。本文所用術語「在嚴格條件下雜交」用於描述如下雜交和洗滌條件在所述條件 下相互 之間顯著相同或同源的核苷酸序列保持相互雜交。所述條件最好是這樣的條件在 所述條件下，相互之間至少約70%相同、更優選至少約80%相同、甚至更優選至少約85% 相同或90%相同的序列保持相互雜交。所述嚴格條件是本領域內技術人員已知的，可以 在下面文獻中找到Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等編輯，John Wiley&Sons, Inc. (1995)，第 2、4 和 6 部分。其它嚴格條件可以在 Molecular Cloning A Laboratory Manual， Sambrook 等，Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， NY(1989)，第7、9和11章中找到。嚴格雜交條件一個優選、非限制性的實施例包括在約 65-70°C下在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交(或者在42_50°C下在4X SSC加50%甲醯 胺中雜交)，然後在約65-70°C下在IX SSC中洗滌一次或多次。高度嚴格雜交條件一個優選 非限制性的例子包括在約65-70°C下在1 X SSC中雜交(或者在42-50°C下在1 X SSC加 50%甲醯胺中雜交)，然後在約65-70°C下在0.3X SSC中洗滌一次或多次。較低嚴格雜交條 件一個優選非限制性的例子包括在約50-60°C下在4X SSC中雜交(或者在40-45°C下在6X SSC加50%甲醯胺中雜交)，然後在約50-60°C下在2X SSC中洗滌一次或多次。本發明也包 括上述值的中間範圍值(如在65-70°C或在42-50°C )。在雜交緩衝液和洗滌緩衝液中可以 使用 SSPE (IxSSPE 是 0. 15M NaCl，IOmM NaH2POjP 1. 25mMEDTA，pH 7.4)替代 SSC (IX SSC 是 0. 15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；完成雜交後每次洗滌進行15分鐘。預期長度少於50個鹼基 對的雜交體的雜交溫度應該比雜交體的熔解溫度(Tm)低5-10°C，而Tm根據下面方程確定。 對於長度少於18個鹼基對的雜交體，Tm(°C ) = 2(A+T鹼基的數量)+4(G+C鹼基的數量)。 對於長度在18到49個鹼基對之間的雜交體，Tm(°C ) = 81. 5+16. 6 (Iog10[Na+])+0. 41 (% G+C) 一(600/N)，其中N是所述雜交體中鹼基的數量，[Na+]是雜交緩衝液中鈉離子的濃度 (IX SSC的[Na+] = 0. 165M)。技術人員將理解在雜交緩衝液和/或洗滌緩衝液中可以加 入其它試劑，以降低核酸分子與膜(例如硝酸纖維素膜或尼龍膜)的非特異性結合，所述試 劑包括但不限於封閉劑(如BSA或鮭魚或鯡魚精子載體DNA)、去汙劑(如SDS)、鰲合劑(如 EDTA)、FicolU PVP等。當使用尼龍膜時，特別地，嚴格雜交條件另一個優選非限制性的例 子是在約 65°C下在 0. 25-0. 5MNaH2P04,7% SDS 中雜交，然後在 65°C下在 0. 02M NaH2PO4,1% SDS 中(見如 Church 和 GiIbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995)或 0· 2X SSC,1% SDS洗滌一次或多次。在嚴格條件下與SEQ ID NO :1、3、5或7的序列雜交的本發明分離的核酸分子最好 對應於天然存在核酸分子。本文所用的「天然出現的」核酸分子指具有天然出現的核苷酸 序列(如編碼天然蛋白)的RNA或DNA分子。技術人員還將理解除可能在群體中存在的所述去飽和酶序列的天然出現的等位 基因變異體外，可以通過突變在SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列中引入變化，由此導致 所編碼的去飽和酶蛋白的胺基酸序列的變化，同時不改變所述去飽和酶蛋白的功能能力。例如，在SEQ ID NO :1、3、5或7的序列中可以製造導致在「非必需」胺基酸殘基發生胺基酸 取代的核苷酸置換。「非必需」胺基酸殘基是Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6的野生型序列(如 SEQ ID N0:2、5、8或11)可以變化但不改變生物活性的殘基，而「必需」胺基酸殘基是生物 活性所需的。例如，在本發明去飽和酶蛋白中保守的胺基酸殘基(如在血紅素結合基序或 組氨酸基序中存在的那些胺基酸殘基)預期將特別不能承受改變。此外，在本發明的去飽 和酶蛋白和脂肪酸去飽和酶家族其它成員間保守的其它胺基酸殘基不可能可以承受改變。
因此，本發明的另一方面涉及編碼去飽和酶蛋白的核酸分子，所述去飽和酶蛋白 對於活性並非必需的胺基酸殘基中包含變化。所述去飽和酶蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO :2、4、6或8不同，但保持生物活性。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包括編碼 蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包括與SEQ ID N0:2、4、6或8(如SEQ IDN0:2、4、6或8 的全長)有至少約 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%, 98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。可以如下製造編碼與SEQ ID NO :2、4、6或8的蛋白同源的去飽和酶蛋白的分離的 核酸分子在SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸置換、添加或缺 失，以便在所編碼的蛋白中引入一個或多個胺基酸取代、添加或缺失。可以通過標準技術將 突變引入SEQ ID NO :1、3、5或7，所述標準技術如定點誘變和PCR介導的誘變。最好在一 個或多個預期非必需胺基酸殘基上製造保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」是其中用具有 相似側鏈的胺基酸殘基替換胺基酸殘基的取代。本領域內已經定義具有相似側鏈的胺基酸 殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性 側鏈的胺基酸(如天冬氨酸、穀氨酸)、具有無電荷極性側鏈的胺基酸(如甘氨酸、天冬醯 胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(如 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支側鏈的氨基 酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的胺基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸、組氨酸)。因此，最好用來自相同側鏈家族的另一胺基酸殘基取代所述去飽和酶蛋白中 預期非必需胺基酸殘基。或者，在另一實施方案中，可以例如通過飽和誘變在去飽和酶編碼 序列的全部或部分內隨機引入突變，然後可以篩選所得突變異體的去飽和酶活性，以鑑定 保持活性的突變異體。對SEQ IDNO :1、3、5或7進行誘變後，可以重組表達所編碼的蛋白， 並測定所述蛋白的活性。在一個優選實施方案中，可以測定突變去飽和酶蛋白的下列能力(i)與去飽和 酶底物或靶分子(如中間體脂肪酸)相互作用；和/或(ii)在去飽和酶底物或靶分子的碳 原子之間形成雙鍵。II.分離的去飽和酶蛋白本發明的一方面涉及分離或重組的去飽和酶蛋白和多肽以及其生物活性部分。在 一個實施方案中，可以使用標準蛋白純化技術，通過合適的純化方案從細胞或組織來源分 離天然去飽和酶蛋白。在另一實施方案中，通過重組DNA技術產生去飽和酶蛋白。作為重 組表達的替代方法，可以使用標準肽合成技術化學合成去飽和酶蛋白或多肽。「分離的」或「純化的」蛋白或其生物活性部分基本不含來自獲得所述去飽和酶蛋 白的細胞或組織來源的細胞物質或其它汙染蛋白，或當使用化學合成時基本不含化學前體 或其它化學試劑。語言「基本不含細胞物質」包括下述去飽和酶蛋白製品，其中所述蛋白與其由之分離或重組產生的細胞的細胞成分分離。在一個實施方案中，語言「基本不含細胞 物質」包括這樣的去飽和酶蛋白製備物所述去飽和酶蛋白製備物含有少於約80%、70%、 60%、50%、40%或30% (乾重)的非去飽和酶蛋白(本文也稱為「汙染蛋白」)、更優選少 於約20%的非去飽和酶蛋白、更優選少於約10%的非去飽和酶蛋白、最優選少於約5%非 去飽和酶蛋白。當重組產生所述去飽和酶蛋白或其生物活性部分時，它也最好基本不含培 養基，即培養基佔所述蛋白製備物量少於約20%、更優選少於約10%、最優選少於約5%。語言「基本不含化學前體或其它化學試劑」包括這樣的去飽和酶蛋白製備物所述 製備物中所述蛋白與涉及所述蛋白合成的化學前體或其它化學試劑分離。在一個實施方案 中，語言「基本不含化學前體或其它化學試劑」包括這樣的去飽和酶蛋白製備物 所述製備 物具有少於約30% (乾重)的化學前體或非去飽和酶化學試劑，更優選少於約20%化學前 體或非去飽和酶化學試劑，甚至更優選少於約10%化學前體或非去飽和酶化學試劑，最優 選少於約5%化學前體或非去飽和酶化學試劑。應當理解，本發明的蛋白也可以採取與它們 對應天然蛋白不同的形式，和/或採取仍然與至少一些細胞成分結合的形式。例如，所述蛋 白可以結合細胞膜。本文所用的去飽和酶蛋白的「生物活性部分」包括去飽和酶蛋白的片段，所述片段 參與去飽和酶分子和非去飽和酶分子(如去飽和酶底物如脂肪酸)間的相互作用。去飽 和酶蛋白的生物活性部分包括這樣的肽所述肽包含與所述去飽和酶胺基酸序列足夠同源 或者來自所述去飽和酶胺基酸序列的胺基酸序列，該胺基酸序列包括足夠顯示至少一種去 飽和酶蛋白活性的胺基酸殘基，所述去飽和酶胺基酸序列如在SEQ ID NO :2、4、6或8顯示 的胺基酸序列。一般地說，生物活性部分包括具有至少一種去飽和酶蛋白活性的結構域或 基序；下面能力(i)與去飽和酶底物或靶分子(如中間體脂肪酸)相互作用；和/或(ii) 在去飽和酶底物或靶分子的碳原子之間形成雙鍵。去飽和酶蛋白的生物活性部分可以是多 肽，所述多肽例如長 10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200 或更多的胺基酸。在一個實施方案中，去飽和酶蛋白的生物活性部分包含一個血紅 素結合基序 和/或至少一個組氨酸基序，最好約三個組氨酸基序。此外，可以通過重組技術製備其中缺 失所述蛋白的其它區的生物活性部分，並評價所述生物活性部分的一種或多種天然去飽和 酶蛋白功能活性。在一個優選實施方案中，去飽和酶蛋白具有SEQ ID N0:2、4、6或8所示的胺基酸 序列。在其它實施方案中，所述去飽和酶蛋白與SEQID N0:2、4、6或8基本相同，並且保 持SEQ ID NO :2、4、6或8的蛋白的功能活性，但由於天然等位基因變異或誘變而在胺基酸 序列上不同，如上文小節I詳細描述。在另一實施方案中，所述去飽和酶蛋白包含與SEQ ID NO :2、4、6 或 8 至少約 50% ,55% ,60% ,65% ,70% ,75% ,80% ,85% ,90% ,95% ,96%, 97 %、98 %、99 %或更多相同的胺基酸序列。在另一實施方案中，本發明提供由一種核酸分子編碼的去飽和酶蛋白，所述核酸 分子包括與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列或其互補物至少約50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的核苷酸序列。本發 明還提供由一種核苷酸分子編碼的去飽和酶蛋白，所述核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷 酸序列在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列或其互補物的核酸分子的互補物雜交。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，可以為最佳比較的目的 排列所述序列(如，可以在第一個和第二個胺基酸序列或核酸序列的一個或兩個中引入缺 口以獲得最佳排列，並且為比較目的可以不考慮不同源的序列)。在一個優選實施方案中， 為比較目的進行排列的參考序列的長度至少是所述參考序列長度的至少30%、優選至少 40 %、更優選至少50 %、甚至更優選至少60 %、甚至更優選至少70 %、80或90 % (如，當將 第二個序列與具有519個胺基酸殘基的SEQID NO 2的Fad4胺基酸序列進行排列時，排列 至少156個胺基酸殘基、優選至少208個胺基酸殘基、更優選至少260個胺基酸殘基、甚至 更優選至少311個胺基酸殘基、甚至更優選至少363、415或467個胺基酸殘基；當將第二個 序列與具有 439個胺基酸殘基的SEQ ID NO 4的Fad5胺基酸序列進行排列時，排列至少 132個胺基酸殘基、優選至少176個胺基酸殘基、更優選至少220個胺基酸殘基、甚至更優選 至少263個胺基酸殘基、甚至更優選至少307、351或395個胺基酸殘基；當將第二個序列與 具有456個胺基酸殘基的SEQ ID NO 6的Fad5_2胺基酸序列進行排列時，排列至少137個 胺基酸殘基、優選至少182個胺基酸殘基、更優選至少228個胺基酸殘基、甚至更優選至少 273個胺基酸殘基、甚至更優選至少319、365或419個胺基酸殘基；當將第二個序列與具有 460個胺基酸殘基的SEQ ID NO 8的Fad6胺基酸序列進行排列時，排列至少138個胺基酸 殘基、優選至少184個胺基酸殘基、更優選至少230個胺基酸殘基、甚至更優選至少276個 胺基酸殘基、甚至更優選至少322、368或414個胺基酸殘基)。然後比較在對應胺基酸位置 或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列中的一個位置與第二個序列的對應位 置同一胺基酸殘基佔據，則所述分子在該位置是相同的(本文所用的胺基酸或核酸「同一 性」等同於胺基酸或核酸「同源性」)。兩個序列間的同一性百分比是所述序列共有的相同 位置的函數，其中還要考慮為進行所述兩個序列的最佳比較而引入的缺口數量以及每個缺 口的長度。可以使用數學算法完成兩個序列間的序列比較以及確定同一性百分比。在一個 優選實施方案中，兩個胺基酸序列間的同一性百分比使用Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. (48) =444-453(1970))算法確定，其中使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，缺口加 權16、14、12、10、8、6或4以及長度加權1、2、3、4、5或6，該算法已經加入606軟體包(可從 http //www. gcg. com獲得)中的GAP程序。在又一優選實施方案中，使用GCG軟體包(可 從http://WWW. gcg. com獲得)中的GAP程序確定兩個核苷酸序列間的同一性百分比，其中 使用NWSgapdna. CMP矩陣和缺口加權40、50、60、70或80以及長度加權1、2、3、4、5或6。與 GAP程序一起使用的參數的優選非限制性的例子包括=Blosum 62計分矩陣，缺口罰分12， 缺口延長罰分4，移碼缺口罰分5。在另一實施方案中，使用Meyers 和 Miller 算法(Comput. Appl. Biosci.，4 11-17(1988))確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列間的同一性百分比，其中使用PAM120加 權殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4，該算法已經加入ALIGN程序(版本2. 0或版本 2. OU 中)。本發明的核酸序列和蛋白序列可以進一步用作「查詢序列」，對公眾資料庫進行搜 索以例如鑑定其它家族成員或相關序列。可以使用Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2. 0)進行所述搜索。可以使用NBLAST程序、分數=100、字長=12進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的去飽和酶核酸分子同源的核苷 酸序列。可以使用XBLAST程序、分數=50、字長=3進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發 明的去飽和酶蛋白分子同源的胺基酸序列。為獲得用於比較目的的帶缺口的比較，可以如 Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) :3389_3402 所述使用缺口型 BLAST。當使 用BLAST和缺口型BLAST程序時，可以使用各個程序(如XBLAST和NBLAST)的默認參數。 見 http //www, ncbi. nlm. nih. rov。III.牛產不飽和脂肪酸的方法本發明提供生產不飽和脂肪酸的新型改良方法，所述不飽和脂肪酸例如LCPUFA，如DHA ( 二十二碳六烯酸，22 6 (n-6))、DPA ( 二十二碳五烯酸，22 5 (n-6))、AA (花生四烯酸， 20 4 (n-6))和 EPA ( 二十碳五烯酸，20 5 (n_3))。Α.用於培養細胞的重組細胞和方法本發明還提供包括核酸序列的重組載體，所述核酸序列編碼如本文所述的基因產 物，最好是Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad6基因產物。術語重組載體包括這樣的載體(如質 粒)所述載體已經受到改變、修飾或工程化，以便其包含與天然載體或質粒中包括的那些 核酸序列相比更長、更短或不同的核酸序列。在一個實施方案中，重組載體包括有效連接 調節序列的編碼至少一種脂肪酸去飽和酶的核酸序列。短語「有效連接調節序列」指目標 核苷酸序列以一定方式連接所述調節序列，所述方式允許表達所述核苷酸序列(如增強表 達、增加表達、組成型表達、基礎表達、減弱表達、降低表達或抑制表達)、最好表達由所述核 苷酸序列編碼的基因產物(如當將所述重組載體引入細胞時)。示例性的載體在本文中更 詳細地描述，並在例如Frascotti等，美國專利第5，721，137號中有描述，該文獻的內容通 過引用結合到本文中。術語「調節序列」包括影響(如調整或調節)其它(非調節)核酸序列表達的核酸 序列。在一個實施方案中，重組載體內調節序列相對於特定目的基因的位置和/或取向與 所述調節序列和所述目的基因的天然狀態(如天然位置和/或取向)相似或相同。例如， 在重組載體中目的基因(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因)可以有效連接調節序列，所 述調節序列在天然生物中伴隨或鄰接所述基因(如有效連接「天然」Fad4、Fad5、Fad5-2或 Fad6調節序列(如有效連接「天然」Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6啟動子))。或者，在重組 載體中目的基因(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因)可以有效連接調節序列，所述調節 序列在天然生物中伴隨或鄰接另一個(如不同的)基因。例如，在載體中可以包括有效連 接非Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6調節序列的Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6基因。或者，在載 體中目的基因(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6基因)可以有效連接來自另一種生物的調節 序列。例如來自其它微生物的調節序列(如其它細菌調節序列、噬菌體調節序列等)可以 有效連接特定目的基因。優選的調節序列包括啟動子、增強子、終止信號和其它表達控制元件(如轉錄的 mRNA中轉錄和/或翻譯調節蛋白的結合位點)。所述調節序列在例如Sambrook，J.，Fritsh, Ε· F.,禾口 Maniatis, Τ· MolecularCloning :A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989中有介紹。調節序列包括那些指導細胞內核苷酸序列組成型表達的序列(如組成型啟 動子和強組成型啟動子)、那些指導細胞內核苷酸序列誘導型表達的序列(例如誘導型啟動子如木糖誘導型啟動子)以及那些減弱和抑制細胞內核苷酸表達的序列(如減弱信號或 阻遏序列)。本發明還包括通過缺失調節序列而調節目的基因的表達。例如，可以去除涉及 轉錄負調節的序列，以便增強目的基因的表達。在一個實施方案中，本發明的重組載體包括編碼至少一種基因產物(如Fad4、 Fad5、Fad5-2或Fad6)的有效連接啟動子或啟動子序列的核酸序列。 在又一實施方案中，本發明的重組載體包括一個終止子序列或多個終止子序列 (如轉錄終止序列)。術語「終止子序列」包括用於終止mRNA轉錄的調節序列。終止子序 列(或串聯轉錄終止子)還可用於使mRNA穩定(如通過在mRNA中添加結構)，例如抵抗核 酸酶。在再一實施方案中，本發明的重組載體包括抗生素抗性序列。術語「抗生素抗性序 列」包括促進宿主生物的抗生素抗性或賦予宿主生物抗生素抗性的序列。在一個實施方案 中，所述抗生素抗性選自以下cat(氯黴素抗性)序列、tet(四環素抗性)序列、erm(紅黴 素抗性)序列、neo(新黴素抗性)序列和speC(壯觀黴素抗性)序列。本發明的重組載體 還可以包括同源重組序列(例如設計用於將目的基因重組進宿主生物染色體的序列)。例 如，amyE序列可以用作重組進宿主染色體的同源性靶。術語「操作的細胞」包括已經受到工程化(如遺傳工程化)或修飾的細胞，以便所 述細胞具有至少一種脂肪酸去飽和酶(如Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6)以生產不飽和脂肪 酸。可以根據本文描述的任何方法進行所述微生物的修飾或工程化，所述方法包括但不限 於去調節生物合成途徑和/或過量表達至少一種生物合成酶。「操作的」酶(如「操作的」 生物合成酶)包括這樣的酶所述酶的表達或生產已經受到改變或修飾，以便與對應野生 型或天然酶相比，所述酶的至少一種上遊或下遊前體、底物或產物已經受到改變或修飾。術語「過量表達的」或「過量表達」包括以一定水平表達基因產物(如脂肪酸去飽 和酶)，所述水平高於操作所述細胞前或未受到操作的對比細胞中的表達水平。在一個實 施方案中，可以遺傳操作(如遺傳工程化)所述細胞，以一定水平過量表達基因產物，該水 平高於操作所述細胞前或未受到操作的對比細胞中的表達水平。遺傳操作可以包括但不限 於改變或修飾與特定基因的表達有關的調節序列或位點(如通過添加強啟動子、誘導型 啟動子或多啟動子，或通過去除調節序列以便使表達成為組成型表達)、修飾特定基因的染 色體位置、改變鄰接特定基因的核酸序列如核糖體結合位點或轉錄終止序列、增加特定基 因的拷貝數、修飾涉及特定基因的轉錄和/或翻譯特定基因產物的蛋白(如調節蛋白、抑制 物、增強物、轉錄激活物等)、或本領域內常規的去調節特定基因表達的任何其它常規方法 (包括但不限於使用反義核酸分子例如以阻斷阻遏蛋白的表達)。在另一實施方案中，可以通過物理操作或環境操作使所述細胞過量表達基因產 物，所述基因產物的表達水平高於操作所述細胞前或未受到操作的對比細胞中的表達水 平。例如，可以用已知或懷疑增加特定基因轉錄和/或特定基因產物翻譯的試劑處理細胞， 或在所述試劑存在下培養所述細胞，以便增強或增加轉錄和/或翻譯。或者，可以在選定的 增加特定基因轉錄和/或特定基因產物翻譯的溫度下培養細胞，以便增強或增加轉錄和/ 或翻譯。術語「去調節的」或「去調節」包括改變或修飾細胞內編碼生物合成途徑酶的至少 一種基因，以便改變或改進細胞內所述生物合成酶的水平或活性。最好改變或修飾編碼生物合成途徑酶的至少一種基因，以便增強或增加所述基因產物。詞組「去調節的途徑」也包 括這樣的生物合成途徑其中已經改變或修飾編碼生物合成途徑酶的至少一種基因，以便 改變或修飾多於一種生物合成酶的水平或活性。在細胞中「去調節」一個途徑的能力(如 刺激性去調節給定生物合成途徑中的多於一種基因)來自於細胞內的特定現象，其中超過 一種酶(如兩種或三種生物合成酶)是由連續遺傳材料上相互鄰接存在的基因(稱為「操 縱子」)編碼。術語「操縱子」包括基因表達的協同單位，該協同單位包含一個啟動子，可能有與 一個或多個、最好至少兩個結構基因(如編碼酶如生物合成酶的基因)連接的調節元件。所 述結構基因的表達可以受到協同調節，例如受到結合所述調節元件的調節蛋白的調節或受 到轉錄的反終止的調節。可以轉錄所述結構基因，獲得編碼所有結構蛋白的單一mRNA。由於 包括在一個操縱子內的基因的協同調節，對單個啟動子 和/或調節元件的改變或修飾可導 致所述操縱子編碼的每個基因產物的改變或修飾。對所述調節元件的改變或修飾可包括但 不限於去除內源啟動子和/或調節元件、添加強啟動子、誘導型啟動子或多啟動子、或去 除調節序列，使得改變所述基因產物的表達、改變所述操縱子的染色體位置、改變與所述操 縱子鄰接或在所述操縱子內的核酸序列如核糖體結合位點、增加所述操縱子的拷貝數、修 飾涉及所述操縱子的轉錄和/或所述操縱子的基因產物的翻譯的蛋白(如調節蛋白、抑制 物、增強物、轉錄激活物等)、或本領域內常規的去調節基因表達的任何其它常規方法(包 括但不限於使用反義核酸分子例如以阻斷阻遏蛋白的表達)。去調節還可涉及改變一個或 多個基因的編碼區，以產生例如抗反饋或具有更高或更低比活的酶。本發明尤其優選的「重組的」細胞已經受到遺傳工程化，以過量表達來自植物的基 因或基因產物或來自微生物的基因或基因產物。術語「來自植物的」、「來自微生物的」或「來 自」，例如，包括在微生物或植物(如油籽植物)中天然存在的基因、或由植物基因或來自微 生物的基因(如編碼的SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 7)編碼的 基因產物(如 Fad4、Fad5、Fad5_2 或 Fad6)。本發明的方法提供過量表達至少一種脂肪酸去飽和酶的重組細胞。在一個實施 方案中，本發明的重組細胞已經受到遺傳工程化，過量表達破囊壺菌屬菌脂肪酸去飽和酶 (如已經受到工程化以過量表達至少一種破囊壺菌屬菌Δ4或Δ 5去飽和酶(Fad4或Fad5 基因產物)(如具有SEQ ID NO :2或4的胺基酸序列或由SEQ ID NO :1或3的核酸序列編 碼的脂肪酸去飽和酶)。在另一實施方案中，本發明的重組細胞已經受到遺傳工程化，過量表達畸雌腐黴 Δ 5或Δ 6去飽和酶(Fad5-2或Fad6基因產物)(如具有SEQ ID NO :6或8的胺基酸序列 或由具有SEQ ID NO :5或7的核酸序列的核酸分子編碼的脂肪酸去飽和酶)。在另一實施方案中，本發明提供已經用一種載體轉化的細胞(如微生物細胞)，所 述載體包含一種脂肪酸去飽和酶核酸序列(如在SEQID N0:l、3、5或7中陳述的脂肪酸去 飽和酶核酸序列)。本發明的另一方面提供調整脂肪酸生產的方法，所述方法包括培養用本發明的核 酸分子(如去飽和酶)轉化的細胞，以便調節脂肪酸生產(如增強不飽和脂肪酸的生產)。 所述培養用本發明核酸分子(如Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6)轉化的細胞以調整脂肪酸生 產的方法在本文中稱為「生物轉化」。所述生物轉化過程可以利用本文描述的重組細胞和/或去飽和酶。術語「生物轉化過程」在本文中也稱為「生物轉換過程」，包括脂肪酸去飽和 酶上遊的任何化合物(如底物、中間體或產物)產生(如轉化或轉換)為在脂肪酸去飽和 酶下遊的化合物(如底物、中間體或產物)的生物過程，所述下遊化合物尤其是不飽和脂肪 酸。在一個實施方案中，本發明提供產生不飽和脂肪酸的生物轉化過程，所述過程包括使過 量表達至少一種脂肪酸去飽和酶的細胞與至少一種合適底物在一定條件下接觸，以便生產 一種不飽和脂肪酸，並可選地回收所述脂肪酸。在一個優選實施方案中，本發明提供生產不 飽和脂肪酸的生物轉化過程，所述過程包括使過量表達Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6的細胞 與一種合適底物(如一種中間體脂肪酸)在一定條件下接觸，以便生產一種不飽和脂肪酸 (如DHA、SDA或GLA)，並可選地回收所述不飽和脂肪酸。其中生產不飽和脂肪酸的條件可 以包括任何導致所需的不飽和脂肪酸生產的條件。
在所述生物轉化反應中使用的細胞和/或酶採取允許它們行使預定功能(如生產 所需脂肪酸)的形式。所述細胞可以是整個細胞，或者可以僅是獲得所需最終結果所需的 細胞部分。所述細胞可以是懸浮的(例如在合適的溶液例如緩衝液或培養基中)、受到洗 滌(如洗滌以不含培養所述細胞的培養基)、用丙酮乾燥、固定化(例如用聚丙烯醯胺凝膠 或k-角叉藻聚糖固定化，或在合成支持物如珠、基質等上固定化)、固定、交聯或接受透化 處理(如已經透化膜和/或壁以便化合物例如底物、中間體或產物可以更容易地穿過所述 膜或壁)。所述細胞類型可以是能夠在本發明的方法內使用的任何細胞，如植物細胞、動物 細胞或微生物細胞。本發明的一個重要方面涉及培養本文所述的重組植物或培養本文所述的重組微 生物，以便生產所需化合物(如所需的不飽和脂肪酸)。術語「培養」包括維持和/或培養本 發明的活微生物(如維持和/或培養一種培養物或菌株)。在一個實施方案中，在液體培養 基中培養本發明的微生物。在另一實施方案中，在固體或半固體培養基中培養本發明的微 生物。在一個優選實施方案中，在培養基(如無菌液體培養基)中培養本發明的微生物，所 述培養基包含對維持和/或培養所述微生物必需或有利的營養物(如碳源或碳底物，如復 合糖如豆類粗粉或谷粉、澱粉、糖、糖醇、碳氫化合物、油、脂肪、脂肪酸、有機酸和醇；氮源， 例如從穀物、大豆和塊莖作用獲得的植物蛋白、蛋白腖、肽和胺基酸、從動物來源如肉、奶和 動物副產品(如蛋白腖、肉提取物和酪蛋白水解物)獲得的蛋白、肽和胺基酸；無機氮源如 尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和磷酸銨；磷源如磷酸、磷酸鈉和磷酸鉀；微量元素如鎂、鐵、 錳、鈣、銅、鋅、硼、鉬和/或鈷鹽；以及生長因子如胺基酸、維生素、促生長劑等)。本發明的微生物最好在受控的pH下培養。術語「受控的pH」包括任何導致生產所 需產物(如不飽和脂肪酸)的PH。在一個實施方案中，在約為7的pH下培養微生物。在另 一個實施方案中，在6. 0到8. 5之間的pH培養微生物。可以通過本領域內技術人員已知的 任何方法維持所需pH。此外，最好在受控的通氣下培養本發明的微生物。術語「受控的通氣」包括導致生 產所需產物(如不飽和脂肪酸)的足夠通氣(如氧氣)。在一個實施方案中，通過調節培養 物中的氧水平控制通氣，例如通過調節培養基中的溶氧量。最好通過攪拌所述培養物來控 制所述培養物的通氣。可以用以下方法攪拌通過螺旋槳或類似的機械攪拌設備、通過旋轉 或振蕩培養容器(如發酵罐)或通過各種泵送設備。還可以通過在培養基中通過無菌空氣 或氧(例如通過發酵混合物)而控制通氣。此外，最好在不產生過多泡沫的情況下培養本發明的微生物(例如通過加入消泡劑)。此外，可以在受控的溫度下培養本發明的微生物。術語「受控的溫度」包括任何導 致生產所需產物(如不飽和脂肪酸)的溫度。在一個實施方案中，受控的溫度包括15°C到 95°C之間的溫度。在另一個實施方案中，受控的溫度包括15°C到70°C之間的溫度。優選的 溫度在20°C到55°C之間、更優選30°C到45°C之間或30°C到50°C之間。可以在液體培養基中培養(如維持和/或培養)微生物，最好通過常規培養方法 連續培養或間歇培養，所述常規培養方法例如靜置培養(standing culture)、試管培養、振 蕩培養(如旋轉振蕩培養、搖瓶培養等)、通氣旋動培養或發酵。在一個優選實施方案中，在 搖瓶中培養所述微生物。在一個更優選的實施方案中，在發酵罐中培養所述微生物(如一個發酵過程)。本發明的發酵過程包括但不限於分批發酵方法、補料分批發酵方法和連續 發酵方法。短語「分批工藝」或「分批發酵」指這樣的封閉系統該系統中培養基組成、營養 物、添加劑等在發酵開始時就已設定，並且發酵過程中不改變，然而，可以嘗試控制例如PH 和氧濃度等因子，以防止培養基過度酸化和/或微生物死亡。短語「補料分批培養」或「補 料分批」發酵指一種分批發酵，只是隨著發酵的進行而加入一種或多種底物或添加劑(如增 量加入或連續加入)。短語「連續工藝」或「連續發酵」指這樣的系統在發酵罐中連續加入 定量發酵培養基，同時取出等量使用過或「條件化」培養基，最好所取出的培養基用於回收 所需產物(如不飽和脂肪酸)。已經發展多種所述方法，並且所述方法是本領域內眾所周知 的。短語「在一定條件下培養以便生產所需化合物(如不飽和脂肪酸如DHA) 」包括 在適於或足以生產所需化合物或達到所生產的特定化合物的所需產量的條件(如溫度、壓 力、PH、時間等)下，維持和/或培養植物或微生物。例如，在足以生產所需量的不飽和脂肪 酸(如DHA)的時間內持續培養。培養最好持續足以充分達到所述不飽和脂肪酸最大產量 的時間。在一個實施方案中，培養持續約12到24小時。在另一實施方案中，培養持續24 到36小時、36到48小時、48到72小時、72到96小時、96到120小時、120到144小時或 超過144小時。在另一實施方案中，培養持續足以達到不飽和脂肪酸產量的時間，例如，培 養細胞以便生產至少約15到20g/L不飽和脂肪酸、生產至少約20到25g/L不飽和脂肪酸、 生產至少約25到30g/L不飽和脂肪酸、生產至少約30到35g/L不飽和脂肪酸、生產至少約 35到40g/L不飽和脂肪酸(如至少約37g/L不飽和脂肪酸)或生產至少約40到50g/L不 飽和脂肪酸。在又一實施方案中，在一定條件下培養微生物，以便在約24小時內、約36小 時內、約48小時內、約72小時內或約96小時內生產優選產量的不飽和脂肪酸，所述產量例 如上文陳述範圍內的產量。在生產不飽和脂肪酸時，可能還希望在添加的脂肪酸生物合成底物的存在下培養 本發明的細胞。術語「添加的脂肪酸生物合成底物」包括這樣的試劑或化合物當將所述 試劑或化合物與細胞接觸或包括在細胞的培養基後，它增強或增加不飽和脂肪酸的生物合 成。本發明的添加的脂肪酸生物合成底物可以採用濃縮溶液或懸浮液的形式(如在合適的 溶劑如水或緩衝液中)或以固體形式添加(如用粉末的形式)。此外，本發明的添加的脂肪 酸生物合成底物可以作為單一等分量添加、連續添加或在給定時間內間歇添加。本發明的方法還可以包括回收所需化合物(如不飽和脂肪酸)的步驟。術語「回 收」所需化合物包括從培養基中提取、收穫、分離或純化所述化合物。可以根據本領域內已知的任何常規分離或純化方法回收所述化合物，所述常規分離和純化方法包括但不限於 用常規樹脂(如陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂、非離子吸附樹脂等)處理、用常規吸附 劑(如活性碳、矽酸、矽膠、纖維素、氧化鋁等)處理、改變pH、溶劑萃取(如用常規溶劑如乙 醇、乙酸乙酯、己烷等)、透析、過濾、濃縮、結晶、重結晶、調節pH、凍乾等。例如，可以如下從 培養基回收化合物首先從所述培養物中除去微生物。然後使培養基通過或流過一種陽離 子交換樹脂，除去不希望有的陽離子，然後通過或流過一種陰離子交換樹脂，除去不希望有 的無機陰離子和比目的不飽和脂肪酸(如DHA)有更強酸性的有機酸。本發明所需的化合物最好是「提取的」、「分離的」或「純化的」，以便所得的製備物 基本不含其它成分(如不含培養基成分和/或發酵副產物)。語言「基本不含其它成分」包 括這樣的所需化合物製備物在所述製備物中所述化合物與生產它的培養 物中的培養基成 分或發酵副產物分離(如純化或部分純化)。在一個實施方案中，所述製備物含超過約80% (乾重)所需化合物(如少於約20%其它培養基成分或發酵副產物)、更優選超過約90% 所需化合物(如少於約10%其它培養基成分或發酵副產物)、甚至更優選超過約95%所需 化合物(如少於約5%其它培養基成分或發酵副產物)、最優選超過約98-99%所需化合物 (如少於約1-2%其它培養基成分或發酵副產物)。當所需化合物是一種已經衍生成鹽的 不飽和脂肪酸時，所述化合物最好還不含(如基本不含)與形成所述鹽有關的化學汙染物。 當所需化合物是一種已經衍生成醇的不飽和脂肪酸時，所述化合物最好還不含(如基本不 含)與形成所述醇有關的化學汙染物。在另一可替代的方案中，所需不飽和脂肪酸不從植物或微生物中純化，例如當所 述植物或微生物是生物學上無害的(如安全的)。例如，可以使用整個植物或培養物(或培 養物上清)作為產物來源(如粗產物)。在一個實施方案中，不加改變地使用所述植物或培 養物(或培養物上清)。在另一實施方案中，濃縮所述植物或培養物(或培養物上清)。在 又一實施方案中，磨碎、乾燥或凍幹所述植物或培養物(或培養物上清)。B.高產量生產方法本發明一個特別優選的實施方案是生產不飽和脂肪酸(如DHA)的高產量生產方 法，該方法包括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便以顯著高產量生產不飽 和脂肪酸。短語「高產量生產方法」，例如，用於生產所需化合物的高產量生產方法(如用 於生產不飽和脂肪酸)包括導致以一定水平生產所需化合物的方法，該水平比類似生產方 法通常獲得的水平提高或升高。高產量生產方法最好導致以顯著高產量生產所需化合物。 短語「顯著高產量」包括比類似生產方法通常獲得的水平足夠提高或升高的生產或產量水 平，例如所述水平提高到足以商業化生產所需化合物的水平(如以在商業上可行的成本生 產所述產物)。在一個實施方案中，本發明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法， 該方法包括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便以高於2g/L的水平生產不 飽和脂肪酸。在另一實施方案中，本發明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該 方法包括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便以高於10g/L的水平生產不飽 和脂肪酸。在另一實施方案中，本發明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該方 法包括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便以高於20g/L的水平生產不飽和 脂肪酸。在又一實施方案中，本發明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該方法 包括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便以高於30g/L的水平生產不飽和脂肪酸。在再一實施方案中，本發明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該方法包 括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便以高於40g/L的水平生產不飽和脂肪酸。本發明還提供生產所需化合物的高產量生產方法(如用於生產一種不飽和脂肪 酸)，該方法涉及在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便在商業化所需的時間內 生產足夠提高的水平的化合物。在一個示例性的實施方案中，本發明提供一種生產 不飽和 脂肪酸的高產量生產方法，該方法包括在一定條件下培養受到操作的植物或微生物，以便 在36小時內以高於15-20g/L的水平生產一種不飽和脂肪酸。在另一的實施方案中，本發 明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該方法包括在一定條件下培養受到操作 的植物或微生物，以便在48小時內以高於25-30g/L的水平生產一種不飽和脂肪酸。在另 一實施方案中，本發明提供一種生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該方法包括在一定 條件下培養受到操作的植物或微生物，以便在72小時內以高於15-20g/L的水平(如在72 小時內以高於37g/L的水平)生產一種不飽和脂肪酸。在另一實施方案中，本發明提供一種 生產不飽和脂肪酸的高產量生產方法，該方法包括在一定條件下培養受到操作的植物或微 生物，以便在60小時內以高於30-40g/L的水平(如在60小時內以高於30、35或40g/L的 水平)生產一種不飽和脂肪酸。在本文陳述的範圍內所包括的值和範圍和/或中間值也在 本發明的範圍內。例如，在60小時內以至少31、32、33、34、35、36、37、38和39g/L的水平生 產不飽和脂肪酸將包括在60小時內30-40g/L的範圍內。另一實例是，30-35g/L或35-40g/ L將包括在60小時內30-40g/L的範圍內。此外，技術人員將理解培養受到操作的微生物 以達到例如「60小時內30-40g/L」的生產水平包括培養所述微生物達到更長的時間(例如 長於60小時的時間)，這可選地導致所生產的不飽和脂肪酸的甚至更高的產量。IV.組合物本發明的去飽和酶核酸分子、蛋白和其片段可以用於生產可加入組合物的不飽和 脂肪酸。本發明的組合物包括例如用作動物飼料的組合物、用作保健品(如食品添加劑) 的組合物以及適於給藥的藥用組合物。所述藥用組合物一般包含不飽和脂肪酸和藥學上可接受的載體。本文所用語言 「藥學上可接受的載體」包括與藥物給藥方法匹配的任何和所有溶劑、分散介質、塗層、抗細 菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。用於藥用活性物質的所述介質和試劑的使用是 本領域內眾所周知的。除任何常規介質或試劑與所述活性化合物不可配伍的情況外，設想 所述介質在所述組合物中的應用。所述組合物中也可以加入附加的活性化合物。本發明的藥用組合物配製成與其既定給藥途徑的匹配形式。給藥途徑的例子包 括胃腸外給藥，如靜脈內給藥、皮內給藥、皮下給藥、口服給藥(如吸入)、經皮給藥(局部 給藥)、經黏膜給藥和直腸給藥。用於胃腸外應用、經黏膜應用和皮下應用的溶液或懸浮液 可以包括下面成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、非揮髮油、聚乙二醇、甘油、丙二醇 或其它合成溶劑；抗細菌劑如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫 鈉；鰲合劑如乙二胺四乙酸；緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節張力的試 劑如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或鹼(如鹽酸或氫氧化鈉)調節PH。所述胃腸外製備物可 以封裝在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料製成的多劑量小管內。適於注射應用的藥用組合物包括無菌水溶液(當水溶時)或分散體，以及用於臨時製備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。為靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、制菌 水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)。在所有情況下，所 述組合物必須是無菌的，並且應該足夠液體化以便容易注射。它應該在生產和貯存條件下 穩定，並且在對抗微生物如細菌和真菌汙染作用的情況下保存。所述載體可以是一種溶劑 或分散體介質，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及它 們合適的混合物。可以使用如下方法維持合適的流動性例如，通過應用一種塗層如卵磷 月旨、在分散體的情況下通過維持所需粒度以及通過使用表面活性劑。可以通過各種抗細菌 劑和抗真菌劑預防微生物的作用，所述抗細菌劑和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、 苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，優選在所述組合物中優選包括等滲劑如糖、多元 醇如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉。可以通過在所述組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂 酸鋁和明膠)，實現所述可注射組合物的延長吸收。 可以如下製備無菌可注射溶液在一種合適的溶劑中以所需量加入所述活性化合 物(如由本發明的核酸分子和蛋白分子產生的LCPUFA或其片段)，並根據需要加入一種上 文列舉成分或其組合，隨後過濾除菌。一般地說，如下製備分散體將所述活性化合物加入 無菌媒介物，該媒介物含有一種基礎分散介質和所需要上文列舉的其它成分。在用於製備 無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選製備方法是真空乾燥和凍幹，該方法產生粉末， 所述粉末包含所述活性成分和事先無菌過濾的溶液的任何附加的所需成分。口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以封裝在明膠膠囊內 或壓縮成片劑。為口服治療給藥的目的，所述活性化合物可以與賦形劑混合，並以片劑、錠 劑或膠囊劑的形式使用。也可以用液體載體製備口服組合物以用作漱口藥，其中所述液體 載體中的所述化合物口服應用並譁譁漱口，然後吐出或吞下。可以包括藥學上可配伍的粘 合劑和/或輔助材料作為所述組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以包含 下面成分中的任何一種或相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形 劑如澱粉或乳糖，崩解劑如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes ； 助流劑如膠體二氧化矽；甜味劑如蔗糖或糖精；或風味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙風味劑 (orange flavoring)0為通過吸入給予，可以用壓力容器或分配器(dispenser)提供的氣溶膠噴霧形式 傳遞所述化合物，所述壓力容器或分配器包含合適的推進劑如一種氣體(如二氧化碳)或 一種霧化劑。也可以通過經黏膜或經皮方式進行系統性給藥。為進行經黏膜或經皮給藥，在所 述製劑中使用適用於所要穿透的屏障的滲透劑。所述滲透劑是本領域內眾所周知的，用於 經黏膜給藥時包括例如去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。可以通過應用鼻噴霧劑或栓劑 實現經黏膜給藥。為進行經皮給藥，將所述活性化合物配製成本領域內眾所周知的軟膏劑、 油膏、凝膠或乳油。所述化合物也可以配製成栓劑(如使用常規栓劑基質如可可油和其它甘油酯)或 保留灌腸劑以進行直腸給藥。在一個實施方案中，所述活性化合物用保護所述化合物對抗機體快速清除的載體 製備，例如控釋製劑，包括植入物和微囊化傳遞系統。可以使用生物可降解、生物相容性聚 合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。製備所述製劑的方法對於本領域內的技術人員將是明顯的。所述材料也可以從AlzaCorporation和 Nova Pharmaceuticals, Inc.商業性獲得。脂質體懸浮液(包括靶向感染細胞的脂質體， 所述脂質體攜帶針對病毒抗原的單克隆抗體)也可以用作藥學上可接受的載體。可以根據 本領域內技術人員已知的方法製備它們，如美國專利第4，522，811號所述。為了便利於給藥和劑量均勻性，特別優選配製成劑量單位形式的口服或胃腸外組 合物。本文所用的劑量單位形式指適合給予治療對象的單位劑量的物理上分離的單位；每 個單位含有預定量的活性化合物，經計算所述量化合物結合所需藥學載體一起產生所需治 療效應。本發明所述劑量單位形式的規格由下面因素決定並直接取決於下面因素所述活 性化合物的獨特特性和需要達到的特定治療效果，以及配製領域內固有的限制例如用於治 療個體的活性化合物。可以通過在細胞培養物或試驗動物中的標準藥學程序確定所述化合物的毒性和 治療功效，例如確定LD50 (使50%群體致死的劑量)和ED50 (50%群體有效治療的劑量)。 毒性效應和治療效應之間的劑量比是治療指數，可以表示為LD50/ED50。優選較大治療指數 的化合物。雖然可以使用表現毒性副作用的化合物，但應當注意設計一種將所述化合物靶 向受累組織位點的傳遞系統，以最小化對未感染細胞的可能損害，由此降低副作用。 從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可以用於制定在人體應用的劑量範圍。所 述化合物的劑量最好在下面循環濃度範圍內該範圍包括具有很小或沒有毒性的ED50。根 據所使用的劑型和所利用的給藥途徑，劑量可以在該範圍內變化。對於在本發明方法中使 用的任何化合物，開始可以根據細胞培養測定估計治療有效劑量。在動物模型中制定一個 劑量，以達到包括細胞培養所測定的IC50(即達到對症狀最大抑制的一半的測試化合物濃 度)的循環血漿濃度範圍。可以使用所述信息更精確地確定在人體內的有效劑量。可以通 過例如高效液相色譜測定血漿中的水平。本文所定義的蛋白或多肽的治療有效量(即有效劑量)範圍從約0. 001到30mg/ kg體重，優選約0. 01到25mg/kg體重，更優選約0. 1到20mg/kg體重，甚至更優選約1到 10mg/kg體重、2到9mg/kg、3到8mg/kg、4到7mg/kg或5到6mg/kg體重。技術人員將認識 到某些因素可以影響有效治療患者所需的劑量，包括但不限於疾病或病症的嚴重性、以前 的治療、總體健康狀況和/或對象的年齡以及同時存在的其它疾病。此外，用治療有效量的 蛋白、多肽或抗體對患者的治療可以包括單一治療，或者最好可包括一系列治療。在一個優選實施例中，用約0. 1到20mg/kg體重範圍內的LCPUFA治療患者，每周 一次治療，連續約1到10周，優選2到8周，更優選約3到7周，甚至更優選約4、5或6周。 人們也將理解用於治療的抗體、蛋白或多肽有效劑量可以在特定治療的療程中升高或降 低。劑量上的變化可能源於如本文所述診斷測定的結果，並由所述結果而變得明顯。所述藥用組合物可以包裝在容器、包裝器材或分配器內，同時附有使用說明。本發明將通過下面的實施例進一步舉例說明，不應當認為下面的實施例是限制性 的。本申請全文中引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請以及附圖通過引用結合到 本文中。
實施例破囊壺菌屬菌ATCC 21685和畸雌腐黴購子美國典型培養物保藏中心(12301 Parklawn Drive, Rockville，Maryland，20852USA)，在 24°C 下在培養基(ffeete, JD.等(1997) Lipids 32 :839_845)中培養7天。然後通過離心收穫生物量，用於RNA分離。實施例1 構建和篩選cDNA文庫根據Qiu 和 Erickson (Qiu, X.和 Eriekson, L. (1994) Plant Mol. Biol. R印r. 12 209-214)所述，從上述材料分離總RNA。從所述總RNA構建cDNA文庫。使用得自Gibco-BRL 的上標II反轉錄酶合成第一條cDNA鏈。用Stratagen e的DNA聚合酶I合成第二條cDNA鏈。 經大小分級分離後，將大於Ikb的cDNA插入片段連接進λ Uni-Zap XR載體(Stratagene)。 然後將所述重組 DNA用Gigapack III Gold包裝提取物包裝，隨後接種在NZY平板上。 得到的文庫代表超過5xl06個獨立集落。根據標準方法(Sambrook, J，Fritseh, E. F.， Maniatis, T. (1989)Molecular cloning-Α laboratory manual. (Cold Spring Harbor, NewYork, USA))進行所述cDNA文庫的篩選。實施例2: RT-PCR使用上標II反轉錄酶(Gibco-BRL)從總RNA合成單鏈cDNA，然後用作模板，與兩 個簡併引物(正向引物GCXCA/GAXGAXCAC/TCCXGGXGG 和反向引物ATXTG/TXGGA/GAAXAG/ AG/ATGG/ATG)進行PCR反應。所述PCR擴增包括35個循環，每個循環在94°C下1分鐘、 在55°C下1. 5分鐘、在72°C下2分鐘，然後在72°C下延伸10分鐘。從瓊脂糖凝膠上分離 從800bp到IOOObp的擴增產物，用試劑盒(Qiaex II凝膠純化，Qiagen)純化，然後克隆 進 TA 克隆載體pCR 2. I(Invitrogen)。然後通過 PEISMDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing System(Perkin Elmer/AppIiedBiosystems)測序克隆的插入片段。實施例3 在酵母中表達Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad6使用Precision Plus 酶(Stratagene)通過 PCR 擴增 Fad4、Fad5、Fad5_2 和 Fad6
的可讀框，然後克隆進TA克隆載體(pCR 2. 1，Invitrogen) 0通過測序確認所述PCR
產物與原始cDNA相同後，通過BarnHI-EcoRI雙消化釋放所述片段，並插入酵母表達載體 PYES2 (Invitrogen)，置於誘導型啟動子GALl的控制之下。使用乙酸鋰方法，用所述表達構建物轉化酵母菌株InvSC2 (Invitrogen)，在缺乏 尿嘧啶的基本培養基上篩選轉化子(Gietz，D.等(1992)Nucleic Acids Res. 20:1425; Covello, P. S.和 Reed, D. W. (1996)Plant Physiol. Ill -.223-226)。轉化子首先在28 V下在缺乏尿嘧啶、含葡萄糖的基本培養基上培養。過夜培養後， 離心沉澱細胞，洗滌並重懸浮於蒸餾水中。用所述酵母轉化子細胞懸浮液接種基本培養基 並在20°C下培養三天，然後在15°C下培養三天，所述基本培養基含2%半乳糖、0. 表面 活性劑、含或不含0. 3mM底物脂肪酸。實施例4:脂肪酸分析收穫破囊壺菌、畸雌腐黴和酵母細胞，用蒸餾水洗滌兩次。在所述材料中加入2mL 甲醇化KOH(在95%甲醇中7. 5% w/v Κ0Η)，將封裝在12ml玻璃培養管內的混合物在80°C 加熱2小時。加入0. 5mL水，所述樣品用2mL己烷萃取兩次，除去非皂化的脂類。加入lmL6N HC1，酸化剩餘的水相，並用2mL己烷萃取兩次。合併己烷相，在氮氣流下乾燥。加入2mL 3N 甲醇化 HCl (SUPELC0, Supelco Park, Bellefonte, PA 16823-0048)，所述混合物在 80°C 加熱2小時。冷卻到室溫後，加入ImL 0.9% NaCl，用2x 2mL己烷萃取所述混合物兩次。 在氮氣下蒸發合併的己烷。根據 Covello&Reed(Covello, P. S.和 Reed，D. W. (1996)PlantPhysiol. Ill :223-226)，通過GC和GC-MS分析所得的脂肪酸甲基酯(FAME)。使用偶聯GC 8000系列氣相色譜的在Masslynx版本2.0軟體控制下的Fisons VG TRIO 2000質譜儀(VG Analytical，UK)，在標準EI模式下進行GC/MS分析。使用DB-23柱 (30Mx0. 25mm 內徑，0. 2511m 膜厚度，J&ff Scientific, Folsom, CA)進行 FAME 分析，該柱的 溫度程序設置為180°C下1小時，然後以4°C /分鐘加熱到240°C，在該溫度下保持15分鐘。實施例5 轉化芥菜和亞麻(Linum usitatissimum)以及外源脂肪酸處理使用芥菜和亞麻的5-6天幼苗的下胚軸作為外植體，在上面接種根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)，所述根癌農桿菌攜帶雙載體，該雙載體包含在不同啟動子 控制下的所述全長cDNA。使用20天的轉基因幼苗進行外源脂肪酸處理。將所述幼苗分為 三部分葉、莖和根。每一部分切成小塊，置於24孔滴定板上。在所有孔中加入2mL 0. 05% 底物的鈉鹽(NuCheck Prep Inc.，Elysian，MN)。在溫和攪拌下，將所述板在24°C下溫育4 小時。溫育後，用水洗滌所述植物組織三次，然後用於脂肪酸分析。實施例6 破囊壺菌屬菌的脂肪酸分布由於破囊壺菌和畸雌腐黴生產LCPUFA如DHA、AA、EPA和DPA的能力，它們最近吸引科學界的注意。圖23和24分別顯示從破囊壺菌和畸雌腐黴的7天培養物分離的脂類的 脂肪酸組成。如表中所示，所述微生物含有廣泛範圍的多不飽和脂肪酸，包括n-3和n-6家 族，從18碳A6脂肪酸(γ -亞麻酸和steardonic acid)到22碳Δ 4脂肪酸(DHA和DPA)。 所述生物(尤其是破囊壺菌屬菌)看起來包含DHA和DPA生物合成所需的全套去飽和酶和 延長酶。該株缺乏24碳多不飽和脂肪酸，即Precher途徑中DHA和DPA合成假定的前體 (Voss, Α.等(1991)J. Biol. Chem. 266 19995-20000 ；Mohammed, B. S.等(1997)Biochem. J. 326 425-430)。在破囊壺菌屬菌中所述24碳脂肪酸可能不涉及22碳Δ 4脂肪酸如DHA 和DPA的體內合成。實施例7 鑑定編碼「前端」去飽和酶的cDNA為鑑定涉及破囊壺菌屬菌和畸雌腐黴內LCPUFA生物合成的去飽和酶的編碼基 因，應用一種基於PCR的克隆策略。設計兩種簡併引物，分別靶向前端去飽和酶內cyt b5 樣結構域N端延伸部分的血紅素結合基序以及所有微粒體去飽和酶內的第三個保守組氨 酸基序。這種設計的合理性在於在破囊壺菌屬菌和畸雌腐黴內涉及EPA和DHA生物合成 的去飽和酶應該與其它前端去飽和酶具有類似的主要結構，即去飽和酶中cyt b5樣結構域 的N端延伸部分。鑑定四個cDNA片段來自破囊壺菌屬菌和畸雌腐黴，它們編碼在N末端包 含cyt b5樣結構域的融合蛋白。為分離全長cDNA克隆，將所述四個插入片段用作探針，篩選破囊壺菌屬菌和畸雌 腐黴的cDNA文庫，導致在每一組中鑑定幾個cDNA克隆。測序所有那些克隆鑑定為四個全 長cDNA的克隆，將它們命名為Fad4、Fad5、Fad5-2和Fad6。Fad4的可讀框長1560bp，編碼 分子量為59. IkDa的519個胺基酸(圖1)。Fad5長1230bp，編碼分子量為49. 8kDa的439 個胺基酸(圖2)。對這兩個來自破囊壺菌屬菌鐘的序列的序列比較顯示在推導的蛋白之 間僅有16%的胺基酸同一性。更詳細的分析揭示Fad4比Fad5長80個胺基酸，這80個氨 基酸出現在第二個和第三個保守組氨酸基序之間(圖3)。來自畸雌腐黴的Fad5-2的可讀 框長1371bp，編碼456個胺基酸(圖4)。來自畸雌腐黴的Fad6的可讀框長1383bp，編碼 460個胺基酸(圖5)。對這兩個來自畸雌腐黴的序列的序列比較顯示在推導的蛋白之間有超過39%相似性(圖6)。BLASTP 對蛋白資料庫的搜索揭示所述四種蛋白Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad6每一 種的下面匹配數(hits)Fad4(519個胺基酸殘基)Blastp nr 實施例8 在酵母中表達Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad6為確認Fad4的功能，將所述全長cDNA置於誘導型啟動子控制下在酵母菌株 InvSc2中表達。圖7顯示在補充22:5(7，10，13，16，19)的培養基上，包含Fad4 cDNA的 酵母細胞與載體對照相比產生額外的脂肪酸。該峰的保留時間與DHA標準相同。游離脂肪 酸的LC/MS分析顯示它在負離子電噴射中產生與DHA標準相同的去質子的分子離子(m/ ζ = 279)。此外，FAME的GC/MS分析證實該峰的圖譜與DHA標準的圖譜相同(圖8)。這 些結果指出Fad4是一種Δ 4脂肪酸去飽和酶，能夠在22:5 (7，10，13，16，19)底物的位置4 引入一個雙鍵，導致一種Δ 4不飽和脂肪酸，即DHA (22:6-4，7，10，13，16，19)。為進一步研究Fad4的底物特異性，分別為酵母轉化子提供包括18:2(9，12)、18:3(9,12,15),20:3(8,11,14)和 224(7，10，13，16)在內的多種底物。結果指出 Fad4也可以使用22:4(7，10，13，16)作為底物(圖9)生產另一種Δ4不飽和脂肪酸，即 DPA (22:5-4，7，10，13，16)(圖10)。檢查的其它脂肪酸不是有效底物。為證實Fad5和Fad5_2的功能，用質粒轉化啤酒酵母(S. cerevisiae)Invsc2，該質 粒分別包含在半乳糖誘導型啟動子控制下的Fad5和Fad5-2的可讀框。當在含高Y -亞麻 酸(HGLA，20:3-8，11，14)的培養基內用半乳糖誘導所述酵母轉化子時，在FAME色譜上出現 一個額外的峰，與對照相比，該峰在所述轉化子中積累(圖11)。該色譜與標準圖譜的比較 揭示所述脂肪酸具有與花生四烯酸標準(AA，20:4-5，8，11，14)相同的保留時間。為進一 步證實所述產物的區域化學，通過GC/MS分析FAME。圖12指出該新脂肪酸的質譜與AA標 準的質譜是相同的。這些結果證明Fad5和Fad5-2在酵母中將HGLA (20 3_8，11，13)轉化成 AA(20:4-5，8，11，14)。為進一步研究Fad5_2的底物特異性，將包含Fad5_2的質粒轉移進另 一酵母菌株ΑΜΥ_2α，其中破壞Δ9去飽和酶基因olel。所述菌株不能在未添加單不飽和 脂肪酸的基本培養基中生長。在本試驗中，該菌株在補充17:1(IOZ)(不是Fad5-2的底物) 的基本培養基中培養，這使得能夠研究該酶對各種底物(尤其是單不飽和化合物)的特異 性。測試多種可能的底物，包括 16:1 (9Z)、18:1(9Z)、18:1 (IlZ)、18:1 (IlE)、18:1(12E)、 18:1(15Z)、18:2(9Z，12Z)、183 (9Z，12Z,15Z)、20:2 (11Z，14Z)和 20:3(11Z, 14Z, 17Z)。結 果指出Fad5-2能夠使帶有Δ 9烯雙鍵和Δ 11烯雙鍵的不飽和脂肪酸去飽和，以及使帶有 Δ 8烯雙鍵的脂肪酸(20:3-8，11，14)去飽和。如圖13所示，Fad5_2有效轉化18 1 (9Ζ)和 18:1(IlZ)底物成為它們對應的Δ 5不飽和脂肪酸，即分別是18:2-5，9(保留時間10.34 分鐘)和18:1-5，11 (保留時間10. 44分鐘)。Fad5-2也使反式脂肪酸如18:1(IlE)和 18:1(12E)去飽和。圖25是在酵母菌株ΑΜΥ-2 α中測試的Fad5_2對脂肪酸底物的底物偏好的比較。 底物與所積累的產物的相對比例是所述酶的底物偏好的有用指標。如圖25所示，Fad5-2偏 好使用有 20碳的脂肪酸作為底物，如 203 (8Z，1 \1,14Z) ,20:3 (11Z, 14Z，17Z)和 202 (11Z, 14Z)。然而，更短鏈脂肪酸是該酶在酵母中相對較弱的底物。為證實Fad6的功能，用質粒轉化啤酒酵母宿主菌株IrwSC2，該質粒包含在半乳糖 誘導型啟動子GALl控制下的Fad6的可讀框。當在含亞油酸的培養基內用半乳糖誘導所述 酵母轉化子時，在FAME色譜上出現一個額外的峰，與對照相比，該峰在所述轉化子中積累 (圖14)。該色譜與標準圖譜的比較揭示所述脂肪酸具有與Y-亞麻酸(GLA，18:3-6，9， 12)相同的保留時間。為進一步證實所述產物的區域選擇性，通過GC/MS分析從所述表達 菌株獲得的脂肪酸的二乙胺衍生物。圖15顯示新峰確實是在Δ6、Δ9和Δ 12位置具有3 個雙鍵的GLA。12D不同的η和η十1碳的主要片段是在η+1和η+2碳間存在一個雙鍵的 特徵。因此，156和168的片段、196和208的片段以及236和248的片段分別指出在Δ 6、 Δ9和Δ 12位置有雙鍵。這些結果證明Fad6是一種在酵母中將亞油酸(18:2)轉化為GLA 的Δ 6去飽和酶。實施例9 :Fad4在芥菜中的表達為確定破囊壺菌屬Fad4是否在油籽作物中是否有功能，用構建物轉化芥菜，所述 構建物包含在組成型啟動子控制下的Fad4。獲得8株獨立的轉基因植株。在芥菜中不能 獲得△ 4脂肪酸去飽和酶底物。因此，為測定所述轉基因酶在植物中的活性，必須外源提供22:5(n-3)底物。在本試驗中，為野生型植株和轉基因植株提供二十二碳五烯酸鈉的水 溶液。發現外源提供的底物能夠容易地被野生型和轉基因植株的根、莖和葉吸收，但僅在轉 基因植株中被轉化為DHA。葉中的DHA生產水平比根和莖中都高。在葉中，所述外源底物 加入達到總脂肪酸10-20%的水平，而生產的Δ4不飽和脂肪酸(22:6，n-3)佔總脂肪酸的 3-6% (圖16)。這些結果指出來自破囊壺菌屬的Δ 4脂肪酸去飽和酶在油籽作物中是有 功能的。實施例10 :Fad5-2在芥菜中的表達 為確定Fad5_2在油籽作物中是否有功能，以及它的表達對應他們生長和發育 是否有任何影響，用雙載體轉化芥菜，所述雙載體包含在組成型啟動子(串聯花椰菜花 葉病毒35S啟動子)之後的Fad5-2cDNA。獲得六株獨立的初級轉基因植株，測定不同組 織的脂類的脂肪酸分布。圖17顯示來自一株T1系的三周齡幼苗植株的脂肪酸組成。與 野生型相比，所有轉基因植物組織具有改變的脂肪酸分布，其中含四個額外的峰，這四個 峰鑑定為四種不同的Δ5非去飽和的聚亞甲基間斷的脂肪酸(A5-UPIFA)，具體地說是 taxoleic acid(182-5,9)、ephedrenicacid(182-5,11)、pinolenic acid(183-5,9,12) 和coniferonic acid (18 4-5，9，12，15)。因此，B. juncea象酵母一樣，能夠有功能地表達 畸雌腐黴Δ 5去飽和酶，該酶將內源底物18:1-9、18:1-11、18:2-9，12和183-9，12，15轉 化成對應的Δ5不飽和脂肪酸。根產生最大量的Δδ-UPIFA，佔總脂肪酸的超過20%，其次 是莖6%和葉5% (圖17)。在芥菜中沒有有效的高Y-亞麻酸(20:3-8，11，14)底物。因此，為檢查所述轉基 因植株是否能夠產生ΑΑ，外源提供底物20:3(8，11，14)。在本試驗中，為野生型植株和轉基 因植株提供高Y-亞麻酸鈉的水溶液。發現外源提供的底物能夠容易地被轉基因植株的 根、莖和葉吸收，並在植株中被轉化為AA (圖18)。雖然Δ 5-UPIFA在植株的所有部分積累，但對於轉基因芥菜的生長和發育沒有能 夠觀察到的表型效應。植物組織如葉、莖和根的生長和分化與對應野生型沒有區別。為在種子中生產Δ 5去飽和脂肪酸，用構建物轉化芥菜，所述構建物包含在異源 種子特異性啟動子(歐洲油菜(B.napuS)napin啟動子)之後的Fad5-2cDNA。對轉基因種 子的脂肪酸分析顯示與野生型對照相比，在轉基因植物的氣相色譜中出現兩種新的脂肪 酸(圖 19)。它們鑑定為 taxoleic acid (18 2-5,9)和 pinolenic acid (18 3-5,9,12)。總 的來說，這些脂肪酸佔所述種子脂肪酸的9.4%。與未轉化的對照相比，A5-UPIFA的積累 對於油酸含量沒有顯著影響。實施例11 :Fad5-2在亞麻中的表達為在亞麻種子中生產Δ5不飽和脂肪酸，用在兩個種子特異性啟動子控制下的 Fad5-2轉化亞麻，所述兩個種子特異性啟動子是異源甘藍型油菜napin啟動子和亞麻內源 啟動子。如圖26所示，包含napin啟動子的轉基因植株在種子中產生一種Δ 5不飽和脂肪 酸，即taxoleicacid，其水平佔總脂肪酸的少於1%。但是，包含亞麻種子特異性啟動子的 轉基因植株生產三種Δ5不飽和脂肪酸taxoleic acid、pinolenic acid和coniferonic acid。其中taX0leiC(18:2-5，9)是最豐富的，在一個原種系(FN-10-1)中佔總脂肪酸的 超過9%，其次是coniferonic acid和pinolenicacid。驚人的是，Δ 5不飽和脂肪酸在轉 基因種子中的積累對於其它脂肪酸的組成沒有顯著影響，尤其是對於油酸水平沒有顯著影響。在不同啟動子控制下表達Fad5-2去飽和酶的兩種轉基因植株中，A5-UPIFA的積累伴 隨著油酸的大量增加。在具有napin和亞麻種子特異性啟動子的轉基因植株中，油酸的含 量平均分別達到總脂肪酸的44. 7%和24. 3%，而未轉化對照的含量是17. 4%。實施例12 :Fad6在亞麻中的表達為在亞麻種子中生產Δ 6不飽和脂肪酸，用構建物轉化兩種亞麻，所述構建物包 含在異源種子特異性啟動子(甘藍型油菜napin啟動子)控制下的Fad6cDNA。I型亞麻 (Normandy)是傳統的工業化油籽作物，而II型(Solin)是由對I型的化學誘變而獲得的 可食用油籽作物。產生總共12株轉基因植株。大部分轉基因植株含有兩種新脂肪酸，這兩 種脂肪酸的保留時間對應於GLA和SDA，它們佔總脂肪酸的0.1到4.3% (圖27)。GLA在 轉基因Solin型中的水平高於SDA的水平，而GLA在轉基因Normandy中的水平低於SDA的 水平。這是可以理解的，因為亞油酸是Solin型亞麻子中的主要脂肪酸，而α-亞麻酸是 Normandy種子中的主要脂肪酸。實施例13 :Fad6在芥菜中的表達 為在芥菜的種子中生產Δ6不飽和脂肪酸，用在轉化亞麻時使用的相同構建物轉 化芥菜，所述構建物即在甘藍型油菜napin啟動子控制下的Fad6。獲得十五株獨立的轉基 因植株。對所述轉基因種子的脂肪酸分析顯示與野生型對照相比，在大多數轉基因植株的 氣相色譜中出現三種新脂肪酸(圖20)。所述三種脂肪酸鑑定為18:2(6,9)和18:3(6,9, 12)以及18:4(6，9，12，15)。芥菜象亞麻一樣，也能夠有功能地表達來自畸雌腐黴的Fad6， 該酶在內源底物18:1(9)、18:2(9，12)和18:3(6，9，12)的位置6引入雙鍵，導致在轉基因 種子中生產三種對應的Δ6脂肪酸。在這三種在轉基因種子中生產的新脂肪酸中，GLA是最 豐富的一種，其水平達到轉基因種子中總脂肪酸的30%到38%。第二最豐富的成分是SDA， 在幾個轉基因系中佔總脂肪酸的3-10% (圖21)。轉基因種子的脂肪酸組成顯示於圖22。清楚的是高水平生產Δ 6不飽和脂肪酸 需要消耗兩種主要的脂肪酸，即亞油酸和亞麻酸。在轉基因種子中油酸和硬脂酸的生產稍 稍降低，但與野生型對照相比並不顯著。所述轉基因種子中的亞油酸含量顯著降低。在未 轉化的野生型中，亞油酸佔種子中總脂肪酸的超過40%。在轉基因種子中，該水平降到低於 10%。與亞油酸在轉基因種子中的降低相比，亞麻酸在轉基因種子中的降低沒有那麼大，但 仍是顯著的。在未轉化的野生型中，亞麻酸佔種子中超過10%的總脂肪酸，而在轉基因種子 中該水平降低到低於5%。在轉基因種子中所述兩種大幅減少的脂肪酸是Δ6去飽和酶的 底物，所述降低是用於生產兩種對應的△ 6不飽和脂肪酸。等同實施方案本領域內技術人員將認識到或能夠確定僅使用常規實驗就可獲得的本文所述本 發明的特定實施方案的許多等同實施方案。所述等同實施方案將包括在下面權利要求的範 圍內。序列表Bioriginal Food&Science Corporation新型脂肪酸去飽和酶家族成員FAD4、FAD5、FAD5-2和FAD6及它們的應用PAT 642W-90PCT/IB01/02346
2001-09-2860/236,3032000-09-28<150)60/297,562 2001-06-128FastSEQ for Windows Version 4. 011560DNA 破囊壺菌屬菌(Thraustochytrium sp.)CDS(1). . . (1560) 變異體462Xaa = Gly1atg acg gtc ggc tac gac gag gag ate ccg ttc gag cag gtc cgc gcg 48Met Thr Val Gly Tyr Asp Glu Glu lie Pro Phe Glu Gln Val Arg Ala151015cac aac aag ccg gat gac gcc tgg tgc gcg ate cac ggg cac gtg tac 96His Asn Lys Pro Asp Asp Ala Trp Cys Ala lie His Gly His Val Tyr202530gat gtg acc aag ttc gcg age gtg cac ccg ggc ggc gac att ate ctg 144Asp Val Thr Lys Phe Ala Ser Val His Pro Gly Gly Asp lie lie Leu354045ctg gcc gca ggc aag gag gcc acc gtg ctg tac gag act tac cat gtg 192Leu Ala Ala Gly Lys Glu Ala Thr Val Leu Tyr Glu Thr Tyr His Val505560egg ggc gtc tcg gac gcg gtg ctg cgc aag tac cgc ate ggc aag ctg 240Arg Gly Val Ser Asp Ala Val Leu Arg Lys Tyr Arg lie Gly Lys Leu65707580ccg gac ggc caa ggc ggc gcg aac gag aag gaa aag egg acg ctc tcg 288Pro Asp Gly Gln Gly Gly Ala Asn Glu Lys Glu Lys Arg Thr Leu Ser859095ggc ctc tcg tcg gcc tcg tac tac acg tgg aac age gac ttt tac agg 336Gly Leu Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Thr Trp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg
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破囊壺菌屬菌CDS (1). . . (1380)7atg gtg gacctc aag cct gga gtg aag cgc ctg gtg age tgg aag gag 48Met Val AspLeu Lys Pro Gly Val Lys Arg Leu Val Ser Trp Lys Glu151015ate cgc gagcac gcg acg ccc gcg acc gcg tgg ate gtg att cac cac96lie Arg GluHis Ala Thr Pro Ala Thr Ala Trp lie Val lie His His202530aag gtc tacgac ate tcc aag tgg gac tcg cac ccg ggt ggc tcc gtg 144Lys Val TyrAsp lie Ser Lys Trp Asp Ser His Pro Gly Gly Ser Val354045atg ctc acgcag gcc ggc gag gac gcc acg gac gcc ttc gcg gtc ttc 192Met Leu ThrGln Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ala Val Phe505560cac ccg tcctcg gcg ctc aag ctg ctc gag cag ttc tac gtc ggc gac 240His Pro SerSer Ala Leu Lys Leu Leu Glu Gln Phe Tyr Val Gly Asp65707580gtg gac gaaacc tcc aag gcc gag ate gag ggg gag ccg gcg age gac 288Val Asp GluThr Ser Lys Ala Glu lie Glu Gly Glu Pro Ala Ser Asp859095gag gag cgcgcg cgc cgc gag cgc ate aac gag ttc ate gcg tcc tac 336Glu Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg lie Asn Glu Phe lie Ala Ser Tyr100105110cgt cgt ctgcgc gtc aag gtc aag ggc atg ggg ctc tac gac gcc age 384Arg Arg LeuArg Val Lys Val Lys Gly Met Gly Leu Tyr Asp Ala Ser115120125gcg ctc tactac gcg tgg aag ctc gtg age acg ttc ggc ate gcg gtg 432Ala Leu TyrTyr Ala Trp Lys Leu Val Ser Thr Phe Gly lie Ala Val130135140ctc tcg atggcg ate tgc ttc ttc ttc aac agt ttc gcc atg tac atg 480Leu Ser MetAla lie Cys Phe Phe Phe Asn Ser Phe Ala Met Tyr Met145150155160gtc gcc ggcgtg att atg ggg ctc ttc tac cag cag tcc gga tgg ctg 528Val Ala GlyVal lie Met Gly Leu Phe Tyr Gln Gln Ser Gly Trp Leu165170175gcg cac gacttc ttg cac aac cag gtg tgc gag aac cgc acg ctc ggc 576
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一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子選自(a)包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7核苷酸序列或其互補序列的核酸分子；(b)編碼下述多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8胺基酸序列或其互補序列；(c)編碼下述多肽的天然等位基因變異體的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8胺基酸序列或其互補序列。
2.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子選自(a)一種包含下述核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列與SEQ ID N0:3、5、7的整 個核苷酸序列或其互補序列至少70%相同；(b)一種核酸分子，該核酸分子包含一種下述核酸的至少30個連續核苷酸的片段，所 述核酸包含SEQ ID NO :3、5、7的核苷酸序列或其互補序列；(c)一種編碼下述多肽的核酸分子，所述多肽包含與SEQ IDN0:4、6或8的整個胺基酸 序列至少約50%相同的胺基酸序列；(d)一種編碼下述多肽的片段的核酸分子，所述多肽包含SEQID N0:4、6或8的胺基酸 序列，其中所述片段包含SEQ ID NO :4、6或8的胺基酸序列的至少10個連續胺基酸殘基。
3.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子在嚴格條件下與權利要求1或2核酸分 子的互補序列雜交。
4.一種載體，所述載體包含權利要求1或2的核酸分子。
5.權利要求4的載體，所述載體是一種表達載體。
6.一種宿主細胞，所述宿主細胞是用權利要求5的表達載體轉染的宿主細胞。
7.權利要求6的宿主細胞，其中所述細胞選自植物細胞、微生物細胞和動物細胞。
8.權利要求7的宿主細胞，其中所述植物細胞是從選自以下的油籽作物獲得的細 胞亞麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine 和 So ja sp.)、向日葵 (Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、撤攬(Olea sp.)、紅花 (Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)禾口花生(Arachis sp.)。
9.權利要求8的宿主細胞，其中所述微生物細胞選自破囊壺菌屬 (Thraustochytrium)、畸雌 腐黴(Pythium irregulare)、 Schizochytrium 禾口 Crythecodinium。
10.一種生產多肽的方法，該方法包括培養權利要求6的宿主細胞以生產所述多肽。
11.一種分離的多肽，所述多肽選自(a)一種多肽的片段，所述多肽包含SEQ ID NO :4、6或8的胺基酸序列，其中所述片段 包含SEQ ID NO :4、6或8的至少10個連續胺基酸；(b)一種多肽的天然等位基因變異體，所述多肽包含SEQ IDN0 :4、6或8的胺基酸序列， 其中所述多肽由一種下述核酸分子編碼，所述核酸分子在嚴格條件下與由SEQ ID N0:3、5 或7組成的核酸分子的互補序列雜交；(c)一種由下述核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子包含下述核苷酸序列，所述核苷酸 序列與包含SEQ ID NO :3、5或7的整個核苷酸序列的核酸至少70%相同；和(d)一種包含下述胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQID N0:4、6或8的整個胺基酸序列至少60%相同。
12.權利要求11的分離的多肽，所述多肽包含SEQID NO :4、6或8的胺基酸序列。
13.—種生產不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括用權利要求1或2的分離核酸分子轉 染或轉化細胞，然後在一定條件下培養所述細胞，從而生產所述不飽和脂肪酸。
14.權利要求13的方法，其中所述細胞選自植物細胞、動物細胞和微生物細胞。
15.權利要求14的方法，其中所述植物選自油籽作物。
16.權利要求15的方法，其中所述油籽作物選自以下亞麻(Linumsp.)、油菜籽 (Brassica sp.)、大豆(Glycine 禾口 So ja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、撤攬(Oleasp.)、紅花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa) 禾口花生(Arachissp.)。
17.權利要求13的方法，所述方法還包括回收所述不飽和脂肪酸的步驟。
18.權利要求13的方法，其中所述不飽和脂肪酸選自GLA18:3(6，9，12)、SDA18:4(6， 9，12，15)、AA 20:4(5,8，11，14)、EPA 205 (5，8，11，14，17)、DPA 225 (4，7，10，13，16)和 DHA 22:6(4,7，10，13，16，19)。
19.一種生產不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括使包含至少一種去飽和酶靶分子的 組合物在一定條件下與至少一種權利要求11或12的分離的多肽接觸，從而生產所述不飽 和脂肪酸。
20.權利要求19的方法，所述方法還包括回收所述不飽和脂肪酸的步驟。
21.權利要求19的方法，其中所述不飽和脂肪酸選自GLA18:3(6，9，12)、SDA18:4(6， 9，12，15)、AA 20:4(5,8，11，14)、EPA 20:5(5,8,11,14,17), DPA 22 5 (4，7，10，13，16)和 DHA 22:6(4,7，10，13，16，19)。
22.—種體外生產細胞的方法，所述細胞能夠產生不飽和脂肪酸，所述方法包括將權利 要求1或2的核酸分子引入所述細胞，其中所述核酸分子編碼去飽和酶，所述去飽和酶具有 催化脂肪醯基鏈中雙鍵形成的活性。
23.權利要求22的方法，其中所述細胞選自植物細胞、動物細胞和微生物細胞。
24.權利要求23的方法，其中所述植物細胞是一種油籽植物細胞。
25.權利要求24的方法，其中所述油籽植物是亞麻(Linumsp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine 禾口 So ja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉 米(Zea mays)、撤攬(Oleasp.)、紅花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)禾口花生 (Arachissp.)。
26.權利要求22的方法，其中所述不飽和脂肪酸選自GLA18:3(6，9，12)、SDA18:4(6， 9，12，15)、AA 20:4(5,8，11，14)、EPA 205 (5，8，11，14，17)、DPA 225 (4，7，10，13，16)和 DHA 22:6(4,7，10，13，16，19)。
27.一種調節不飽和脂肪酸產生的方法，所述方法包括培養權利要求6的細胞，從而調 節不飽和脂肪酸產生。
28.權利要求27的方法，其中增強不飽和脂肪酸的產生。
29.權利要求27的方法，其中所述不飽和脂肪酸選自GLA18:3(6，9，12)、SDA18:4(6， 9，12，15)、AA 20:4(5,8，11，14)、EPA 205 (5，8，11，14，17)、DPA 225 (4，7，10，13，16)和 DHA 22:6(4,7，10，13，16，19)。
30.權利要求27的方法，所述方法還包括回收所產生的不飽和脂肪酸。
31.一種大規模生產不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括培養權利要求6的細胞，從而 生產不飽和脂肪酸。
32.權利要求31的方法，其中增強不飽和脂肪酸的產生。
33.權利要求31的方法，其中所產生的不飽和脂肪酸選自GLA18:3(6,9,12), SDA 18:4(6,9，12，15)、AA 20:4(5，8，11，14)、EPA20:5(5，8，11，14，17)、DPA 22:5(4,7,10，13， 16)和 DHA 22:6(4,7，10，13，16，19)。
34.權利要求29的方法，所述方法還包括回收所產生的不飽和脂肪酸。
35.一種組合物，所述組合物包含權利要求11或12的多肽。
36.一種組合物，所述組合物包含通過權利要求13的方法生產的多肽。
37.一種組合物，所述組合物包含通過權利要求19的方法生產的多肽。
38.一種組合物，所述組合物包含通過權利要求22的方法生產的細胞。
39.權利要求35的組合物，其中所述組合物用於動物飼料中。
40.權利要求36的組合物，其中所述組合物用於動物飼料中。
41.權利要求36的組合物，其中所述組合物用作食品添加劑。
42.權利要求35的組合物在製備用於以下病症的人或動物的食品添加劑中的用途應 激、糖尿病、癌症、炎症性疾病及心血管疾病。
43.權利要求35的組合物在製備用於治療以下病症的患者的藥物中的用途應激、糖 尿病、癌症、炎症性疾病及心血管疾病。全文摘要
本發明提供分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼新型脂肪酸去飽和酶家族成員。本發明還提供包含去飽和酶核酸分子的重組表達載體、已經引入所述表達載體的宿主細胞以及大規模生產長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)如DHA的方法。
文檔編號A61K38/44GK101845446SQ20091020982
公開日2010年9月29日 申請日期2001年9月28日 優先權日2000年9月28日
發明者H·洪, 邱曉 申請人:生物源食物及科學公司