溶葡萄球菌複合酶漱口水及製備方法
2023-05-29 12:01:46 2
專利名稱：溶葡萄球菌複合酶漱口水及製備方法
技術領域：
本發明涉及生物製劑，具體涉及一種溶葡萄球菌複合酶漱口水(高科複合溶菌酶漱口水)及製備方法。
口腔是人肌體與外界接觸的一道重要屏障，是呼吸系統、消化系統的一個組成部分，同時也是最易受到侵害的部分，包括空氣汙染、細菌等的侵害。隨著空氣汙染的加劇，環境的惡化，口腔疾病的發生率大大提高了。
口腔中存在為數眾多的致病菌，其中佔主要比例的包括葡萄球菌、溶血性鏈球菌、白色念珠菌、厭氧菌等細菌。它們不但是口腔疾病的根源，而且還影響營養的正常攝入甚至會引起諸如呼吸道，胃腸等器官的疾病，因此預防和殺滅口腔致病菌，對維護人體口腔健康，降低其它器官的發病率十分關鍵。
長期以來，對口腔疾病的治療一直採用化學、抗生素類藥物，儘管當時起到一定的作用，但隨著這些藥物的反覆使用，帶來了一系列的不利影響——產生了許多抗藥性菌株，給肌體帶來了毒副作用。現在耐藥性菌株在致病菌中所佔的比例有逐年上升之勢。
抗生素是在細菌生長代謝的過程中起作用，只能起到抑制細菌生長的目的，而不能將其全部殺死，一部分存活下來的細菌就會帶有此種抗生素的抗性。
傳統的口腔清潔劑主要含有四種成分乙醇、溼潤劑、表面活性劑和香精。為了防止口臭，多數噴霧劑配入抑菌劑，其主要為甲硝脞、洗必泰和一些中藥如雙黃連等。雖然加入抑菌劑能達到較好的抑菌效果，但由於化學藥品很易產生耐藥菌，對口腔黏膜也有刺激，如甲硝脞對胃刺激很大，不易被人接受。
在口腔感染疾病的治療中，現階段仍以化學和抗生素類藥物為主。例如，老年人口腔念珠菌病主要用制黴菌素和西地碘，急性冠周炎用甲硝脞，口腔扁平苔蘚用甲硝脞及四環素等來治療，這些藥物都有毒副作用，而且還會產生抗藥性菌株。目前還沒有一種真正有效的全生物製劑，既能有效殺菌又無任何毒副作用，而且還不易產生抗藥性。
本發明的目的在於克服上述不足之處，設計一種安全有效的生物製劑型漱口水。
本發明提供了一種溶葡萄球菌複合酶(高科複合溶菌酶漱口水)，它是由溶葡萄球菌酶、溶菌酶與藥用輔料組成的，其中主要成分為溶葡萄球菌酶0.003～0.007％、溶菌酶5～15％，藥用輔料為山梨醇5～8％、磷酸鉀7～10％、氯化鈉0.5～1％、香精0.1％、蒸餾水65～82％。
溶葡萄球菌複合酶漱口水中的一種成分溶葡萄球菌酶是一種革蘭氏陽性菌的溶菌素，組成該類革蘭氏陽性菌(例如金黃色葡萄球菌)細胞壁肽聚糖的四肽側鏈的胺基酸，依次為L-丙氨酸，D-穀氨酸，L-賴氨酸，D-丙氨酸；而首位的L-丙氨酸通過一個醯胺鍵與胞壁酸相連，該聚糖鏈四肽側鏈第3位的L-賴氨酸，通過五肽(五個甘氨酸)交聯橋聯結到相鄰聚糖鏈四肽側鏈D-丙氨酸羧基上。由此縱橫交叉，左右聯結構成十分堅韌的三維立體多孔結構，並聚合成較厚的肽聚糖層。溶葡萄球菌酶可切斷肽聚糖中的Gly-Gly鍵，而溶葡萄球菌複合酶漱口水中另一種溶菌酶可切斷N-乙醯胞壁酸和N-乙醯葡萄糖胺之間的鍵，從而使殺菌活性更強，達到溶解並殺死細菌的目的，並可避免細菌耐藥性的產生。
由於溶葡萄球菌複合酶獨特的殺菌機理，使其不同於一般抗生素，常用抗生素是抑制細菌生長，而該酶則是裂解細菌殺死細菌。上海市華山醫院抗生素研究所、第二軍醫大學長海醫院檢驗科、上海市第六人民醫院檢驗科、上海市第九人民醫院檢驗科等單位曾將臨床各科收集到的400多株細菌進行了溶葡萄球菌複合酶的抑殺菌實驗。實驗結果表明溶葡萄球菌複合酶對革蘭氏陽性菌，如臨床上常見的金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、肺炎雙球菌、D群腸球菌、四聯球菌、產單核李斯特菌、鏈球菌以及胃幽門螺旋桿菌等均有明顯的抑殺作用。
實驗還證明溶葡萄球菌複合酶對耐藥性菌株，如目前醫學臨床上最感棘手的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，耐藥性肺炎雙球菌、嗜麥芽窄食單孢菌的效果更優於常用抗生素。疾病控制中心對引起口腔炎症細菌如鏈球菌和卟啉菌進行抑菌試驗，殺菌率可達99.9％。
本發明的溶葡萄球菌複合酶漱口水產品，經上海市疾病預防控制中心進行安全性毒理學評價結果如下一、急性毒性(經口LD50)試驗目的樣品通過一次經口接觸所能引起的健康危害及求出半數致死劑量，為急性毒性分類、分級提供依據(為亞慢性試驗和其它試驗確定劑量提供參考)。
1、樣品性狀透明液體，溶於水。
2、樣品處理及配製取樣品5000mg加蒸餾水至20ml，供試。
3、實驗動物昆明種小鼠，體重18-22克，由上海醫科大學實驗動物部提供(合格證號02-22-1)。
4、實驗方法按《消毒技術規範(衛生部1991)》測試。
4.1試驗前，實驗動物禁食16小時。
4.2將動物隨機分組，雌雄各一組，每組10隻，稱重，按0.4ml/20g體重，採用灌胃法進行一次給樣。
4.3觀察給樣後兩周內，實驗動物的中毒表現及死亡情況。
4.4計算LD50及95％可信區間。
5、結果表雌雄小鼠急性毒性經口毒性試驗結果動物性別劑量動物數 死亡數 LD50及95％(mg/kg)(只)(只)可信限(mg/kg)雌性小鼠 5000 10 0＞5000雄性小鼠 5000 10 0＞50006、結論雌性小鼠LD50＞5000mg/kg雄性小鼠LD50＞5000mg/kg二、微核試驗1、樣品性狀透明液體，溶於水。
2、樣品的處理及配製取樣品2500、1000、500、250mg分別加蒸餾水至20ml，配成濃度為125、50、25、12.5mg/ml的溶液，供試。
3、實驗動物3.1來源上海醫科大學實驗動物部(合格證號02-22-1)3.2種屬與品系昆明小鼠3.3性別雌、雄3.4體重25-30克4、實驗方法4.1將動物隨機分為6組，每組8隻，雌雄各半，分別作為樣品四個劑量組及陰性對照和陽性對照組。
4.2採用30小時兩次灌胃法，動物稱重，將配製的不同濃度樣品按0.4ml/20g體重，分別對各組動物灌胃。
4.3於第二次灌胃後6小時，頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓加小牛血清混勻，常規塗片、固定Giemsa染色製片。
4.4鏡檢觀察，每鼠計數1000個嗜多染紅細胞的微核發生率，並進行統計分析。
5、結果表 動物骨髓嗜多染紅細胞微核發生率劑量性別 動物數 受檢細胞數 微核細胞數 微核率 統計學(mg/kg)(只) (個)(個) (‰)檢驗*2500 雄性 44000 6 1.5＞0.52500 雌性 44000 5 1.2＞0.51000 雄性 44000 4 1.0＞0.51000 雌性 4 40005 1.2＞0.5500 雄性 4 40006 1.5＞0.5500 雌性 4 40007 1.8＞0.5250 雄性 4 40005 1.2＞0.5250 雌性 4 40006 1.5＞0.5陰性對照 雄性 4 40007 1.8(蒸餾水2000mg/kg) 雌性 4 40008 2.0陽性對照 雄性 4 40007719.20.01(環磷醯胺40mg/kg) 雌性 4 40007819.50.01陰陽性對照相比(經卡方檢驗)結論經統計學分析，樣品骨髓嗜多染紅細胞微核試驗，是為陰性。
三、黏膜刺激試驗1、目的通過眼刺激試驗來提示當眼一旦接觸該樣品後可能出現的危害情況。
2、樣品性狀透明液體，溶於水。
3、樣品處理樣品直接測試。
4、實驗動物紐西蘭種家兔，4隻，體重2-3kg，雌雄各半，由上海醫科大學實驗動物部提供。合格證號02-52-1。
5、實驗方法5.1將實驗動物一側眼瞼輕輕拉開，將0.1ml(g)受試物滴入(或放入)結膜囊中將上下眼瞼閉合數秒，另一側眼用生理鹽水作對照。
5.2滴眼後24h進行衝洗(刺激性強者，可在滴眼後30s衝洗)。
5.3分別於滴眼後6、24、48h和72h、4d、7d，對實驗動物眼睛進行檢查，按消毒技術規範(衛生部1991)進行黏膜刺激強度評價。
6、結果試驗動物黏膜刺激反應未見結膜刺激強度評價。動 部位 黏膜刺激反應積分物 6h 24h 48h72h 4d 7d編 樣 對 樣 對 樣 對 樣 對 樣 對 樣 對號1結膜 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 0 0 0 0 0 0總分 0 0 0 0 0 0 0 02結膜 0 0 0 0 0 0 0 0虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 0 0 0 0 0 0總分 0 0 0 0 0 0 0 03結膜 0 0 0 0 0 0 0 0
虹膜0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 04 結膜0 0 0 0 0 0 0 0虹膜0 0 0 0 0 0 0 0角膜0 0 0 0 0 0 0 0總分0 0 0 0 0 0 0 0總積分 0 0 0 0 0 0 0 0平均刺 0 0 0 0 0 0 0 0激指數黏膜刺激0 0 0 0 0 0 0 0分指數(I.A.0.1)18h後刺激 0 0 0 0 0 0 0 0平均指數( )7、結論本品黏膜刺激積分指數為0黏膜刺激平均指數48h後為是無刺激性。
本發明的溶葡萄球菌複合酶漱口水產品，經上海市疾病預防控制中心進行抑菌作用檢驗結果如下一、結果1、對大腸桿菌(8099)的抑菌作用濃度不同作用時間(min)抑菌率％(％) 1 2 3 5100 10010010010050 99.98 100100100注對照菌數為5.5×104cfu/ml。
2、對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)的抑菌作用濃度不同作用時間(min)抑菌率％(％) 1 2 3 5100 100 10010010050 99.98100100100注對照菌數為7.1×104cfu/ml。
3、對白色念珠菌(ATCC 10231)的抑菌作用濃度不同作用時間(min)抑菌率％(％) 12 3 5100 99.9910010010050 99.9799.99 100100注對照菌數為9.2×104cfu/ml。
4、對溶血性鏈球菌(32210)的抑菌作用濃度 不同作用時間(min)抑菌率％(％) 1 2 3 5100 10010010010050 99.99 100100100注對照菌數為9.5×104cfu/ml。
5、對厭氧菌(牙齦卟啉菌)的抑菌作用濃度 不同作用時間(min)抑菌率％(％) 1 2 3 5100 10010010010050 99.97 100100100注對照菌數為8.5×104cfu/ml。
6、現場試驗選10名志願者，在口腔上下牙齒用滅菌棉拭塗擦二次，將此棉拭放入10ml蛋白腖PBS，搖勻後取1ml放入滅菌平皿培養計數作為對照樣本(本底)。試驗時向口腔噴霧溶葡萄球菌複合酶口腔清潔液1分鐘，用滅菌棉拭按上法採樣培養計數。另外將產品稀釋成50％濃度50ml漱口1分鐘，按前法採樣培養計數。並做溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、厭氧菌培養。在試驗過程中，志願者未出現頭暈、嘔吐、腹瀉、過敏等不良反應。(1)噴霧法的殺菌作用噴霧法殺菌率(％)口腔牙齒細菌菌落數(cfu/ml)92.82 1.4×105(2)漱口法殺菌作用漱口法殺菌率(％)口腔牙齒細菌菌落數(cfu/ml)91.47 1.4×105注噴霧法、漱口法均未檢出溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、厭氧菌。
7、細菌學檢測檢測指標 結果 標準值細菌菌落總數(CFU/g)＜10 ＜20大腸菌群 未檢出不得檢出金黃色葡萄球菌未檢出不得檢出綠膿桿菌 未檢出不得檢出溶血性鏈球菌 未檢出不得檢出真菌 未檢出不得檢出二、評價本品50％濃度作用1分鐘對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、溶血性鏈球菌、厭氧菌均有較強的抑菌作用；經現場志願者試驗，對口腔噴霧、漱口，抑菌率分別為92.82％和91.47％。試驗後未檢出溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、厭氧菌。經細菌學檢測，符合GB15979-1995。
通過在多家醫院口腔科對牙周病、口腔黏膜潰瘍等口腔疾病的治療發現，溶葡萄球菌複合酶對口腔和牙齦急性炎症，有良好的治療作用。一般復發性口瘡的疼痛症狀，多數在2-3天內消失。牙周病患者的急性充血、腫脹等症狀在第一療程後也能消失，臨床還觀察到，本品對復發性口瘡，能明顯地延長緩解期，減少復發次數。因此，溶葡萄球菌複合酶是理想的治療口腔炎症疾患的藥物及口腔衛生用品。
山西醫科大學第二附屬醫院口腔科用溶葡萄球菌複合酶漱口水共治療316例口腔炎性疾患病例，其中包括口腔潰瘍90例，牙周炎79例，齒槽膿腫81例，舌炎21例，咽炎45例，有效297例，臨床總有效率達到93％。
上海市口腔病防治院對溶葡萄球菌複合酶漱口水治療冠周炎進行了研究發現，三天後本品對冠周炎的有效率為83.3％，三天後繼續用藥的21例病人均在治療後5-10天治癒。而對照組無一例完全治癒。
上海第二醫科大學口腔醫學院和上海市口腔醫學研究所對溶葡萄球菌複合酶漱口水預防牙齦炎的臨床試驗表明，本品可顯著降低牙齦炎患者的菌斑指數、牙齦指數和齦溝出血指數，試驗前後這三個指數有差異，本品可顯著改善牙齦炎患者的臨床症狀。
本發明的另一目的是提供了上述溶葡萄球菌複合酶漱口水的製備方法，該方法是在無菌室中，將溶葡萄球菌酶(從美國Sigma公司購買)，溶菌酶，山梨醇，磷酸鉀，氯化鈉，按比例依次加入潔淨的玻璃或不鏽鋼盛具中，輕輕攪拌，充分混和均勻後，再加入所示比例的香精和蒸餾水，充分混勻，灌裝於塑料瓶或金屬瓶中，入庫，室溫保存即可。
本發明的產品具有以下特點1、它能迅速而有效地殺滅引起口腔感染的葡萄球菌、溶血性鏈球菌、白色念珠菌、厭氧菌等細菌。
2、不易產生抗藥性，對口腔黏膜無刺激和其他副作用。
3、穩定性好。
由於以上優點，本發明產品可在臨床廣泛使用。
實例 每製造100克溶葡萄球菌複合酶漱口水的配製方法。
1、先分別將溶葡萄球菌酶0.0032克，溶菌酶15克，山梨醇7克，磷酸鉀9克，氯化鈉0.8克混勻，再加入薄荷香精0.1克和蒸餾水65.6ml，混勻灌裝。該配方對金黃色葡萄球菌殺菌率99.9％2、先分別將溶葡萄球菌酶0.004克，溶菌酶7克，山梨醇7克，磷酸鉀10克，氯化鈉1克混勻，再加入檸檬香精0.1克和蒸餾水71.9ml，混勻灌裝。該配方對金黃色葡萄球菌殺菌率99.5％3、先分別將溶葡萄球菌酶0.005克，溶菌酶10克，山梨醇6克，磷酸鉀7克，氯化鈉0.5克混勻，再加入芒果香精0.05克和蒸餾水73.45ml，混勻灌裝。該配方對金黃色葡萄球菌殺菌率99.3％。
權利要求
1.一種溶葡萄球菌複合酶漱口水製劑，其特徵在於該製劑是由溶葡萄球菌複合酶與藥用輔料組成的，其中主要成分為溶葡萄球菌酶0.003～0.007％、溶菌酶5～15％、藥用輔料為山梨醇5～8％、磷酸鉀7～10％、氯化鈉0.5～1％、香精0.1％、蒸餾水65～82％。
2.一種如權利要求1所述的一種溶葡萄球菌複合酶漱口製劑的製備方法，其特徵在於該方法是在無菌室中，將溶葡萄球菌酶，溶菌酶，山梨醇，磷酸鉀，氯化鈉，按比例依次加入潔淨的玻璃或不鏽鋼盛具中，輕輕攪拌，充分混和均勻後，再加入所示比例的香精和蒸餾水，充分混勻，灌裝於塑料瓶或金屬瓶中，入庫，室溫
全文摘要
本發明提供了一種溶葡萄球菌複合酶漱口水製劑,該製劑是以溶葡萄球菌複合酶與藥用輔料組成的。能有效治療葡萄球菌、溶血性鏈球菌、白色念株菌、厭氧菌等細菌引起的口腔疾病,無毒副作用,不產生抗藥性,穩定性好,可廣泛用於臨床。
文檔編號A61P31/04GK1360886SQ0013720
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月28日 優先權日2000年12月28日
發明者陸婉英 申請人:上海高科生物工程有限公司