可溶性共同刺激分子增強免疫應答的用途的製作方法

2023-06-18 12:25:36

專利名稱：可溶性共同刺激分子增強免疫應答的用途的製作方法
相關申請本申請要求1999年5月6日提交的美國臨時申請第60/132,944號的優先權，其內容全文引用在此作為參考文獻。
背景技術：
T細胞為了響應外來蛋白質，抗原呈遞細胞(APC)必須向靜息T淋巴細胞提供兩種信號(Jenkins，M.和Schwartz，R.(1987)《實驗醫學雜誌》165，302-319；Mueller，D.L.等(1990)《免疫學雜誌》144，3701-3709)。第一種信號賦予免疫應答以特異性，它是在呈遞在主要組織相容性複合物(MHC)中的外來抗原肽的識別之後經由T細胞受體(TCR)轉導的。第二種信號稱為共同刺激，誘導T細胞增殖而成為功能性的(Lenschow等1996《免疫學年評》14233)。共同刺激既不是抗原特異性的，也不是MHC限制性的，據認為它是由一種或多種被APC表達的不同細胞表面分子所提供的(Jenkins，M.K.等1988《免疫學雜誌》140，3324-3330；Linsley，P.S.等1991《實驗醫學雜誌》173，721-730；Gimmi，C.D.等1991《美國國家科學院院報》88，6575-6579；Young，J.W.等1992《臨床研究雜誌》90，229-237；Koulova，L.等1991《實驗醫學雜誌》173，759-762；Reiser，H.等1992《美國國家科學院院報》89，271-275；van-Seventer，G.A.等(1990)《免疫學雜誌》144，4579-4586；LaSalle，J.M.等1991《免疫學雜誌》147，774-80；Dustin，M.I.等1989《實驗醫學雜誌》169，503；Armitage，R.J.等1992《自然》357，80-82；Liu，Y.等1992《實驗醫學雜誌》175，437-445)。如果T細胞是僅通過T細胞受體而被刺激的，沒有接收另外的共同刺激信號，那麼它們會成為無應答性的、無反應性的，或者死亡，導免疫應答的下調。
在APC上表達的CD80(B7-1)與CD86(B7-2)蛋白是決定性的共同刺激分子(Freeman等1991《實驗醫學雜誌》174625；Freeman等1989《免疫學雜誌》1432714；Azuma等1993《自然》36676；Freeman等1993《科學》262909)。B7-2似乎在初次免疫應答期間扮演主要角色，而B7-1在免疫應答過程後期受到上調，它可能對延長初次T細胞應答或共同刺激再次T細胞應答來說是重要的(Bluestone，1995《免疫》2555)。
一種與B7-1和B7-2結合的配體是CD28，它在靜息T細胞上組成型表達，在活化之後表達增加。通過T細胞受體發信號之後，CD28的連接反應和共同刺激信號的轉導誘導T細胞增殖和分泌IL-2(Linsley，P.S.等1991《實驗醫學雜誌》173，721-730；Gimmi，C.D.等1991《美國國家科學院院報》88，6575-6579；June，C.H.等1990《今日免疫學》11，211-6；Harding，F.A.等1992《自然》356，607-609)。第二種配體稱為CTLA4(CD152)，它與CD28是同源的，但不在靜息T細胞上表達，而出現在T細胞活化之後(Brunet，J.F.等1987《自然》328，267-270)。與CD28相反，CTLA4似乎對T細胞應答的負調節來說是決定性的(Waterhouse等1995《科學》270985)。CTLA4的阻斷已經發現可除去抑制信號，而CTLA4的聚集已經發現可提供下調T細胞應答的抑制信號(Allison和Krummel，1995《科學》270932)。
對開發增強免疫應答的方法一直存在迫切需要。例如，迄今為止利用本領域公認的方法還難以增加對某些病毒和腫瘤細胞的免疫應答。用於普遍增強免疫應答、特別是增強對腫瘤抗原和感染因子(例如病毒、細菌和/或寄生物抗原)的應答將大有裨益。
發明概述本發明提供通過操縱共同刺激途徑增強免疫應答的方法。這些方法對增加對腫瘤抗原和來自感染因子的抗原的應答來說是特別有效的。本發明至少在部分程度上基於這樣的發現，共同刺激分子的可溶形式能夠預防性和治療性增強免疫應答。儘管本發明的可溶性共同刺激分子不是在固相上給藥的(例如不是在細胞上給藥的)，而且是在沒有交聯劑的存在下給藥的，也見到了這種增強作用。這些發現是特別驚人的，因為根據現有教導，B7-1和B7-2分子的可溶形式不能產生共同刺激應答(Hayden等1996《組織抗原》48242；U.S.專利5,580,756)。
因此，本發明在一方面提供預防性增強受治療者對抗原的免疫應答的方法，即，將包含共同刺激分子的細胞外結構域的可溶性組合物給藥，以便增強該受治療者對該抗原的免疫應答。
本發明在另一方面提供治療性增強受治療者對抗原的免疫應答的方法，即，將包含共同刺激分子的細胞外結構域的可溶性組合物給藥，以便增強該受治療者對該抗原的免疫應答。
在一種實施方式中，該共同刺激分子選自由B7-1和B7-2組成的組。
另一方面，本發明提供增強受治療者對I類限制性抗原的CD8+T細胞應答的方法，即，將包含I類限制性抗原或其片段的第一種試劑和包含B7分子的細胞外結構域的可溶性組合物給藥，以便一旦對該受治療者給藥即增強對I類限制性抗原的CD8+T細胞應答。
在一種實施方式中，這些方法進一步包括將II類限制性抗原對該受治療者給藥。在另一種實施方式中，這些方法進一步包括將佐劑對該受治療者給藥。
在一種實施方式中，該B7分子是B7-1分子。在另一種實施方式中，該B7分子是B7-2分子。
在一種實施方式中，該共同刺激分子是單特異性的。在另一種實施方式中，該共同刺激分子是二聚體和二價的。在一種實施方式中，該可溶性共同刺激分子是單特異性的和二聚體和二價的。
在本發明的另外一種實施方式中，B7分子的細胞外部分是與包含免疫球蛋白分子一部分的第二種蛋白質或多肽融合的。在一種實施方式中，該部分免疫球蛋白分子包含半胱氨酸殘基。在一種實施方式中，該部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區、CH2與CH3區。在另一種實施方式中，該部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區、CH1、CH2與CH3區。在一種實施方式中，該免疫球蛋白分子已經經過修飾，減少了補體固定和/或Fc受體結合。
在一種實施方式中，該抗原是腫瘤細胞抗原。
在另一種實施方式中，該受治療者患有選自下組類型的癌癥結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肥大細胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
在一種實施方式中，該抗原選自由細菌抗原、病毒抗原和寄生物抗原組成的組。
在一種實施方式中，該免疫應答是細胞免疫應答。在另一種實施方式中，該免疫應答是體液免疫應答。
圖例說明

圖1顯示用II類限制肽免疫小鼠細胞的抗原特異性增殖應答，同時有或沒有B7-2Ig(100μg)的共同給藥。
圖2顯示在初次免疫時接受單一B7-2Ig治療的小鼠細胞在再次免疫後比從未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的增殖應答。數據來自平行實驗。
圖3顯示B7-2Ig的共同給藥增強對I類限制肽免疫的CTL應答。
圖4顯示在有或沒有II類限制肽和B7-2Ig治療的存在下，用I類限制肽免疫小鼠的CTL應答。
圖5顯示B7-IgG為脾細胞的體外增殖和淋巴因子分泌提供共同刺激信號。
圖6顯示B7Ig在預防性腫瘤疫苗模型中是有效的佐劑。
圖7顯示用混合有B7-1-或B7-2-IgG的輻射處理P815腫瘤細胞治療性接種小鼠誘導腫瘤消退，延長存活期。
圖8顯示用以B7-IgG作為佐劑的治療性輻射處理腫瘤細胞疫苗免疫小鼠對若干不同的小鼠腫瘤模型是有效的。
圖9顯示單獨的B7-IgG的治療性給藥對小鼠的抗腫瘤作用與其作為疫苗佐劑的作用相當。
圖10顯示T或B細胞是B7-IgG-介導的抗腫瘤活性所需的。
圖11顯示CD8+、而非CD4+T細胞是介導B7-IgG抗腫瘤活性所需的。
圖12顯示已建立腫瘤的B7-IgG療法與宿主IFN-γ無關。
詳細說明本發明提供增強免疫應答的改進方法，即，將可溶性共同刺激分子(例如B7分子的細胞外結構域或B7融合蛋白)給藥，從而增強免疫應答。可溶性共同刺激分子在給藥時沒有交聯劑，仍然驚人地刺激T細胞應答。事實上，申請人已經發現，本方法比呈遞在表面上的共同刺激分子增加了共同刺激水平，例如細胞表面上的共同刺激分子。
在發明的進一步說明之前，為了方便起見，這裡收集了用在說明書、實施例和附後權利要求書中的某些術語。
I、定義本文所用的術語「預防性」包括共同刺激分子在接觸抗原之前或與此同時給藥，針對該抗原形成、增加和/或增強免疫應答。
本文所用的術語「治療性」包括共同刺激分子給藥治療現有或進行中的感染或疾病(例如癌症或者病毒或細菌感染)，用共同刺激分子治療將對該感染或疾病有益。關於治療性處理，將共同刺激分子在接觸抗原之後某一時間點給藥，針對該抗原形成、增加和/或增強免疫應答。不言而喻，用共同刺激分子治療性處理對受治療者的免疫應答還可能具有其他有益效果，例如不是該特定抗原所特有的。
本文所用的術語「免疫細胞」包括造血起源的並且在免疫應答中扮演角色的細胞。免疫細胞包括淋巴細胞，例如B細胞和T細胞；自然殺傷細胞；骨髓細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、嗜曙紅細胞、肥大細胞、嗜鹼細胞和粒細胞。
本文所用的術語「免疫應答」包括T和/或B細胞應答，也就是細胞和/或體液免疫應答。在一種實施方式中，所要求保護的方法可以用於減少T輔助細胞應答。在另一種實施方式中，所要求保護的方法可以用於減少細胞毒性T細胞應答。所要求保護的方法可以用於減少初次與再次免疫應答。受治療者的免疫應答例如可以通過測定抗體產生、免疫細胞增殖、細胞因子的釋放、細胞表面標記物的表達、細胞毒性等加以測定。
本文所用的關於活化免疫細胞的術語「共同刺激」包括共同刺激分子提供第二種非活化受體介導信號(「共同刺激信號」)的能力，該信號誘導增殖或效應器功能。例如，共同刺激信號能夠例如在已經接受T細胞受體介導信號的T細胞中導致細胞因子分泌。本文所用的術語「共同刺激分子」包括存在於抗原呈遞細胞上的分子(例如B7-1、B7-2、B7RP-1(Yoshinaga等1999《自然》402827)、B7h(Swallow等1999《免疫》11423)和/或有關分子(例如同系物))，它們與T細胞上的共同刺激受體(例如CD28、CTLA4、ICOS(Hutloff等1999《自然》397263)、B7h配體(Swallow等1999《免疫》11423)和/或有關分子)。本文也將這些分子總稱為「B7分子」。
本文所用的措辭「B7」或「B7分子」包括天然存在的B7-1分子、B7-2分子、B7RP-1分子(Yoshinaga等1999《自然》402827)、B7h分子(Swallow等1999《免疫》11423)、結構上有關的分子、這些分子的片段和/或其功能等價物。術語「等價物」試圖包括編碼功能相當的共同刺激分子的胺基酸序列，它們具有B7分子的活性，例如與免疫細胞上的天然B7配體結合的能力，例如T細胞上的CTLA4、ICOS和/或CD28，和/或調製免疫細胞共同刺激的能力。
本文所用的「多肽」指的是任意包含兩個或多個胺基酸的肽或蛋白質，這些胺基酸通過肽鍵或改性肽鍵彼此連接。「多肽」指的是短鏈，通常稱為肽、寡肽和寡聚物，和長鏈，一般稱為蛋白質。多肽可以含有除20種基因編碼胺基酸以外的胺基酸。「多肽」不僅包括經過自然過程修飾的那些，例如加工和其他轉譯後修飾，而且包括經過化學修飾技術修飾的那些。這樣的修飾充分描述在基礎文章和更詳細的專著以及長篇研究文獻中，它們是本領域技術人員所熟知的。人們將領會到，在給定的多肽中，相同類型的修飾可以在相同或不同程度上存在於若干位置上。而且，給定的多肽可以含有多種類型的修飾。修飾可以發生在多肽中的任意各處，包括多肽骨架、胺基酸側鏈和氨基或羧基末端。修飾例如包括乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂醯肌醇的共價連接、交聯、環化、二硫鍵生成、去甲基化、共價交聯的生成、半胱氨酸的生成、焦穀氨酸鹽的生成、甲醯化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨定物生成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯基化、外消旋化、脂質連接、硫酸化、穀氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化與ADP-核糖基化、硒酸化、轉運RNA介導的胺基酸加成為蛋白質(例如精氨醯化)和遍在蛋白化。例如參見《蛋白質——結構與分子性質》第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Wold，F.「轉譯後的蛋白質修飾觀點與展望」，《蛋白質的轉譯後共價修飾》pgs.1-12，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter等《酶學方法》182626-646(1990)；Rattan等「蛋白質合成轉譯後修飾與老化」《Ann.N.Y.Acad.Sci.》66348-62(1992)。多肽可以是支鏈的或者是帶有或不帶有分支的環狀。環狀、支鏈和帶有分支的環狀多肽可以從轉譯後的自然過程獲得，也可以完全利用合成方法製備。
本文所用的「分離的多肽」或「分離的蛋白質」指的是這樣的多肽或蛋白質，當從細胞中分離後或者用重組DNA技術生產時，基本上不含其他多肽、蛋白質、細胞材料和培養基，或者當用化學方法合成時，基本上不含化學前體或其他化學品。「分離的」或「純化的」多肽或其生物活性部分基本上不含來自該細胞或衍生B7多肽的組織來源的細胞材料或其他汙染性多肽，或者當用化學方法合成時，基本上不含化學前體或其他化學品。措辭「基本上不含細胞材料」包括其中該多肽是從該細胞的細胞組分中分離的B7多肽製劑，從該細胞分離或者用重組方法生產該多肽。在一種實施方式中，措辭「基本上不含細胞材料」包括非B7多肽(本文也稱為「汙染性多肽」)少於約30％(以乾重計)的B7多肽製劑，更優選為非B7多肽少於約20％，進而更優選為非B7多肽少於約10％，最優選為非B7多肽少於約5％。當B7多肽或其生物活性部分是用重組方法生產的時，它還優選地基本上不含培養基，也就是說，培養基佔多肽製劑體積的不到約20％，更優選為少於約10％，最優選為少於約5％。
措辭「基本上不含化學前體或其他化學品」包括其中該多肽是從參與該多肽合成的化學前體或其他化學品中分離的B7多肽製劑。在一種實施方式中，措辭「基本上不含化學前體或其他化學品」包括化學前體或非B7化學品少於約30％(以乾重計)的B7多肽製劑，更優選為化學前體或非B7化學品少於約20％，進而更優選為化學前體或非B7化學品少於約10％，最優選為化學前體或非B7化學品少於約5％。
優選的B7核酸分子與多肽是「天然存在的」。本文所用的「天然存在的」分子指的是具有天然存在的核苷酸序列(例如編碼天然B7多肽)的B7分子。另外，還有這些多肽與核酸分子的天然或非天然存在的變體，它們保留了相同的功能活性，例如調製對應激反應的適應作用和/或微生物毒力的能力。這樣的變體可以這樣製備，例如利用本領域熟知的技術進行突變。作為替代選擇，變體可以用化學方法合成。
本文所用的術語「變體」包括這樣的核酸分子或多肽，它們在序列上不同於參照核酸分子或多肽，但是保留其必要性質。變體核苷酸序列的變化可能改變、也可能不改變被參照核酸分子編碼的多肽的胺基酸序列。核苷酸的變化可以導致在被參照序列編碼的多肽中發生胺基酸的取代、加成、刪去、融合和截斷，討論見下。典型的多肽變體在胺基酸序列上不同於另一種參照多肽。差異一般是有限的，以致參照多肽與變體的序列總的說來是非常相似的，並且在很多區域是同一的。變體和參照多肽在胺基酸序列上可以通過任意組合的一種或多種取代、加成和/或刪去加以區別。核酸分子或多肽的變體可以是天然存在的，例如等位變體，或者它可以是未知是否天然存在的變體。非天然存在的核酸分子與多肽變體可以通過技術人員已知的誘變技術、直接合成和其他重組方法加以製備。
例如，不言而喻的是，本文所述的B7多肽還包括其等價物。這樣的變體例如可以這樣製備，利用本領域已知的方法進行突變。作為替代選擇，變體可以用化學方法合成。例如，利用本領域熟知的技術可以製備B7多肽的突變形式，它們在功能上是等價的(例如具有與CTLA4和/或CD28結合的能力)。突變例如可以包括至少一種分散的點突變，後者可以引起取代，或者包括至少一種刪去或插入。例如，可以使用隨機誘變。突變還可以通過隨機誘變或者利用盒式誘變來完成。關於前者，分子的完整編碼區被若干方法(化學、PCR、摻雜寡核苷酸合成)之一誘變，對隨機突變的分子集合進行選擇或篩選操作。關於後者，對相當於所定義的結構或功能決定子的多肽分散區進行飽和或半隨機誘變，再將這些被誘變的盒重新引入到其他野生型等位基因構造中。在一種實施方式中，可以使用PCR誘變。例如，可以使用大引物PCR(O.H.Landt，1990《基因》96125-128)。
本文所用的術語「增強免疫應答」包括利用所要求保護的方法治療受治療者，增加T和/或B細胞應答，即細胞和/或體液免疫應答。在一種實施方式中，所要求保護的方法可以用於增強T輔助細胞應答。在另一種實施方式中，所要求保護的方法可以用於增強細胞毒性T細胞應答。所要求保護的方法可以用於增強初次與再次免疫應答。優選地，當與未經治療的受治療者或者未用所要求保護的方法治療的受治療者相比，所要求保護的方法增加受治療者的免疫應答。免疫應答的增加例如可以表現為一旦用所要求保護的方法治療後，受治療者免疫細胞對抗原的應答增加。受治療者的免疫應答例如可以利用各種體外或體內免疫細胞活化作用測量加以測定，例如測定抗體產生、免疫細胞增殖、細胞因子的釋放、細胞表面標記物的表達、細胞毒性等。
本文所用的術語「可溶性」包括不與細胞締合的分子，例如共同刺激分子。從細胞締合分子衍生的可溶性共同刺激分子保留了前者的功能，也就是說它們能夠與T細胞上的關連配體結合，經由T細胞上的CD28和/或CTLA4介導信號轉導，不過，它們是可溶性的，也就是不與膜結合的。優選地，可溶性組合物包含B7分子的細胞外結構域。
本文所用的術語「共同刺激分子的細胞外結構域」包括共同刺激分子的一部分，它在共同刺激分子的細胞締合形式中是細胞外的。優選地，共同刺激分子的細胞外結構域包含B7分子的細胞外結構域。B7細胞外結構域包括共同刺激分子介導與CD28和/或CTLA4結合的部分。例如，人B7-1細胞外結構域包含成熟型B7-1的約胺基酸1至約胺基酸208(SEQ ID NO1)，人B7-2細胞外結構域包含成熟型B7-2的約胺基酸24至約胺基酸245(SEQ ID NO2)。在一種實施方式中，可溶性共同刺激分子包含B7分子的細胞外結構域，進一步包含信號序列。
本文所用的術語「I類限制抗原」包括這樣的抗原，它與主要組織相容性複合物(MHC)I類溝結合，並且在MHC I類分子構造中被呈遞給T細胞。I類限制抗原主要刺激CD8+T細胞。本文所用的術語「II類限制抗原」包括這樣的抗原，它與MHC II類溝結合，並且在MHC II類分子構造中被呈遞給T細胞。II類限制抗原主要刺激CD4+T細胞。
本文所用的術語「佐劑」包括強化對抗原的免疫應答的試劑。佐劑可以與共同刺激分子聯合給藥，以另外增加免疫應答。
本文所用的術語「單特異性」包括僅具有一種特異性的可溶性共同刺激分子，也就是說，它們與T細胞上的關連配體結合，例如CD28或CTLA4。這樣的單特異性試劑還不包括另外的特異性，因而不以定向方式與其他細胞表面分子結合。本文所用的術語「寡特異性」包括具有一種以上特異性的可溶性共同刺激分子，例如對除B7配體以外的分子具有另外的特異性，例如對細胞表面分子的特異性，例如腫瘤細胞抗原或T細胞受體。本文所用的術語「二價」包括每個可溶性共同刺激分子具有兩個結合位點，用於與其關連配體、例如CD28和/或CTLA4發生相互作用。本文所用的術語「二聚體」包括以同型二聚體存在的可溶形式，也就是由兩個相同的亞單位組成的單位，二者例如通過二硫鍵連接在一起。本文所用的術語「多聚的」包括具有兩個以上亞單位的可溶形式。
II、可溶性共同刺激分子B7抗原是在B淋巴細胞、專業的抗原呈遞細胞(例如單核細胞、樹狀細胞、朗格罕氏細胞)和向免疫細胞呈遞抗原的細胞(例如角質形成細胞、內皮細胞、星形細胞、成纖維細胞、少突膠質細胞)表面上發現的一類共同刺激分子。這些共同刺激分子與T細胞表面上的CTLA4、CD28和/或ICOS或者免疫細胞上其他已知或尚不明確的受體結合。這類共同刺激分子的成員能夠向活化的T細胞提供共同刺激作用，從而誘導T細胞增殖和/或細胞因子分泌。
人們已經確立了B7分子的純化技術，另外已經從許多物種克隆了B7基因(cDNA)，包括人和小鼠(例如參見Freeman，G.J.等(1993)《科學》262909-911；Azuma，M.等(1993)《自然》36676-79；Freeman，G.J.等(1993)《實驗醫學雜誌》1782185-2192)。
共同刺激分子的核苷酸序列是本領域已知的，可以在文獻或資料庫中找到，例如GenBank。例如參見B7-2(Freeman，G.J.等1993《科學》262909或GenBank入藏號P42081或A48754)、B7-1(Freeman等《實驗醫學雜誌》1991.174625或GenBank入藏號P33681或A45803)、CTLA4(例如參見Ginsberg等1985《科學》2281401或GenBank入藏號P16410或291929)、CD28(Aruffo和Seed《美國國家科學院院報》848573或GenBank入藏號180091)、ICOS(Hutloff等1999《自然》397263；WO 98/38216)和相關的序列。
除了共同刺激分子的天然存在形式以外，術語「共同刺激分子」還包括非天然存在的形式，例如共同刺激分子的變體或突變體形式，它們保留有共同刺激分子的功能，例如與關連反受體結合的能力。例如，在避免與非共同刺激分子基因雜交的條件下(例如在等價於65℃5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M檸檬酸鈉)的條件下)，能夠與編碼B7分子的DNA雜交的DNA序列可以用於製備抗B7抗體。作為替代選擇，在核酸分子編碼蛋白質結構域的區域保留序列同一性的DNA序列可以用於生產可用作免疫原的共同刺激蛋白，這些蛋白質結構域對共同刺激分子的功能來說是重要的，例如與其他共同刺激分子結合。優選地，非天然存在的共同刺激分子與天然存在的共同刺激分子細胞外結構域的胺基酸序列具有顯著的胺基酸同一性(例如大於70％，優選為大於80％，更優選為大於90-95％)。
為了測定可能對共同刺激分子與其反受體結合來說是重要的共同刺激分子的胺基酸殘基，可以對比包含不同物種、例如小鼠和人的共同刺激分子的細胞外結構域的胺基酸序列，記錄保守的(例如同一的)殘基。例如這可以利用任意的標準對比程序進行，例如MegAlign(DNASTAR)。這樣的對比程序詳細描述如下。這類保守或同一的殘基對共同刺激分子與其受體的正確結合來說可能是必要的，因而不可能會改變。
例如，對介導與CD28和CTLA4的功能相互作用來說是重要的B7-1分子區域已經通過突變進行了鑑別。B7-1V-樣結構域中的兩個疏水性殘基、包括在從各種物種克隆的所有B7-1與B7-2分子中都是保守的Y87殘基，被發現是決定性的(Fargeas等1995《實驗醫學雜誌》182667)。利用這些或相似的技術，可以測定決定性共同刺激分子的細胞外結構域的胺基酸殘基，它們是決定性的，因此不會改變。
使用B7 cDNA分子，具有B7活性的肽可以利用標準技術加以生產。為表達肽而被轉染的宿主細胞可以是任意的原核細胞或真核細胞。例如，具有B7活性的肽可以在下列細胞內被表達細菌細胞、例如大腸桿菌，昆蟲細胞(杆狀病毒)，酵母，或哺乳動物細胞、例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和NS0細胞。其他適合的宿主細胞和表達載體可以參見Goeddel，(1990)，見上，或者是本領域技術人員已知的。釀酒酵母內的表達載體實例包括pYepSecl(Baldari等(1987)《歐洲分子生物學組織雜誌》6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)《細胞》30933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)《基因》54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。在所培養的昆蟲細胞(SF9細胞)內可用於蛋白質表達的杆狀病毒載體包括pAc系列(Smith等(1983)《分子細胞生物學》32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.D.，(1989)《病毒學》17031-39)。一般地，COS細胞(Gluzman，Y.，(1981)《細胞》23175-182)與諸如pCDM8等載體(Seed，B.，(1987)《自然》329840)聯合用於哺乳動物細胞內的短暫擴增/表達，而CHO(中國倉鼠卵巢)細胞與諸如pMT2PC等載體(Kaufman等(1987)《歐洲分子生物學組織雜誌》6187-195)用於哺乳動物細胞內的穩定擴增/表達。優選用於重組蛋白質生產的細胞系是NS0骨髓瘤細胞系，可從ECACC獲得(目錄#85110503)，描述在Galfre，G.和Milstein，C.中((1981)《酶學方法》73(13)3-46；和《單克隆抗體的製備策略與操作》AcademicPress，N.Y.，N.Y.)。載體DNA可以經由常規技術引入到哺乳動物細胞內，例如磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質轉染試劑或電穿孔。適合於轉化宿主細胞的方法可以參見Sambrook等(《分子克隆實驗室手冊》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他實驗室教科書。當用在哺乳動物細胞內時，表達載體的控制功能經常由病毒材料提供。例如，常用的啟動子是從多瘤、腺病毒2、巨細胞病毒衍生的，最常見的是猿病毒40。
在哺乳動物細胞或其他細胞內被表達的具有B7活性的肽可以按照本領域的標準操作進行純化，包括硫酸銨沉澱、分級柱色譜(例如離子交換、凝膠過濾、電泳、親和色譜等)，最後包括結晶(一般參見「酶的純化與相關技術」《酶學方法》22233-577(1971))。
用於製備本方法所用可溶性B7分子的B7分子可以來源於任意哺乳動物物種，優選為人。若干來源B7分子的核苷酸序列是本領域已知的。人B7-1的完整DNA序列(CD80)的GenBank入藏號為L25259，公布在Freeman等《科學》1993，2629090或Azuma等《自然》1993，36676中(另見WO 96/40915關於B7-1和B7-2的序列)。人B7-1和人B7-2的核苷酸序列還如SEQ ID Nos 1與2(B7-1)和SEQ ID Nos 3與4(B7-2)所示。作為替代選擇，這樣一種序列可以這樣測定，基於序列與已知的、例如人B7序列雜交的能力，從所需來源分離B7核酸分子。例如，可以檢測B7分子在高或低嚴格條件下與已知編碼具有B7活性的肽的核酸分子雜交的能力。適當的促進DNA雜交的嚴格條件例如在約45℃下的6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然後在50℃下用2.0×SSC洗滌，這些條件是本領域技術人員已知的，或者可以參見《分子生物學流行方案》JohnWiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從約2.0×SSC 50℃的低嚴格條件到0.2×SSC 50℃的高嚴格條件中加以選擇。另外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫約22℃的低嚴格條件增加到約65℃的高嚴格條件。在優選的實施方式中，B7分子是人B7分子。
在一種實施方式中，可溶性共同刺激分子是從天然存在的B7-1或B7-2分子衍生的。具有如本文所述B7分子活性、並且因遺傳密碼的簡併性而具有不同於天然存在B7分子的序列的多肽也可以以可溶形式被表達，也屬於本發明的範圍。這樣的核酸編碼功能上等價於B7的多肽(例如具有B7活性的多肽)，但是在序列上不同於本領域已知的B7-1或B7-2。例如，大量胺基酸由一個以上三聯體命名。由於遺傳密碼的簡併性，可能存在指定相同胺基酸的密碼子或同義密碼子(例如CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子)。作為一個實例，B7分子核苷酸序列內(尤其在密碼子的第三個鹼基內)的DNA序列多態性可能導致DNA中的「沉默」突變，這並不影響所編碼的胺基酸。不過，預期在某一種群內將存在確實引起B7抗原胺基酸序列改變的DNA序列多態性。本領域技術人員將認識到，由於天然的等位基因變異，在某一種群個體中可能存在編碼具有新穎B淋巴細胞抗原活性的肽的核酸的一種或多種核苷酸中的這些變異(高達核苷酸的約3-4％)。這樣的核苷酸變異和所致胺基酸多態性也屬於本發明的範圍。此外，還可能存在一種或多種同種型或有關的交叉反應性B7分子。
除了天然存在的等位基因變體以外，本發明範圍內的B7分子可以利用本領域公認的技術進行製備。在另一種實施方式中，可溶性共同刺激分子是B7-1或B7-2的修飾形式，它保留了B7共同刺激分子的功能，也就是在功能上是完全相同的。B淋巴細胞抗原的DNA序列經過遺傳技術修飾，可以產生胺基酸序列改變了的蛋白質或多肽。這樣的序列視為屬於本發明的範圍，其中被表達的多肽能夠與CTLA4和/或CD28結合，並且調製T細胞介導的免疫應答和免疫功能。
例如，在一種實施方式中，按照大量方法的任意一種可以向DNA分子中引入突變，包括用於產生簡單的刪去或插入、有系統的刪去、鹼基簇的插入或取代或者單一鹼基的取代，生成B淋巴細胞抗原DNA的變體或修飾後的等價物。例如，B7-1或B7-2 cDNA序列的改變、例如胺基酸的取代或刪去優選地是通過定向誘變而獲得的。定向誘變系統是本領域熟知的。方案和試劑在商業上可以從Amersham International PLC，Amersham，U.K.獲得。
具有B7分子活性、也就是具有與B7分子的天然配體結合併且調製T細胞介導免疫應答的能力的修飾後的多肽視為屬於本發明的範圍，這種能力例如由已經接收初級活化信號的T細胞的細胞因子產生和/或T細胞增殖作用所證實。
具有B7分子活性的肽的另一種修飾實例是半胱氨酸殘基優選地被丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或穀氨酸殘基取代，以減少經由二硫鍵的二聚作用。另外，具有B7活性的肽的胺基酸側鏈可以用化學方法修飾。另一種修飾是肽的環化。
為了增強穩定性和/或反應性，具有B7活性的多肽經過修飾，可以在抗原胺基酸序列中摻入一種或多種多態性，這是由任意天然的等位基因變異所引起的。另外，D-胺基酸、非天然胺基酸或非胺基酸類似物經過取代或加成，可以產生屬於本發明範圍的修飾後的蛋白質。此外，按照A.Sehon及合作者的方法(Wie等，同上)，肽可以用聚乙二醇(PEG)修飾，產生與PEG共軛結合的肽。另外，可以在肽的化學合成期間加入PEG。肽的其他修飾包括還原/烷基化(Tarr《蛋白質微特性化方法》J.E.Silver ed.，Humana Press，Clifton NJ 155-194(1986))；醯化(Tarr，同上)；與適當載體的化學偶聯(Mishell和Shiigi，eds《細胞免疫學精選方法》WH Freeman，San Francisco，CA(1980)，美國專利4,939,239)或稀福馬林處理(Marsh(1971)《國際變態反應與應用免疫學文獻》41199-215)。
優選的B7多肽具有B7活性，並且與天然存在的B7胺基酸序列具有至少約60％的同一性，優選為至少約70％的同一性，更優選為至少約80％的同一性。具有B7活性、並且與天然存在的B7分子具有至少約90％同一性、優選為至少約95％、更優選為至少約98-99％同一性的多肽也屬於本發明的範圍。術語在給定位置上的胺基酸「同一性」指的是當對比兩種肽的胺基酸序列時，在對應位置上具有相同的胺基酸。若所比較的序列中某一位置被相同的胺基酸佔據，則分子在該位置上是同一的。序列之間同一性的程度(或百分率)是由這些序列共享的匹配或同一位置數量的函數。
本領域普通技術人員能夠輕易對比兩種胺基酸序列，以提供生物學有義對比。序列的比較和兩種序列之間同一性百分率的測定還可以利用數學算法來完成。在一種實施方式中，兩種胺基酸序列之間的同一性百分率是利用Needleman和Wunsch(《分子生物學雜誌》(48)444-453(1970))算法測定的，該算法已經結合在GCG軟體包(可從http//www.gcg.com獲得)中的GAP程序內，採用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，間距權重為16、14、12、10、8、6、5或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。在另外一種實施方式中，兩種核苷酸序列之間的同一性百分率是利用GCG軟體包(可從http//www.gcg.com獲得)中的GAP程序測定的，採用NWSgapdna.CMP矩陣，間距權重為40、50、60、70或80，長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一種實施方式中，兩種胺基酸或核苷酸序列之間的同一性百分率是利用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS，411-17(1989))測定的，該算法已經結合在ALIGN程序(2.0版)內，採用PAM120權重殘基表，缺口長度補償為12，缺口補償為4。
本發明的核酸與蛋白質序列可以進一步用作「查詢序列」，以在公用資料庫內例如對其他家族成員或有關序列進行檢索。這樣的檢索可以利用Altschul等(1990)《分子生物學雜誌》215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行。BLAST核苷酸檢索可以利用NBLAST程序、得分＝100、字長＝12進行，以得到與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以利用XBLAST程序、得分＝50、字長＝3進行，以得到與本發明B7蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了得到帶有缺口的對比以利比較，可以採用Gapped BLAST，如Altschul等(1997)《核酸研究》25(17)3389-3402所述。當採用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
「B7分子的至少一部分細胞外結構域」被定義為這樣一種胺基酸序列，它包含B7的完整細胞外結構域序列或其一部分，該序列編碼具有活性(也就是與免疫細胞上的天然B7配體結合的能力，例如與T細胞上的CTLA4和/或CD28結合)的多肽。具有B7活性的肽結合CTLA4和/或CD28，調製T細胞介導的免疫應答，這例如得到與這些配體結合或者誘導細胞因子產生和/或已經接收初級活化信號的T細胞增殖作用的證實，如附後實施例所示。在優選的實施方式中，「B7分子的至少一部分細胞外結構域」包括這樣一種多肽，它包含人B7抗原的完整細胞外部分(例如B7-1序列的大約第1-208個胺基酸殘基或B7-2序列的大約第24-245個胺基酸殘基)，這部分可用於結合CTLA4和/或CD28。
除了僅包含天然存在的胺基酸的B7多肽以外，還提供了B7肽模擬物。肽類似物在藥物工業中常用作非肽藥物，具有類似於模板肽的性質。這些類型的非肽化合物稱為「肽的模擬物」或「肽模擬物」(Fauchere，J.(1986)《藥物研究進展》1529；Veber和Freidinger(1985)《TINS》p.392；Evans等(1987)《醫藥化學雜誌》301229，引用在此作為參考文獻)，在開發中通常藉助計算機分子建模。
在結構上與具有治療價值的肽相似的肽的模擬物可以用於產生等價的治療或預防作用。一般地，肽模擬物在結構上與多肽範例(也就是具有生物或藥理活性的多肽)、例如B7相似，但是其中一條或多條肽鍵可選地被選自下組的鍵代替-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式與反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，方法是本領域已知的，進一步描述在下列參考文獻中Spatola，A.F.《胺基酸、肽和蛋白質的化學與生物化學》B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.《Vega Data》(1983.3.)，1卷，3期，「肽主鏈修飾」(綜述)；Morley，J.S.《藥物科學趨勢》(1980)pp.463-468(綜述)；Hudson，D.等《國際肽與蛋白質研究雜誌》(1979)14177-185(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola，A.F.等《生命科學》(1986)381243-1249(-CH2-S)；Hann，M.M.《英國化學會志柏爾金彙刊I》(1982)307-314(-CH-CH-，順式與反式)；Almquist，R.G.等《醫藥化學雜誌》(1980)231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.等《四面體快報》(1982)232533(-COCH2-)；Szelke，M.等，歐洲專利申請EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等《四面體快報》(1983)244401-4404(-C(OH)CH2-)；Hruby，V.J.《生命科學》(1982)31189-199(-CH2-S-)，它們分別引用在此作為參考文獻。特別優選的非肽鍵是-CH2NH-。
這類肽的模擬物可以具有顯著優於多肽實施方式的優點，例如包括生產更經濟、化學穩定性更高、藥理性質增強(半衰期、吸收、效力、功效等)、特異性改變(例如廣譜生物活性)、抗原性降低以及其他等等。肽模擬物的標記通常涉及一種或多種標記物直接或者通過間隔基團(例如醯胺基)與肽模擬物上的非幹擾性位置共價結合，這些位置是通過定量結構-活性數據和/或分子建模來預測的。這樣的非幹擾性位置一般是這樣的位置，它們不與大分子形成直接接觸，而肽模擬物與這些大分子結合產生治療效果。肽模擬物的衍生(例如標記)應當基本上不幹擾肽模擬物的所需生物或藥理活性。
B7胺基酸序列的一個或多個胺基酸被相同類型的D-胺基酸有系統地取代(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)，可以用於生成更穩定的分子。另外，按照本領域已知的方法可以生成包含B7胺基酸序列或基本上同一的序列變異的約束肽(Rizo和Gierasch(1992)《生物化學年評》61387，引用在此作為參考文獻)；例如，加入內在的半胱氨酸殘基，這些殘基能夠形成分子內二硫橋，使肽環化。
本領域技術人員無需過度的實驗方法即可生產相當於B7肽序列及其序列變體的多肽。這類多肽可以這樣生產，在原核動物或真核動物宿主細胞中，表達編碼B7肽序列的多核苷酸，經常作為更大多肽的一部分。作為替代選擇，這樣的肽可以用化學方法合成。異種多肽在重組宿主中的表達、多肽的化學合成和體外轉譯的方法是本領域熟知的，進一步描述在Maniatis等《分子克隆實驗室手冊》(1989)第2版，Cold SpringHarbor，N.Y.；Berger和Kimmel《酶學方法》152卷「分子克隆技術指南」(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Merrifield，J.(1969)《美國化學會志》91501；Chaiken I.M.(1981)《CRC Crit.Rev.Biochem.》11255；Kaiser等(1989)《科學》243187；Merrifield，B.(1986)《科學》232342；Kent，S.B.H.(1988)《生物化學年評》57957；Offord，R.E.(1980)《半合成蛋白質》Wiley Publishing，引用在此作為參考文獻。
肽例如可以通過直接的化學合成加以生產。肽可以被製成修飾的肽，其中非肽部分通過共價鍵與N-端和/或C-端結合。在某些優選的實施方式中，羧基末端或氨基末端或二者都是經過化學修飾的。末端氨基與羧基的最普通的修飾分別是乙醯化和醯胺化。氨基末端修飾例如醯化(例如乙醯化)或烷基化(例如甲基化)，羧基末端修飾例如醯胺化，以及其他末端修飾，包括環化，這些都可以體現在本發明的各種實施方式中。某些氨基末端和/或羧基末端修飾和/或肽延長為核心序列，能夠提供有利的物理、化學、生物化學和藥理性質，例如穩定性增強、效力和/或功效增加、耐受血清蛋白酶、可取的藥動學性質以及其他等等。
本發明還提供B7嵌合或融合多肽。本文所用的B7「嵌合多肽」或「融合多肽」包含用手術方法與非B7多肽連接的B7多肽。「B7多肽」指的是具有相當於B7多肽的胺基酸序列的多肽，而「非B7多肽」指的是具有相當於這樣一種多肽的胺基酸序列的多肽，前者多肽與B7多肽基本上不是同源的，例如不同於B7多肽並且來源於相同或不同生物體的多肽。在B7融合多肽內，B7多肽可以相當於B7多肽的全部或一部分。在優選的實施方式中，B7融合多肽包含B7多肽的至少一個生物活性部分。在融合多肽內，術語「用手術方法連接」意在表明B7多肽與非B7多肽彼此是框架內融合的。非B7多肽可以與B7多肽的N-端或C-端融合。
優選的核酸片段編碼長度為至少約40個胺基酸殘基的B7多肽，優選地長度為至少約80個胺基酸殘基，更優選地長度為至少約120個胺基酸殘基。特別優選的片段在長度上為至少約200個胺基酸，例如包含B7分子的完整細胞外結構域。大量方法可以用於生成分離DNA序列的片段。編碼B7-1或B7-2蛋白質、例如1-30個鹼基長度的核酸亞區或片段可以按照標準的有機化學合成手段加以製備。該技術也可用於製備引物，引物用於生成更大的合成B7 DNA片段。
編碼B淋巴細胞抗原的基因的更大亞區或片段可以這樣被表達為肽，利用聚合酶鏈反應(PCR)合成有關的DNA碎片(Sambrook，Fritsch和Maniatis《分子克隆實驗室手冊》第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989))，將所得DNA連接在適當的表達載體內。利用PCR，生成了所克隆的雙鏈DNA的特定序列，克隆在表達載體內，然後測定CTLA4/CD28結合活性。例如，為了利用PCR表達人B7-1或B7-2蛋白的分泌(可溶)形式，可以合成不編碼蛋白質的跨膜與胞質區的DNA。這種DNA分子可以連接在適當的表達載體內，引入到宿主細胞中，例如CHO，在那裡合成和分泌B7蛋白片段。然後能夠輕易地從培養基中獲得B7蛋白片段。
在一種實施方式中，編碼B7分子的至少一部分、例如缺乏分子跨膜部分的細胞外結構域部分的核酸分子被置於表達載體中，被宿主細胞表達，以便B7分子不在細胞表面上被表達。例如，編碼B7分子細胞外結構域的cDNA在合成時可以使用從公開的B7-1或B7-2序列(參見Freeman等《免疫學雜誌》1989.1432714或《科學》1993.2629090)衍生的引物，利用聚合酶鏈反應(美國專利4,683,202)。所得cDNA序列然後可以裝配成真核生物或原核生物表達載體，該載體可以用於定向適當宿主細胞、例如COS或CHO細胞合成B7的細胞外結構域。
在另一種實施方式中，表達載體包括編碼具有B7抗原活性的肽的DNA和編碼第二種多肽的DNA。第二種多肽優選地不是從共同刺激分子衍生的。優選地，本發明的B7嵌合或融合蛋白是用標準的重組DNA技術生產的。例如，將編碼不同多肽序列的DNA片段按照常規技術框架內連接在一起，利用採用鈍端或交錯端進行連接，限制酶消化以提供適當的末端，酌情填入粘端，鹼性磷酸酶處理以避免不可取的連接，和酶的連接。在另一種實施方式中，融合基因可以用常規技術合成，包括自動DNA合成儀。作為替代選擇，基因片段的PCR擴增可以利用錨定引物進行，該引物引起兩個連續基因片段之間的互補突出端，隨後可以進行退火和重新擴增，產生嵌合的基因序列(例如參見《分子生物學最新方案》eds.Ausubel等John Wiley Sons1992)。而且，很多表達載體都是商業上可得到的，並且已經編碼融合部分(例如GST多肽)。編碼B7的核酸分子可以被克隆在這樣的表達載體中，以便該融合部分與B7蛋白質進行框架內連接。例如，可以向肽中加入六-組氨酸，用於固定化金屬離子親和色譜純化(Hochuli，E.等(1988)《生物工程學》61321-1325)。另外，為了促進不含無關序列的B淋巴細胞抗原的分離，可以在融合部分與肽的序列之間引入特異性內蛋白酶裂解位點。增加肽的溶解度可能是必要的，例如向肽中加入官能團，或者刪去肽的疏水區。
在一種實施方式中，將編碼B7分子或其部分的DNA與編碼免疫應答所需抗原的DNA進行框架內連接，該抗原例如病毒抗原或腫瘤細胞抗原。
在一種實施方式中，將編碼相當於B7抗原細胞外結構域的胺基酸序列的DNA與編碼相當於免疫球蛋白分子恆定區的胺基酸序列的DNA連接(例如參見美國專利5,580,756或WO 97/28267)。第二種肽可以包括免疫球蛋白恆定區，例如人Cγ1結構域或Cγ4結構域或Cμ或其部分(例如人IgCγ1或人IgCγ4的鉸鏈區、CH2和CH3區，例如參見Capon等US 5,116,964，引用在此作為參考文獻)。所得B7Ig融合蛋白可以具有改變了的溶解度、結合親合性、穩定性和/或化合價(也就是每個分子可利用的結合位點數)，並且可以增加蛋白質純化的效率。
在優選的實施方式中，免疫球蛋白恆定區中的半胱氨酸殘基是保守的，有助於二硫化物的鍵合和可溶性二聚B7Ig蛋白的生成。在一種實施方式中，B7分子的一部分與IgM抗體或其部分的恆定區融合，有助於可溶性多聚形式的B7Ig蛋白的生成。
特別優選的B7Ig融合蛋白包括與免疫球蛋白恆定區偶聯的人B7-1或B7-2的細胞外結構域部分或可變區樣結構域。用在可溶性B7分子中的免疫球蛋白恆定區可以含有遺傳修飾，這些修飾減少或消除免疫球蛋白結構固有的效應器活性(例如參見WO 97/28267)。例如，編碼B7-1或B7-2的細胞外部分的DNA以及編碼B7-1或B7-2的可變區樣結構域或者B7-1或B7-2的恆定區樣結構域的DNA可以與編碼經過位點定向誘變修飾的人IgCγ1和/或IgCγ4的鉸鏈區、CH2和CH3區的DNA連接。
如果使用非人免疫球蛋白恆定區，優選地該恆定區被人源化。用於製備嵌合或人源化抗體的技術是本領域熟知的(例如參見Morrison等《美國國家科學院院報》816851(1985)；Takeda等《自然》314452(1985)；Cabilly等美國專利No.4,816,567；Boss等美國專利No.4,816,397；Tanaguchi等歐洲專利公報EP 171496；歐洲專利公報0173494；英國專利GB 2177096B；Teng等《美國國家科學院院報》807308-7312(1983)；Kozbor等《今日免疫學》47279(1983)；Olsson等《酶學方法》923-16(1982)；PCT公報WO 92/06193和EP 0239400)。
用於裝配和表達編碼相當於B7抗原和可溶性B7Ig分子的胺基酸序列的DNA的技術例如寡核苷酸的合成、PCR、轉化細胞、構建載體、表達系統等，都已得到本領域的充分確認。
由重組技術生產的B7融合蛋白和多肽可以從含有蛋白質或肽的細胞與培養基的混合物中分泌和分離。作為替代選擇，蛋白質或肽可以保留在細胞質中，收穫細胞，溶解，分離蛋白質。細胞培養物通常包括宿主細胞、培養基和其他成分。適合於細胞培養的培養基是本領域熟知的。蛋白質和多肽可以從細胞培養基、宿主細胞中分離，或者利用本領域已知的用於純化蛋白質和多肽的技術。用於轉染宿主細胞和純化蛋白質與肽的技術在本文中有進一步詳細描述。
III、結構相關的可溶性共同刺激分子的活性篩選利用一種或多種若干不同的測定法可以完成結構相關的B7分子篩選，如本文所述它們保留特有的B淋巴細胞抗原活性。例如，肽的篩選可以看出它們保持對與天然存在的B7分子結合的抗-B7單克隆抗體的特異反應性。具體來說，將適當的細胞、例如COS細胞可以用編碼供試多肽的DNA轉染。在免疫沉澱測定法中，可以利用抗-B7單克隆抗體或CTLA4Ig或CD28融合蛋白評價分泌形式B7的產生。通過移動，還可以試驗表達有關肽的細胞與CTLA4或CD28在平板上結合的能力。作為替代選擇，還可以試驗供試肽與天然存在的B7分子競爭與CD28或CTLA4結合的能力。
其他更優選的測定法試驗B7抗原的功能特徵。已如前述，T細胞合成細胞因子的能力不僅取決於T細胞受體對抗原的佔據或交聯(例如由抗-CD3或佛波酯提供的「初級活化信號」，產生「活化的T細胞」)，而且取決於共同刺激信號的誘導，在這種情況下是由與B淋巴細胞抗原的相互作用誘導的，例如B7-1或B7-2與T細胞上的CD28和/或CTLA4分子的相互作用。B7分子與T細胞上的已經經由T細胞受體接收信號的其天然配體的結合具有傳遞信號給T細胞的作用，誘導產生細胞因子、特別是白介素-2的水平增加，後者進而刺激T淋巴細胞的增殖。其他關於B7功能的測定法因而涉及測定細胞因子的合成，例如白介素-2、白介素-4或其他細胞因子，和/或測定已經接收初級活化信號的CD28+T細胞的T細胞增殖作用。
體外可以這樣向T細胞提供第一或初級活化信號，使它們與抗-T3單克隆抗體(例如抗-CD3)或佛波酯接觸，或者更優選地，由與I類或II類MHC分子有關的抗原提供。已經接收初級活化信號的T細胞在本文中稱為活化的T細胞。B7功能是這樣測定的，向T細胞培養物中加入B7源(例如表達具有B7活性的肽或B7的分泌形式的細胞)和初級活化信號(例如與I類或II類MHC有關的抗原)，測定功能結果，例如測定培養物上清液中的白介素-2、γ-幹擾素或其他已知或未知的細胞因子。例如，可以採用若干常規的白介素-2測定法的任意一種，例如《美國國家科學院院報》861333(1989)所述測定法，有關部分引用在此作為參考文獻。用於幹擾素產生測定的試劑盒可從Genzyme Corporation(Cambridge，MA)獲得。還可以如下實施例所述測量T細胞增殖。與缺乏共同刺激信號的陰性對照相比，如本文所述保留B7抗原特徵的肽可以導致每個T細胞所產生的細胞因子增加，例如IL-2，還可以導致T細胞增殖作用增強。
IV、可溶性共同刺激分子的給藥方法本文所述的組合物和/或藥物對需要促進免疫應答的受治療者給藥。在一種實施方式中，可溶性B7分子是與抗原預防性給藥的，例如在被病原體感染之前或者對未患癌症的受治療者給藥。在另一種實施方式中，可溶性B7分子是治療性給藥的，例如對將從增強共同刺激獲益的患病受治療者給藥，例如患有癌症或被病原體感染的受治療者。
在一種實施方式中，共同刺激分子是與抗原製劑共同給藥的。抗原可以是蛋白質、多糖、脂多糖、脂肽，或者它可以是任意這些的組合。例如，抗原可以包括天然蛋白或蛋白片段、合成蛋白或蛋白片段、或肽；它可以包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、核蛋白、核肽；它可以包括肽-肽綴合物；或者它可以包括重組的核酸表達產物。
在一種實施方式中，抗原製劑包含抗原的混合物，例如抗原是以輻射處理細胞(例如腫瘤細胞或病毒感染的細胞)、病毒顆粒或粗勻漿的形式給藥的。在另一種實施方式中，將抗原肽或抗原肽的重組形式的純化製劑對受治療者給藥，例如病毒肽或腫瘤相關抗原。在一種實施方式中，抗原製劑包含I類MHC限制肽。在另一種實施方式中，抗原製劑包含II類MHC限制肽。在另一種實施方式中，抗原製劑包含I類限制肽與II類限制肽的組合，用於對受治療者給藥。
在一種實施方式中，抗原是通過「遺傳免疫」給藥的。在這種實施方式中，將編碼有關肽的DNA表達載體注入宿主動物，例如注入受治療者的皮膚或肌肉。基因產物被正確地合成和糖基化，摺疊，被受治療者表達。利用這種方法，可以將難以足量獲得或純化的抗原給藥。在一種實施方式中，通過粒子轟擊裝置「基因槍」將DNA注入肌肉或者釋放到皮膚中，DNA是塗在金微粒上的。已經顯示遺傳免疫誘導特異性體液應答和細胞免疫應答(例如參見Mor等1995《免疫學雜誌》1552039；Xu和Liew.1995《免疫學》84173；Davis等1994《疫苗》121503)。
可溶性B7分子的最優給藥過程可以因所治療的受治療者而異。例如，可溶性B7分子可以與抗原給藥和/或可以在抗原給藥之前單獨給藥，或者可以在抗原給藥之後若干天單獨給藥。在一種實施方式中，可溶性B7分子可以「遺傳」給藥，也就是將編碼可溶性B7分子或其部分的核酸分子給藥。在另外一種實施方式中，可溶性B7分子與抗原是以綴合物的形式給藥的。
可溶性B7分子的給藥劑量方案經過調整，可以為每名受治療者提供最佳治療反應，無需進行過度的實驗。例如，可以測量對抗原的抗體效價或對抗原的細胞免疫應答(例如DTH應答(Puccetti等1994《歐洲免疫學雜誌》241446))，以確定受治療者是否對抗原正在形成免疫應答或者正在表現增強了的免疫應答，相應地可以調整劑量方案。
活性藥物或組合物還可以通過腸胃外或腹膜內方式給藥。藥物例如可以通過鼻內、口服、靜脈內、肌內、皮下或黏膜方式給藥。還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中製備分散系。在普通的貯存和使用條件下，這些製劑可以含有防腐劑，以防止微生物的生長。
適合注射的藥物組合物包括無菌水溶液(若是水溶性的)或分散系，和用於臨時製備無菌注射溶液或分散系的無菌粉末。本發明的藥物組合物經過配製，可以適合於特定的給藥途徑。例如，在各種實施方式中，本發明的藥物組合物可以適合於注射、吸入或吹入(通過口或鼻)，或者適合於鼻內、黏膜、口服、頰、腸胃外、直腸、肌內、靜脈內、腹膜內和皮下釋放。
藥物或組合物將是無菌的。另外，它們應當在製備和貯存條件下是穩定的，應當防止微生物、例如細菌和真菌的汙染作用。載體可以是溶劑或分散介質，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適合的混合物。適當的流動性可以這樣保持，例如利用包衣、例如卵磷脂，在分散系的情況下保持所需的粒徑，和利用表面活性劑。各種抗細菌和抗真菌劑可以防止微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫汞撒等。在很多情況下，優選的是在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇、例如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化鈉。在組合物中包括延遲吸收的試劑可以延長可注射組合物的吸收，例如一硬脂酸鋁和明膠。
無菌注射溶液可以這樣製備，向適當的溶劑中加入所需量的活性組合物或藥物，以及根據需要的一種如上列舉的成分或其組合，然後無菌過濾。一般地，分散系是這樣製備的，向含有基本分散介質和如上列舉的所需其他成分的無菌載體中加入活性化合物(例如共同刺激分子和/或抗原和任意另外的藥物)。在用於無菌注射溶液製備的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，從其預先無菌過濾的溶液中得到活性成分(例如藥物或組合物)加任意另外的所需成分的粉末。藥物或組合物在給藥時可以是適用於無針注射藥具的形式(這樣的藥具是本領域已知的，例如參見5,383,851、5,581,198、5,846,233)，例如《分子醫學》1998.4109所述。
當活性藥物或組合物被適當保護時，如上所述，蛋白質例如可以與惰性稀釋劑或可同化的食用載體一起口服給藥。本文所用的「藥學上可接受的載體」包括任意所有的溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌與抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類介質和試劑關於藥學活性物質的用途是本領域熟知的。除了與活性化合物不相容的那些常規介質或試劑以外，其在治療組合物中的用途是被期待的。也可以向組合物中加入補充的活性化合物。
尤其有利的是配製腸胃外組合物的劑量單元形式，有利於給藥和劑量的均勻。本文所用的劑量單元形式指的是物理上不連續的單元，適合作為哺乳動物受治療者的單元劑量；每個單元含有預定量的活性化合物以及所需的藥物載體，該預定量經過計算，產生所需的治療效果。本發明劑量單元形式的規範聽命於和直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和所要達到的治療效果，和(b)複合這樣一種活性藥物或組合物用於個體治療領域所固有的限制。
本文所用的「藥學上可接受的載體」例如包括溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌與抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類介質和試劑關於藥學活性物質的用途是本領域熟知的。也可以加入補充的試劑。
本發明的藥物以適合於體內藥物給藥的生物學上可相容的形式對受治療者給藥，以增強免疫應答。「適合於體內給藥的生物學上可相容的形式」表示所要給藥的蛋白質形式，其中藥物的治療效果重於任何毒性作用。術語受治療者打算包括其中能夠引起免疫應答的活生物體，例如哺乳動物。受治療者的實例包括人、非人靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。如本文所述具有B7分子活性的肽的給藥可以是任意藥理學形式，其中包括治療有效量的單獨的可溶性B7肽、可溶性B7肽與抗原的組合和可溶性B7肽與藥學上可接受的載體的組合。
治療或預防有效量的本發明組合物的給藥被定義為在達到所需結果所必要的劑量和時間階段下有效的量。優選地，可溶性B7分子的給藥(含有或不含抗原)導致對抗原(例如病毒或腫瘤細胞抗原)的免疫應答增強。
受治療者對抗原的免疫應答(例如細胞和/或體液免疫應答)可以利用本領域公認的技術加以測量。對抗原的免疫應答測量可以在體內或體外進行。例如，通過進行活組織檢查並尋找細胞浸潤，可以測量免疫細胞對腫瘤細胞的反應性。在感染部位或腫瘤部位附近或者在引流淋巴結中可以進行原位細胞因子染色。可以進行細胞的體外培養，以試驗細胞對抗原的反應性(例如在抗原存在下的增殖和/或細胞因子產生，和/或對抗原的細胞毒活性)。例如，具有B7活性的多肽的治療或預防有效量可因各種因素而異，例如個體的疾病狀態、年齡、性別與體重、和肽引起個體所需應答的能力。劑量方案經過調整，可以提供最佳的治療或預防應答。例如，可以每日分若干次給藥或者可以適當減少劑量，這視治療情形的緊急程度而定。
活性化合物可以按適宜的方式給藥，例如注射(皮下、靜脈內等)、口服給藥、吸入、透皮用藥或直腸給藥。根據給藥途徑，活性化合物可以是包衣的，以保護化合物不受酶、酸和其他自然條件的作用，這些可能使化合物失去活性。
本發明進一步涉及藥物形式的活性化合物，用在本文所述的療法中。活性化合物還可以用於治療藥物的製備。
V、其他藥物的給藥治療可以得到其他藥物給藥的補充，以進一步增加免疫應答。例如，可以將佐劑和/或細胞因子對受治療者給藥。
在一種實施方式中，可以將細胞因子給藥，例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、白介素1、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素10和/或白介素12。也可以將幹擾素給藥，例如α、β和/或γ幹擾素。優選地，將諸如IL-12等細胞因子給藥，它們有助於Th1-型T輔助應答的形成和細胞免疫的形成。在另一種實施方式中，可以將其他調製共同刺激信號的藥物對受治療者給藥，例如抗-CD28抗體。
在另一種實施方式中，可以將已知為佐劑的藥物給藥。如今唯一廣泛用於人的佐劑是明礬(磷酸鋁或氫氧化鋁)。其他佐劑例如皂甙及其純化組分Quil A、Freund完全佐劑和其他用於研究與獸醫應用的佐劑在人用疫苗中具有潛在的用途。不過，也可以使用新的化學限定的製劑，例如胞壁醯二肽、一磷醯基脂質A、磷脂綴合物(例如Goodman-Snitkoff等《免疫學雜誌》147410-415(1991)所述的那些)、雷瑣酚、非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯油醯醚和正十六烷基聚乙烯醚)、酶抑制劑(包括胰蛋白酶抑制劑)、二異丙基氟代磷酸酯(DEP)和抑肽酶。在將抗原給藥的實施方式中，抗原例如可以被包封在脂蛋白體內，如Miller等《實驗醫學雜誌》1761739-1744(1992)所述，引用在此作為參考文獻，或者被包封在脂質囊中，例如Novasome TM脂質囊(Micro Vescular Systems，Inc.，Nashua，N.H.)，以進一步增強免疫應答。
除非另有指示，本發明的實施將採用本領域常規的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學技術。這樣的技術在文獻中有詳細解釋。例如參見《遺傳學分子克隆實驗室手冊》第2版Sambrook，J.等編(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))；《分子生物學簡明方案》第3版Ausubel，F.等編(Wiley，NY(1995))；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編(1984))；Mullis等美國專利No4,683,195；《核酸雜交》(B.D.Hames S.J.Higgins編(1984))；專著《酶學方法》(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《細胞與分子生物學中的免疫化學方法》(Mayer和Walker編，Academic Press，London(1987))；《實驗免疫學手冊》第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編(1986))；Miller，J.《分子遺傳學實驗》(Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1972))。
所有引述在本申請中的參考文獻、未決專利申請和公布的專利的內容據此特意加以引用作為參照。本文公開的每篇參考文獻都是全文引用的。作為本申請優先權基礎的所有專利申請也都全文引用在此作為參考文獻。
下列實施例進一步闡述本發明，它們不應當被解釋為進一步的限制。
實施例實施例1可溶性共同刺激分子增強CTL應答最佳的T細胞活化作用既要求通過T細胞受體發信號，也要求共同刺激作用。B7-1和B7-2是APC表面上的兩種有力的共同刺激分子。已經檢查了B7-2的可溶形式體內對T細胞應答的作用。可溶性分子是一種嵌合蛋白，含有B7-2的細胞外結構域，與小鼠IgG2a的Fc區融合。在用II類限制肽免疫之時將B7-2Ig融合蛋白給藥，顯著增強抗原-特異性T細胞增殖和細胞因子應答。B7-2Ig給藥還增強對I類限制肽免疫的CTL應答。在對II類限制肽的T輔助細胞應答的存在下，B7-2Ig對CTL應答的增強作用顯著增加。這些發現證明了共同刺激分子、例如B7-2的可溶性蛋白形式對多T細胞免疫應答參數的免疫刺激活性，並且證明，這些分子在傳染病和疫苗適應徵中具有臨床應用。
實施例1所用材料和方法小鼠本研究使用7至10周齡的雌性BALB/cJ小鼠(Jackson Labs，BarHarbor，ME)。
肽免疫原的製備所用全部肽都是H-2d-限制的優勢免疫表位，來自流感病毒A/PR18/34的核蛋白(NP)。藉助HOBT/DCC胺基酸活化作用，利用標準的Fmoc/NMP化學，在PE Biosystems 430A肽合成儀上合成I類限制肽aa 147-155 TYQRTRALV(Taylor，P.M.等1987《免疫遺傳學》26267)和II類限制肽aa 55-77 RLIQNSLTIERMVLSAFDERRNK-OH與aa 206-229 FWRGENGRKTRIAYERMCNILKGK(Brett，S.J.等1991《免疫學雜誌》1471647)。在Beckman HPLC上分析和純化，利用Bruker MALDI質譜儀確認質量。
AIPR18/34病毒原種的製備為了製備和滴定AIPR18/34流感病毒原種，將種病毒按104稀釋比注射到10天含胚雞卵中。培養42小時後，逐個收穫被感染卵的尿囊液，在血液瓊脂板上加以無菌確認。匯集無菌的尿囊液，製備等分試樣，速凍貯存在-70℃下。在病毒的快速融化和稀釋(在尿囊液中)之後進行噬斑滴定(Bucher，D.J.等1991《臨床微生物學雜誌》292484)。
B7-2Ig融合蛋白如前人所述表達和純化B7-2Ig融合蛋白(Fields，P.E.等1998《免疫學雜誌》1615268)。簡而言之，表達質粒pED是這樣構建的，連接編碼小鼠B7-2的信號和細胞外結構域的cDNA與編碼小鼠IgG2a鉸鏈區、CH2和CH3區的基因組DNA。將表達載體轉染到CHO細胞系中，用前人所述技術擴增(Kaufman，R.J.等1988《生物化學雜誌》2636352)。使濃縮後的細胞培養物上清液通過蛋白A瓊脂糖快速流動柱(PharmaciaBiotech)。將B7-2Ig用20mM檸檬酸鹽pH3.0洗脫，用1M Tris(Sigma)pH8.0中和，通過緩衝交換配製在PBS pH7.2中。利用280nm吸光度計算蛋白質濃度，消光係數為1.33cm/mg/ml。內毒素水平小於0.25EU/mg，這是用凝膠凝塊測定法測定的(Cape Cod Associates)。多聚體形式蛋白質的百分率小於1％，這是用TSK 3000 SWXL柱測定的(TosoHaas USA，Mongomeryville，PA)。B7-2Ig的體外共同刺激活性已經得到證實(Fields，P.E.等1998《免疫學雜誌》1615268)。這裡列舉的實驗至少進行三次，結果是相似的。每項實驗至少重複進行一次，使用抗無關人蛋白GDF-9的純化小鼠單克隆IgG2a(Genetics Institute，CambridgeMA)作為B7-2Ig處理的對照。
肽免疫將100μg指定肽或肽混合物按體積1∶1與IFA(Sigma)混合，乳化。向尾根部皮下給以100μl抗原/IFA乳劑，致小鼠免疫。在鄰近肽免疫部位的部位將100μl B7-2Ig皮下給藥。在收穫淋巴結細胞的實驗中，小鼠在尾根部和頸後部都接受肽和B7-2Ig給藥，如上所述。每個治療組由5隻小鼠組成。所給藥的是B7-2Ig的0.1氫氧化鋁溶液(Rehydragel，Rehies，Dublin，Ireland)。
活病毒免疫和攻擊將Metafane(Mallinckrodt Veterinary，Mundelein，IL)通過頭錐體給藥，直至小鼠喪失反射應答。將稀釋在PBS中的活病毒鼻內給藥，最終濃度為40μl。病毒致死劑量(4,000PFU/小鼠)導致未免疫小鼠100％死亡。40PFU/小鼠的免疫劑量導致沒有死亡，完全保護小鼠不受致死攻擊。
增殖測定在指定日期收集淋巴結(腸繫膜結除外)和脾臟，製備單細胞懸液，在200μl RPMI 1640(Gibco/BRL)中，按5×105細胞/孔培養在平底96孔平板中，培養基補充有5×10-5M 2ME、2mM L-穀氨醯胺、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素(Gibco/BRL)和10％FCS。在培養開始時按指定濃度加入II類限制肽。利用1450 Microbeta平板讀數器(Wallac)，通過18小時脈衝處理(1μC/孔)後的3H胸苷結合作用測量增殖作用。初次免疫後第3、5、7和9天進行淋巴結細胞的增殖應答比較。再次免疫後三天收穫脾臟，評估再次應答。
細胞因子測定如上關於增殖測定所述培養細胞。在第3天收穫上清液，利用商業上可得到的試劑盒，通過ELISA法測定IFN-γ、IL-5和IL-13的水平(IFN-γ用Genzyme，Cambridge MA測定，IL-5用Endogen，Woburn MA測定，IL-13用RD Systems，Minneapolis，MN測定)。
個別未分離的小鼠血細胞樣本的CTL測定初次免疫後兩至三周，從Aerrane(Ohmeda Caribe，Inc，Guayama，PR)麻醉的小鼠眼眶後放血，收集血液樣本(每份150μl至200μl)。將樣本用100μl含有50U肝素的PBS稀釋。取40μl樣本進行白細胞計數。樣本的微分計數不是例行方法。在研究期間不同時間取100份樣本進行微分計數，淋巴細胞佔白細胞部分的百分率為69％±8％。洗滌細胞，以除去肝素。將總計8×105WBC/小鼠重新懸浮在10ml如上關於增殖測定所述經過補充的RPMI 1640培養基中，另外，為產生體外初次CTL應答而作下列補充4μg/ml抗-CD28(PV1.17)與10U/ml重組鼠IL-12(rmIL-12，Genetics Institute，Cambridge，MA)、10U/ml IL-2與200U/mlIL-6(Genzyme，Cambridge，MA)、0.1pM I類限制肽(TYQRTRALV，aa147-155)和1×106/ml輻射處理(2,000rads)同基因脾細胞，脾細胞用經過0.017M Tris緩衝的0.17M NH4Cl處理過，以溶解RBC(Gajewski，T.F.1996《免疫學雜誌》156465)。
將體積為100μl的細胞平板接種在96孔圓底Costar平板中，每孔總計8×103個白細胞。每份血液樣本總共平板接種80個孔。每個平板上有16個孔僅接受含有輻射處理脾細胞的培養基。在培養的第7天，倒置平板以傾瀉上清液，攪拌平板以懸浮細胞顆粒。將P815細胞用10μg/mlI類限制肽脈衝處理過夜，製備抗原-陽性(Ag-陽性)靶。向50％孔的100μl培養基中加入1×103Ag-陽性、51Cr標記的P815靶，向其餘50％加入1×103Ag-陰性、51Cr標記的對照P815靶。每個平板不含效應細胞的16個孔中，8個用來自發釋放，8個用於最大釋放測量。加入20μl 10％Triton X100達到全體釋放。培養4小時後，將50μl上清液/孔收穫到Wallac 96孔平板(1450-401)內，加入125μl閃爍劑(OptiPhase SuperMix，Wallac，Turku，Finland)，在Wallac Microbeta 1450中計數平板。
平均特異性溶胞率的計算按照標準公式計算每孔的溶胞率 其中全體釋放是所有接受靶和triton-X100的孔的平均cpm，培養基釋放是所有僅接受靶和培養基的孔的平均cpm+SD。按照下列公式計算每孔的平均特異性溶胞率 數據以平均特異性溶胞±SD表示，這是通過每組五隻小鼠所得每孔平均特異性溶胞值再取平均而計算得到的。利用雙尾學生t檢驗測定統計學顯著性。
結果B7-2Ig增強對II類限制肽免疫的初次CD4+T細胞增殖應答為了測定B7-2Ig是否會增強或抑制對肽免疫的初次T細胞應答，在有或沒有B7-2Ig給藥的存在下將小鼠用肽免疫。將來自A/PR/8/34流感病毒NP的II類限制肽aa 55-77和aa 206-229在IFA中的混合物皮下給藥。這些肽已經顯示是免疫顯性CD4+Th細胞表位(Brett，S.J.等1991《免疫學雜誌》1471647，Brett，S.J.和J.P.Tite.1996)。與及不與H-2連接的基因都影響流感核蛋白表位被CD4+T細胞識別(《免疫學》8742)。在鄰近部位將B7-2Ig(0.1％明礬溶液)給藥。在預備研究中，在免疫後第3、5、7和9天測量淋巴結細胞的肽特異性增殖應答。應答的動力學不受B7-2Ig給藥的影響。在免疫後第7和9天，B7-2Ig和對照處理的小鼠都觀察到最佳的增殖應答。如圖1所示，在肽免疫之時用B7-2Ig處理導免疫9天後收穫的淋巴結細胞的抗原特異性增殖應答顯著增加(p＝0.014，體外用50μg/ml肽重新刺激)。圖1中，將每組五隻小鼠在兩個皮下部位用IFA乳劑免疫，每次注射的IFA乳劑各含有100μg兩種II類限制肽或PBS。在鄰近免疫部位的部位將100μg B7-2IgG2a的0.1％明礬溶液或單獨的0.1％明礬給藥。將小鼠淋巴結細胞用單獨的肽免疫(-○-)、用單獨的B7-2Ig處理(-△-)或者用肽免疫且用B7-2Ig處理(-■-)，在免疫9天後收穫，體外各用指定濃度的免疫所用兩種肽重新刺激。不接受B7-2Ig的肽免疫小鼠接受明礬作為對照。通過3H-胸苷結合作用測定增殖作用。數據以每組5隻小鼠的平均cpm/孔±SD表示。當使用IgG2a mAb小鼠作為對照時得到相似結果。數據來自三次代表性實驗之一。在沒有免疫作用下的B7-2Ig給藥不導致增殖應答，證明了B7-2Ig作用在初次免疫後的抗原依賴性。這些結果證明，B7-2Ig的體內給藥增強對肽免疫的CD4+Th細胞應答。
B7-2Ig增強回憶應答為了試驗初次抗原特異性增殖應答的B7-2Ig依賴性增強作用是否增強回憶應答，在有或沒有B7-2Ig處理的存在下將小鼠用肽免疫，四十六天後加強，而沒有進一步的B7-2Ig給藥。再次免疫後3天收集脾細胞，測量肽特異性增殖應答。如圖2所示，在初次免疫之時已經接受單一B7-2Ig處理的小鼠在再次免疫後比從未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的增殖應答(p＝0.0006，體外用100pg/ml肽重新刺激)。將每組五隻小鼠用單獨的肽免疫(-○-)、用單獨的B7-2Ig處理(-△-)或者用肽免疫且用B7-2Ig處理(-■-)。初次免疫後第46天，在沒有B7-2Ig共同給藥的存在下將兩組肽免疫小鼠都用肽重新免疫。非免疫小鼠僅接受IFA。重新免疫後三天，將脾細胞體外各用指定濃度的免疫所用兩種肽重新刺激。通過3H-胸苷結合作用測定增殖作用。數據以每組5隻小鼠的平均cpm/孔±SD表示。數據來自兩次重複實驗之一。這些數據表明，B7-2Ig當用作初次T細胞應答的佐劑時，增強回憶應答。
B7-2Ig增強Th1與Th2依賴性初次細胞因子應答為了測定作為免疫佐劑的B7-2Ig是否有差別地促進Th1或Th2應答的形成，在免疫後第3、5、7和9天分析免疫小鼠淋巴結細胞在初次免疫後的肽特異性細胞因子應答。正如增殖應答一樣，在第9天觀察到最佳的細胞因子應答。如表I所示，在用肽免疫之時的B7-2Ig給藥導致與Th1有關的細胞因子IFN-γ(p＝0.017)、與Th2有關的細胞因子IL-5(p＝0.011)和IL-13(p＝0.002)的產生水平顯著增加。在來自用B7-2Ig處理的未免疫小鼠的培養物中沒有觀察到抗原特異性細胞因子產生作用。這些結果表明，B7-2Ig增強Th1與Th2表型的初次T細胞應答。
B7-2Ig增強對I類限制肽的CTL應答膜結合B7與CD28的相互作用已經顯示可以在沒有CD4+細胞的存在下誘導體外CTL應答(Harding，F.A.等1993《實驗醫學雜誌》1771791)。為了試驗B7-2Ig對初次CTL應答的作用，將小鼠用免疫顯性I類限制肽的IFA乳劑免疫，伴隨或者不伴隨B7-2Ig給藥。利用少量血樣測量未分離外周血細胞的肽特異性CTL應答，CTL測定如材料和方法所述。該測定有可能實現在單一實驗中分析大量小鼠、評估組間的統計學顯著性差異、在免疫應答期間重複個別小鼠的CTL測定和研究CTL應答與體內結果之間的相互關係。
數據以每隻小鼠的單一數值(平均特異性溶胞率)表示(圖3)。將肽的IFA乳劑給藥(100μg/小鼠)。將B7-2Ig皮下共同給藥(100μg的0.1％明礬溶液/小鼠)。免疫後三周收集未分離的血液，測量CTL。數據以平均特異性溶胞率±SD表示。活病毒免疫組的數值來自2隻小鼠的單一匯集物，在9項獨立的實驗中試驗18隻小鼠，得到該組的平均特異性溶胞率為52±12。所有其他組中，每組有五隻小鼠。所示數據來自三次重複實驗之一。對I類限制肽IFA乳劑的應答不明顯高於背景。該發現與Fayolle等1991《免疫學雜誌》147406的發現是一致的，他們指出在沒有T細胞的幫助下，對I類限制肽IFA乳劑的CTL應答接近於背景水平。當在用I類限制肽IFA乳劑免疫之時將B7-2Ig給藥時，觀察到應答有微小而統計學顯著(p＝0.013)的增加(圖3)。不過，與用活病毒免疫的小鼠的肽特異性應答相比，用肽免疫且用B7-2Ig共同給藥的小鼠的肽特異性CTL應答的幅度小。因此，100μg B7-2Ig的共同給藥不升高對I類限制肽免疫作用的應答至用有效活病毒免疫法所達到的最大水平。
B7-2Ig對CTL應答的最佳增強作用需要T細胞的幫助由於最佳的CTL應答取決於Th細胞(Fayolle，C.等1991《免疫學雜誌》1474069；Keene，J.A.等1982《實驗醫學雜誌》155768；vonHerrath，M.G.等1996《病毒學雜誌》701072和Ossendorp，F.等1998《實驗醫學雜誌》187693)，因此在將小鼠用已知引起Th細胞應答的肽共同免疫的條件下試驗B7-2Ig對CTL應答的作用。將小鼠用含有單獨的I類限制肽或I類限制肽與兩種II類限制肽的混合物的IFA乳劑免疫，如圖1與2和下表I所述。測量未分離的外周血細胞的CTL應答(圖4)。以單一的IFA乳劑形式進行肽免疫作用。按指定方法將小鼠免疫和處理。三周後，測量外周血液的CTL應答。數據以平均特異性溶胞率±SD表示。活病毒免疫組的數值來自2隻小鼠的單一匯集物，在9項獨立的實驗中試驗18隻小鼠，得到該組的平均特異性溶胞率為52±12。所有其他組中，每組有五隻小鼠。接受II類限制肽IFA乳劑和對照Ig明礬溶液的組的平均特異性溶胞率減去接受對照Ig的組的平均特異性溶胞率。接受II類限制肽IFA乳劑和B7-2Ig明礬溶液的組的平均特異性溶胞率減去接受B7-2Ig的組的平均特異性溶胞率。所示數據來自四次重複實驗之一。
用I類與II類限制肽的混合物免疫的小鼠細胞的平均特異性溶胞率顯著高於用單獨的I類限制肽免疫的小鼠細胞(實驗顯示p＝0.046，重複實驗為.004)。用I類與II類限制肽的混合物免疫且用100μg B7-2Ig處理導致平均特異性溶胞率顯著大於不接受B7-2Ig的肽免疫小鼠(四次重複實驗中p＝0.003、p＝0.0001、p＝0.045和p＝0.0012)。當B7-2Ig的劑量增加一倍至200μg/小鼠時，並不增加這種應答，說明100μg劑量誘導最大的B7-2Ig依賴性增強作用。
肽混合物免疫與B7-2Ig處理的結合導致肽特異性CTL應答在幅度上類似於活病毒免疫作用所引起的應答。將9項獨立實驗中18隻活病毒免疫小鼠所得數值取平均後，得到平均特異性溶胞值為52±12，證明了少量外周血樣CTL測定法的可再現性和在T細胞的幫助與B7-2Ig的存在下的肽的免疫作用所引起的應答相當於有效活病毒免疫法所引起的應答這一結論的有效性。從外周血細胞檢測的CTL應答在2至3周達到峰值，在第五周淡化，用活病毒免疫的小鼠和用肽免疫且用B7-2Ig處理的小鼠都是如此，再次說明應答的相似性。不過正如下文所討論的，用肽混合物免疫且用B7-2Ig處理的小鼠不被保護免受致死病毒的攻擊。
圖3和4數據是由配製在0.1％明礬中的B7-2Ig所產生的，前者本身是一種經過臨床批准的免疫佐劑(Aprile，M.A.等1966《加拿大公共衛生雜誌》57343)。單獨的明礬或對照Ig的明礬溶液給藥不影響抗肽應答，明礬製劑也不是B7-2Ig依賴性免疫增強作用所需的。不過，明礬製劑的確強化B7-2Ig的作用。若直接比較B7-2Ig的明礬溶液的作用與B7-2Ig的PBS溶液的作用，在將B7-2Ig的明礬溶液給藥時觀察到更大的CTL應答增強作用(平均溶胞率含有明礬為72±13，不含明礬為38±12，p＝0.007)。
T細胞的最佳抗原特異性活化作用和調節作用需要共同刺激信號從APC表面上的B7分子釋放到T細胞表面上的CD28與CTLA-4(Boussiotis，V.A.等1996《免疫學評論》1535；Lenschow，D.J.等1996《免疫學年評》14233；Green，J.M.等1994《免疫》1501；Tivol，E.A.等1995《免疫》3541和Waterhouse，P.1995《科學》270985)。多種小鼠模型研究顯示，通過增加B7的細胞表面表達能夠增強免疫應答。在這些研究中，B7表達的增加是如下誘導的腫瘤細胞轉導(Baskar，S.等1993《美國國家科學院院報》905687；Cavallo，F.等1995《歐洲免疫學雜誌》251154；Coughlin，C.M.等1995《癌症研究》554980；Chen，L.等1992《細胞》711093；Chen，L.等1994《實驗醫學雜誌》179523；Gajewski，T.F.等1996《免疫學雜誌》82909；Yang，G.等1995《免疫學雜誌》154279和Dunussi-Joannopoulos K.等1996《血液》872938)、cDNA注入(Kim，J.J.等1997《天然生物工程》15641；Kim，J.J.等1998《新疫苗》161828和Horspool，J.H.等1998《免疫學雜誌》1602706)或用病毒載體感染(Chamberlain，R.S.等1996《癌症研究》562832；Emtage，P.C.等1998《免疫學雜誌》1602531；Hodge，J.W.等1994《癌症研究》545552和Putzer，B.M.等1997《美國國家科學院院報》9410889)。利用增加體內B7水平的不同策略，已經開發了B7-2的可溶性蛋白形式B7-2Ig，由小鼠IgG2a的Fc組成，該Fc與B7-2的細胞外部分融合，該部分與每條Ig鏈連接。B7-2Ig的體內給藥增強抗原特異性Th細胞與CTL應答。因而，B7-2Ig的體內給藥是腫瘤細胞的來自體外B7轉導或者使用病毒或DNA載體優化B7-2介導共同刺激的簡單的替代選擇。
因為傳染病和自體免疫疾病的後果大大受到應答性Th細胞產生細胞因子的模式的影響，所以人們有興趣確定B7途徑是否能夠用來向Th1或Th2型細胞因子應答偏斜(Kuchroo，V.K.等1995《細胞》8010；Lenschow，D.J.等1995《實驗醫學雜誌》1811145；Corry，D.B.等1994《免疫學雜誌》1534142；Freeman，G.J.等1995《免疫》2523；Schweitzer，A.N.等1997《免疫學雜誌》158713；Rulifson，I.C.等1997《免疫學雜誌》158658和McAdam，A.J.等1998《免疫學評論》165231)。大量實驗系統表明，Th2分化比Th1分化更依賴於B7的共同刺激作用(Lenschow，D.J.等1995《實驗醫學雜誌》1811145；Corry，D.B.等1994《免疫學雜誌》1534142；Freeman，G.J.等1995《免疫》2523和Rulifson，I.C.等1997《免疫學雜誌》158658)。抗-B7 mAb已經成功地用於體內操縱T細胞分化。B7-1被mAb阻斷據報導有助於Th2分化，而B7-2的阻斷有助於Th1分化(Kuchroo，V.K.等1995《細胞》80Mar 10(5)；Lenschow，D.J.等1995《實驗醫學雜誌》1811145；Corry，D.B.等1994《免疫學雜誌》1534142；Freeman，G.J.等1995《免疫》2523和Rulifson，I.C.等1997《免疫學雜誌》158658)。相反，Schweitzer等利用B7失效小鼠APC發現，B7-1或B7-2體外似乎都不選擇性調節Th1或Th2的分化(Schweitzer，A.N.等1997《免疫學雜誌》158713)。該例數據顯示，B7-2Ig的體內給藥增強Th1和Th2型的抗原特異性細胞因子應答。因此，治療潛在性B7-2Ig很可能在以升高而非偏斜應答為目標的情況下是最好的。
為了試驗B7-2Ig對CTL應答的作用，比較用來自流感病毒A/PR/8/34的NP的肽所引起的肽特異性CTL應答和用來自活病毒免疫小鼠的相同的肽所引起的應答。B7-2Ig處理誘導對I類限制肽IFA乳劑的應答的小而顯著的增強作用。這些數據是一致的，證明在沒有外來幫助的存在下，用B7轉染的腫瘤細胞足以產生體外CTL應答(Harding，F.A.等1993《實驗醫學雜誌》1771791)。
不過，被B7-2Ig增強的應答顯著低於對活病毒免疫小鼠的相同的肽的CTL應答。這些數據顯示，小鼠能夠比通過I類限制肽免疫且B7-2Ig共同給藥所引起的小鼠應答產生大得多的抗肽應答。
在進一步增強對I類限制肽的應答的努力中，研究了向含有I類限制CTL肽抗原的IFA乳劑中加入Th細胞、II類限制肽抗原的作用。前人報導最佳的CTL應答取決於Th細胞(Fayolle，C.等1991《免疫學雜誌》1474069；Keene，J.A.等1982《實驗醫學雜誌》155768；von Herrath，M.G.等1996《病毒學雜誌》701072和Ossendorp，F.等1998《實驗醫學雜誌》187693)。在用I類與II類限制肽免疫的小鼠中，CTL應答顯著升高。這些數據表明，Th細胞抗原的共同免疫能夠提供對抗肽抗原的CTL應答的幫助。CTL與Th肽表位之間的共價連接並不是所需要的，提示任何免疫原性蛋白質都可以用作共同免疫原，以提供對CTL應答的幫助。我們的發現進一步支持了該結論，也就是向含有I類限制肽的IFA乳劑中加入KLH，導致肽特異性CTL應答的顯著增強作用。
儘管得到增強，用I類與II類限制肽免疫的小鼠的肽特異性CTL應答也小於用活病毒免疫的小鼠。向方案中加入B7-2Ig增加用肽混合物免疫的小鼠的CTL應答至用活病毒免疫的小鼠的水平。這兩組的應答是相當的，但是前者不被保護免受致死病毒的攻擊。該結果與Lawson等的結果是一致的(Lawson，C.M.等1994《病毒學雜誌》683505)，他們通過將表達肽的重組疫苗病毒給藥，引起對用在該項研究中的相同的肽的劇烈CTL應答。目前，對單獨這種肽的劇烈CTL應答不足以賦予BALB/c小鼠以保護性免疫。
儘管不是B7-2Ig的免疫增強作用所需要的，明礬製劑仍然導致比PBS製劑更大的增強作用。對照Ig的明礬溶液給藥不影響應答，說明單獨的明礬不增強應答。
用活病毒感染是I類限制應答活化作用的天然和有效的途徑(Zinkernagel，R.M.等1979《免疫學進展》2751)。因此，這裡列出的、表明從用活病毒免疫的小鼠和用I類與II類限制肽的混合乳劑免疫且用B7-2Ig處理的小鼠得到相當的抗肽應答的數據確立了後者免疫方案的有效性。目前，引起對I類限制肽的CTL應答是很令人感興趣的。近些年來關於人CTL象小鼠CTL一樣能夠識別與腫瘤有關的I類限制肽的證明提示，針對這些肽的CTL應答可以證實對人腫瘤有效(van derBruggen，P.等1991《科學》2541643；Wolfel，T.等1993《國際癌症雜誌》55237；Maeurer，M.J.1996《黑色素瘤研究》611；Cormier，J.N.等1997《科學美國人癌症雜誌》337；Apostolopoulos，V.等1997《免疫學雜誌》1595211；Rosenberg，S.A.1998《天然醫藥》4321和Nestle，F.O.等1998《天然醫藥》4328)。這種可能性刺激了人們更大的熱情，設計優化對I類限制肽疫苗的應答的免疫方案。據報導，多種不同的策略都已取得了成功，包括向重組病毒和細菌中插入小基因、肽的寡聚化、脂質的修飾、cDNA的免疫、使用毒素和細胞因子作為佐劑和抗原脈衝刺激樹狀細胞(Allsopp，C.E.等1996《歐洲免疫學雜誌》261951；Rotzschke，O.等1997《美國國家科學院院報》9414642；Alving，C.A.等1995《免疫學評論》1451；Ciernik，I.F.等1996《免疫學雜誌》1562369；Porgador，A.等1997《免疫學雜誌》158834；Noguchi，Y.等1995《美國國家科學院院報》922219和Takahashi，H.等1992《國際免疫學》5849)。這裡所報導的方法的優點是，它可一貫地應用於任何肽，無需進一步修改，對I類和II類限制應答都有效。
B7-2Ig與肽免疫的共同給藥升高相對弱的I類限制肽應答至相當於由活病毒免疫所引起的水平，提示了B7-2蛋白的可溶形式也能夠增強對其他弱免疫原的應答。這些發現顯示，B7-2的可溶性蛋白形式可以在免疫系統應答無效的癌症或傳染病療法中增強抗原特異性免疫應答。
表ITh細胞因子應答的B7-2Ig依賴性增強作用a細胞因子在體外重新刺激後的表達體內處理 IFNγ IL-5IL-13(pg/ml±SD) (pg/ml±SD) (pg/ml±SD)肽的免疫 b.db54±44 136±125肽免疫加B7-2Ig 1720±9862479±1104 5365±1795IFA加B7-2Igb.dbb.dbb.dba將每組五隻小鼠在兩個皮下部位用IFA乳劑免疫，每次注射的乳劑含有100μg兩種II類限制肽或PBS。在鄰近免疫部位的部位將100μgB7-2IgG2a的0.1％明礬溶液或單獨的0.1％明礬給藥。九天後，收穫淋巴結細胞，在培養基中用5μg/ml各種肽重新刺激三天。從一式三份的小孔所得結果取平均，得到關於每隻小鼠的數值。數據以組內小鼠細胞因子的平均濃度±SD表示。結果類似於使用IgG2a mAb作為對照的對照小鼠所得結果。所示數據是三次重複實驗之一。b低於測定法的檢測限度。
實施例2B7-IgG融合蛋白增強抗腫瘤免疫應答，誘導已建立腫瘤的消退評價了B7-1或B7-2的細胞外區與IgG2a之間的融合蛋白關於它們在四種不同的鼠腫瘤模型中增強抗腫瘤應答的能力，包括弱免疫原性黑色素瘤B16/F10。當與B7-1或B7-2 IgG混合時，用輻射處理腫瘤細胞進行單次疫苗接種，保護小鼠免受活腫瘤的攻擊。更顯著地，在用與B7-IgG混合的輻射處理腫瘤細胞進行疫苗接種後，已經生長7天的腫瘤消退了。甚至單獨的B7-IgG的治療性給藥也類似地減少了腫瘤的負擔。已經排斥已建立腫瘤的動物對重新攻擊是耐受性的，強烈提示了B7-IgG的抗腫瘤作用是由腫瘤特異性免疫機理介導的。另外，用與B7-1或B7-2 IgG混合的輻射處理腫瘤細胞進行單次疫苗接種，產生抗與腫瘤有關的抗原的CD8應答。因而，B7-IgG與外源性釋放的和內源性抗原結合表現有力的佐劑活性。這些發現提示了B7-Ig增強抗腫瘤與抗病毒應答的臨床價值。
實施例2所用材料和方法鼠B7-1-IgGIgG和B7-2-IgG2a融合蛋白的表達質粒是這樣構建的，連接編碼鼠B7-1或B7-2的信號和細胞外結構域的DNA與編碼從鼠IgG2a抗體衍生的鉸鏈區-CH2-CH3結構域的DNA。抗體鉸合區內的半胱氨酸殘基保持保守，以便所產生的mB7-1-IgGIgG2a或mB7-2-IgG2a是二聚體和二價的。在所生成的融合蛋白中，為了防止被高親和性Fc受體結合和防止補充活化，突變IgG2a區(稱為B7-IgG2mut)。下列CH2結構域中的胺基酸殘基被丙氨酸代替#235位亮氨酸、#318位穀氨酸、#320位賴氨酸和#322位賴氨酸。關於B7-IgG蛋白的產生，在CHO細胞系中表達質粒，分離蛋白質。
P815是從肥大細胞瘤衍生的腫瘤細胞系，在向DBA/2小鼠(JacksonLaboratories)真皮內(i.d.)注射5×104細胞後生長成為固體腫瘤。用在這些實驗中的克隆在i.d.注射後自發轉移，25-35天後引起小鼠死亡。MethA是從Balb/C小鼠肉瘤衍生的腫瘤細胞系，在i.d.注射5×105細胞後生長成為固體腫瘤(來自Taconic的Balb/C小鼠)。B16/F10是從C57BL/6小鼠(Taconic)黑色素瘤衍生的非免疫原性腫瘤系，在i.d.注射1×105細胞後生長成為固體腫瘤，因在25-35天後轉移導致死亡。膀胱癌MB49也是從C57BL/6小鼠衍生的，i.d.注射1×105細胞，100％小鼠在5-7天後長出固體腫瘤。
體外共同刺激測定法將2×105幼鼠脾細胞一式三份平板接種在96孔平板上，平板塗有低濃度的抗-CD3 mAb(0-500ng-ml-2C11，Pharmingen)。為了提供共同刺激所必要的信號，平板同時塗有抗-CD28 mAb(0-1μg/ml)作為陽性對照，或者塗有B7-1-IgG或B7-2-IgG(0-9μg/m1)。還加入B7-IgG的可溶形式或與次生抗-小鼠IgG2a Ab交聯的形式。將脾細胞刺激72小時。取上清液試樣用於IFN-γ分析，將細胞用H3-胸苷脈衝處理8小時。在標準ELISA中進行IFN-γ分析，用捕獲Ab R46A4和生物素基化XGM1.2作為檢測Ab。
疫苗接種方案在預防性腫瘤疫苗模型中，在第0天，在小鼠被腫瘤細胞攻擊的同時進行疫苗接種。將小鼠用輻射處理腫瘤細胞(1×107細胞)的PBS溶液免疫，其中混合有75-100μg mB7-1-IgG、B7-2-IgG、鼠IgG或者什麼也沒有。對兩條後肢給以爪墊內(i.fp.)注射。在第3或5天重複一次B7-IgG的注射。在第7天，用限定劑量的活腫瘤細胞攻擊動物，在右脅i.d.注射50μl。監測40-60天內的原發性腫瘤的生長和動物的存活率。
在治療性腫瘤疫苗模型中，原發性腫瘤是通過i.d.接種限定數量的腫瘤細胞而建立的。在第5-7天(此時腫瘤可明顯觸知)，用1×107輻射處理腫瘤細胞i.fp.接種小鼠，其中混合有100μg B7-1-IgG、B7-2-IgG或者什麼也沒有。三天後再次i.fp.注射100μg B7-IgG。這種疫苗接種方案重複兩或三周。監測第7天至第40-70天內的原發腫瘤的生長和小鼠的存活率。
在治療模型中，將攜帶腫瘤的小鼠B7-IgG用單獨的融合蛋白處理。i.fp.注射50-100μg單獨的B7-1-IgG或B7-2-IgG三周，一周兩次。監測40天內的腫瘤生長和存活率。
P1A特異性CTL應答的檢測用混合有或者沒有混合B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理P815細胞單次免疫後10-14天，從DBA/2小鼠中收集脾。紅細胞溶解後，在T25燒瓶內將20×106脾細胞用0.1ng/ml P1A肽和5U/ml IL-2(Pharmingen)重新刺激6天。然後，進行標準的5h Cr51-釋放測定，用A20細胞作為靶，用10μg/ml P1A進行肽脈衝處理或者不進行脈衝處理。P1A-肽特異性溶胞百分率以肽-脈衝處理的靶溶胞百分率與未脈衝處理的靶溶胞百分率之間的差異表示。
結果固定化或交聯的B7-IgG體外為次優刺激的鼠脾細胞提供共同刺激信號FACS或Biocore分析測定了B7-1-IgG和B7-2-IgG融合蛋白與鼠CD28和CTLA-4結合。為了測定B7-IgG融合蛋白增強還是抑制T細胞活化作用，通過聯合培養與平板結合的抗-CD3 mAb和固定在平板上的B7-IgG，體外刺激鼠脾細胞。與平板結合的抗-CD28 mAb的共同刺激作用充當陽性對照。B7-1-IgG和B7-2-IgG相似地誘導增殖和IFN-γ分泌的劑量依賴性增加(圖5)。將2×105幼脾細胞一式三份用50ng/ml抗-CD3單克隆抗體和遞增數量的固定化抗-CD28抗體或B7-1或B7-2 IgG刺激72小時。6小時脈衝後加入3H-胸苷，測量增殖應答。B和C欄分別顯示IFNγ或IL2的數量，它們在用50ng/ml抗-CD3抗體和指定數量的固定化B7-2-IgG刺激72小時後釋放。用標準ELISA測量細胞因子。在沒有抗-CD3刺激的存在下，B7-IgG不誘導增殖作用。B7-IgG分子與次生抗-鼠IgG mAb的固定化或交聯是有效共同刺激所必需的，因為可溶性B7-IgG蛋白不增強增殖作用或IFN-γ的產生。在其Fc結合區突變的B7-IgG蛋白(B7-1-IgG與B7-2-IgG2mut)當被固定在平板上時有效共同刺激脾細胞。
B7-1-IgG或B7-2-IgG都增強輻射處理腫瘤細胞疫苗的保護功效在預防性腫瘤疫苗模型中評價了作為佐劑的B7-IgG融合蛋白。接種5×104活P815腫瘤細胞，100％幼DBA/2小鼠在5-7天後生成固體腫瘤。將每組10隻DBA/2小鼠用1×107輻射處理P815腫瘤細胞i.fp.免疫一次。細胞疫苗是單獨給藥的，或者與100μg的B7-1-IgG、B7-2-IgG或它們的突變蛋白混合給藥。在第5天將B7-IgG再次給藥。作為對照，在第0和5天將100μg單獨的B7-1-IgG或B7-2-IgG i.fp.給藥。在第7天用5×104活P815腫瘤細胞攻擊小鼠。24天後沒有可觸知的腫瘤，確定對攻擊具有保護作用。圖6顯示五次代表性實驗之一的結果。活腫瘤攻擊前一周將小鼠用P815腫瘤細胞免疫不導致對腫瘤生長的保護作用。不過，用混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理腫瘤細胞單次免疫，誘導60-70％保護作用(圖6，表2)。相反，用單獨的B7-1-IgG或B7-2-IgG免疫不提供保護作用(圖6)。14-24天後沒有固體腫瘤和/或存活至少60天都確認了保護作用。後者說明不存在轉移性疾病。
為了評價IgG結構域在融合蛋白功能中的角色，將小鼠用混合有突變融合蛋白B7-IgGmut的輻射處理P815腫瘤細胞免疫，該突變的融合蛋白不結合Fc受體，不活化補體。突變的分子不如野生型有效(圖6，表2)，提示了在B7-IgG分子的Fc結合中的角色。
還比較了與B7-IgG混合的輻射處理腫瘤細胞與被B7-1或B7-2轉染的腫瘤細胞的功效。用B7-轉染體進行疫苗接種，誘導顯著更低的抗腫瘤免疫性，僅保護了30％的小鼠，而用混合有B7-IgG的輻射處理野生型P815細胞免疫後保護了65％(表2)。這些發現說明，B7-IgG可能是有效生成抗腫瘤保護作用的佐劑，可以比B7-轉染的腫瘤細胞更有效。
用混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理P815腫瘤細胞進行疫苗接種，治癒小鼠的已建立P815腫瘤為了試驗B7-IgG在治療性腫瘤疫苗模型中的佐劑活性，用P815腫瘤細胞i.d.注射DBA/2小鼠，劑量為在五至七天後生成可觸知的固體腫瘤。在第0天通過i.d.注射5×104P815細胞建立固體P815腫瘤。在已經形成可觸知的腫瘤之後，在第7天開始疫苗接種。圖7顯示如下i.fp.注射小鼠的結果PBS對照(A，E)，單獨的輻射處理P815腫瘤細胞(B)，與無關小鼠IgG2a Ab混合的輻射處理P815腫瘤細胞(F)，與B7-1-IgG(C)或B7-2-IgG(G)混合的輻射處理P815腫瘤細胞。在第7、14、21天重複免疫。三天後分別將PBS、無關Ab或B7-IgG再次給藥。監測40天內的腫瘤生長。25-30天後，對照組動物開始死於自發性轉移瘤。D和H欄顯示不同治療組的存活時間。數據是四次獨立實驗的代表。腫瘤生長的動力學和疫苗接種後的存活如圖7所示，是四次獨立實驗的代表。從第一次免疫後約一周開始，觀察到混合有B7-IgG的腫瘤細胞免疫組小鼠腫瘤生長減少，也就是腫瘤消退。單獨的輻射處理腫瘤細胞或混合有無關小鼠IgG2a Ab的輻射處理腫瘤細胞處理組腫瘤生長不減少。混合有B7-IgG的輻射處理P815腫瘤細胞免疫的三個周期之後，60-80％的小鼠原發性腫瘤已經消失。原發性腫瘤的消退與小鼠的長期存活有相互關係。混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理P815細胞免疫增加長期存活大約80％(圖7D，H)。未治療組或輻射處理腫瘤疫苗對照組的大部分小鼠一般在25與35天之間死亡，顯然是由肝、脾和淋巴結內形成的自發性轉移瘤所引起的。
在不同腫瘤模型中作為治療性腫瘤疫苗佐劑的B7-IgG為了確定B7-IgG結果是否與P815腫瘤或DBA/2小鼠株一致，利用兩種不同的小鼠株試驗了B7-IgG作為佐劑在三種另外的腫瘤模型中的功效。在所有四種模型中都得到了相似的陽性結果。
將攜帶7日已建立MethA肉瘤的Balb/c小鼠用PBS、單獨的輻射處理MethA細胞或混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理MethA細胞免疫。分別在Balb/c或C57BL/6小鼠中建立固體MethA或B16/F10腫瘤。圖8顯示將每組十隻小鼠分別用單獨的輻射處理腫瘤細胞(B，E)或混合有25μg(C，D)或100μg(F，G)B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理腫瘤細胞i.fp.免疫。3-4天後再一次給以PBS、B7-1-IgG或B7-2-IgG注射。一組用單獨的PBS處理(A，關於B16/F10沒有顯示)。監測35天腫瘤生長。一旦腫瘤達到400mm2，使MethA腫瘤小鼠安樂死，或者動物死於自發性轉移瘤。存活動物的百分率如H欄所示。實驗重複至少三次。用混合有B7-IgG的輻射處理MethA細胞免疫兩次治癒100％小鼠，而對照組10-15％小鼠自發地痊癒(圖8)。在攜帶膀胱癌MB49的C57BL/6小鼠中觀察到相似的結果。在C57BL/6小鼠中，還研究了高轉移性與弱免疫原性黑色素瘤B16/F10的應答。用混合有兩種B7-IgG蛋白之一的輻射處理B16腫瘤細胞免疫三次，相對對照而言減少腫瘤生長，提高長期存活率(圖8)。對照組動物在35-40天內全部死亡，而用B7-IgG疫苗處理過的小鼠至少有40-80％存活超過60天(圖8)。這些發現支持了P815腫瘤模型中的觀察結果，證明了B7-IgG作為治療性腫瘤疫苗佐劑的有力活性。
單獨的B7-IgG的治療性給藥誘導抗腫瘤應答如上所述，在沒有輻射處理腫瘤細胞的存在下將幼鼠用B7-IgG進行預防性免疫，不保護小鼠免受腫瘤攻擊。不過，在所有四種治療性腫瘤模型中，將攜帶腫瘤的小鼠用單獨的B7-1-IgG或B7-2-IgG處理，減少腫瘤生長，增加存活率(圖9)。在第0天用活P815(A)、MethA(B)、MB49(C)或C57BL/6(D)腫瘤細胞接種小鼠。如上所述在第6-8天開始免疫。將小鼠用PBS(□)、單獨的輻射處理腫瘤細胞(◇)、混合有B7-1-IgG(△)或B7-2-IgG(○)的輻射處理腫瘤細胞或者單獨的B7-1-IgG(*)或B7-2-IgG(+)處理。每組7-10隻小鼠腫瘤大小的平均值繪圖。一旦腫瘤達到400mm2大小，使小鼠安樂死，或者如果它們死於轉移性疾病就賦予該值。在所有所試驗的模型中，用單獨的B7-IgG對攜帶腫瘤的小鼠進行治療性處理，延緩腫瘤生長，誘導腫瘤消退，增加存活率。不過，B16/F10腫瘤模型數據提示，用輻射處理腫瘤細胞加B7-IgG進行疫苗接種的抗腫瘤療效強於單獨的B7-IgG，至少對弱免疫原性腫瘤來說如此。
這些可溶性B7-IgG的結果驚人地給出利用呈遞在細胞表面上的共同刺激分子所得結果(固相共同刺激)。在全部三種這些模型中評價了用B7-轉染的腫瘤細胞進行治療性疫苗接種，顯示對腫瘤生長和存活率沒有作用至具有適度作用。這裡利用混合有可溶性B7-Ig的輻射處理腫瘤細胞疫苗所示作用驚人地強大得多。混合100μg B7-IgG與疫苗可提供大約1016B7分子，而在107轉染腫瘤細胞表面上僅有大約總計1010-1011B7分子。這樣一種數量上的差異可以解釋為什麼用輻射處理B7-轉染體進行疫苗接種的效率大大低於活B7-轉染體，其中活細胞能夠增加和增大可利用的B7分子數量。其他解釋可能涉及B7-IgG分子比表達在輻射處理腫瘤細胞表面上的B7分子延長了存在的時間。而且，可溶性分子在體內可以不同地分布，到達更適當的免疫刺激部位。
B7-IgG介導的腫瘤痊癒是CD8 T細胞依賴性的和IFN-γ獨立性的為了進一步描繪適應性免疫應答參與B7-IgG介導的免疫刺激作用的特徵，評價了缺乏成熟T與B細胞的SCID小鼠中的B7-IgG。在SCID小鼠中建立固體腫瘤，然後將它們用單獨的B7-IgG活輻射處理細胞疫苗加B7-IgG處理。沒有一種處理措施對腫瘤生長起作用，證明了B7-IgG介導的腫瘤應答對T或B細胞的依賴性(圖10)。另在使CD8或CD4T細胞衰竭之後處理攜帶腫瘤的小鼠。在B7-IgG療法開始前一天，注射抗體，使CD8或CD4 T細胞衰竭。在第28天通過PBL的FACS分析驗證衰竭成功。在CD4衰竭的小鼠中，B7-IgG誘導腫瘤消退和痊癒，與正常小鼠沒有區別(圖11)，而CD8衰竭廢除了B7-IgG介導的抗腫瘤活性。腫瘤生長比CD8衰竭的未治療小鼠緩慢，但是觀察到沒有腫瘤痊癒(圖11)。
儘管IFN-γ在抗腫瘤免疫監視和抗腫瘤應答中扮演重要角色，也可確定B7-IgG治癒已建立腫瘤而與IFN-γ無關。在IFN-γ失效小鼠中建立固體腫瘤，用B7-IgG或混合有B7-IgG的輻射處理腫瘤細胞疫苗處理。兩種處理均誘導腫瘤消退和在第28天左右痊癒，相當於野生型小鼠，證明了B7-IgG腫瘤療法的IFN-γ獨立性(圖12)。而且，因其IFN-γ受體突變而對IFN-γ不是應答性的腫瘤用B7-IgG處理後仍然痊癒。
還測定了B7-IgG在抗腫瘤療法中或者作為疫苗佐劑比阻斷CTLA4抗體更有力。在三種不同的腫瘤模型中，B7-IgG處理治癒腫瘤或者保護免受腫瘤攻擊，其中抗-CTLA4抗體沒有作用，儘管它對CTLA4具有高得多的親和性，前人也報導了它的阻斷活性。這些數據證明，B7-IgG增強免疫應答的機理不僅限於和依賴於阻斷由CTLA4介導的負信號。
表2與輻射處理腫瘤細胞混合的B7-IgG2a提供保護性免疫免疫作用保護百分率 動物數(受攻擊動物的被實驗數(平均+/-SD) 保護數/總數)幼鼠 8％(11) 3/42 5輻射處理P815 2％(4) 1/43 5輻射處理P815-B7-1轉染體 23％(4) 3/13 2輻射處理P815+B7-1IgG 65％(18)29/45 4輻射處理P815+B7-2IgG 60％(24)23/37 4輻射處理P815+突變的B7-1IgG 28％(4) 5/18 2輻射處理P815+突變的B7-2IgG 20％2/10 1輻射處理P815+抗-CD28 0％ 0/10 1輻射處理P815+抗-CTLA-4 40％4/10 1輻射處理L1210-P1A0％(0) 0/19 2輻射處理L1210-P1A+ 10％(14)2/20 2B7-1-IgGIgG等價方式本領域技術人員只需利用常規的實驗方法將認識或者能夠確定很多本文所述發明的具體實施方式
的等價方式。這樣的等價方法打算為下列權利要求所涵蓋。
序列表110遺傳研究所有限公司(Genetics Institute，Inc)120可溶性共同刺激分子增強免疫應答的用途130GNN-00314009/565，3161412000-05-0515060/132，9441511999-05-061607170PatentIn Ver.2.021012111491212DNA213人(Homo sapiens)220221CDS222(318)..(1181)220221成熟肽222(420)220223318到1181bp位置的開放讀框220223來自1474到1479bp位置的交替聚腺苷酸化信號4001ccaaagaaaa agtgatttgt cattgcttta tagactgtaa gaagagaaca tctcagaagt 60ggagtcttac cctgaaatca aaggatttaa agaaaaagtg gaatttttct tcagcaagct 120gtgaaactaa atccacaacc tttggagacc caggaacacc ctccaatctc tgtgtgtttt 180gtaaacatca ctggagggtc ttctacgtga gcaattggat tgtcatcagc cctgcctgtt 240ttgcacctgg gaagtgccct ggtcttactt gggtccaaat tgttggcttt cacttttgac 300cctaagcatc tgaagcc atg ggc cac aca cgg agg cag gga aca tca cca350Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro-30 -25tcc aag tgt cca tac ctg aat ttc ttt cag ctc ttg gtg ctg gct ggt 398Ser Lys Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly-20 -15 -10ctt tct cac ttc tgt tca ggt gtt atc cac gtg acc aag gaa gtg aaa446Leu Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys-5 -1 1 5gaa gtg gca acg ctg tcc tgt ggt cac aat gtt tct gtt gaa gag ctg494Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu10 15 20 25gca caa act cgc atc tac tgg caa aag gag aag aaa atg gtg ctg act542Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr30 35 40atg atg tct ggg gac atg aat ata tgg ccc gag tac aag aac cgg acc590Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr45 50 55atc ttt gat atc act aat aac ctc tcc att gtg atc ctg gct ctg cgc638Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg60 65 70cca tct gac gag ggc aca tac gag tgt gtt gtt ctg aag tat gaa aaa686Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys75 80 85gac gct ttc aag cgg gaa cac ctg gct gaa gtg acg tta tca gtc aaa734Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys90 95 100 105gct gac ttc cct aca cct agt ata tct gac ttt gaa att cca act tct782Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser110 115 120aat att aga agg ata att tgc tca acc tct gga ggt ttt cca gag cct830Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro125 130 135cac ctc tcc tgg ttg gaa aat gga gaa gaa tta aat gcc atc aac aca878His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr140 145 150aca gtt tcc caa gat cct gaa act gag ctc tat gct gtt agc agc aaa926Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys155 160 165ctg gat ttc aat atg aca acc aac cac agc ttc atg tgt ctc atc aag974Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys170 175 180 185tat gga cat tta aga gtg aat cag acc ttc aac tgg aat aca acc aag1022Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys190 195 200caa gag cat ttt cct gat aac ctg ctc cca tcc tgg gcc att acc tta1070Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu205 210 215atc tca gta aat gga att ttt gtg ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt1118Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe220 225 230gcc cca aga tgc aga gag aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa1166Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu235 240 245agt gta cgc cct gta taacagtgtc cgcagaagca aggggctgaa aagatctgaa1221Ser Val Arg Pro Val250ggtagcctcc gtcatctctt ctgggataca tggatcgtgg ggatcatgag gcattcttcc 1281cttaacaaat ttaagctgtt ttacccacta cctcaccttc ttaaaaacct ctttcagatt 1341aagctgaaca gttacaagat ggctggcatc cctctccttt ctccccatat gcaatttgct 1401taatgtaacc tcttcttttg ccatgtttcc attctgccat cttgaattgt cttgtcagcc 1461aattcattat ctattaaaca ctaatttgag 14912102211288212PRT213人(Homo sapiens)220223-34到-12位的信號序列可溶性蛋白的氨基末端測序2202231到208位的細胞外結構域；與已知序列的類似性220223209到235位的跨膜結構域；與已知序列的類似性220223236到254位的細胞內結構域；與已知序列的類似性22022319-21，55-57，64-66，152-154，173-175，177-179，192-194，198-200位的N連接的糖基化，與已知序列的類似性2202231到104位的Ig V-set結構域；與已知序列的類似性220223105到202位的Ig C-set結構域；與已知序列的類似性4002Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr-30 -25 -20Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys-15 -10 -5Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu-1 1 5 10Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile15 20 25 30Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp35 40 45Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr50 55 60Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly65 70 75Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg80 85 90Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr95 100 105 110Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile115 120 125Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu130 135 140Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp145 150 155Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met160 165 170Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg175 180 185 190Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro195 200 205Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly210 215 220Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg225 230 235Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val240 245 25021032111120212DNA213人(Homo sapiens)220221CDS222(107)..(1093)4003cacagggtga aagctttgct tctctgctgc tgtaacaggg actagcacag acacacggat 60gagtggggtc atttccagat attaggtcac agcagaagca gccaaa atg gat ccc 115Met Asp Pro1cag tgc act atg gga ctg agt aac att ctc ttt gtg atg gcc ttc ctg163Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu5 10 15ctc tct ggt gct gct cct ctg aag att caa gct tat ttc aat gag act211Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr20 25 30 35gca gac ctg cca tgc caa ttt gca aac tct caa aac caa agc ctg agt259Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser40 45 50gag cta gta gta ttt tgg cag gac cag gaa aac ttg gtt ctg aat gag307Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu55 60 65gta tac tta ggc aaa gag aaa ttt gac agt gtt cat tcc aag tat atg355Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met70 75 80ggc cgc aca agt ttt gat tcg gac agt tgg acc ctg aga ctt cac aat403Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn85 90 95ctt cag atc aag gac aag ggc ttg tat caa tgt atc atc cat cac aaa451Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys100 105 110 115aag ccc aca gga atg att cgc atc cac cag atg aat tct gaa ctg tca499Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser120 125 130gtg ctt gct aac ttc agt caa cct gaa ata gta cca att tct aat ata547Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile135 140 145aca gaa aat gtg tac ata aat ttg acc tgc tca tct ata cac ggt tac595Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr150 155 160cca gaa cct aag aag atg agt gtt ttg cta aga acc aag aat tca act643Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr165 170 175atc gag tat gat ggt att atg cag aaa tct caa gat aat gtc aca gaa691Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu180 185 190 195ctg tac gac gtt tcc atc agc ttg tct gtt tca ttc cct gat gtt acg739Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr200 205 210agc aat atg acc atc ttc tgt att ctg gaa act gac aag acg cgg ctt787Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu215 220 225tta tct tca cct ttc tct ata gag ctt gag gac cct cag cct ccc cca835Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro230 235 240gac cac att cct tgg att aca gct gta ctt cca aca gtt att ata tgt883Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys245 250 255gtg atg gtt ttc tgt cta att cta tgg aaa tgg aag aag aag aag cgg931Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg260 265 270 275cct cgc aac tct tat aaa tgt gga acc aac aca atg gag agg gaa gag979Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu280 285 290agt gaa cag acc aag aaa aga gaa aaa atc cat ata cct gaa aga tct1027Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser295 300 305gat gaa gcc cag cgt gtt ttt aaa agt tcg aag aca tct tca tgc gac1075Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp310 315 320aaa agt gat aca tgt ttt taattaaaga gtaaagccca aaaaaaa 1120Lys Ser Asp Thr Cys Phe3252104211329212PRT213人(Homo sapiens)4004Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met1 5 10 15Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe20 25 30Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln35 40 45Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val50 55 60Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser65 70 75 80Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg85 90 95Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile100 105 110His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser115 120 125Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile130 135 140Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile145 150 155 160His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys165 170 175Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn180 185 190Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro195 200 205Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys210 215 220Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln225 230 235 240Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val245 250 255Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys260 265 270Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu275 280 285Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro290 295 300Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser305 310 315320Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe32521052119212PRT213人工序列220223人工序列描述肽4005Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val1 5210621123212PRT213人工序列220223人工序列描述肽4006Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala1 5 10 15Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys20210721124212PRT213人工序列220223人工序列描述肽4007Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg1 5 10 15Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys20
權利要求
1.預防性增強受治療者對抗原的免疫應答的方法，包括將包含共同刺激分子細胞外結構域的可溶性組合物給藥，以便增強受治療者對抗原的免疫應答。
2.治療性增強受治療者對抗原的免疫應答的方法，包括將包含共同刺激分子細胞外結構域的可溶性組合物給藥，以便增強受治療者對抗原的免疫應答。
3.權利要求1或2的方法，其中該共同刺激分子選自由B7-1和B7-2組成的組。
4.增強受治療者對I類限制抗原的CD8+T細胞應答的方法，包括將包含I類限制抗原或其片段的第一種藥物和包含B7分子細胞外結構域的可溶性組合物給藥，以便一旦對受治療者給藥，即增強對I類限制抗原的CD8+T細胞應答。
5.權利要求4的方法，進一步包括將II類限制抗原對受治療者給藥。
6.權利要求1、2或4任一項的方法，進一步包括將佐劑對受治療者給藥。
7.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該B7分子是B7-1分子。
8.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該B7分子是B7-2分子。
9.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該共同刺激分子是單特異性的。
10.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該共同刺激分子是二聚體和二價的。
11.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該可溶性共同刺激分子是單特異性的和二聚體和二價的。
12.權利要求11的方法，其中B7分子細胞外部分是與包含免疫球蛋白分子一部分的第二種蛋白質或多肽融合的。
13.權利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子的該部分包含半胱氨酸殘基。
14.權利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子的該部分包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區、CH2和CH3區。
15.權利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子的該部分包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區、CH1、CH2和CH3區。
16.權利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子已經經過修飾，減少了補體固定和/或Fc受體結合。
17.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該抗原是腫瘤細胞抗原。
18.權利要求2的方法，其中該受治療者患有選自下組類型的癌癥結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肥大細胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
19.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該抗原選自由細菌抗原、病毒抗原和寄生物抗原組成的組。
20.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該免疫應答是細胞免疫應答。
21.權利要求1、2或4任一項的方法，其中該免疫應答是體液免疫應答。
全文摘要
提供了增強免疫應答的方法,其中將共同刺激分子、例如B7分子的可溶形式給藥,以增加對抗原、例如腫瘤細胞和感染性試劑的免疫應答。該方法可用於受治療者的預防性和治療性免疫作用。
文檔編號A61P35/00GK1377279SQ00810038
公開日2002年10月30日 申請日期2000年5月5日 優先權日1999年5月6日
發明者K·斯圖爾姆赫菲, S·F·沃爾夫, M·奧託勒 申請人:遺傳研究所有限公司