人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的新用途的製作方法

2023-06-07 23:53:56 2

專利名稱:人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的新用途，特別涉及其在製備治療肝癌的藥物中的應用。
背景技術：
端粒(telomere)是存在於真核生物線性染色體末端的由串聯重複的DNA序列及其相關蛋白所組成的結構，由於能防止染色體的端-端融合、重組和降解，故具有穩定染色體的作用。如所周知，參與真核生物線性DNA複製的DNA聚合酶並不能使染色體DNA完全複製，因而染色體末端的端粒序列在不斷分裂的過程中逐漸縮短。當人染色體的末端，又稱末端限制片斷TRF(terminal restriction fragments)，縮短到5-7Kbp時，細胞就會發生衰老(Harley CB et al.Cancer Surveys 1997 29263-84)，因此，端粒的長度和細胞壽命的控制相關。
端粒酶是一種由蛋白質和RNA構成的核糖核蛋白體。在絕大多數的真核生物中，端粒的長度都是通過端粒酶(telomerase)維持的。正常體細胞中，除生殖細胞、骨髓造血幹細胞及外周淋巴細胞等少數細胞外，一般沒有端粒酶的活性，染色體末端的端粒序列便會不斷縮短。由於腫瘤細胞是永生性的細胞，不會衰老，而85％的腫瘤細胞都具有端粒酶的表達(Shay JW et al.Eur J Cancer 1997 33787-91)，因此，端粒酶的活性與表達程度和腫瘤的發生、惡性及轉歸間的關係便成為近年來生物學和基礎醫學共同關注的熱點。端粒酶的激活可能是腫瘤發生的早期事件(Cheng RYS et al.Br J Cancer1998 77456-60)。
端粒酶的有關蛋白組分中，有一部分被稱之為端粒酶反轉錄酶樣結構(hTERT)的組分，目前引起了學界的關注，hTERT的編碼基因具有七個反轉錄酶保守結構域和一個端粒酶特異的保守結構域，其表達調控是多水平的，涉及轉錄、轉錄後mRNA剪切和蛋白磷酸化等，其中主要的調控方式是轉錄水平調控(Liu JP.FASEB J 1999 132091-104)。對hTERT基因啟動子區的分析表明，其啟動區存在轉錄因子MYC和Sp1的結合位點，核心調控區由59bp組成，位於-280到-150(Horikawa I，et al.Cancer Res 199959826-30、Kyo S，et al.Nucleic Acids Res 2000 28669-77)。
人類端粒酶催化亞單位或端粒酶反轉錄酶樣組分(hTERT，humantelomerase reverse transcriptase subunit)是人類端粒酶的重要組分，有活性的端粒酶反轉錄酶樣組分可以說是絕大部分惡性腫瘤共同的「標誌蛋白」，這種蛋白只在惡性腫瘤細胞中表達，在正常細胞中則沒有表達，其表達水平與腫瘤細胞的端粒酶活性水平呈正相關。如果研製成一種人類端粒酶催化亞單位或端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體，就有可能通過競爭抑制去抑制端粒酶的活性，阻斷腫瘤細胞的有絲分裂，從而達到控制腫瘤生長的目的。
考慮到hTERT蛋白相對於腫瘤細胞的特異性，啟發我們打算用hTERT基因的點突變體(DN-hTERT)去抑制人肝癌細胞的異常分裂，從而有可能將這種點突變的基因通過載體注入患者體內進行基因治療，達到控制肝癌的目的。根據文獻報導，應用PCR定點突變的方法，將端粒酶反轉錄酶樣組分的第三個保守的反轉錄結構域中710和711位的編碼天冬氨酸和纈氨酸殘基的序列替換為編碼丙氨酸和異亮氨酸的序列，從而構建了端粒酶反轉錄酶組分的功能域突變體(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)，其基因序列見序列表中的2101(Counter CM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 19989514723-8、Hahn WC，et al.Nat Med 1999 51164-70)，已有文獻報導該功能域突變體在卵巢癌細胞(36M)、乳腺癌細胞(SW613和SKBR3)和結腸癌細胞LoVo中可以有效抑制上述各種癌細胞的端粒酶活性進而使之發生凋亡(Hahn WC，et al.Nat Med 199951164-70)，但該功能域突變體對有「癌中之王」之稱的肝癌的端粒酶活性及其惡性行為的影響在國際上卻無報導。
根據Medline的檢索，目前並無任何有關採用人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體進行臨床治療肝癌的研究的報導。查到有關telomerase和catalytic and mutant的文獻18篇，其中涉及肝癌的研究為0篇。

發明內容
本發明的目的在於提供一種人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的新用途，特別是其在製備治療肝癌的藥物中的應用。該基因突變體的基因順序包括在端粒酶反轉錄酶樣組分各保守結構域的各種可能的突變順序；該基因突變體的突變方式是點突變；該基因突變體的基因序列為2101中所述序列；該基因突變體的載體為真核表達質粒或核酸病毒；該核酸病毒為反轉錄病毒或腺病毒；所述藥物的給藥方式為靜脈注射或肌肉注射。
在BEL-7404人肝癌細胞中表達端粒酶反轉錄酶組分的功能域突變體後，由於該突變體可以與野生型的端粒酶反轉錄樣組分發生競爭，因而可以有效抑制其端粒酶活性，表達DN-hTERT的BEL-7404人肝癌細胞的端粒長度隨著細胞分裂的進行逐漸縮短，而表達野生型的反轉錄酶組分(wild typehTERT，WT-hTERT)和空白載體對照的細胞則沒有這樣的變化；DN-hTERT表達細胞的生長受到抑制，抑制程度與端粒酶活性的抑制水平相關，但WT-hTERT表達細胞的生長與對照細胞相比則幾乎沒有變化；DN-hTERT表達細胞在細胞傳代培養的後期，細胞膨脹變大；當DN-hTERT表達細胞的端粒長度達到極限短時(大約1.7Kb)，細胞發生凋亡；裸鼠成瘤性實驗結果顯示，DN-hTERT表達細胞的裸鼠成瘤性消失。上述結果表明，端粒酶的反轉錄酶組分對肝癌細胞的生長是必需的，是肝癌基因治療和抗肝癌藥物篩選的理想靶點。
我們又將端粒酶的反轉錄酶組分的基因點突變體對載人肝癌的裸鼠模型進行了實驗治療，結果令人滿意。並在實驗動物中證明了端粒酶反轉錄酶組分的功能域突變體能夠使人肝癌細胞的成瘤性消失。上述結果表明通過基因點突變構建的端粒酶的反轉錄酶組分的功能域突變體作為一種治療人類肝細胞肝癌的新藥是完全值得的。



圖1表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)對BEL-7404人肝癌細胞端粒酶活性的影響。
其中1-裂解液陰性對照 2-BEL-7404母細胞對照3-Vector對照 4-WT-hTERT表達克隆25-WT-hTERT表達克隆3 6-WT-hTERT表達克隆87-DN-hTERT表達克隆1 8-DN-hTERT表達克隆39-DN-hTERT表達克隆4 10-DN-hTERT表達克隆8圖2表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)對BEL-7404人肝癌細胞端粒長度的影響。
其中1，7-Marker 2，8-Bel-7404母細胞3-Vector對照 4-WT-hTERT表達克隆3，PD 105-DN-hTERT表達克隆3，PD 7 6-DN-hTERT表達克隆1，PD 109-WT-hTERT表達克隆2，PD 5 10-WT-hTERT表達克隆2，PD 1011-WT-hTERT表達克隆2，PD 15 12-DN-hTERT表達克隆4，PD 113-DN-hTERT表達克隆4，PD 8 14-DN-hTERT表達克隆4，PD 15圖3表示出外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表達對BEL-7404人肝癌細胞生長的影響。
其中除了DN-hTERT表達克隆3，在PD 5外，所有實驗細胞均處於PD6。實驗結果顯示為平均值±標準誤，每組實驗數值均來自3個復孔。
圖4表示出外源DN-hTERT基因表達誘導的BEL-7404人肝癌細胞的形態變化。
其中A-表達DN-hTERT基因的BEL-7404人肝癌細胞；B-表達WT-hTERT基因的BEL-7404人肝癌細胞；C-BEL-7404人肝癌細胞；D-表達空白載體對照的BEL-7404人肝癌細胞。
圖5表示出外源DN-hTERT基因表達誘導的BEL-7404人肝癌細胞超微形態的變化。
其中A-表達WT-hTERT基因的BEL-7404人肝癌細胞；B-表達空白載體對照的BEL-7404人肝癌細胞；C-達DN-hTERT基因的BEL-7404人肝癌細胞。
圖6A、6B、6C表示出流式細胞儀檢測DN-hTERT表達克隆3，PD 7；WT-hTERT表達克隆3，PD 10和空白載體表達克隆，PD 10的細胞凋亡結果。
圖7表示出TUNEL檢測細胞凋亡的結果。
其中A-DN-hTERT表達克隆細胞 B-WT-hTERT表達克隆細胞C-表達空白載體對照的細胞 D-陰性對照E-陽性對照圖8表示出外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表達對BEL-7404人肝癌細胞裸鼠成瘤性的影響。
其中A-BEL-7404人肝癌母細胞B-表達空白載體對照克隆細胞C-表達WT-hTERT外源基因克隆3D-表達WT-hTERT外源基因克隆8E-表達DN-hTERT外源基因克隆1
F-表達DN-hTERT外源基因克隆具體實施方式
實施例1在BEL-7404人肝癌細胞中表達端粒酶反轉錄酶組分的功能域突變體(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)可以有效抑制其端粒酶活性。
經過脂質體轉染，篩選和鑑定後，以非放射性端粒酶活性定量測定方法檢測端粒酶活性，該方法包括含端粒酶的細胞抽提液的製備、端粒酶介導的延伸反應、PCR擴增和染色拍照等步驟(Zhang RG，et al.Cell Res，20001071-7)。我們觀察了外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)對BEL-7404人肝癌細胞端粒酶活性的影響，以裂解液為陰性對照，以BEL-7404細胞為母細胞對照，以pCMV-script質粒為Vector對照，發現所有的WT-hTERT表達克隆的端粒酶活性均有所活躍，所有的DN-hTERT表達克隆的端粒酶均有所抑制，其抑制程度同DN-hTERT的表達強度相平行(見圖1)。
實施例2表達DN-hTERT的BEL-7404人肝癌細胞的端粒長度隨著細胞分裂的進行逐漸縮短，而表達野生型的反轉錄酶組分(wild type hTERT，WT-hTERT)和空白載體對照的細胞則沒有這樣的變化；以Southerblot方法應用Roche公司試劑盒，該方法有以下一些步驟細胞基因組DNA的抽提、Rsa I/HinfI酶切、與標記的端粒特異探針雜交和端粒長度計算(Ulaner GA，et al.Int J Cancer 2001 91644-9)。我們觀察了外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)對BEL-7404人肝癌細胞端粒長度的影響，以Roche公司的DNA Marker(以Kilo base pair為單位)為標誌值，以Bel-7404細胞為母細胞對照，以pCMV-script質粒為Vector對照，發現所有WT-hTERT的、包括連續傳代後的表達克隆，其端粒DNA長度與對照細胞均相似，而DN-hTERT表達克隆則隨著細胞的傳代，其端粒DNA長度逐漸縮短(見圖2)。
實施例3DN-hTERT表達細胞的生長受到抑制，抑制程度與端粒酶活性的抑制水平相關，但WT-hTERT表達細胞的生長與對照細胞相比則幾乎沒有變化。
以臺盼藍拒染法測定端粒酶反轉錄樣組分的功能域突變體對細胞生長的影響，將細胞按3×104個細胞/孔，接種到96孔板中培養。每12小時收集細胞進行計數，連續觀察96小時。計數時，將細胞懸液與等體積的0.4％臺盼藍混合。活細胞的細胞膜完整，透明不著色，而著色的細胞均為死細胞計數時不予計算。實驗中，以轉染有pCMV-script Vector和表達WT-hTERT的BEL-7404人肝癌細胞為對照，我們觀察了表達DN-hTERT的BEL-7404細胞的生長情況同端粒酶活性間的相關性，發現表達WT-hTERT細胞的生長情況與轉染有pCMV-script Vector的對照細胞相似，但表達DN-hTERT的BEL-7404細胞的生長明顯受到抑制(見圖3)。
實施例4DN-hTERT表達細胞在細胞傳代培養的後期，細胞膨脹變大；當DN-hTERT表達細胞的端粒長度達到極限短時，細胞發生凋亡。
我們以BEL-7404人肝癌母細胞、轉染有pCMV-script Vector和表達WT-hTERT的BEL-7404人肝癌細胞為對照，發現當DN-hTERT表達細胞在細胞傳代培養的後期，細胞膨脹變大。以電子顯微鏡觀察細胞核形態、TUNEL原位細胞凋亡檢測和流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。其中TUNEL原位細胞凋亡檢測方法為，在蓋玻片上培養的細胞空氣乾燥，4％多聚甲醛室溫固定1h，PBS洗片並用含3％H2O2的甲醛作用10min終止固定，PBS洗片並用含0.1％ Triton X-100的0.1％檸檬酸鈉冰上浸浴滲透2min，PBS洗片兩次並加TUNEL反應混合物50μl，37℃孵育1h，PBS洗片三次並加Conver-POD試劑50μl，37℃孵育30min，螢光顯微鏡下觀察拍照。以不含末端轉移酶的標記試劑代替TUNEL反應混合物孵育滲透後的細胞作為陰性對照。以50μg/ml的DNase I室溫作用滲透後的細胞10min誘導DNA斷裂作為陽性對照；流式細胞儀檢測細胞凋亡的方法為細胞收集後用D-Hanks洗滌一次，檸檬酸固定液(40mmol/L sodium citrate，250mmol/L sucrose，5％DMSO)固定後置4℃保存，測定時PI染色(50mg/L RNase A，20mg/L PI)，流式細胞儀(Becton-Dickson公司產品)檢測細胞凋亡率(Kang JX，et al.Cell Growth Differ 1999 10591-600、Andreassen PR，et al.J Cell Biol 1994 127789-802)。結果發現，當端粒長度達到1.7Kb時，細胞發生凋亡(見圖4-7)。
實施例5裸鼠成瘤性實驗結果顯示，DN-hTERT表達細胞的裸鼠成瘤性消失(HahnWC，et al.Nature 1999 400464-8)。
將雌性Balb/c裸鼠隨機分為6組，每組5鼠，按2×106個細胞/鼠將不同處理方式的BEL-7404人肝癌細胞接種於裸鼠的右側腋下，在無病原體的條件下飼養，接種五周後處死裸鼠觀察接種細胞的成瘤情況。我們發現母細胞組(Parental cells)、空載體對照組(Vector control)、表達端粒酶反轉錄酶樣組分的2個觀察組(WT-hTERT)均100％成瘤，而表達端粒酶反轉錄酶樣組分突變體(DN-hTERT)的2個觀察組則100％不形成腫瘤(見表1和圖8)表1 外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表達對BEL-7404人肝癌細胞裸鼠成瘤性的影響


SEQUENCE LISTING110中國科學院上海細胞生物學研究所120人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的新用途13011602170PatentIn version 3.121012113399212DNA213human220
221CDS222(1)..(3399)223
4001atg ccg cgc gct ccc cgc tgc cga gcc gtg cgc tcc ctg ctg cgc agc48Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser1 5 10 15cac tac cgc gag gtg ctg ccg ctg gcc acg ttc gtg cgg cgc ctg ggg96His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly20 25 30ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac ccg gcg gct ttc cgc144Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg35 40 45gcg ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg ccg192Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60ccc ccc gcc gcc ccc tcc ttc cgc cag gtg tcc tgc ctg aag gag ctg240Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu65 70 75 80gtg gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac gtg288Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val85 90 95ctg gcc ttc ggc ttc gcg ctg ctg gac ggg gcc cgc ggg ggc ccc ccc336Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro100 105 110gag gcc ttc acc acc agc gtg cgc agc tac ctg ccc aac acg gtg acc384Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr115 120 125gac gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ttg cgc cgc gtg432Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val130 135 140ggc gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt gtg480Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val145 150 155 160ctg gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg tac528
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr165 170 175cag ctc ggc gct gcc act cag gcc cgg ccc ccg cca cac gct agt gga576Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly180 185 190ccc cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc agg624Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg195 200 205gag gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg cgc672Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg210 215 220ggg ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg cgt720Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg225 230 235 240ggc gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc tgg768Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp245 250 255gcc cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt gtg816Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val260 265 270gtg tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt gcg
864Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala275 280 285ctc tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac cac912Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His290 295 300gcg ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg cct960Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro305 310 315 320tgt ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca ggc1008Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly325 330 335gac aag gag cag ctg cgg ccc tcc ttc cta ctc agc tct ctg agg ccc1056Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro340 345 350agc ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt tcc1104Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser355 360 365agg ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc cag1152Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln370 375 380
cgc tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac cac1200Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His385 390 395 400gcg cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg cga1248Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg405 410 415gct gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc cag1296Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Giy Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln420 425 430ggc tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc ctg1344Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu435 440 445gtg cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc ttc1392Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe450 455 460gtg cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc tcc1440Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser465 470 475 480agg cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc tcc1488Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser485 490 495
ctg ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag atg1536Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met500 505 510agc gtg cgg ggc tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc tgt1584Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys515 520 525gtt ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag ttc1632Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe530 535 540ctg cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tct ttc1680Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe545 550 555 560ttt tat gtc acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctc ttt ttc tac1728Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr565 570 575cgg aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag cac1776Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His580 585 590ttg aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg cag1824Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln595 600 605
cat cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc atc1872His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile610 615 620ccc aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc gtg1920Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val625 630 635 640gga gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc tcg1968Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser645 650 655agg gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gcg cgg cgc2016Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg660 665 670ccc ggc ctc ctg ggc gcc tct gtg ctg ggc ctg gac gat atc cac agg2064Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg675 680 685gcc tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg cct2112Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro690 695 700gag ctg tac ttt gtc aag gtg gct atc acg ggc gcg tac gac acc atc2160Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715ccc cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc cag2208Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln725 730 735aac acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc cat2256Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His740 745 750ggg cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca gac2304Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp755 760 765ctc cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc agc2352Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser770 775 780ccg ctg agg gat gcc gtc gtc atc gag cag agc tcc tcc ctg aat gag2400Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu785 790 795 800gcc agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac cac2448Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His805 810 815gcc gtg cgc atc agg ggc aag tcc tac gtc cag tgc cag ggg atc ccg2496Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830cag ggc tcc atc ctc tcc acg ctg ctc tgc agc ctg tgc tac ggc gac2544Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp835 840 845atg gag aac aag ctg ttt gcg ggg att cgg cgg gac ggg ctg ctc ctg2592Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu850 855 860cgt ttg gtg gat gat ttc ttg ttg gtg aca cct cac ctc acc cac gcg2640Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala865 870 875 880aaa acc ttc ctc agg acc ctg gtc cga ggt gtc cct gag tat ggc tgc2688Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys885 890 895gtg gtg aac ttg cgg aag aca gtg gtg aac ttc cct gta gaa gac gag2736Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu900 905 910gcc ctg ggt ggc acg gct ttt gtt cag atg ccg gcc cac ggc cta ttc2784Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe915 920 925ccc tgg tgc ggc ctg ctg ctg gat acc cgg acc ctg gag gtg cag agc2832
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser930 935 940gac tac tcc agc tat gcc cgg acc tcc atc aga gcc agt ctc acc ttc2880Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe945 950 955 960aac cgc ggc ttc aag gct ggg agg aac atg cgt cgc aaa ctc ttt ggg2928Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly965 970 975gtc ttg cgg ctg aag tgt cac agc ctg ttt ctg gat ttg cag gtg aac2976Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn980 985 990agc ctc cag acg gtg tgc acc aac atc tac aag atc ctc ctg ctg cag3024Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln995 1000 1005gcg tac agg ttt cac gca tgt gtg ctg cag ctc cca ttt cat cag3069Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln1010 1015 1020caa gtt tgg aag aac ccc aca ttt ttc ctg cgc gtc atc tct gac3114Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp1025 1030 1035acg gcc tcc ctc tgc tac tcc atc ctg aaa gcc aag aac gca ggg
3159Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly1040 1045 1050atg tcg ctg ggg gcc aag ggc gcc gcc ggc cct ctg ccc tcc gag3204Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu1055 1060 1065gcc gtg cag tgg ctg tgc cac caa gca ttc ctg ctc aag ctg act3249Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr1070 1075 1080cga cac cgt gtc acc tac gtg cca ctc ctg ggg tca ctc agg aca3294Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr1085 1090 1095gcc cag acg cag ctg agt cgg aag ctc ccg ggg acg acg ctg act3339Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr1100 1105 1110gcc ctg gag gcc gca gcc aac ccg gca ctg ccc tca gac ttc aag3384Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys1115 1120 1125acc atc ctg gac tga3399Thr Ile Leu Asp1130
21022111132212PRT213human4002Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser1 5 10 15His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly20 25 30Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg35 40 45Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro50 55 60Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu65 70 75 80Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val85 90 95Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro100 105 110Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr115 120 125Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val130 135 140Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr165 170 175Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly180 185 190Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg195 200 205Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg210 215 220Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg225 230 235 240Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Trp245 250 255Ala His Pro Gly Arg Thr Arg y Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val260 265 270Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala275 280 285Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His290 295 300Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro305 310 315 320Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly325 330 335Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser355 360 365Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln370 375 380Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His385 390 395 400Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg405 410 415Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln420 425 430Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu435 440 445Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe450 455 460Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser465 470 475 480Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser485 490 495Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met500 505 510Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys515 520 525Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe545 550 555 560Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr565 570 575Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His580 585 590Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln595 600 605His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile610 615 620Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val625 630 635 640Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser645 650 655Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg660 665 670Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg675 680 685Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro690 695 700Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile705 710 715 720Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His740 745 750Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp755 760 765Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser770 775 780Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu785 790 795 800Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His805 810 815Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro820 825 830Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp835 840 845Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu850 855 860Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala865 870 875 880Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys885 890 895Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu900 905 910Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser930 935 940Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe945 950 955 960Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly965 970 975Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn980 985 990Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln995 1000 1005Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln1010 1015 1020Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp1025 1030 1035Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly1040 1045 1050Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu1055 1060 1065Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr1070 1075 1080Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr1085 1090 1095Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys1115 1120 1125Thr Ile Leu Asp1130
權利要求
1.人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的應用，其特徵在於，用於製備治療肝癌的藥物，且該基因突變體的突變方式為點突變，具有SEQ ID NO1所示的基因序列。
2.根據權利要求
1所述的應用，其特徵在於，該基因突變體的表達載體為真核表達質粒或核酸病毒。
3.根據權利要求
2所述的應用，其特徵在於，該核酸病毒為反轉錄病毒或腺病毒。
4.根據權利要求
1所述的應用，其特徵在於，所述藥物的給藥方式為靜脈注射或肌肉注射。
專利摘要
本發明公開了一種人端粒酶反轉錄酶樣組分的基因突變體的新用途，即其在製備治療肝癌的藥物中的應用。該基因突變體的基因順序包括在端粒酶反轉錄酶樣組分各保守結構域的各種可能的突變順序，該基因突變體的載體為真核表達質粒或核酸病毒，其作為藥物的給藥方式為靜脈注射或肌肉注射。
文檔編號A61K48/00GKCN1255186SQ02110521
公開日2006年5月10日 申請日期2002年1月9日
發明者謝弘, 張如剛, 郭立霞, 李雋哲, 來文 申請人:中國科學院上海細胞生物學研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan