用纖維素酶和葡糖澱粉酶提高發酵製備乙醇的產率的製作方法

2023-06-07 20:54:01 3

用纖維素酶和葡糖澱粉酶提高發酵製備乙醇的產率的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種改進的糖化工藝，所述糖化工藝包括使用葡糖澱粉酶和至少一種纖維素酶。所述改進的糖化工藝使發酵產物例如乙醇的產率提高。在一個實施例中，所述改進的糖化工藝使用商購的纖維素酶使乙醇的產率提高最多0.5%至1%。還提供了改進的同步糖化發酵(SSF)工藝，和包含液化澱粉漿、葡糖澱粉酶和纖維素酶的組合物。
【專利說明】用纖維素酶和葡糖澱粉酶提高發酵製備乙醇的產率
[0001]優先權
[0002]本專利申請要求提交於2011年4月29日的美國臨時申請N0.61/481，094的優先權，其全文以引用方式併入本文。
【技術領域】
[0003]本專利涉及澱粉和/或生物質的發酵，具體地講，涉及利用此類發酵提高產率例如乙醇產率的方法。具體地講，本專利涉及用葡糖澱粉酶和纖維素酶的組合糖化和/或發酵澱粉和/或生物質來發酵(包括同步糖化發酵(SSF)工藝)生產乙醇的組合物和方法。
【背景技術】
[0004]通過澱粉和/或生物質的工業發酵來生產可用產品(例如乙醇)仍然是受到廣泛關注的領域。乙醇的許多用途包括食品和飲料以及工業化學品、燃料添加劑或液體添加劑的應用。當前經濟、社會、政治、環境、能源和地質問題使燃料乙醇尤為受到關注。作為潛在的燃料源並因為其來源於可再生資源，乙醇可幫助降低對化石燃料源的依賴，減少不良排放，提高汽油發動機的性能，以及減小大氣中二氧化碳的積聚。
[0005]雖然已經關注利用主要為纖維質原料的糖化和發酵來獲得乙醇，但大多數乙醇由澱粉質原料的發酵製備而來。用含澱粉的原料製備乙醇的典型方法包括兩個連續的酶催化步驟，這些步驟導致在發酵前從澱粉釋中放出葡萄糖。第一個步驟是液化經過α-澱粉酶催化的澱粉。α -澱粉酶(EC3.2.1.1)是隨機裂解內部a -1, 4_D_糖苷鍵的內切水解酶。它們能夠將澱粉漿料降解成短麥芽糖糊精。由於α-澱粉酶降解澱粉，混合物的粘度降低。因為液化通常在高溫下進行，所以優選使用熱穩定性的α -澱粉酶，如來自芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)的α-澱粉酶。近年來，已經開發出許多新的α -澱粉酶來提高液化並提供許多引人關注的、新型和 可用的酶學性質。
[0006]酶液化可為多步驟方法。例如，添加酶之後，加熱漿料至約60至95°C之間的溫度，通常為約78至88°C之間的溫度。隨後，該漿料被加熱(例如噴射蒸煮或以其它方式)至通常約95至125°C之間的溫度，然後冷卻至約60至95°C。添加更多的酶，並以所需溫度(通常約60至95°C )另外保持該糊狀物約0.5至4小時。在一些情況下，已知纖維素酶被添加至液化槽來幫助降低糊狀物的粘度。用於該目的的商業纖維素酶產品的例子包括由丹尼斯克公司傑能科分公司(Danisco』 s Genencor Division))生產的多種0PTIMASH?,例如OPTIMASHtmBG、OPTIMASHtmTBG、OPTIMASHtmVR 和 OPTIMASHtmXL。
[0007]儘管在此類液化過程中粘度下降，並且長澱粉分子裂解成短麥芽糖糊精，但這些麥芽糖糊精無法容易地通過酵母發酵來形成醇。因此，可能需要第二酶催化步驟糖化進一步分解麥芽糖糊精。通常使用葡糖澱粉酶和/或麥芽糖α-澱粉酶來催化液化後形成的麥芽糖糊精的非還原性末端的水解，以釋放葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖。還可用分支酶例如支鏈澱粉酶來幫助糖化。糖化通常在高溫的酸性條件下進行，例如。約60°C、pH4.3。
[0008]雖然基本的酶澱粉液化方法得到很好的建立，但進一步提高商業澱粉加工是有用的。具體地講，在碾磨原料(例如穀物，如玉米)以及澱粉的凝膠化和液化後剩餘有纖維素材料。這種纖維素材料可捕獲或結合一些澱粉，從而降低了理論和實際產率。液化期間可使用纖維素酶來降低眾料的粘度。參見例如0hgren等人的Process Biochemistry, Vol.42，pp.834-839，2007 (《過程生物化學》，第42卷，第834-839頁，2007年)。SSF過程中還可將纖維素酶用於預處理的木質纖維素材料，例如針葉木漿和甘蔗渣。參見例如Kovdcs等人的 Process Biochemistry, Vol.44, pp.1323-1329，2009 (《過程生物化學》,第 44 卷，第1323-1329 頁，2009 年)；和 daSilva 等人的 Bioresource Technology, Vol.101, pp.7402-7409，2010(《生物資源技術》，第101卷，第7402-7409頁，2010年)。能夠提高發酵產物例如乙醇的產率的方法代表本領域的一次進步，因為僅根據在美國每年生產的120億加侖乙醇來考慮而言，即使很小的可再生產率的提高(如果在不投入額外能源的條件下可以達到)也是有價值的。

【發明內容】

[0009]提供了用於糖化和發酵含澱粉材料的方法。在存在用於發酵原液的纖維素酶和葡糖澱粉酶的情況下，可通過糖化澱粉植物材料(例如糧谷)來提高產率。該方法涉及在液化後優選地在例如糖化和/或發酵過程中添加纖維素酶和葡糖澱粉酶。本方法不同於以下本領域已知的方法:(1)在用以降低漿料的粘度的液化過程中使用纖維素酶(纖維素酶通常在高溫液化步驟結束時失活)；以及(2)在針對具有低澱粉含量的富含纖維素的材料的SSF過程中使用纖維素酶。例如在同步糖化發酵(SSF)過程中可添加酶。不限於任何特定作用模式，所述酶可水解纖維素材料的某些部分和/或幫助釋放結合到纖維素纖維或纖維素纖維捕獲的澱粉分子。無論何種機制，添加所述酶的淨效應是提高產率，這明顯是由於釋放/轉化額外的可發酵材料來生成額外的葡萄糖。
[0010]幹酒糟及可溶物(DDGS)是幹磨乙醇設施的副產物，其通常含有約葡聚糖總量的20%或更多，其中約16% (乾重計)來源於纖維素。(參見Youngmi等人的BioresourceTechnology, 99:5165-5176 (2008)(《生物資源技術》，第 99 卷，第 5165-5176 頁，2008 年))。如果完全轉變成葡萄糖，該纖維素理論上每蒲式耳玉米可多生產約0.1加侖乙醇。(Savilleand Yacyshyn,「Effect of Cellulase Supplementation on Cookline Operation in ADryMill Ethanol Plant,，27th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.,May 1-4, 2005, Denver, CO) (Saville和Yacyshyn, 「補充纖維素酶對在幹磨乙醇植物中進行Cookline操作的影響」，《第27屆燃料與化學物用生物技術專題討論會》，2005年5月I日至4日，科羅拉多州丹佛))。例如，對於乙醇發酵，產率可提高0.4-0.5%。如果在工業範圍內應用，此類提高每年會在美國多生產4800-6000萬加侖乙醇。
[0011]因此，在第一方面，提供了一種糖化含澱粉底物以生成發酵原液的方法。該方法包括(a)在足以產生酶活性的條件下使包含至少一些纖維素材料的液化的澱粉漿料(即液化物)與葡糖澱粉酶和纖維素酶接觸，以及(b)使酶有時間產生活性，從而生成發酵原液。優選地，酶活性足以至少:(a)提高發酵原液中至少一種可發酵糖的濃度；(b)釋放至少一條結合到纖維素或纖維素捕獲的澱粉鏈；或(C)水解存在於液化澱粉漿料中的纖維素材料的某些部分。
[0012]在一個實施例中，提供了用於提高通過發酵澱粉底物生產的發酵產物的產率的方法。該方法通常包括以下步驟:選擇包含至少一些纖維素材料的液化澱粉，在足以產生酶活性的條件下使液化澱粉與葡糖澱粉酶和纖維素酶接觸，隨後發酵該混合物以生產發酵產物。在一個目前的優選實施例中，發酵產物為乙醇。在多個實施例中，發酵產物的產率可提高約0.1%至約1.0%。
[0013]在另外的實施例中，提供了同步糖化和發酵液化穀類澱粉的方法。此類方法包括以下步驟:(I)在存在適於發酵的生物體的情況下，使液化澱粉漿料與葡糖澱粉酶和纖維素酶在足以產生酶活性和發酵的條件下接觸，(2)使酶產生活性並進行發酵。在一個實施例中，發酵進行至少24至約72小時。相對於沒有添加纖維素酶的對照發酵，該發酵可具有提高的產率。在一個實施例中，該發酵生成乙醇，並且乙醇產率提高了例如約0.1至約1.0%。
[0014]在另一個方面，提供了包含液化澱粉漿料、葡糖澱粉酶和纖維素酶的組合物。此類組合物可用於製備發酵乙醇或其他可用產品的給料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1示出了在對32%幹固體(DS)玉米醪進行72小時發酵的過程中添加纖維素酶對乙醇產率的影響。實驗使用了 SSF方法。所述葡糖澱粉酶為0.4GAU/g玉米的G-ZYME480(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division))。所述纖維素酶為以5千克/公噸幹玉米添加的ACCELLERASE1000 (丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division))。對照包含葡糖澱粉酶,但不添加纖維素酶。測量乙醇DPl和DP2濃度以進行對照和纖維素酶處理。y軸示出了濃度(g/L) ;x軸表示發酵的時間(小時)。
[0016]圖2是條形圖，示出了在存在葡糖澱粉酶的情況下在液化物中每公噸幹固體(kg/MT DS)含有0、5、10和50kg纖維素酶的結果。y軸示出了指定時間的乙醇的量(g/L)。
[0017]圖3-4示出了將葡糖澱粉酶`(G-ZYME，(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(DaniscoUS Inc., Genencor Division)以 0.4GAU/g 玉米)和纖維素酶(ACCELLERASE1500 (丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division) ) 0.5-2kg/MT DS)添加至玉米醪發酵的一個實驗的結果。圖3描述了葡糖澱粉酶和纖維素酶對乙醇產率的影響。該圖表示出了相對於添加的纖維素酶的量(％重量/重量DS)，y軸上乙醇的最終量(％體積H體積)。圖4示出了圖3描述的實驗中相對於添加的纖維素酶的量，發酵中葡萄糖的最終濃度。該圖表示出了相對於添加的纖維素酶的量(％重量/重量DS)，y軸上的最終葡萄糖濃度(％重量/體積)。
【具體實施方式】
[0018]本文提供的方法包括在液化後糖化澱粉材料的位置使用纖維素酶。在澱粉材料例如糧谷的糖化或SSF過程中添加纖維素酶可提高發酵產物的產率。改進的糖化或SSF工藝有利地增加了葡萄糖的濃度，釋放結合到纖維素材料、與纖維素材料結合或被其捕獲的一個或多個澱粉分子，或分解在例如幹磨和液化後剩餘的纖維素的至少某些部分。在一個實施例中，改進的糖化工藝使用與葡糖澱粉酶一起添加的商購的纖維素酶，導致乙醇的產率提聞。
[0019]1.定義和縮寫[0020]根據此描述，應用下面的縮寫和定義。應該指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明確指明，否則單數形式「一個」、「一種」和「該」包括多個指代物。因此，例如，提及「一種酶」包括多個此種酶，而提及「該製劑」，包括提及一個或多個製劑以及本領域技術人員已知的其等同物，等等。另外，本文所用的術語「包含」及其同源詞以其「包括在內」的含義使用；也就是說，與術語「包括」及其相應的同源詞等同。
[0021]除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常所理解的含義。下面提供如下的術語。
[0022]1.1.定義
[0023]相對於數值或範圍的術語「約」表示數值可最高至10%，大於或小於所述值。在其他實施例中，「約」表示數值可最高至5%，大於或小於所述值。
[0024]如本文所用，「澱粉」指由植物的複雜多糖碳水化合物構成的任何材料，由具有式(C6H10O5)x (其中X可以是任何正整數)的直鏈澱粉和支鏈澱粉構成。具體地講，該術語指任何植物基材料，包括(但不限於)穀物、草、塊莖和根。所述澱粉材料優選地為小麥、大麥、玉米、裸麥、燕麥、 穀物高粱」，也被稱為「蜀黍」。
[0025]術語「漿料」指含有至少一些不溶性固體的水性混合物。漿料還可包含一種或多種可溶組分。研磨的穀物、麵粉或澱粉通常懸浮在水性溶液中，以形成漿料，用於檢測澱粉酶或液化工藝。
[0026]「凝膠化」意指使澱粉分子通過蒸煮增溶形成粘性懸浮液。
[0027]術語「液化」意指澱粉被「液化」或轉變成粘性更低的短鏈可溶糊精的過程。液化過程包括在至少添加α-澱粉酶的同時或之前凝膠化澱粉。因此，液化是膠凝化澱粉被酶法水解例如從而減小澱粉的鏈長並降低其粘度的階段。如本文所用，「液化物」指液化澱粉漿料，即所得的水解混合物。此類液化物通常是與發酵結合的糖化過程的原料。
[0028]如本文所用，「糖化」指酶將澱粉轉化為葡萄糖。液化後，「糖化」澱粉漿料以將麥芽糖糊精轉化為可發酵糖，例如葡萄糖、麥芽糖。糖化涉及使用酶，特別是葡糖澱粉酶，但也經常使用分支酶。
[0029]術語「聚合度」(DP)指給定的糖類中無水吡喃葡萄糖的數目(n)。DPI的實例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的實例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP>3表示聚合度大於3的聚合物。可使用DP來測量澱粉(高DP)分解至糖(低DP)的相對程度。術語「DE」或「右旋糖當量」被定義為還原糖佔總碳水化合物的百分比。
[0030]「同步糖化發酵」 (SSF)指特定類型的發酵方法，其中糖化原料(例如全穀物或其他包含澱粉和纖維素材料的生物質)的步驟和發酵步驟結合成一起進行的單一步驟。
[0031]「澱粉酶」意指除其他方面外還能夠催化澱粉、直鏈澱粉、支鏈澱粉等的降解的酶。一般來講，澱粉酶包括(a)裂解含三個或更多個a-D-α —4)連接的葡萄糖單元的多糖中的a-D-(l — 4)0-糖苷鍵的內切酶活性(例如存在於α-澱粉酶(EC3.2.1.1; a -D-(I — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶))，和(b)依次從非還原性末端裂解底物分子的外切澱粉分解活性。後者的例子可見於澱粉酶出03.2.1.2)，其生成β-麥芽糖。β -澱粉酶、a -葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20; a -D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡萄糖澱粉酶(EC3.2.1.3 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和產物特異性澱粉酶可由相應底物生成特定長度的麥芽低聚糖。
[0032]「 α -澱粉酶」(例如Ε.C.3.2.1.1)通常指催化α -1, 4_葡糖苷鍵水解的酶。這些酶影響含1，4- α -鍵合的D-葡萄糖單元的多糖中1，4- a -D-葡糖苷鍵的水解。α -澱粉酶在α-構型中釋放還原性基團。針對本發明的目的，「α-澱粉酶」尤其包括那些具有相對高熱穩定性(即在高溫下具有持續活性)的α澱粉酶。例如，α-澱粉酶可用於在高於80°C的溫度下液化澱粉。[0033]相對於酶的「活性」意指催化活性並包括任何可接受的測量酶活性的度量，例如活性速率、活性量或比活性。如本文所用，術語「比活性」意指一種酶單位，定義為在特定條件下每單位時間被酶製劑轉化為產物的底物的摩爾數。比活性表達為蛋白質單位(U)/mg。
[0034]「 α -澱粉酶單位」(AAU)指按照美國專利N0.5，958，739中公開的方法測量的α -澱粉酶活性。簡而言之，測定法使用對硝基苯麥芽庚糖苷(PNP-G7)作為底物，其非還原末端糖被化學封閉。PNP-G7可被內切澱粉酶例如α-澱粉酶裂解。裂解後，α-葡糖苷酶和葡糖澱粉酶消化該底物以釋放游離的PNP分子，從而顯示黃顏色，可通過可見光分光光度法在410nm處測量。PNP釋放速率與澱粉酶活性成比例。比照標準對照品計算給定樣品的AAU。一個單位的AAU指在指定條件下每分鐘水解IOmg的澱粉所需的酶量。
[0035]「葡糖澱粉酶」是一種外切澱粉酶，其從直鏈澱粉和支鏈澱粉分子的非還原性末端釋放葡糖基殘基。葡糖澱粉酶還催化水解α-1，6和^-1，3鍵，儘管速率遠低於(1-1，4鍵。葡糖澱粉酶活性可在「葡糖澱粉酶單元」(GAU)中表達。
[0036]如本文所用，「纖維素」是通用術語，包括纖維素、半纖維素、木質素、相關β-D-葡聚糖等。
[0037]如本文所用，「纖維素酶」指所有水解纖維素的酶，即其任何組分，例如纖維素、半纖維素、木質素和/或相關β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷鍵，例如存在於穀物中的那些。因此，「纖維素酶」至少包括所有分類為E.C.3.2.1.4 (纖維素酶/內切纖維素酶)、Ε.C.3.2.1.91 (外切纖維素酶)和Ε.C.3.2.1.21 (纖維二糖酶)的酶。內切纖維素酶的例子包括內切糖酶-1，4-β -葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶(CMCase)、內切_1，4_β -D-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，4-內切糖酶葡聚糖水解酶和纖維素糊精酶。外切纖維素酶的例子包括從還原性末端作用的纖維二糖水解酶和在纖維素分子的非還原性末端作用的那些。β葡萄糖苷酶是纖維二糖酶的另一個名稱。在本文的某些實施例中，纖維素酶優先指內切纖維素酶、外切纖維素酶、半纖維素酶和β -葡萄糖苷酶中的一種或多種，或它們的任意組合。商業製備纖維素酶組合物在本文中適用，包括例如丹尼斯克公司傑能科分公司(Danisco，s Genencor Division)的產品，如 ACCELLERASE1000 和 ACCELLERASE1500，其包括外切-和內切-葡聚糖酶、半纖維素酶和β葡萄糖苷酶。
[0038]在本文中，術語「蛋白質」與「多肽」可互換使用。
[0039]術語「衍生自」涵蓋術語「來源於」、「獲自」或「可獲自」和「分離自」。
[0040]「發酵」是通過微生物酶分解和/或無氧分解有機物質以生成更簡單的有機化合物。雖然發酵在無氧條件下進行，但並不是說該術語只限於嚴格的無氧條件，因為在存在多種氧氣含量的條件下也可以進行發酵。發酵涵蓋了含顆粒澱粉的澱粉底物向終產物的至少任何發酵生物轉化(例如在容器或反應器中)。
[0041]術語「接觸」指將相應酶放置在反應器、管等中，使得所述酶能夠足夠接近相應底物，以便使酶將底物轉化為終產物。本領域的技術人員將認識到，將酶(例如在溶液中)與一種或多種相應底物混合(無論是以相對純或不純的形式)會影響接觸。
[0042] 如本文所用，術語「幹固體含量(ds)」指按乾重計的混合物(如漿料)的總固體。幹固體含量和乾重計通常表達為例如被測材料的重量佔總乾材料重量的百分比。
[0043]術語「殘餘澱粉」指發酵後以穀物副產物形式存在的澱粉的量。通常，100克DDGS中存在的殘餘澱粉的量可以是其中一個參數，以評估發酵過程(例如乙醇製備過程)中澱粉的利用率。
[0044]如本文所用，「回收步驟」指回收糊狀物組分，其可包括殘餘澱粉、酶和/或微生物以發酵包括澱粉的底物。
[0045]術語「糊狀物」指可發酵碳源(碳水化合物)在水中的混合物，其用於製備發酵產物，例如醇。在一些實施例中，術語「啤酒」和「糊狀物」可交換使用。
[0046]術語「釜餾物」指非發酵固體與水的混合物，所述混合物是將醇從發酵糊狀物移除後的殘餘物。
[0047]術語「幹酒糟」(DDG)和「幹酒糟及可溶物」(DDGS)指穀物發酵的可用副產物。
[0048]如本文所用，「微生物」包括任何細菌、酵母或真菌種。
[0049]如本文所用，「乙醇微生物」指能夠將糖或低聚糖轉化為乙醇的微生物。乙醇微生物能生產乙醇是因為其能夠表達一種或多種酶，所述酶單獨或一起將糖轉化為乙醇。
[0050]如本文所用，「乙醇生產者」或「產乙醇微生物」指任何能夠從己糖或戊糖製備乙醇的有機物生物體或細胞。一般來講，產生乙醇的細胞包含醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產乙醇微生物的例子包括真菌微生物，例如酵母。在乙醇製備過程中使用的典型酵母包括酵母屬的菌種和菌株，例如釀酒酵母。
[0051]結合多核苷酸或蛋白質的術語「異源」是指並非天然存在於宿主細胞中的多核苷酸或蛋白質。在一些實施例中，蛋白質是商業上很重要的工業蛋白質。意在使該術語涵蓋通過天然存在的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質。
[0052]結合多核苷酸或蛋白質的術語「內源」是指天然存在於宿主細胞中的多核苷酸或蛋白質。
[0053]如本文所用，術語「回收的」、「離析的」和「分離的」指從至少一種與其天然結合的組分移除開來的化合物、蛋白質、細胞、核酸或胺基酸。
[0054]關於乙醇產率的術語「產率」指從一定量的原料製備化合物(例如乙醇)。「產率」可表達為在特定時間段內從原料形成的產物。在一個實施例中，乙醇產率計算為「加侖UD/蒲式耳玉米」，表示每蒲式耳玉米製備的未變性乙醇的加侖數。一蒲式耳玉米重約56磅。
[0055]「ATCC」指位於馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心，VA 20108(ATCC)。
[0056]1.2.縮寫
[0057]除非另有指明，否則應用下述縮寫:
[0058]AAα -澱粉酶
[0059]AAUα -澱粉酶單元
[0060]CMC 羧甲基纖維素
[0061]DDG 幹酒糟
[0062]DDGS 幹酒糟及可溶物[0063]DE葡萄糖當量
[0064]DNA 脫氧核糖核酸
[0065]DPn 具有η個亞單位的聚合度
[0066]DS, ds 幹固體
[0067]EC進行酶分類的酶學委員會
[0068]g克
[0069]gal加侖
[0070]GAU 葡糖澱粉酶活性單位
[0071]h小時
[0072]kg千克
[0073]MT公噸
[0074]nm納米
[0075]pi等電點
[0076]PNP-G7 對硝基苯麥芽庚糖苷
[0077]ppm 份每一百萬份
[0078]rpm 轉每分鐘
[0079]SSF同時糖化發酵
[0080]w/v 重量/體積
[0081]w/w 重量/重量
[0082]UD未變性
[0083]μ L 微升
[0084]2.乙醇制各
[0085]在其中一個方面，本文提供的改進的糖化工藝特別適用於乙醇的製備。通常，用含澱粉材料製備醇(乙醇)總體上可分為四個步驟:碾磨、液化、糖化和發酵。
[0086]2.1.原料
[0087]在本發明的澱粉加工過程中，尤其是本發明的乙醇工藝中，起始原料優選地為包括基本澱粉來源和至少一些纖維素材料來源的材料。通常，原料(例如玉米籽粒)包含低於5%的纖維素材料(基於乾重量計)。參見例如Kim等人的Bioresour.Technol.Vol.99, pp.5177-5192(2008)(《生物資源技術》，第 99 卷，第 5177-5192 頁，2008 年)。在一個實施例中，澱粉和纖維素在自然狀態下緊密相關。在一個典型應用中，本文所用澱粉的來源是全穀物或至少主要是全穀物。原料可選自多種含澱粉作物，包括玉米、馬鈴薯、木薯、高粱或蜀黍、小麥、大麥、裸麥、燕麥等。在一個實施例中，含澱粉原料是穀物。在某些優選的實施例中，含澱粉原料可以是選自玉米、小麥和大麥或它們的組合的全穀物。
[0088]2.2.碾磨
[0089]碾磨穀粒以打開結構，從而允許進一步加工。三個常用工藝是溼磨、幹磨和多種分級法。在幹磨法中，碾磨整個去殼穀粒並用於該工藝的後續步驟。另一方面，溼磨很好地分離胚芽和粗粉(澱粉顆粒和蛋白質)，使得其常應用於平行製備糖漿劑的位置，但也有一些例外。不同的分級工藝(例如溼磨或幹磨工藝的變型形式)導致穀物組分更高或更低程度的分離。幹磨是乙醇發酵最常用的碾磨方法。預期針對本文的用法，不要求高度純化的澱粉，但優選地，至少一些纖維素殘餘物將保持與澱粉相關。因此，幹磨非常適用於本發明公開的工藝。
[0090]2.3.凝膠化和液化
[0091]在一些實施例中，將如上所述製備的澱粉底物用水調成漿液。澱粉漿液含有的澱粉以乾物質重量百分比計可為約10-55%、約20-45%、約30-45%、約30-40%或約30_35%。在一個目前優選的實施例中，幹固體含量可介於約20%和約35%之間。如果可用或需要的話，可用例如NaOH或HCl調節漿料的pH，例如以最大化酶穩定性和/或活性。有時調節pH是有利的，以便改善或優化α -澱粉酶穩定性和活性。
[0092]針對本文的液化，任何常規的液化工藝是合適的,其他不太常規的液化方法也適用。可以任何有效量使用α-澱粉酶以完成液化目標。按本文可使用比常規更高的劑量。還預期按本文使用不同液化時間和/或溫度，前提是它們能有效地實現要求的粘度下降和澱粉分解。雖然可使用任何適於液化的α-澱粉酶，預期按本文使用的代表性α-澱粉酶包括GC358和SPEZYME& XTRA (丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco USInc., Genencor Division)) 以及l]quozyme'k sc 和Liquozymek'sc ds (丹麥諾維信公司(Novozymes A/S, Denmark))。或者,可用於液化的α _澱粉酶產品包括(但不限於)SPEZYME? FRED.SPEZYME? HPA、Maxaliq?0NE (丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division) )IFUELZYMEk LF (維萊尼姆公司(VereniumCorp.))。還可使用任何上述酶產品的組合物或共混物。
[0093]還預期可按本文使用常規高溫處理如噴射蒸煮，其通常在介於約100_125°C之間的溫度下進行，這是省略高溫步驟的液化工藝。液化物中存在殘餘α-澱粉酶對於本文提供的改進的糖化方法是可以接受的。
[0094]2.4.改進的糖化方法
[0095]液化之後，通過糖化進一步水解糊狀物或液化物，以生成可易於發酵的低分子糖(DP1-DP2)。在一些實施例中，可在液化步驟和糖化步驟之間加入1-4小時的預糖化步驟。糖化過程中，通常通過在葡糖澱粉酶的酶促作用下完成水解。通常，除了葡糖澱粉酶還可補充α-葡萄糖苷酶和/或酸α-澱粉酶。
[0096]在改進的糖化方法中，例如按以下所述將纖維素酶與葡糖澱粉酶一起添加。
[0097]在一個方面，提供了糖化含澱粉底物(如穀物或其他澱粉作物)的改進方法。所述方法可用於例如製備發酵給料。該方法包括:確定至少包含一些纖維素材料的液化澱粉漿(液化物)；在足以產生酶活性的條件下，使液化物與葡糖澱粉酶和纖維素酶接觸；並使酶有時間產生活性。發酵給料通過該方法製備並可用於任何類型的發酵，無論是製備工業化學品、醫藥，還是製備甚至乙醇或其他生物燃料。
[0098]在一個實施例中，酶活性，尤其是纖維素酶的活性足以至少:(a)提高發酵原液中至少一種可發酵糖的濃度；(b)釋放至少一條結合到纖維素或纖維素捕獲的澱粉鏈；或(C)水解纖維素材料的某些部分。可進行實驗，其中可相對於糖化過程中未與纖維素酶接觸或用其處理的對照液化物測量上述(a)、(b)或(C)中的任一者。
[0099]如技術人員將會知道的那樣，「纖維素酶」活性是酶活性中的複雜群組，並不是能夠催化水解多個葡聚糖鍵的單一蛋白質或多肽。在多個實施例中，纖維素酶因而包括任何通常被視為或稱為纖維素酶的酶，包括任意一種或多種外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性或它們的任意組合。所述纖維素酶包括至少外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶和β_葡萄糖苷酶活性。以下3.3節中提供了預期按本文使用的商業纖維素酶的一些例子。
[0100]可以任何可用的劑量添加纖維素酶。技術人員將會知道，過度施加任何酶可對例如糖化處理時或之後的發酵造成負面影響。在多個實施例中，纖維素酶加入液化物的劑量介於約0.05至約50kg/公噸幹固體之間，介於約0.075至約25kg/公噸之間，介於約0.1至約12.5kg/公噸之間，介於約0.3至約6kg/公噸之間或介於約0.5至約Ikg/公噸幹固體之間。在一個目前優選的實施例中，液化物中每公噸幹固體可使用約5kg纖維素酶。
[0101]或者，可相對於添加的葡糖澱粉酶制定纖維素酶的劑量。在多個實施例中，纖維素酶/葡糖澱粉酶比率可介於約0.00011至約0.14g/GAU之間，介於約0.00017至約0.07g/GAU之間，介於約0.00022至約0.04g/GAU之間，介於約0.00068至約0.016g/GAU之間或介於約0.0011至約0.0028g/GAU之間。
[0102]可以注意到，雖然澱粉液化物的任何糖化可能包括纖維素酶而不對糖化造成任何負面影響，但至少從經濟的角度，確定可從添加纖維素酶獲益的液化物是有用的。因此，例如已知包含或可能包含纖維素材料的液化物可能是幹磨的澱粉源(如穀物，尤其是玉米)產生的液化物。
[0103]接觸步驟可以是連續的，先添加葡糖澱粉酶或先添加纖維素酶。接觸步驟還可以是同時的，同時或幾乎同時添加酶。為了避免出現問題，優選的是選擇有共同活性條件的酶-例如pH、溫度、離子強度、鹽和/或其他要求重疊，使得更易於為使酶具有活性設置條件。
[0104]在一個實施例中，可通過使液化物接觸一種或多種額外的選自去分支酶、果膠酶、β澱粉酶和植酸酶的酶進一步改善糖化。此類酶可用於分解研磨後剩餘或未受到液化過程影響的植物壁和其他多孔材料 。額外的此類材料的消化可有助於葡萄糖或其等同物的製備，無論是直接方式(通過釋放還原糖)還是間接方式(例如通過釋放其他材料例如纖維素捕獲或結合的澱粉分子)。
[0105]在另一方面，提供了用於提高通過發酵澱粉底物製備的發酵產物的產率的方法。與前述方法一樣，該方法涉及液化後在含澱粉材料的糖化期間添加纖維素酶的步驟。該方法通常包括以下步驟:選擇包含至少一些纖維素材料的液化澱粉，在足以產生酶活性的條件下使液化澱粉與葡糖澱粉酶和纖維素酶接觸，隨後發酵該混合物以生產發酵產物。
[0106]選擇步驟大體上類似於上述確定步驟，因為改進方法的優點將使得更易於恰當地選擇液化物-即優選地具有至少一些纖維素材料的液化物。在一個實施例中，發酵產物為乙醇。優選地，產率提高至少約0.1%至約1.0%。對於乙醇製備而言，提高至少0.3%至約
0.5%在實施過程中是可實現的。
[0107]纖維素酶通常包括外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶、β -葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性中的一種或多種或其任意組合。在一個實施例中，所述纖維素酶包括至少外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶和β -葡萄糖苷酶活性。
[0108]纖維素酶的劑量類似於上述的那些。因此，可在液化物中以每公噸幹固體約0.05至約50kg的量添加纖維素酶。一般來講，商業纖維素酶例如ACCELLERASE產品(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division))的劑量可以為約5kg/公噸幹固體。
[0109] 接觸步驟和發酵步驟可進行對產率和其他考慮因素有利的任意時間長度。優選地，這兩個步驟總共進行約24至72小時。然而，如果需要的話，僅糖化步驟就可能持續幾天。在一個實施例中，被糖化的澱粉來自玉米、小麥、大麥、高粱或蜀黍、裸麥、馬鈴薯或它們的任意組合。更優選地，所述澱粉可來自玉米，例如玉米醪。
[0110]所述方法還可包括以下步驟:使液化物與如上所述的一種或多種額外的選自去分支酶、果膠酶、β澱粉酶和植酸酶的酶接觸。
[0111]如技術人員將會知道的那樣，完全糖化可能需要最高至約72小時。在一些目前可優選用於本文的實施例中，糖化步驟和發酵步驟結合為一個步驟，稱為同步糖化發酵或SSF。
[0112]結合SSF，另一方面提供了同步糖化和發酵液化澱粉的改進方法，所述方法包括在存在適於發酵的生物體的情況下，使液化物與葡糖澱粉酶和纖維素酶在足以產生酶活性和發酵的條件下接觸，並且使酶產生活性和讓發酵進行至少24至約72小時；其中，相對於沒有添加纖維素酶的對照發酵，該發酵具有提高的產率。
[0113]與本文所公開的其他方面一樣，通過一個實施例中的發酵製備乙醇，並且乙醇產率得到提高。同樣，所述纖維素酶包括外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶、葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性中的任意一種或多種。某些目前優選的纖維素酶包括至少外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶和β -葡萄糖苷酶活性。
[0114]纖維素酶的劑量可以是任何可用的量，纖維素酶加入液化物的量介於約0.05至約50kg/公噸幹固體之間，介於約0.1至約25kg/公噸之間，介於約I至約IOkg/公噸之間，或為約2.5-7.5kg/公噸幹固體。在一個目前優選的實施例中，液化物中每公噸幹固體使用約5kg纖維素酶。
[0115]在多個實施例中，產率提高約0.1至約1.0%，或約0.3至約0.6%。
[0116]在一個實施例中，接觸和發酵步驟總共需要約24至72小時。在多個實施例中，澱粉來自玉米、小麥、大麥、高粱或蜀黍、裸麥、馬鈴薯或它們的組合。示例性澱粉為玉米，尤其與乙醇發酵結合。
[0117]改進的方法中可任選地包括額外的酶，例如分支酶、果膠酶、β澱粉酶和植酸酶。
[0118]在改進糖化的另一個方面，提供了包含澱粉、葡糖澱粉酶和纖維素酶的液化物的組合物。所述組合物可用於製備發酵的給料。可例如在低於對酶活性有用的溫度的溫度下保存組合物，並隨後可根據以上所述將其升溫並保持以進一步進行糖化。優選地，組合物包含的纖維素酶的量介於液化物中每公噸幹固體0.05至約50kg之間。所述澱粉通常來自玉米、小麥、大麥、高粱或蜀黍、裸麥、馬鈴薯或它們的任意組合，但目前優選玉米，特別是對於乙醇發酵。所述組合物還可包含一種或多種額外的酶，例如分支酶、果膠酶、β澱粉酶和/或植酸酶。
[0119]2.5.發酵
[0120]發酵中使用的生物體將取決於所需的終產物。通常，如果乙醇是所需的終產物，那麼酵母將被用作發酵生物體。在一些實施例中，產乙醇微生物是酵母，特別是酵母屬，例如釀酒酵母菌株(美國專利N0.4，316，956)。多種釀酒酵母可商購獲得，其包括(但不限於)Ethanol Red? (富酶泰斯公司(Fermentis) )，THERMOSACC^ Superstart? (拉曼乙醇技術公司(Lallemand Ethanol Technology) ),FALI(弗萊舍曼酵母公司(Fleischmann’sYeast) )，FERMIOL?(帝斯曼特種公司(DSMSpecialties) )，Bio-Ferm? 狀(美國臨床生化學會(NACB))和安琪釀酒酵母(中國安琪酵母公司(Angel Yeast Company, China))。該方法中使用的發酵劑為這樣的量，其能有效地在適當的時間內生產商業上大量的乙醇，(例如在小於72小時的時間內從具有介於25-40%之間的幹固體的底物生產至少10%的乙醇)。可以每毫升發酵液約IO4至IO12活酵母菌數的量提供酵母細胞，通常為每毫升發酵液約IO7至IOltl活酵母菌數。發酵除了發酵微生物(例如酵母)包括營養素、任選的額外的酶，包括(但不限於)植酸酶。發酵中酵母的用法是已知的。參見例如THE ALCOHOL TEXTBOOK, K.A.JACQUESET AL., EDS.2003, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS, UK (《醇教科書》，K.A.JACQUES 等人編輯，2003年，英國諾丁漢大學出版社)。
[0121]本文所述的改進方法可使乙醇產率提高。提高的乙醇產率為約0.1至約1.0%,大於未添加葡糖澱粉酶和纖維素酶的乙醇製備方法的產率。乙醇產率可表達為「加侖UD/蒲式耳玉米」，表示每蒲式耳玉米製備的未變性乙醇的加侖數。現代技術通常使乙醇產率保持在約2.5至約2.8加侖UD/蒲式耳玉米的範圍內。參見Bothast&Schlicher, 「Biotechnological Processes for Conversion of Corn into Ethanol, ^Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:19-25 (2005) (Bothast 和 Schlicher，「玉米轉化為乙醇的生物技術工藝」，《應用微生物學與生物技術》，第67卷，第19-25頁，2005年)。提高的乙醇製備效率可歸因於本文所述的澱粉處理過程中更高的澱粉利用率。乙醇製備結束時，100克穀物副產物中的殘餘澱粉比下述乙醇製備方法的殘餘澱粉量低至少約10%、約20%或約30%，該乙醇製備方法在約85°C的溫度下並且要求α -澱粉酶在90分鐘內達到至少約10的DE值的條件下液化澱粉。
[0122]在另外的實施例中，通過使用本領域已知的適當的發酵微生物，發酵終產物可包括(但不限於)甘油、1，3-丙二醇、葡糖酸鹽、2-酮基-D-葡糖酸鹽、2，5- 二酮-D-葡糖酸鹽、2-酮基-L-古龍酸、琥珀酸、乳酸、胺基酸及它們的衍生物。更具體地講，當乳酸為所需的終產物時，可使用乳酸桿菌 屬(Lactobacillus sp.)(乾酪乳桿菌(L.casei));當甘油或1，3-丙二醇為所需終產物時，可使用大腸桿菌(E.coli);當2-酮基-D-葡糖酸鹽、2，5-二酮-D-葡糖酸鹽和2-酮基-L-古龍酸為所需終產物時，檸檬泛菌(Pantoea citrea)可用作發酵微生物。以上列舉的名單僅為例子，本領域技術人員會知道多種可適當地用於獲得所需的終產品的發酵微生物。
[0123]標準分批系統的適當變型是「分批補料發酵」系統。在典型的分批系統的這個變型中，隨著發酵的進行以增量的形式(in increments)添加底物。在分解代謝物阻遏可能抑制細胞的代謝時和在需要在培養基中具有有限量的底物的情況下可使用補料分批系統。補料分批系統中實際底物濃度的測量是困難的，因此根據諸如pH、溶氧、廢氣(如CO2)分壓的可測量因素的變化進行估計。分批發酵和補料分批發酵是本領域普通且公知的。
[0124]連續發酵是開放系統，其中限定的發酵培養基被連續地添加到生物反應器，並同時移取等量的經調理的培養基進行加工。連續發酵通常以恆定的高密度維持培養物，其中細胞主要處於對數生長期。連續發酵使得可以調節影響細胞生長和/或產品濃度的一個或多個因素。例如，在一個實施方案中，以固定的速率維持限制性營養物如碳源或氮源，同時讓所有其他參數調節。在其他系統中，可連續地改變多個影響生長的因素，同時保持細胞濃度(通過培養基濁度測量)恆定。連續系統旨在維持穩態生長條件。因此，應使由於移取培養基導致的細胞損失與發酵中的細胞生長速率保持平衡。調節連續發酵過程的營養物和生長因子的方法以及使產物形成速率最大化的技術是工業微生物學領域公知的。
[0125]2.6.蒸餾
[0126]任選地，發酵之後，乙醇可通過例如蒸餾然後任選地進行一個或多個處理步驟來提取。在一些實施例中，本方法製備的乙醇的產率將是至少約8%，至少約10%，至少約12%，至少約14%，至少約15%，至少約16%，至少約17%，至少約18%和至少約23%體積/體積。根據本公開的工藝獲得的乙醇可用作例如，燃料乙醇；飲用乙醇(即可飲用的中性烈酒或工業乙醇)。
[0127]2.7.副產物
[0128]發酵產生的穀物副產物通常以液體形式或乾燥形式用作動物飼料。如果溼磨澱粉，則非澱粉副產物包括粗蛋白、油和纖維，例如玉米蛋白粉。如果幹磨澱粉，則副產物可包括動物飼料副產物，例如幹酒糟(DDG)和幹酒糟及可溶物(DDGS)。然而，當幹磨穀物並在液化和糖化前將其混入漿料中，則沒有穀物剩作副產物。
[0129]3.澱粉製備乙醇過程中涉及的酶
[0130]就本文所公開的改進的糖化工藝而言，此類方法可與多種酶結合使用，已知其中一些酶用於製備發酵的澱粉材料，例如乙醇。
[0131]在一些實施例中，額外的酶可包括在本文所公開的改進的糖化工藝或SSF工藝的液化步驟中。此類酶的例子包括α澱粉酶，其可加入液化步驟，還可加入糖化步驟或從液化步驟轉入。其他例子包括纖維素酶和植酸酶，它們也可加入如上所述的液化步驟和糖化步驟。可以在澱粉分解過程中在一個或多個點加入的其他酶包括葡糖澱粉酶、果膠酶、分支酶和β_澱粉酶。這些酶的一些另外的方面和/或來源在下文討論。
[0132]3.1.α -澱粉酶
[0133]任何可用於澱粉底物的液化和/或糖化的α-澱粉酶預期可用於本文。尤其可用的是具有相對高熱穩定性並因此能夠在高於80°C的溫度下液化澱粉的那些。適用於液化處理的α -澱粉酶可來自真菌或細菌來源，特別是分離自嗜熱細菌(例如芽孢桿菌屬(Bacillus))的α -澱粉酶。這些芽孢桿菌α -澱粉酶通常被稱為「Termamyl樣α -澱粉酶」。已知的Termamyl樣α -澱粉酶包括來自地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)、解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和嗜熱脂肪地芽孢桿菌(GeobacillusstearothermophiIus)(此前被稱為嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus))的那些。其他Termamyl樣α -澱粉酶包括來源於芽孢桿菌屬(Bacillus sp)的那些。在W095/26397 中公開了 NCIB12289、NCIB12512、NC皿2513 和 DSM9375。預期 α -澱粉酶還可來源於麴黴菌屬(Aspergillus),例如米麴黴(A.0ryzae)和黑麴黴(A.niger) α -澱粉酶。此外，商購的α -澱粉酶和含α -澱粉酶的產品包括termamyl?sc、fungamyl?、LIQUOZYME i SC and SANtmSUPER (丹麥諾維信公司(Novozymes A/S, Denmark))和
SPEZYME? XTRA, GC358、SPEZYME? FRED、SPEZYME? FRED-L 和 SPEZYME? HPA
(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division))。
[0134]本文可用的α-澱粉酶包括野生型(或親本)酶以及所述親本酶的變體。此類變體可與Termamyl樣α -澱粉酶或其他野生型澱粉酶(例如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) α -澱粉酶(在提交於2008年11月3日的US2009/0238923中公開)或嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophiIus) α -澱粉酶(在提交於2008年11月3日的US2009/0252828中公開))具有約80%至約99%的序列同一性。W096/23874、W097/41213和W099/19467中公開的澱粉酶變體還可預期在本文中使用，包括嗜熱脂肪地芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophiIus) α _澱粉酶變體，其與W099/19467中公開的野生型α-澱粉酶相比具有突變Λ (181-182)+N193F。
[0135]在一些實施例中，與親本酶的性質相比變體α-澱粉酶可顯示一種或多種改變的性質。改變的性質可有利地使變體α-澱粉酶在液化中有效地進行。相似地，該改變的性質可導致與其親本相比改良的變體性能。這些性質可包括底物特異性、底物結合、底物裂解模式、熱穩定性、PH/活性曲線、pH/穩定性曲線、針對氧化的穩定性、在較低水平的鈣離子(Ca2+)下的穩定性和/或比活。代表性的α -澱粉酶變體包括公布於2008年9月11日的US2008/0220476 ;公布於 2008 年 7 月 3 日的 US2008/0160573 ;公布於 2008 年 6 月 26 日的US2008/0153733 ;和公布於2008年4月10日的US2008/0083406中所公開的那些。兩種或多種α -澱粉酶的共混物還可預期在本文中使用，其中每一種可具有不同的性質。
[0136]可根據美國專利N0.5，958，739中公開的經過細微修改的方法測定α -澱粉酶的活性。簡而言之，測定法使用對硝基苯麥芽庚糖苷(PNP-G7)作為底物，其非還原末端糖被化學封閉。PNP-G7可被內切澱粉酶例如α-澱粉酶裂解。裂解後，α-葡糖苷酶和葡糖澱粉酶消化該底物以釋放游離的PNP分子，所述PNP分子顯示黃顏色，可通過可見光分光光度法在410nm處測量。PNP釋放速率與α-澱粉酶活性成比例。比照標準對照物計算樣本的α -澱粉酶活性。
[0137]從例如任何已知的野生型序列開始，變體或突變型α -澱粉酶也可由技術人員製備以在本文中使用。許多例如通過將突變體引入已知基因來製備此類變體的方法在本領域中是已知的。利用多種本領域已知的方法，編碼親本α-澱粉酶的DNA序列可分離自產生所考慮的α-澱粉酶的任何 細胞或微生物。
[0138]3.2.葡糖澱粉酶
[0139]另一種預期用於澱粉處理(特別是糖化期間)的酶是葡糖澱粉酶(EC3.2.1.3)。葡糖澱粉酶通常來源於微生物或植物。例如，葡糖澱粉酶可以是真菌或細菌來源。
[0140]示例性真菌葡糖澱粉酶是麴黴菌(Aspergillus)葡糖澱粉酶,特別是黑麴黴(A.niger) Gl 或 G2 葡糖澱粉酶(Boel et al.(1984), EMBO J.3 (5):1097-1102) (Boel 等人，1984年，《歐洲分子生物學學會會刊》第3卷第5期，第1097-1102頁)或其變體，例如W092/00381和W000/04136中所公開的；泡盛麴黴(A.awamori)葡糖澱粉酶(W084/02921)；米麴黴(A.0ryzae)葡糖澱粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55 (4):941-949)(《農業生物化學雜誌》，1991年，第55卷第4期，第941-949頁)或其變體或片段。其他預期的麴黴菌(Aspergillus)葡糖澱粉酶變體包括具有增強的熱穩定性的變體:G137A和G139A(Chen etal.(1996)，Prot.Eng.9:499-505) (Chen 等人，1996 年，《蛋白工程》，第 9 卷，第 499-505頁)；D257E 和 D293E/Q(Chen et al.(1995), Prot.Eng.8:575-582) (Chen 等人，1995 年，《蛋白工程》，第 8 卷，第 575-582 頁)；N182 (Chen et al.(1994), Biochem.J.301:275-281)(Chen等人，1994年，《生物化學雜誌》，第301卷，第275-281頁)；二硫鍵、A246C (Fierobeet al.(1996), Biochemistry, 35:8698-8704) (Fierobe 等人，1996 年,《生物化學雜誌》,第35 卷，第 8698-8704 頁)；和將 Pro 殘基引入位置 A435 和 S436(Li et al.(1997) ProteinEng.10:1199-1204) (Li 等人，1997 年，《蛋白工程》，第 10 卷，第 1199-1204 頁)。
[0141]示例性真菌葡糖澱粉酶還可包括裡氏木黴(Trichoderma reesei)葡糖澱粉酶和其在美國專利N0.7，413，879中公開的同源物(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division))。葡糖澱粉酶可包括例如裡氏木黴(T.reesei)葡糖澱粉酶、美洲橙黃肉座菌變種(Hypocrea citrina var.americana)葡糖澱粉酶、酒紅肉座菌(H.vinosa)葡糖澱粉酶、膠質肉座菌(H.gelatinosa)葡糖澱粉酶、東方肉座菌(H.0rientalis)葡糖澱粉酶、康長木黴(T.koniIangbra)葡糖澱粉酶、哈茨木黴(T.harzianum)葡糖澱粉酶、長枝木黴(T.1ongibrachiatum)葡糖澱粉酶、棘孢木黴(T.asperellum)葡糖澱粉酶和短孢鉤狀木黴(T.strictipilis)葡糖澱粉酶。
[0142]其他預期用於本文的葡糖澱粉酶包括踝節菌屬(Talaromyces)葡糖澱粉酶，特別是來源於埃默森踝節菌(T.emersonii) (W099/28448)、T.1eycettanus(美國專利RE32, 153)、T.duponti或嗜熱踝節菌(T.thermophilus)(美國專利N0.4，587，215)。預期的細菌葡糖澱粉酶包括來自梭菌屬(Clostridium)，特別是
C.thermoamylolyticum(EP135138)和 C.thermohydrosulfu;ricum(TO86/01831)的葡糖澱粉酶。
[0143]合適的葡糖澱粉酶包括來源於米麴黴的葡糖澱粉酶，如與W000/04136中公開的胺基酸序列具有約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%或甚至約90%同一性的葡糖澱粉酶。合適的葡糖澱粉酶還可包括來源於裡氏木黴(T.reesei)的葡糖澱粉酶，如與W008/045489中公開的胺基酸序列具有約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%或甚至約90%同一性的葡糖澱粉酶(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US Inc., Genencor Division))。具有改變的性質的裡氏木黴(T.reesei)葡糖澱粉酶變體(如提交於2008年11月20日`的W008/045489和US2009/0275080中公開的那些(丹尼斯克美國
【權利要求】
1.一種糖化含澱粉底物以製備發酵給料的方法，所述方法包括(a)在足以產生酶活性的條件下，使包含至少一些纖維素材料的液化澱粉漿料與葡糖澱粉酶和纖維素酶接觸，以及(b)使所述酶有時間產生活性，從而生成發酵給料。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述酶活性足以至少:(a)提高所述發酵給料中至少一種可發酵糖的濃度；(b)釋放至少一條結合到纖維素或所述纖維素捕獲的澱粉鏈；或(C)水解所述纖維素材料的某些部分；其中，可相對於未接觸纖維素酶的對照液化澱粉漿料測定(a)、(b)或(C)。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述纖維素酶包括外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶、β -葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性中的一種或多種，或它們的任意組合。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述纖維素酶包括至少外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、半纖維素酶或葡萄糖苷酶活性。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述纖維素酶加入所述液化澱粉漿料的量介於約0.05kg/公噸至約50kg/公噸幹固體之間。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述纖維素酶的添加量為約5kg/公噸幹固體。
7.根據權利要求1所述的方法，還包括使所述液化澱粉漿料與一種或多種額外的選自脫支酶、果膠酶、β澱粉酶和植酸酶的酶接觸。
8.根據權利要求1所述的方法，還包括發酵所述發酵給料以製備發酵產物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述發酵產物為乙醇。
10.根據權 利要求8所述的方法，其中與未添加所述纖維素酶的產率相比，所述發酵產物的產率提高約0.1至約1.0%。
11.根據權利要求10所述的方法，其中與未添加所述纖維素酶的產率相比，所述發酵產物的產率提高約0.3至約0.5%。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述接觸和發酵步驟總共需要約24至72小時。
13.根據權利要求1所述的方法，其中澱粉來自玉米、小麥、大麥、高粱、裸麥、馬鈴薯或它們的任意組合。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述澱粉來自玉米。
15.根據權利要求8所述的方法，還包括使所述液化澱粉漿料與一種或多種選自脫支酶、果膠酶、β澱粉酶和植酸酶的酶接觸。
16.根據權利要求8所述的方法，其中所述發酵與所述糖化同時進行。
17.—種組合物，所述組合物包含液化澱粉漿料、葡糖澱粉酶和纖維素酶。
18.根據權利要求17所述的組合物，其中所述纖維素酶以介於約0.05kg/公噸至約50kg/公噸幹固體的量存在。
19.根據權利要求17所述的組合物，其中澱粉來自玉米、小麥、大麥、高粱、裸麥、馬鈴薯或它們的任意組合。
20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述澱粉來自玉米。
21.根據權利要求17所述的組合物，還包含一種或多種額外的選自脫支酶、果膠酶、β澱粉酶和植酸酶的酶。
【文檔編號】C12P7/06GK103492579SQ201280020637
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月29日
【發明者】李勉, C·米奇森 申請人:丹尼斯科美國公司