用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒的製作方法
2023-06-07 15:22:06 2
專利名稱：用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測股骨頭壞死易感 性的試劑盒，通過檢測VEGF、FV、MTHFR、APOAU APOB和PONl基因的單核苷酸多態性位點 (SNP)，來預測個體對股骨頭壞死的易感性。
背景技術：
股骨頭壞死因其主要病理系股骨頭血運受阻，遭受破壞而引起的頭部骨質缺血， 故多稱為股骨頭缺血性壞死或股骨頭無菌性壞死。由於股骨頭壞死有一個複雜的病理過 程，如早期不能得到及時有效的治療，就會使股骨頭塌陷，關節間隙變窄，最後導致骨關節 炎，使病人髖關節功能障礙而致殘致癱。病人在遭受生理病痛的同時，還要遭受心理創傷的 煎熬，也給家庭、單位和社會增添了沉重的負擔。股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head ANFH)是骨科常 見病，多發病，早期診斷困難，治療效果欠佳，最終仍需人工關節置換術，給患者和社會帶來 巨大損失。其發病機理尚不十分清楚，但其共同特徵都是血液循環障礙導致股骨頭缺血壞 死。由於機體對壞死區具有自然的修復能力，當新生骨細胞隨新生血管向壞死區生長並形 成新骨的同時，壞死骨小梁將被逐步吸收。在此過程中骨的力學性能明顯減弱，正常負重即 可致股骨頭塌陷變形及髖關節退行性關節炎，同時出現以疼痛和活動障礙為主的臨床症狀 群。早期的診斷和治療是治療ΑΝ 的關鍵。隨著ΑΝ 的基因多態性的深入研究，越來越 多的和ANFH相關的基因見諸報導。證實了多種基因在ANFH的發生發展中的作用，為ANFH 的早期診斷和治療提供了理論依據。血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)基因位於 6 號 染色體pl2區，其-634上C/G多態性會影響基因的表達，其產物血管內皮生長因子能特異 性作用於血管內皮細胞，促進內皮細胞分裂，促進血管的生長和側支循環建立的作用，也能 促進血管內皮細胞分泌胰島素樣生長因子等生長因子，促進成骨細胞生長，其多態性會影 響VEGF基因的表達，從而導致ANFH的發生。亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR gene)位於1ρ36. 13，由11個外顯子組成，編 碼656個胺基酸，翻譯成能夠催化N5，WO-亞甲基四氫葉酸還原成N5-亞甲基四氫葉酸的 蛋白質，後者為Hcy的再甲基化提供甲基供體，使其生成蛋氨酸。MTHFR基因677位存在 C —T突變。該突變會導致其編碼的丙氨酸(GCU)被纈氨酸(GUU)所取代，從而影響MTHFR 的活性，使血漿中HCY水平升高。是同型半胱氨酸，高同型半胱氨酸血症是血栓形成的獨立 危險因素。凝血因子5 (coagulation factor V，FV)基因位於 lq23，編碼 Glueek 因子 V 蛋白， 在凝血過程中位於內外源性凝血途徑的交匯點，加速和促進凝血酶原的激活和凝血酶的生 成。因子V在rs6025發生基因突變後稱V Leiden因子。V Leiden因子是靜脈血栓形成的 常見的危險因素。基因突變導致深靜脈血栓形成，血液高凝狀態，從而導致股骨頭小血管的 血栓形成。
脂類代謝紊亂是導致股骨頭壞死的重要機理，長期大劑量使用糖皮質激素引起體 內高脂血症，脂肪分解，血中游離脂肪酸增多，從而使血管內皮損傷，膠原暴露，激活內源性 凝血途徑，使纖維蛋白血小板血栓形成。對氧磷酶(pamoxonase，PON)又稱芳香基二烷基磷酸酯酶，人類血清中的PONl與 HDL緊密結合，形成一個八聚合體的結構，是ApoA — 1的重要組成部分。PON基因位於染色 體7q21. 3 一 q22. 1，含有9個外顯子及8個內含子，PON基因家族至少有三個成員，分別為 PONUP0N2和P0N3。PONl基因產物是循環中HDL的組成部分，並且HDL的抗氧化的活性大 部分取決於P0N1。PONl的192Glu/Arg的改變，影響了對氧磷酶酶的活性。載脂蛋白Afepolipoprotein Α,Αρο Α)位於人類11號染色體長臂上約15kb的基 因片段內，與Apo C3、Apo A4基因呈簇狀排列。Apo Al基因轉錄起始點上遊_75bp處有G/ A多態性位點(rs670)，Apo Al基因結構的改變影響著Apo Al的分子結構、生成和向血液 中釋放的速率，進而影響血中Apo Al與HDL的水平。載脂蛋白Bfepolipoprotein B,Apo B)基因位於第2號染色體短臂Op23)末端， 全長43吐，由四個外顯子和觀個內含子組成。最大的外顯子是沈號外顯子。位於第沈 號外顯子的C7673T多態(rs69;3)靠近LDL受體結合區域，被認為與動脈粥樣硬化、冠心病、 心肌梗死及股骨頭壞死密切相關。現有技術檢測股骨頭壞死易感人群，採用雜交晶片法或玻璃板晶片法，以及利用 taqman探針，該方法準確率低、假陰性和假陽性率較高，且不能批量檢測；另一種直接測序 法，雖準確率高，但其成本高、同樣不能實現批量檢測，因此現有方法均無法滿足大規模基 因篩選的要求。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，通過檢測一組與股骨頭壞死易感性的試劑盒，利 用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術結合微陣列晶片技術，綜合檢測和分析受檢 人群是否攜帶「股骨頭壞死易感基因」，將股骨頭壞死易感人群從人群中篩選出來，改變不 良的生活習慣，達到預防的目的。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種用於檢測股骨頭壞死易 感的檢測試劑盒，它檢測與股骨頭壞死關係密切的六個基因的組合血管內皮因子類的 VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PONl基因、AP0A1基因和 APOB基因。包括下述SNP位點VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR 基因的rsl801133位點、AP0A1基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PCMl基因的 rs662位點。所述的用於檢測股骨頭壞死易感的基因組合，用於針對所述位點設計特異性的引 物對和探針。所述的用於檢測股骨頭壞死易感的基因組合設計的特異性引物，所述的特異性引 物對的序列如下，用於進行多重PCR擴增，能同時擴增出上述6個位點的基因片段針對rs2010963 位點GGTAGCAAGAGCTCCAGAGAG(SEQ ID NO 1)
AAGCAGGTCACTCACTTTGC(SEQ ID NO 2)針對rs6025 位點TAGCCAGGAGACCTAACATGTTC(SEQ ID NO 3)GAGAGACATCGCCTCTGGG(SEQ ID NO 4)針對rsl801133 位點CACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 5)GTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 6)針對rs670位點AGCTCTTGCAGGGCCTATT(SEQ ID NO 7)CCACATTGCCAGGACCAGT(SEQ ID NO 8)針對rs693位點AAACCTGGCCTACCAGAGAC(SEQ ID NO 9)TTGGTTACAGGAGGCTTTAAGT(SEQ ID NO 10)針對rs662位點CAAATCCTTCTGCCACCACT(SEQ ID NO: 11)CTGTGGGACCTGAGCACTTT(SEQ ID NO :12)所述的用於檢測白血病易感的基因組合設計的特異性探針，其特徵在於，所述的 特異性探針序列如下，能同時對6個位點進行檢測分型針對rs2010963 位點ACGCACGTCCACGGTGATTTCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG(SEQ ID NO :13)針對rs6025 位點GGATGGCGTTCCGTCCTATTTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC(SEQ ID NO :14)針對rsl801133 位點CGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID NO :15)針對rs670位點AGCGATCTGCGAGACCGTATAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC(SEQ ID NO :16)針對rs693位點GCGGTAGGTTCCCGACATATACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC(SEQ ID NO :17)針對rs662位點GGCTATGATTCGCAATGCTTCACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC(SEQ ID NO :18)所述的引物或探針，用於通過單核苷酸延伸技術結合微陣列晶片技術特異性檢出 白血病易感基因。本試劑盒的組分和含量包括250ul 10XPCR 反應緩衝液，20ul IOmM dNTP 混合液，450ul 25mM MgCl2 溶液，45ul (5U/ul) Taq DNA 聚合酶，50ul特異性引物(12條)混合液(IOuM each)，15ul特異性延伸探針(6條)混合液(IOuM)，
90ul ExoI(10U/ul),450ul SAP(lU/ul),140ul 10XSAP 反應緩衝液，1700ul Extension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix,IOul DNA polymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive,2500ul 20XWash Buffer 1，800ul 64XWash Buffer 2，一個384孔12重微陣列晶片去離子水20ml，本試劑盒供380人份檢測應用，試劑盒保存溫度為-20°C。本發明的有益效果是(1)分型結果準確性高達99%以上，重複性好，沒有假陽性 影響；( 同時檢測多個SNP位點，檢測成本低；C3)通量高，可一次對384個樣本進行檢測； (4)操作簡便；( 靈敏度高，每次檢測的DNA用量僅2ng。本發明通過單核苷酸延伸技術 結合微陣列晶片技術，利用特異性引物和探針對單核苷酸多態性(SNP)的基因分型準確率 超過99%。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。下列實施例中未註明具體條件 的實驗放大，通常按照常規條件，或按照廠商所建議的條件。IDNA 的提取取受檢者外周靜脈血，加入同等體積的細胞裂解液，裂解兩次，充分裂解白細胞， 離心棄上清後加入蛋白酶K緩衝液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分鐘，異丙醇沉澱、 75 %乙醇洗滌兩次，晾乾後溶於適量TB溶液中。2PCR 擴增取受檢者的基因組DNA提取液加入96孔板中，進行多重PCR擴增反應總體積5ul，其中 10M mol/L dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2 lul，模板 DNA 30ng，6 重引物混合液 lOuM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul，補足水到 5ul。置於 PCR 儀上反應預變性 94°C Imin ；94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，40 個循環；Hold 4°C。擴增引物混合液包括下列引物
IFGGTAGCAAGAGCTCCAGAGAG(SEQ ID NO 1)
IRAAGCAGGTCACTCACTTTGC(SEQ ID NO 2)
2FTAGCCAGGAGACCTAACATGTTC(SEQ ID NO 3)
2RGAGAGACATCGCCTCTGGG(SEQ ID NO 4)
3FCACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 5)
3RGTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 6)
6
4F AGCTCTTGCAGGGCCTATT(SEQ ID NO 7)4R CCACATTGCCAGGACCAGT(SEQ ID NO 8)5F AAACCTGGCCTACCAGAGAC(SEQ ID NO 9)5R TTGGTTACAGGAGGCTTTAAGT(SEQIDN0:10)6F CAAATCCTTCTGCCACCACT (SEQ ID N0:11)6R CTGTGGGACCTGAGCACTTT(SEQ ID NO 12)3 純化在PCR擴增產物中加入 0. 2ul ExoI, Iul SAP，0. 3ul 10 X SAP 反應緩衝液禾口 1. 5ul 去離子水。將96孔板放入PCR儀中進行純化，純化程序37°C 30min,96°C 10min,Hold 4°C。4引物延伸反應純化後的PCR產物中加入延伸反應混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸探針混合液(1010uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix 0. 2ul，DNA 聚合酶 0. 02ul， 去離子水;3ul。將裝有延伸反應混合物的96孔板再次放入PCR儀中進行延伸反應，反應程 序=Hold 96°C 3min ；94°C 20sec，40°C llsec，46 個循環；Hold 4°C。延伸探針混合液包含下列探針IPACGCACGTCCACGGTGATTTCGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG(SEQIDNO13)
2PGGATGGCGTTCCGTCCTATTTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC(SEQIDNO14)
3PCGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQIDNO15)
4PAGCGATCTGCGAGACCGTATAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC(SEQIDNO16)
5PGCGGTAGGTTCCCGACATATACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC(SEQIDNO17)
6PGGCTATGATTCGCAATGCTTCACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC(SEQIDNO18)以上延伸探針5』端具有與微陣列晶片地址引物對應的地址序列。5延伸反應結束後，加入雜交液可與微陣列晶片進行雜交反應。孵育溫度42 °C，孵育時間2小時。6雷射掃描檢測螢光信號本發明將上述6個與股骨頭壞死易感、發生密切相關的基因進行組合，通過大量 的篩選數據表明所述6個基因VEGF基因、FV基因，MTHFR基因、PONl基因、AP0A1基因、 APOB基因，如6個基因都有位點發生突變，則患股骨頭壞死的概率最高；4或5個基因發生 突變次之；沒有發生突變患股骨頭壞死的概率最小。本發明採用單核苷酸延伸技術和微陣列晶片技術相結合的方法，針對上述6個位 點，設計一套多重PCR引物，在一個擴增反應中同時擴增攜帶SNP位點的6個基因片段，根 據SNP位點上遊5』端23-2^p的序列設計寡核苷酸探針，此探針與序列雜交後3』末端位 於snp5』端上遊Ibp處。檢測時聚合酶根據SNP攜帶的鹼基在探針末端結合上一個攜帶熒 光的ddNTP，根據結合的ddNTP不同，其所攜帶的螢光顏色也不相同，在探針的5』端根據與 微陣列晶片結合位置的不同設計有不同的20bp的Tag地址序列，與微陣列晶片上對應的序 列互補，延伸後的探針與微陣列晶片上對應區域上的序列雜交，不同的探針結合在晶片的 不同區域，通過檢測對應位置的螢光，達到同時進行多個SNP分型的目的。疾病的發生是一個十分複雜的過程，受到多個蛋白和基因的共同影響，其中任何 一個酶的改變都會影響疾病的易感性。傳統的基因檢測疾病的方法受到方法的限制，往往只能對一到兩個基因的多態性進行分析，只能覆蓋一部份患病風險人群，對於由於其他基 因上的多態性造成的疾病患病風險不能及時的預警，檢測的準確性因此會大幅降低，受檢 者不能全面的了解自身疾病的易感情況。本發明針對一種疾病不同的患病途徑檢測多個相關的基因和其多態性位點，能更 準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病風險，能給受檢者提出具有針對性和有效地 健康建議，及時有效的避免其疾病的發生。由於本發明使用的檢測方法可以高通量，自動化的檢測SNP，大幅降低了檢測成 本，可以對不同患病途徑的多個基因同時進行檢測，本發明針對股骨頭壞死不同的患病途 徑的關鍵酶基因尋找挑選了 6個多態性位點，能更準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑 的患病風險，能夠給受檢者提出具有針對性的健康建議，及時有效的避免其疾病的發生。本 發明通過單核苷酸延伸技術結合微陣列晶片技術，利用特異性引物和探針對單核苷酸多態 性(SNP)的基因分型準確率超過99%，同時檢測上述6個基因對檢測、比較個體的股骨頭壞 死易感性具有重要意義。綜上所述，本發明的內容並不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可 以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發 明的範圍之內。
8
權利要求
1.一種用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特徵在於，包括同時檢測VEGF基因 的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR基因的rs 1801133位點、APOAl基因的 rs670位點、APOB基因的rs693位點和PONl基因的rs662位點的特異性引物及對應的延 伸探針，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，10XPCR反應緩衝液，ExoI，SAP, 10XSAP反應緩 衝液，Extension Dilution Buffer, IOXExtension Mix, DNA polymerase, Hybridization Solution, Hybridization Additive, 20 Xffash Buffer 1,64X Wash Buffer2，去離子水，微 陣列晶片。
2.根據權利要求1所述的用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特徵在於所述的 特異性引物對是針對VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR基因的 rsl801133位點、AP0A1基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PONl基因的rs662 位點而設計，能特異性擴增出包括上述SNP位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特徵在於所述的 特異性延伸探針是針對VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR基因的 rsl801133位點、AP0A1基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PONl基因的rs662 位點而設計，能通過單核苷酸延伸和微陣列技術檢測出這六個SNPs位點基因型的探針。
4.根據權利要求1所述的用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特徵在意所含的 特異性引物對選自具有SEQ ID NO :1，2所示核苷酸序列的引物對、具有SEQ ID N0:3，4所 示核苷酸序列的引物對、具有SEQ ID NO :5，6所示核苷酸序列的引物對、具有SEQ ID NO :7， 8所示核苷酸序列的引物對、具有SEQ ID NO :9，10所示核苷酸序列的引物對以及具有SEQ ID NO :11，12所示核苷酸序列的引物對。
5.根據權利要求1所述的用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特徵在於所含的 特異性延伸探針選自具有SEQ ID N0:13、14、15、16、17和18所示核苷酸序列的延伸探針。
6.根據權利要求1所述的用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，其特徵在於試劑 盒的組分和含量包含250ul 10XPCR反應緩衝液，20ul IOmM dNTP混合液，450ul 25mM MgCl2溶液，45ul 5U/ul Taq DNA聚合酶，50ul每條IOuM的12條特異性引物混合液， 15ul 每條 IOuM 的 6 條特異性延伸探針混合液，90ull0U/ul Exol，450ul lU/ul SAP, 140ul 10XSAP 反應緩衝液，1700ulExtension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix, IOul DNApolymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive, 2500ul 20XWash Buffer l,800ul 64XWash Buffer 2，去離子水20ml，一個供 380人份檢 測應用的384孔12重微陣列晶片，試劑盒保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測股骨頭壞死易感性的試劑盒，它檢測與股骨頭壞死關係密切的六個基因的組合血管內皮因子類的VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PON1基因、APOA1基因和APOB基因。利用本試劑盒，通過檢測一組與股骨頭壞死易感性相關的基因及位點，利用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術結合微陣列晶片技術，可清晰的判斷受檢人群是否攜帶「股骨頭壞死易感基因」，將股骨頭壞死易感人群從人群中篩選出來，改變不良的生活習慣，達到預防的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102108413SQ201010599558
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月22日 優先權日2010年12月22日
發明者劉志霈, 劉蓉華, 周毓玲, 李楠, 杜宏偉, 靳霞, 韓俊領 申請人:協和幹細胞基因工程有限公司, 天津濱海協和基因科技有限公司