編碼參與膜合成和膜轉運的蛋白質的穀氨酸棒桿菌基因的製作方法

2023-06-07 21:36:26 3

專利名稱：編碼參與膜合成和膜轉運的蛋白質的穀氨酸棒桿菌基因的製作方法
本申請是申請日為2000年6月23日，申請號為00811820.5，發明名稱為「編碼參與膜合成和膜轉運的蛋白質的穀氨酸棒桿菌基因」的發明專利申請的分案申請。
相關申請本申請要求於1999年6月25日申請的美國臨時專利申請順序號60/141031的優先權。本申請也要求以下專利申請的優先權1999年7月8日申請的德國專利申請號19931454.3、1999年7月8日申請的德國專利申請號19931478.0、1999年7月8日申請的德國專利申請號19931563.9、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932122.1、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932124.8、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932125.6、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932128.0、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932180.9、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932182.5、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932190.6、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932191.4、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932209.0、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932212.0、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932227.9、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932228.7、99070申請的德國專利申請號19932229.5、1999年7月9日申請的德國專利申請號19932230.9、1999年7月14日申請的德國專利申請號19932927.3、1999年7月14日申請的德國專利申請號19933005.0、1999年7月14日申請的德國專利申請號19933006.9、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940764.9、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940765.7、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940766.5、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940830.0、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940831.9、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940832.7、1999年8月27日申請的德國專利申請號19940833.5、1999年8月31日申請的德國專利申請號19941378.9、1999年8月31日申請的德國專利申請號19941379.7、1999年8月31日申請的德國專利申請號19941395.9、1999年9月3日申請的德國專利申請號19942077.7、1999年9月3日申請的德國專利申請號19942078.5、1999年9月3日申請的德國專利申請號19942079.3和1999年9月3日申請的德國專利申請號19942088.2。所有以上引用的申請的全部內容均通過引用結合到本文中。
背景技術：
在細胞中天然發生的代謝過程的某些產物和副產物在多種多樣的工業中具有實用性，所述工業包括食品工業、飼料工業、化妝品工業和製藥業。這些分子統稱為「精細化學品」，包括有機酸、生成蛋白質的(proteinogenic)和非生成蛋白質的胺基酸、核苷酸和核苷、脂質和脂肪酸、二元醇、糖類、芳族化合物、維生素和輔因子和酶。它們的生產最為方便的是通過開發用以生產和分泌大量的一種或多種所需分子的細菌的大規模培養來進行。用於此目的的一種特別有用的生物是穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，這是一種革蘭氏陽性的非致病菌。通過菌株的選擇，已經開發了許多產生一系列所需化合物突變型菌株。然而，在特定分子生產方面改進的菌株的選擇是一個費時且困難的過程。
發明概要本發明提供具有多種用途的新型細菌核酸分子。這些用途包括可以用來生產精細化學品的微生物的鑑定、穀氨酸棒桿菌或相關細菌中精細化學品生產的調節、穀氨酸棒桿菌或相關細菌的定型或鑑定、作為穀氨酸棒桿菌基因組作圖的參比點以及作為轉化的標記。這些新型核酸分子編碼本文中稱為膜構建和膜轉運(membrane construction andmembrane transport)(MCT)蛋白的蛋白質。
穀氨酸棒桿菌是一種革蘭氏陽性需氧菌，通常用於工業中以大規模生產種類繁多的精細化學品，也用於糖類降解(例如用於石油溢出)以及用於萜類化合物的氧化。因此，本發明的MCT核酸分子可以用來鑑定可以用以例如通過發酵過程生產精細化學品的微生物。本發明MCT核酸表達的調節或本發明MCT核酸分子序列的修飾，可以用以調節得自微生物的一種或多種精細化學品的生產(例如以改進得自棒桿菌或短桿菌菌種的一種或多種精細化學品的收率或產量)。
本發明的MCT核酸也可以用來將生物鑑定為穀氨酸棒桿菌或其密切相關菌種，或用來鑑定混合微生物群體中穀氨酸棒桿菌或其相關菌種的存在。本發明提供多種穀氨酸棒桿菌基因的核酸序列；通過用跨越穀氨酸棒桿菌基因區的探針，在嚴格條件下探測特有微生物或混合微生物群體的培養物的提取的基因組DNA，人們可以確定該生物是否存在。雖然穀氨酸棒桿菌本身是非致病性的，但它與人類中的致病菌種例如白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉的病原體)相關；這類生物的檢測具有重大的臨床意義。
本發明的MCT核酸分子也可以用作穀氨酸棒桿菌基因組或相關生物基因組作圖的參比點。同樣，這些分子或其變異體或其部分可以用作基因工程棒桿菌或短桿菌菌種的標記。
由本發明新型核酸分子編碼的MCT蛋白能夠例如執行參與膜生物合成必需的化合物的代謝(例如，生物合成或降解)或有助於一種或多種化合物跨膜轉運進或轉運出細胞的功能。已知可得到用於穀氨酸棒桿菌的克隆載體例如Sinskey等的美國專利號4,649,119中的克隆載體以及用於穀氨酸棒桿菌和相關短桿菌菌種(例如乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum))遺傳操作技術(Yoshihama等，J.Bacteriol.162591-597(1985)；Katsumata等，J. Bacteriol.159306-311(1984)；和Santamaria等，J. Gen.Microbiol.1302237-2246(1984))，因此本發明的核酸分子可以用於這種生物的基因工程，以使其成為一種或多種精細化學品的更好或更有效的生產者。精細化學品的這種改進的生產或產率可能是由於本發明基因的操作的直接效應引起的，或者它可能是由這類操作的間接效應引起的。
有許多機制使得改變本發明MCT蛋白可以直接影響摻入這種改變的蛋白的穀氨酸棒桿菌菌株生產精細化學品的收率、產量或產率。可以在數量或活性方面增加參與細胞輸出精細化學品分子的那些MCT蛋白，使得將更大量的這些化合物分泌到胞外介質中，從胞外介質中更為容易地回收它們。同樣，可以在數量或活性方面增加參與一種或多種精細化學品(例如磷酸、硫酸、含氮化合物等)生物合成所必需營養物輸入的那些MCT蛋白，使得細胞內這些前體、輔因子或中間體化合物的濃度增加。此外，脂肪酸和脂質本身是理想的精細化學品；通過優化一種或多種參與這些化合物生物合成的本發明MCT蛋白的活性或增加其數量，或通過降低一種或多種參與這些化合物降解的MCT蛋白的活性，有可能增加穀氨酸棒桿菌生產脂肪酸和脂質分子的收率、產量和/或產率。
一種或多種本發明MCT基因的誘變也可能產生活性改變的MCT蛋白，這間接影響穀氨酸棒桿菌的一種或多種所需精細化學品的生產。例如，可以在數量或活性方面增加參與廢物輸出的本發明MCT蛋白，使得細胞的正常代謝廢物(由於所需精細化學品的過量生產所致，其量有可能增加)在它們能夠損害細胞內核苷酸和蛋白(這可能降低細胞的生存力)或幹擾精細化學品生物合成途徑(這可能降低所需精細化學品的收率、產量或產率)之前，得以有效地輸出。另外，胞內相對大量的所需精細化學品本身可能對細胞有毒性，因此通過增加能夠將該化合物輸出所述細胞的轉運蛋白的活性或數量，可能提高培養物中細胞的生存力，這進而導致在所述培養物中生產所需精細化學品的細胞數更大。也可以操作本發明的MCT蛋白，使得可生產相對量的不同脂質和脂肪酸分子。這可能對細胞膜的脂質組成具有深遠的影響。由於每種類型的脂質具有不同的物理特性，因此膜脂質組成的改變可能顯著改變膜的流動性。膜流動性的改變可以影響跨越所述膜的分子轉運以及細胞的完整性，這兩者對大規模發酵培養物中穀氨酸棒桿菌的精細化學品生產具有深遠的影響。
本發明提供編碼本文稱為MCT蛋白的新型核酸分子，所述MCT蛋白能夠例如參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需的化合物的代謝、或參與跨越這些膜的分子轉運。編碼MCT蛋白的核酸分子在本文中稱為MCT核酸分子。在一個優選實施方案中，所述MCT蛋白參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需的化合物的代謝、或參與跨越這些膜的分子轉運。這類蛋白的實例包括由表1中所述基因編碼的那些蛋白。
因此，本發明的一個方面涉及分離的核酸分子(例如cDNA、DNA或RNA)，所述分離的核酸分子包含編碼MCT蛋白或其生物活性部分的核苷酸序列，還涉及適合作為檢測或擴增MCT編碼核酸(例如DNA或mRNA)的引物或雜交探針的核酸片段。在特別優選的實施方案中，所述分離的核酸分子包含序列表中奇數SEQ ID NO(例如SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7...)中所述核苷酸序列之一、序列表中奇數SEQ ID NO(例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7...)中所述核苷酸序列之一、或這些核苷酸序列之一的編碼區或其互補序列。在其它特別優選的實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含這樣的核苷酸序列或其部分，所述核苷酸序列與一種序列表奇數SEQ ID NO(例如SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7...)中所述核苷酸序列雜交或有至少約50％、優選至少約60％、更優選至少約70％、80％或90％、甚至更優選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性。在其它優選實施方案中，所述分離的核酸分子編碼序列表偶數SEQ ID NO (例如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8...)中所述胺基酸序列之一。本發明優選的MCT蛋白也最好具有至少一種本文所述的MCT活性。
在另一實施方案中，所述分離的核酸分子編碼一種蛋白質或其部分，其中所述蛋白或其部分包括足以與本發明胺基酸序列(例如具有序列表中偶數SEQ ID NO的序列)同源的胺基酸序列，例如足以與本發明的胺基酸序列同源，使得所述蛋白質或其部分保留MCT活性。最好是，由所述核酸分子編碼的蛋白質或其部分保留參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運的能力。在一個實施方案中，由所述核酸分子編碼的蛋白質與本發明胺基酸序列(例如選自具有序列表中偶數SEQ ID NO的完整的胺基酸序列)的同源性為至少約50％、優選至少約60％、更優選至少約70％、80％或90％、最優選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更高。在另一優選實施方案中，所述蛋白質是與本發明完整胺基酸序列(由序列表中相應的奇數SEQ ID NO(例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7...)中所示的可讀框編碼)基本上同源的全長穀氨酸棒桿菌蛋白質。
在另一優選實施方案中，所述分離的核酸分子得自穀氨酸棒桿菌，並且編碼一種包括一個生物活性結構域的蛋白質(例如MCT融合蛋白)，所述生物活性結構域與一種本發明的胺基酸序列(例如序列表中一種偶數SEQ ID NO的序列)有至少約50％或更高的同源性，並且能夠參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝、或參與跨越這些膜的分子轉運，或具有表1中所述的一種或多種活性，所述分離的核酸分子也包括編碼異源多肽或調節區的異源核酸序列。
在另一實施方案中，所述分離的核酸分子至少長15個核苷酸，並且在嚴格條件下與包含本發明核苷酸序列(例如序列表中奇數SEQ IDNO的序列)的核酸分子雜交。優選所述分離的核酸分子對應於天然存在的核酸分子。更優選所述分離的核酸編碼天然存在的穀氨酸棒桿菌MCT蛋白或其生物活性部分。
本發明的另一方面涉及含有本發明核酸分子的載體，例如重組表達載體，涉及已經導入這類載體的宿主細胞。在一個實施方案中，這樣一種宿主細胞用來通過在合適的培養基中培養所述宿主細胞而生產MCT蛋白。然後從所述培養基或所述宿主細胞中分離出所述MCT蛋白。
本發明的再一方面涉及其中已經導入MCT基因或改變MCT基因的遺傳改變的微生物。在一個實施方案中，通過導入作為轉基因的編碼野生型或突變型MCT序列的本發明核酸分子，已經改變了所述微生物的基因組。在另一實施方案中，所述微生物基因組內的內源MCT基因通過與改變的MCT基因同源重組而已經被改變，例如功能性斷裂。在另一實施方案中，微生物中內源的或所引入的MCT基因通過一個或多個點突變、缺失或倒位而被改變，但仍編碼功能性MCT蛋白。在再一實施方案中，微生物中MCT基因的一個或多個調節區(例如啟動子、阻抑蛋白或誘導物)已經被改變(例如通過缺失、截短、倒位或點突變)，使得所述MCT基因的表達得到調節。在一個優選實施方案，所述微生物屬於棒桿菌屬或短桿菌屬，特別優選穀氨酸棒桿菌。在一個優選實施方案中，所述微生物也用於生產所需化合物，例如胺基酸，特別優選賴氨酸。
另一方面，本發明提供一種鑑定受治療者體內白喉棒桿菌存在或其活性的方法。該方法包括檢測受治療者體內的一種或多種本發明的核酸序列或胺基酸序列(例如序列表SEQ ID NO 1-676中所述序列)，由此檢測所述受治療者體內白喉棒桿菌的存在或其活性。
本發明的又一方面涉及分離的MCT蛋白或其部分，例如生物活性部分。在一個優選實施方案中，所述分離MCT蛋白或其部分可以參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運。在另一優選實施方案中，所述分離的MCT蛋白或其部分與本發明的胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO的序列)足夠同源，使得所述蛋白質或其部分保留參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運的能力。
本發明也提供MCT蛋白的分離製劑。在優選實施方案中，所述MCT蛋白包含本發明的胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO的序列)。在另一優選實施方案中，本發明涉及與本發明的完整胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO的序列)(由序列表A中相應奇數SEQ ID NO所述可讀框編碼)基本上同源的分離的全長蛋白質。在再一實施方案中，所述蛋白質與本發明完整胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO的序列)的同源性為至少約50％、優選至少約60％、更優選至少約70％、80％或90％、最優選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更高。在其它實施方案中，所述分離的MCT蛋白包含與本發明的一種胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO的序列)的同源性至少約50％或更高的胺基酸序列，並且能夠參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運，或具有表1中所述的一種或多種活性。
或者，所述分離的MCT蛋白可以包含這樣一種核苷酸序列編碼的胺基酸序列，所述核苷酸序列與序列表中一種偶數SEQ ID NO所述的核苷酸序列雜交，例如在嚴格條件下雜交，或與序列表中一種奇數SEQ ID NO所示的核苷酸序列的同源性至少約50％、優選至少約60％、更優選至少約70％、80％或90％、最優選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更高。也優選MCT蛋白的優選形式也具有本文所述一種或多種MCT生物活性。
所述MCT多肽或其生物活性部分可以與一種非MCT多肽有效地連接，形成融合蛋白。在優選實施方案中，這種融合蛋白具有不同於單獨的所述MCT蛋白的活性。在其它優選實施方案中，這種融合蛋白參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運。在特別優選的實施方案中，這種融合蛋白整合到宿主細胞中，調節所述細胞的所需化合物產生。
另一方面，本發明提供用於篩選調節MCT蛋白活性的分子的方法，所述分子或者通過與MCT蛋白本身相互作用或者作為所述MCT蛋白的底物或結合配偶體，或者通過調節本發明MCT核酸分子的轉錄或翻譯，調節MCT蛋白活性。
本發明的另一方面涉及用於生產精細化學品的方法。該方法包括培養含指導本發明MCT核酸分子表達的載體的細胞，使得可生產精細化學品。在一個優選實施方案中，該方法還包括獲得含這種載體的細胞的步驟，其中用指導MCT核酸表達的載體轉染細胞。在另一優選實施方案中，該方法還包括從培養物中回收所述精細化學品的步驟。在一個特別優選的實施方案中，所述細胞得自棒桿菌屬或短桿菌屬，或選自表3中所述的那些菌株。
本發明的另一方面涉及用於調節由微生物生產分子的方法。這類方法包括使所述細胞與調節MCT蛋白活性或MCT核酸表達的因子接觸，使得細胞相關活性相對於在缺乏所述因子時的所述活性而言被改變。在一個優選實施方案中，調節所述細胞的一種或多種穀氨酸棒桿菌細胞膜組分的代謝途徑，或調節所述細胞的跨越這些膜的化合物轉運，使得改進這種微生物的所需精細化學品的收率或產率。調節MCT蛋白活性的因子可以是刺激MCT蛋白活性或MCT核酸表達的因子。刺激MCT蛋白活性或MCT核酸表達的因子的實例包括小分子、活性MCT蛋白和已被導入所述細胞的編碼MCT蛋白的核酸。抑制MCT活性或表達的因子的實例包括小分子和反義MCT核酸分子。
本發明的另一方面涉及調節細胞的所需化合物收率的方法，所述方法包括將野生型或突變型MCT基因導入細胞中，或者保留在單獨的質粒上或整合到宿主細胞的基因組中。如果整合到基因組中，則這種整合可以是隨機的，或它可以通過同源重組而發生，使得所述天然基因被所導入的拷貝取代，導致從待調節的細胞產生所述所需化合物。在一個優選實施方案中，所述收率增加。在另一優選實施方案中，所述化學品是一種精細化學品。在一個特別優選的實施方案中，所述精細化學品是一種胺基酸。在尤其優選的實施方案中，所述胺基酸是L-賴氨酸。
發明詳述本發明提供MCT核酸分子和MCT蛋白分子，所述分子參與穀氨酸棒桿菌細胞膜組分的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運。本發明的分子可以用於或者直接調節微生物例如穀氨酸棒桿菌的精細化學品產生(例如其中脂肪酸生物合成蛋白的過量表達或優化對經修飾的穀氨酸棒桿菌的脂肪酸收率、產量和/或產率有直接影響)，或可以具有間接影響，這無論如何導致所需化合物的收率、產量和/或產率的提高(例如其中細胞膜組成代謝的調節導致收率、產量和/或產率或細胞膜組合的改變，這進而可以影響一種或多種精細化學品的生產)。以下進一步說明本發明的各個方面。
I.精細化學品術語「精細化學品」是本領域公知的，包括由生物產生的在各種工業(例如但不限於製藥業、農業和化妝品工業)上具有多種應用的分子。這類化合物包括有機酸，例如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸；生成蛋白質的和非生成蛋白質的胺基酸；嘌呤和嘧啶鹼基、核苷和核苷酸(如描述於例如Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相關化合物，載於Biotechnology，第6卷，第561-612頁，Rehm等編著，VCHWeinheim以及其中含有的參考文獻)；脂質、飽和和不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)；二元醇(例如丙二醇和丁二醇)；糖類(例如透明質酸和海藻糖)；芳族化合物(例如芳香胺、香草醛和靛藍)；維生素和輔因子(如描述於Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，「Vitamins」，第443-613頁(1996)VCHWeinheim以及其中的參考文獻；和Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)「Nutrition，Lipids，Health，and Disease」Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，於1994年9月1-3日在馬來西亞Penang舉行，AOCS Press，(1995))；酶；聚酮化合物(Cane等(1998)Science 28263-68)；和描述於Gutcho(1983)Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086中以及其中的參考文獻的所有其它化學品。以下進一步詳細描述這些精細化學品中的某些的代謝和應用。
A.胺基酸代謝和應用胺基酸包括所有蛋白質的基本結構單元，因此是所有生物的正常細胞功能必不可少的。術語「胺基酸」是本領域公知的。生成蛋白質的胺基酸有20種，用作蛋白質的結構單元，在蛋白質中它們通過肽鍵連接；而非蛋白生成的胺基酸(已知數百種所述胺基酸)不是在蛋白質中正常發現的(參見Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97頁VCHWeinheim(1985))。胺基酸可以具有D-或L-光學構型，雖然L-胺基酸一般是天然存在的蛋白質中發現的唯一類型。20種生成蛋白質的胺基酸中每種的生物合成和降解途徑已經在原核細胞和真核細胞中很好地表徵了(參見例如Stryer，L. Biochemistry，第3版，第578-590頁(1988))。「必需」胺基酸(組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)如此命名，是因為它們的生物合成複雜，一般是營養上需要的，所述「必需」胺基酸容易通過簡單的生物合成途徑轉化為其餘11種「非必需」胺基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸)。高等動物的確保留合成這些胺基酸中的某些胺基酸，但必需胺基酸必需從飲食中供應，以便進行正常的蛋白質合成。
除了這些胺基酸在蛋白質生物合成中的功能外，這些胺基酸自身還是令人感興趣的化學品，已經發現其中許多胺基酸在食品工業、飼料工業、化學工業、化妝品工業、農業和製藥業中具有各種應用。賴氨酸不僅是人類營養的重要胺基酸，而且也是單胃動物(例如家禽和豬)營養的重要胺基酸。穀氨酸最常用作調味添加劑(穀氨酸一鈉，MSG)，並且在食品工業廣泛使用，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸都用於製藥業。穀氨醯胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸在製藥業和化妝品工業上有價值。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常用的飼料添加劑。(Leuchtenberger，W.(1996)胺基酸-技術生產和應用，載於Rehm等(編著)Biotechnology，第6卷，第14a章，第466-502頁，VCHWeinheim)。另外，已經發現這些胺基酸可用作合成胺基酸和蛋白質合成的前體，例如N-乙醯半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥基色氨酸以及描述於Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第A2卷，第57-97頁，VCHWeinheim，1985的其它胺基酸。
在能夠生產這些天然胺基酸的生物(例如細菌)體內的這些天然胺基酸的生物合成已經很好地表徵(有關細菌胺基酸生物合成及其調節的綜述，參見Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。通過檸檬酸循環中的中間體α-酮戊二酸的還原醯胺化，合成穀氨酸。隨後由穀氨酸分別產生穀氨醯胺、脯氨酸和精氨酸。絲氨酸的生物合成是一個三步驟過程，以3-磷酸甘油酸(糖酵解中的中間體)開始，在氧化、轉氨基作用和水解步驟後，產生這種胺基酸。半胱氨酸和甘氨酸都由絲氨酸產生，前者通過高半胱氨酸和絲氨酸縮合而產生，而後者通過在一個由絲氨酸轉羥甲基酶催化的反應中將側鏈β-碳原子轉移至四氫葉酸而產生。苯丙氨酸和酪氨酸在預苯酸合成後在僅最後兩個步驟不同的9步驟生物合成途徑中，由糖酵解和戊糖磷酸途徑前體4-磷酸赤蘚糖和磷酸烯醇丙酮酸合成。色氨酸也由這兩種起始分子產生，但其合成是一個11步驟途徑。酪氨酸也可以在一個由苯丙氨酸羥化酶催化的反應中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是糖酵解終產物-丙酮酸的生物合成產物。天冬氨酸由檸檬酸循環的中間體草醯乙酸生成。天冬醯胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸分別通過天冬氨酸的轉化而產生。異亮氨酸由蘇氨酸生成。一個複雜的9步驟途徑導致由一種活化糖-5-磷酸核糖-1-焦磷酸產生組氨酸。
細胞的過量蛋白質合成需求中的胺基酸不能被貯存，而是被降解，為細胞的主要代謝途徑提供中間體(有關綜述參見Stryer，L.Biochemistry，第3版，第21章，「胺基酸降解和尿素循環」，第495-516頁(1988))。雖然細胞能夠將不想要的胺基酸轉化為有用的代謝中間體，但就能量、前體分子和合成胺基酸所必需的酶而言，胺基酸生產是昂貴的。因此，胺基酸生物合成受反饋抑制調節是不奇怪的，在反饋抑制中，特定胺基酸的存在起減慢或完全終止其自身產生的作用(有關胺基酸生物合成途徑中的反饋機制的綜述，參見Stryer，L.Biochemistry，第3版，第24章，「胺基酸和血紅素的生物合成」，第575-600頁(1988))。因此，任何特定胺基酸的輸出受細胞中存在的胺基酸量的限制。
B.維生素、輔因子和營養藥的代謝和應用維生素、輔因子和營養藥包括高等動物已經喪失合成能力並且因此必須攝入的另外一組分子，儘管它們容易由其它生物例如細菌合成。這些分子或者本身是生物活性物質，或者是可以用作用作電子載體或多種代謝途徑的中間體的生物活性物質的前體。這些化合物除了具有營養價值外，也具有作為著色劑、抗氧化劑和催化劑或其它加工助劑的重要工業價值。(有關這些化合物的結構、活性和工業應用的概述，參見例如Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，「Vitamins」，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996)。術語「維生素」是本領域公知的，包括生物正常功能所需、但生物自身不能合成的營養物。維生素類可以包括輔因子和營養藥化合物。用語「輔因子」包括發生正常酶活性所需的非蛋白性化合物。這類化合物可以是有機化合物或無機化合物；本發明的輔因子分子最好是有機分子。術語「營養藥」包括在植物和動物、特別是人類中具有健康益處的食物增補劑。這類分子的實例是維生素、抗氧化劑以及某些脂質(例如多不飽和脂肪酸)。
已經大量表徵了這些分子在能夠生產其的生物例如細菌中的生物合成(Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，「Vitamins」，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley Sons；Ong，A.S.，Niki，E和Packer，L.(1995)「Nutrition，Lipids，Health，and Disease」Proceedings of the UNESCO/Confederationof Scientific and Technological Associations in Malaysia，and the Societyfor Free Radical Research-Asia，於1994年9月1-3日在馬來西亞Penang舉行，AOCS PressChampaign，IL X，374 S)。
通過將嘧啶和噻唑部分化學偶聯，產生硫胺素(維生素B1)。核黃素(維生素B2)由鳥苷-5』-三磷酸(GTP)和核糖-5』-磷酸合成。核黃素進而用來合成黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。統稱為「維生素B6」的化合物家族(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛-5』-磷酸以及商業上使用的鹽酸吡哆醇)都是具有共同結構單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸((R)-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可以或者通過化學合成或者通過發酵生產。泛酸生物合成中的最後的步驟由ATP驅動的β-丙氨酸和泛解酸縮合組成。負責轉化為泛解酸、β-丙氨酸和轉化為泛酸的縮合的生物合成步驟的酶是已知的。代謝活性形式的泛酸是輔酶A，其生物合成以5個酶促步驟進行。泛酸、吡哆醛-5』-磷酸、半胱氨酸和ATP是輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸的生成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(前維生素B5)、泛醯巰基乙胺(及其衍生物)和輔酶A的產生。
已經詳細研究了微生物中由前體分子庚二醯輔酶A開始的生物素生物合成，並且已經鑑定出所涉及的幾種基因。已經發現許多相應的蛋白質也參與鐵簇合成，並且是nifS類蛋白質的成員。硫辛酸衍生自辛酸，用作能量代謝中的輔酶，在能量代謝中它成為丙酮酸脫氫酶複合體和α-酮戊二酸脫氫酶複合體的一部分。葉酸類是一類葉酸衍生物的物質，葉酸又衍生自L-穀氨酸、對氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已經在某些微生物中詳細地研究了葉酸及其衍生物的生物合成，所述生物合成起始於代謝中間體鳥苷-5』-三磷酸(GTP)、L-穀氨酸和對氨基苯甲酸。
類咕啉(例如鈷胺素、特別是維生素B12)和卟啉屬於一類特徵為四吡咯環系的化學物質。維生素B12的生物合成足夠複雜，以致尚未被完全鑑定，但現在已知許多所涉及的酶和底物。煙酸和煙醯胺是吡啶衍生物，也稱為「尼克酸」。煙酸是重要的輔酶NAD(煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其還原形式的前體。
這些化合物的大規模生產一直主要依靠無細胞化學合成，儘管這些化學品中的某些也已經通過大規模微生物培養來生產，例如核黃素、維生素B6、泛酸和生物素。僅維生素B12由於其合成的複雜性通過發酵生產。體外方法花費大量原料和時間，通常費用巨大。
C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代謝和應用嘌呤和嘧啶代謝基因及其相應的蛋白質是腫瘤疾病和病毒感染的重要的治療靶。用語「嘌呤」或「嘧啶」包括含氮鹼基，它們是核酸、輔酶和核苷酸的組分。術語「核苷酸」包括核酸分子的基本結構單元，它們由一個含氮鹼基、一個戊糖(在RNA的情況下，所述糖是核糖；在DNA的情況下，所述糖是D-脫氧核糖)和磷酸構成。用語「核苷」包括用作核苷酸前體、但缺乏核苷酸所具有的磷酸部分的分子。通過抑制這些分子的生物合成或抑制其形成核酸分子的轉移，有可能抑制RNA和DNA的合成；通過以靶向癌細胞的方式抑制這種活性，可以抑制腫瘤細胞分裂和複製的能力。另外，有不形成核酸分子、而是用作能量貯存(即AMP)或用作輔酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
幾個出版物已經描述了通過影響嘌呤和/或嘧啶代謝，將這些化學物質用於這些醫學適應徵(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)「作為化療藥的嘧啶和嘌呤從頭生物合成的有效抑制劑」，Med.Res.Reviews 10505-548)。對參與嘌呤和嘧啶代謝的酶的研究一直集中於可以用作例如免疫抑制劑或抗增殖藥的新藥的開發(Smith，J.L.，(1995)「核苷酸合成中的酶」，Curr.Opin. struct.Biol.5752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23877-902)。然而，嘌呤和嘧啶鹼基、核苷和核苷酸具有其它用途用作幾種精細化學品(例如硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、葉酸或核黃素)生物合成的中間體、用作細胞的能量載體(例如ATP或GTP)和用於化學品自身，通常用作黃素增強劑(例如IMP或GMP)或用於幾種藥物應用(參見例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesand Related Compounds in Biotechnology，第6卷，Rehm等編著，VCHWeinheim，第561-612頁)。此外，參與嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代謝的酶越來越多地用作開發用於保護作物的化學品的靶，所述化學品包括殺真菌劑、除草劑和殺蟲劑。
已經鑑定了這些化合物在細菌中的代謝(有關綜述參見例如Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)「嘌呤核苷酸的從頭生物合成」，載於Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology，第42卷，Academic Press，第259-287頁；和Michal，G.(1999)「核苷酸和核苷」，載於Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，第8章，WileyNew York)。嘌呤代謝一直是廣泛研究的主題，並且對於細胞的正常功能是必不可少的。在高等動物中嘌呤代謝受損可以引起嚴重的疾病，例如痛風。嘌呤核苷酸由核糖-5-磷酸開始合成，通過中間體化合物肌苷-5』-磷酸(IMP)的一系列步驟，導致鳥苷-5』-一磷酸(GMP)或腺苷-5』-一磷酸(AMP)的產生，由GMP或AMP容易生成用作核苷酸的三磷酸形式。這些化合物也用作能量貯存，因為其降解為細胞中的許多不同生物化學過程提供能量。嘧啶生物合成通過由核糖-5-磷酸形成尿苷-5』-一磷酸(UMP)而進行。UMP進而轉化為胞苷-5』-三磷酸(CTP)。所有這些核苷酸的脫氧形式在一步還原反應中產生，從所述核苷酸的二磷酸核糖形式還原反應為所述核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。在磷酸化後，這些分子能夠參與DNA合成。
D.海藻糖的代謝和應用海藻糖由以α，α-1，1-鍵合連接的兩個葡萄糖分子組成。海藻糖在食品工業中通常用作甜味劑，即用於乾燥食品或冷凍食品和飲料中的一種添加劑。然而，它在製藥業、化妝品工業和生物技術工業中也具有許多應用(參見例如Nishimoto等，(1998)美國專利號5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.(1998)Trends Biotech.16460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2293-314；和Shiosaka，M.(1997)J.Japan 17297-102)。海藻糖用來自許多微生物的酶來生產，並且天然被釋放到周圍介質中，可以用本領域已知的方法從所述周圍介質中收集海藻糖。
II.膜生物合成和跨膜轉運細胞膜在細胞中有各種各樣的功能。首要的是，細胞膜將細胞內容物與周圍環境區分開來，因此給予細胞完整性。細胞膜也用作阻擋有害或不想要的化合物流入以及阻止所需化合物流出的屏障。細胞膜由於其脂質分子雙層的結構，對於不易擴散的親水性化合物例如蛋白質、水分子和離子是天然不透過性的，在脂質分子雙層結構中，極性頭基面向外(分別朝向細胞的外部和內部)，而劑型尾面向內朝向雙層中心，形成疏水核心(有關膜結構和功能的總體綜述，參見Gennis，R.B.(1989)Biomembranes，Molecular Structure and Function，SpringerHeidelberg)。這種屏障使細胞能夠維持相對高於周圍介質中所含濃度的所需化合物和相對低濃度不需要的化合物，因為這些化合物的擴散被膜有效地阻斷。然而，膜也提供了輸入所需化合物和輸出廢物分子的有效屏障。為了克服這種困難，細胞膜摻入了許多種類的轉運蛋白，所述轉運蛋白能夠促進不同種類化合物的跨膜轉運。有兩個主要類別的轉運蛋白膜孔蛋白或通道蛋白以及轉運蛋白。前者形成膜內在蛋白，有時形成蛋白複合體，構成受調節的通過該膜的膜孔。這種調節或者「門控」通常對於所述膜孔蛋白或通道蛋白待轉運的分子是特異性的，使得這些跨膜構成物選擇性地可透過特定類別的底物；例如構建鉀通道，使得僅電荷和大小類似於鉀的離子可以通過。通道蛋白和膜孔蛋白往往具有分隔的疏水結構域和親水結構域，使得所述蛋白質的疏水面可以與膜的內部締合，而親水面襯於通道內部，由此提供選定親水分子可以通過的受保護的親水環境。本領域已知許多這類膜孔/通道，包括鉀離子、鈣離子、鈉離子和氯離子的膜孔/通道。
這種膜孔和通道介導的易化擴散系統限於非常小的分子，例如離子，因為大到足以讓完整蛋白質通過易化擴散而通過的膜孔或通道也不能阻止較小的親水性分子的通過。通過這一過程的分子轉運有時稱為「易化擴散」，因為發生所述轉運需要濃度梯度的驅動力。當較大分子(例如葡萄糖或其它糖)在膜一側的濃度高於另一側時，通透酶也提供這些分子到細胞中的易化擴散(也稱為「單向轉運」)。與膜孔或通道相反，這些膜內在蛋白(通常具有6-14個跨膜α-螺旋)不形成通過膜的開放通道，而是與膜表面的靶分子結合，然後經過構象變化，使得所述靶分子在膜的相反一側釋放。
然而，細胞通常需要逆現有濃度梯度輸入或輸出分子(「主動轉運」)，這是不能發生易化轉運的情況。細胞使用兩個主要的機制進行膜轉運同向轉運或對向轉運、以及能量偶聯轉運，例如ABC轉運蛋白介導的轉運。同向轉運和對向轉運系統偶聯跨越膜的兩種不同分子的運動(通過對於所述兩種不同分子具有兩個獨立的結合部位的通透酶)；在同向轉運中，兩種分子以同一方向轉運，而在對向轉運中，一種分子輸入，另一種分子輸出。這在能量學上可能的，因為這兩種分子之一按照濃度梯度運動，這種符合能量學的事件僅在所需化合物逆優勢(prevailing)濃度梯度同時運動時才是允許的。在能量驅動的過程中，單種分子可以被逆濃度梯度跨膜轉運，例如ABC轉運蛋白所利用的能量驅動過程。在該系統中，位於膜中的轉運蛋白具有一個ATP結合盒；當靶分子結合時，ATP轉化為ADP+Pi，所產生的能量釋放被用來驅動所述轉運蛋白易化的靶分子到膜另一面的移動。有關所有這些轉運系統的更詳細描述，參見Bamberg，E.等，(1993)「脂質雙層膜上離子泵的電荷轉運」，Q.Rev.Biophys.261-25；Findlay，J.B.C.(1991)「膜轉運系統中的結構和功能」，Curr.Opin.Struct.Biol.1804-810；Higgins，C.F.(1992)「從微生物到人類的ABC轉運蛋白」，Ann.Rev.Cell Biol.867-113；Gennis，R.B.(1989)「膜孔、通道和轉運蛋白」，載於Biomembranes，Molecular Structure and Function，SpringerHeidelberg，第270-322頁；和Nikaido，H.和Saier，H.(1992)「細菌中的轉運蛋白其設計中的共同主題」，Science 258936-942以及這些參考文獻中的每個中所含有的參考文獻。
膜的合成是一個已充分表徵的過程，涉及許多組分，其中最為重要的是脂質分子。脂質合成可以分為兩個部分脂肪酸的合成及其與sn-甘油-3-磷酸的連接、以及極性頭基的加入或修飾。細菌細胞膜中所用的典型脂質包括磷脂、糖脂、鞘脂和磷酸甘油酯。脂肪酸合成始於或者由乙醯CoA羧化酶將乙醯CoA轉化為丙二醯CoA、或由乙醯基轉移酶將乙醯CoA轉化為乙醯-ACP。在縮合反應之後，這兩種產物分子一起形成乙醯乙醯-ACP，這通過一系列縮合、還原和脫水反應而轉化，產生具有所需鏈長的飽和脂肪酸分子。從這類分子產生不飽和脂肪酸，由特定的去飽和酶或者藉助於分子氧有氧催化，或者無氧催化(有關脂肪酸合成的參考文獻，參見F.C.Neidhardt等(1996)E.coliandSalmonella.ASM PressWashington，D.C.，第612-636頁和其中含有的參考文獻；Lengeler等(編著)(1999)Biology of Procaryotes.ThiemeStuttgart，New York和其中含有的參考文獻；和Magnuson，K.等(1993)Microbiological Reviews 57522-542和其中含有的參考文獻)。環丙烷脂肪酸(CFA)由特定CFA合酶用SAM作為共底物來合成。支鏈脂肪酸由支鏈胺基酸脫氨產生支鏈2-酮-酸而合成(參見Lengeler等編著(1999)Biology of Procaryotes.ThiemeStuttgart，New York及其中含有的參考文獻)。脂質合成中的另一必需步驟是由例如甘油-磷酸-醯基轉移酶將脂肪酸轉移至極性頭基上。各種前體分子和生物合成酶的聯合導致產生不同的脂肪酸分子，這對所述膜的組成具有深遠的影響。
III.本發明的元件和方法本發明至少部分基於本文稱為MCT核酸和蛋白分子的新分子的發現，所述MCT分子控制穀氨酸棒桿菌中細胞膜的產生並且控制跨越這類膜的分子的運動。在一個實施方案中，MCT分子參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運。在一個優選實施方案中，本發明的MCT分子調節膜組分產生和膜轉運的活性對該生物產生所需精細化學品有影響。在一個特別優選的實施方案中，本發明的MCT分子在活性上受調節，使得在收率、產量和/或產率以及化合物通過所述膜的轉運方面調節本發明MCT蛋白所調節的穀氨酸棒桿菌代謝途徑在效率方面被改變，這或者直接或者間接地調節穀氨酸棒桿菌的所需精細化學品的收率、產量和/或產率。
用語「MCT蛋白」或「MCT多肽」包括參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運的蛋白質。MCT蛋白的實例包括由表1中所述的MCT基因和奇數SEQ ID NO編碼的那些蛋白質。術語「MCT基因」或「MCT核酸序列」包括編碼MCT蛋白、由一個編碼區以及相應的非翻譯5』和3』序列區組成的核酸序列。MCT基因的實例包括表1中所述的那些基因。術語「產量」或「生產力」是本領域公知的，包括在給定時間和給定發酵體積內生成的發酵產物(例如所需精細化學品)的濃度(例如每小時每升的kg產物)。術語「產率」包括待達到的特定生產水平所需的時間(例如細胞達到特定精細化學品產出率需要多長時間)。術語「收率」或「產物/碳收率」是本領域公知的，包括碳源轉化為產物(即精細化學品)的效率。這通常表示為例如每kg碳源的kg產物。通過增加所述化合物的收率或產量，增加在給定時間給定量的培養物中該化合物的回收分子的量或可用回收分子的量。術語「生物合成」或「生物合成途徑」是本領域公知的，包括細胞在可以多步驟且高度受調節的過程中從中間體化合物開始的化合物、最好是有機化合物的合成。術語「降解」或「降解途徑」是本領域公知的，包括細胞在可以是多步驟且高度受調節的過程中將化合物、最好是有機化合物分解為降解產物(一般而言，是較小或複雜度較低的分子)。用語「代謝」是本領域公知的，包括生物體內發生的全部生物化學反應。特定化合物的代謝(例如諸如甘氨酸的胺基酸的代謝)則包括細胞中與該化合物有關的全部生物合成、修飾和降解途徑。
在另一實施方案中，本發明的MCT分子能夠調節微生物例如穀氨酸棒桿菌中所需分子例如精細化學品的產量。有許多機制使得改變本發明MCT蛋白可以直接影響得自摻入這種改變的蛋白的穀氨酸棒桿菌菌株的精細化學品的收率、產量和/或產率。可以在數量或活性上增加參與從細胞輸出精細化學品的那些MCT蛋白，使得更大量的這些化合物被分泌到胞外介質中，從胞外介質中更容易將其回收。同樣，可以在數量或活性上增加參與一種或多種精細化學品(例如磷酸、硫酸、含氮化合物等)生物合成所必需營養物輸入的那些MCT蛋白，使得這些前體、輔因子或中間體化合物在細胞中的濃度增加。此外，脂肪酸和脂質本身是理想的精細化學品；通過優化參與這些化合物生物合成的一種或多種本發明MCT蛋白的活性，或者增加所述MCT蛋白的數量，或者通過降低參與這些化合物降解的一種或多種MCT蛋白的活性，有可能增加得自穀氨酸棒桿菌的脂肪酸或脂質分子的收率、產量和/或產率。
一種或多種本發明MCT基因的誘變也可能產生具有改變活性的MCT蛋白，這間接影響得自穀氨酸棒桿菌的一種或多種所需精細化學品的產生。例如，可以數量或活性上增加參與廢物輸出的本發明MCT蛋白，使得細胞的正常代謝廢物(由於所需精細化學品的過量產生，其量可能增加)在能夠損害細胞內的核苷酸和蛋白質(這可能降低細胞的生存力)或幹擾精細化學品生物合成途徑(這可能降低所需精細化學品的收率、產量或產率)之前被有效地輸出。此外，胞內相對大量的所需精細化學品可能本身對細胞有毒性，因此通過增加能夠將該化合物輸出細胞的轉運蛋白的活性或數量，可能增加培養物中細胞的生存力，進而在培養物中產生更大量的生產所需精細化學品的細胞。也可以對本發明的MCT蛋白進行操作，使得產生相對量的不同脂質和脂肪酸分子。這可能對對細胞膜脂質組成有深遠的影響。由於每種類型的脂質具有不同的物理特性，因此膜脂質組成的改變可能顯著改變膜的流動性。膜流動性的改變可能影響跨越所述膜的分子的轉運以及細胞的完整性，這兩者對得自大規模發酵培養物中穀氨酸棒桿菌的精細化學品生產具有深遠的影響。
本發明的分離的核酸序列包含在穀氨酸棒桿菌菌株的基因組中，所述菌株可通過美國典型培養物保藏中心獲得，保藏號為ATCC13032。所述分離的穀氨酸棒桿菌MCT DNA的核苷酸序列和穀氨酸棒桿菌MCT蛋白的預測胺基酸序列分別示於序列表中奇數SEQ ID NO和偶數SEQ ID NO中。進行計算分析，將這些核苷酸序列分類和/或鑑定為參與細胞膜組分的代謝或參與跨越這些膜的化合物轉運的蛋白質的編碼序列。
本發明也涉及所具有的胺基酸與本發明胺基酸序列(例如序列表中的偶數SEQ ID NO的序列)基本上同源的蛋白質。本文所用的所具有的胺基酸序列與選定胺基酸序列基本上同源的蛋白質，與所選定胺基酸序列(例如所述完整的所選定胺基酸序列)至少約50％同源。所具有的胺基酸序列與選定胺基酸序列基本上同源的蛋白質，也可以與所選定胺基酸序列有至少約50-60％、優選至少約60-70％、更優選至少約70-80％、80-90％或90-95％、最優選至少約96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
本發明的MCT蛋白或其生物活性部分或片段可以參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運，或具有表1中所述的一種或多種活性。
在以下小節中更加詳細地描述本發明的各個方面。
A.分離的核酸分子本發明的一個方面涉及編碼MCT多肽或其生物活性部分的分離的核酸分子、以及足以用作MCT編碼核酸(例如MCT DNA)鑑定或擴增的雜交探針或引物的核酸片段。本文所用的術語「核酸分子」將是指包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及採用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。該術語也包括位於基因編碼區3』端和5』端的非翻譯序列基因編碼區5』端上遊的至少約100個核苷酸的序列和編碼區3』端下遊至少約20個核苷酸的序列。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好是雙鏈DNA。「分離的」核酸分子是與所述核酸天然來源中存在的其它核酸分子分離的核酸分子。最好是，「分離的」核酸不含所述核酸來源的生物的基因組DNA中天然鄰接所述核酸的序列(即位於所述核酸5』端和3』端的序列)。例如，在各種實施方案中，分離的MCT核酸分子可以含有小於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述核酸來源的細胞(例如穀氨酸棒桿菌細胞)的基因組DNA中天然鄰接所述核酸分子的核苷酸序列。此外，「分離的」核酸分子，例如DNA分子，可以基本上不含其它細胞物質，或當通過重組技術產生時不含培養基，或當化學合成時不合化學前體或其它化學物質。
本發明的核酸分子，例如具有序列表中奇數SEQ ID NO核苷酸序列的核酸分子或其部分，可以用標準分子生物學技術和本文提供的序列信息來分離。例如，可以用序列表中奇數SEQ ID NO序列之一的全部序列或部分序列作為雜交探針，採用用標準雜交技術(例如，描述於以下文獻的技術Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，可以從穀氨酸棒桿菌文庫中分離出穀氨酸棒桿菌MCT DNA。此外，包含本發明核酸序列(例如奇數SEQ ID NO)之一的全部或部分序列的核酸分子，可以採用基於該序列設計的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應來分離(例如，包含本發明核酸序列之一的全部或部分序列的核酸分子(例如序列表的奇數SEQ ID NO)可以採用基於所述序列的設計的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應來分離)。例如，可以從正常的內皮細胞分離mRNA(例如通過Chirgwin等(1979)Biochemistry 185294-5299的異硫氰酸萃取法)，然後用反轉錄酶(例如莫洛尼MLV反轉錄酶，可得自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或AMV反轉錄酶，可得自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)製備DNA。可以基於序列表中所示的核苷酸序列之一，設計用於聚合酶鏈式反應擴增的合成寡核苷酸引物。用cDNA或者基因組DNA作為模板，用合適的寡核苷酸引物，按照標準PCR擴增技術，可以擴增本發明的核酸。將如此擴增的核酸克隆到合適的載體中，並且通過DNA序列分析進行鑑定。此外，對應於MCT核苷酸序列的寡核苷酸可以通過標準合成技術，例如用自動DNA合成儀來製備。
在一個優選實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含一種序列表中所示的核苷酸序列。序列表中所示的本發明的核酸序列對應於本發明的穀氨酸棒桿菌MCT DNA。該DNA包含編碼MCT蛋白(即分別示於序列表奇數SEQ ID NO中的「編碼區」)的序列以及5』非翻譯序列和3』非翻譯序列，所述非翻譯序列也分別示於序列表中的奇數SEQID NO中。另一方面，所述核酸分子可以僅包含序列表中任一核酸序列的編碼區。
為了進行這種應用，人們會理解，序列表中所示的每種核酸序列和胺基酸序列具有標識性RXA、RXN、RXS或RXC編號，所述編號具有後接5位數字的標識符「RXA」、「RXN」、「RXS」或「RXC」(即RXA02099、RXN03097、RXS00148或RXC01748)。每種所述核酸序列包含至多三個部分一個5』上遊區、一個編碼區和一個下遊區。這三個區中的每個區通過相同的RXA、RXN、RXS或RXC標識符來鑑別，以避免混淆。敘述「序列表中奇數序列之一」則是指序列表中任一核酸序列，它也可以根據其不同的RXA、RXN、RXS或RXC標識符來區分。這些序列中的每個序列的編碼區被翻譯為相應的胺基酸序列，所述胺基酸序列也示於序列表中，作為緊接相應核酸序列之後的偶數SEQ ID NO。例如，RXA03097的編碼區示於SEQ ID NO1中，而其編碼的胺基酸序列示於SEQ ID NO2中。本發明核酸分子的序列根據與它們所編碼的胺基酸分子相同的RXA、RXN、RXS或RXC標識符來鑑別，使得可以容易地將它們相聯繫。例如，名為RXA02099、RXN03097、RXS00148和RXC01748的胺基酸序列分別是核酸分子RXA02099、RXN03097、RXS00148和RXC01748核苷酸序列編碼區的翻譯物。本發明的RXA、RXN、RXS和RXC核苷酸序列和胺基酸序列與其指定的SEQ ID NO之間的對應關係示於表1中。例如，如表1中所示，RXA00104的核苷酸序列是SEQ ID NO5，而RXA00104的胺基酸序列是SEQ ID NO6。
本發明的幾種基因是「F標誌的基因」。F標誌的基因包括表1中所示的在RXA、RXN、RXS或RXC標識符之前具有一個「F」的那些基因。例如，在表1中指定為「F RXA02581」的SEQ ID NO11是一種F標誌的基因，SEQ ID NO31、33和43(在表1中分別指定為「F RXA02487」，「F RXA02490」，「F RXA02809」)也是如此。
在一個實施方案中，本發明的核酸分子不是指包括表2中編輯的那些核酸分子。就dapD基因而言，該基因的序列公布於Wehrmann，A.等(1998)J. Bacteriol.180(12)3159-3165中。然而，本申請發明人獲得的序列顯著比所公布的形式長。認為所公布的形式依賴於不正確的起始密碼子，因此僅代表真實編碼區的一個片段。
在另一優選實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含作為本發明核苷酸序列(例如序列表中的奇數SEQ ID NO序列)之一的互補序列的核酸分子或其部分。作為本發明中所示核苷酸序列之一的互補序列的核酸分子是與序列表中所示的核苷酸序列(例如奇數SEQ ID NO序列)之一足夠互補、使得可以與本發明核苷酸序列之一雜交並因此形成穩定雙鏈體的核酸分子。
在再一優選實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含這樣的核苷酸序列或其部分，所述核苷酸序列與本發明核苷酸序列(例如序列表中的奇數SEQ ID NO序列)的同源性為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高。本發明也包括上述數值之間的範圍和標識數值(例如70-90％相同或80-95％相同)。例如，將包括採用上述值作為上限和/或下限的任何組合的標識值範圍。在另一優選實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含與本發明核苷酸序列之一雜交、例如在嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其部分。
此外，本發明的核酸分子可以僅包含序列表中一種奇數SEQ IDNO序列編碼區的一部分，例如可以用作探針或引物的片段或編碼MCT蛋白的生物活性部分的片段。根據從穀氨酸棒桿菌克隆MCT基因而測定的核苷酸序列，使得可以產生設計用於鑑定和/或克隆其它細胞類型和生物中的MCT同系物以及來自其它棒桿菌或相關菌種的MCT同系物的探針和引物。所述探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含一種核苷酸序列區，所述核苷酸序列區在嚴格條件下與本發明核苷酸序列之一(例如序列表中一種奇數SEQ ID NO序列)的有義鏈、這些序列之一的反義序列或其天然存在的突變體的至少約12個、優選約25個、更優選約40個、50個或75個連續核苷酸雜交。基於本發明核苷酸序列的引物可以用於PCR反應中，以克隆MCT同系物。基於所述MCT核苷酸序列的探針可以用來檢測編碼同一蛋白或同源蛋白的轉錄物或基因組序列。在優選實施方案中，所述探針還包含與其連接的一個標記基團，例如所述標記基團可以是放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。這類探針可以用作診斷試驗試劑盒的一部分，以鑑定錯誤表達(misexpress)MCT蛋白的細胞，例如通過測定細胞樣品中MCT編碼核酸的水平，例如檢測MCT mRNA水平或檢測基因組MCT基因是否已經突變或缺失。
在一個實施方案中，本發明的核酸分子編碼一種包含與本發明胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO序列)足夠同源的胺基酸序列的蛋白質或其部分，使得所述蛋白質或其部分保留參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運的能力。本文所用的用語「足夠同源」是指這樣的蛋白質或其部分，所述蛋白質或其部分所具有的胺基酸序列包含最小數目的與本發明胺基酸序列相同或等同(例如所具有的側鏈與序列表中一種偶數SEQ ID NO序列中的胺基酸殘基相似的胺基酸殘基)胺基酸殘基，使得所述蛋白質或其部分能夠參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運。本文所述的這類膜組分代謝途徑或膜轉運系統的蛋白成員可能在一種或多種精細化學品的生產和分泌方面起作用。在本文中也描述了這類活性的實例。因此，「MCT蛋白的功能」或者直接或者間接地影響一種或多種精細化學品生產的收率、產量和/或產率。MCT蛋白活性的實例示於表1中。
在另一實施方案中，所述蛋白質與本發明的完整胺基酸序列(例如序列表偶數SEQ ID NO序列)的同源性為至少約50-60％，優選至少約60-70％，更優選至少約70-80％、80-90％、90-95％，最優選至少約96％、97％、98％、99％或更高。
本發明MCT核酸分子所編碼的蛋白質的部分最好是一種所述MCT蛋白的生物活性部分。本文所用的術語「MCT蛋白的生物活性部分」將包括可以參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運的MCT蛋白的部分，例如結構域/基序，或具有表1中所述的一種活性。為了確定MCT蛋白或其生物活性部分是否可以參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運，可以進行酶活性的測定。這類測定方法是本領域技術人員眾所周知的，如實施例部分的實施例8中詳細描述的。
通過分離一種本發明胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO序列)的一部分，表達所編碼的所述MCT蛋白或肽的一部分(例如通過體外重組表達)，並且評價所編碼的所述MCT蛋白或肽部分的活性，可以製備另外的編碼MCT蛋白生物活性部分的核酸片段。
本發明還包括由於遺傳密碼的簡併性而不同於本發明核苷酸序列(例如序列表中的奇數SEQ ID NO序列)之一(和其部分)並因此編碼與本發明核苷酸序列所編碼蛋白相同的MCT蛋白的核酸分子。在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子所具有的核苷酸序列編碼具有序列表中所示胺基酸序列(例如偶數SEQ ID NO)的蛋白質。在再一實施方案中，本發明的核酸分子編碼與本發明胺基酸序列(由序列表中奇數SEQ ID NO中所示的可讀框編碼)基本上同源的全長穀氨酸棒桿菌蛋白。
本領域技術人員會理解，在一個實施方案中，本發明的序列不意味著包括現有技術的序列，例如表2或4中敘述的在本發明之前獲得的Genbank序列的那些序列。在一個實施方案中，本發明包括與本發明的核苷酸序列或胺基酸序列具有的同一性百分比大於現有技術序列(例如表2或4中敘述的Genbank序列(或由這種序列編碼的蛋白質))的同一性百分比的核苷酸序列和胺基酸序列。例如，本發明包括與名為RXA01420(SEQ ID NO7)的核苷酸序列的同一性大於38％和/或至少為38％的核苷酸序列；與名為RXA00104(SEQ ID NO5)的核苷酸序列的同一性大於41％和/或至少為41％的核苷酸序列；以及與名為RXA02173(SEQ ID NO25)的核苷酸序列的同一性大於45％和/或至少為45％的核苷酸序列。本領域技術人員通過檢查任何給定的本發明序列三個最高命中各自的表4中所示GAP計算的同一性百分比分值，並且從100％中減去GAP計算的最高同一性百分比分值，能夠計算出所述給定的本發明序列同一性百分比的下限。本領域技術人員也會認識到，本發明也包括同一性百分比大於如此計算的下限(例如同一性至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高)的核酸序列和胺基酸序列。
除了序列表中奇數SEQ ID NO中所示的穀氨酸棒桿菌MCT核苷酸外，本領域技術人員會認識到，在群體(例如穀氨酸棒桿菌群體)中可能存在導致MCT蛋白胺基酸序列改變的DNA序列多態性。由於自然變異，這類所述MCT基因中的遺傳多態性可能存在於群體的個體中。本文所用的術語「基因」和「重組基因」是指包含編碼MCT蛋白、最好是穀氨酸棒桿菌MCT蛋白的可讀框的核酸分子。這類天然變異通常可以導致所述MCT基因核苷酸序列中1-5％的變異。由於自然變異的結果並且不改變MCT蛋白功能活性的MCT中的任何和所有這類核苷酸變異和所產生的胺基酸多態性將包括在本發明範圍內。
根據對應於本發明穀氨酸棒桿菌MCT DNA的天然變異體和非穀氨酸棒桿菌同系物的核酸分子與本文所公開的穀氨酸棒桿菌MCT核酸的同源性，採用所述穀氨酸棒桿菌DNA或其部分作為嚴格雜交條件下按照標準雜交技術的雜交探針，可以分離出所述核酸分子。因此，在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子至少長15個核苷酸，並且在嚴格條件下與包含序列表中奇數SEQ ID NO核苷酸序列的核酸分子雜交。在其它實施方案中，所述核酸至少長30個、50個、100個、250個或更多個核苷酸。本文所用的術語「在嚴格條件下雜交」意在描述相互之間至少60％同源的核苷酸序列通常保留相互雜交的雜交和洗滌條件。最好是，所述條件使得相互之間同源性為至少約65％、更優選至少約70％、甚至更優選至少約75％或更高的序列通常保持相互雜交。這類嚴格條件是本領域技術人員已知的，並且可以在CurrentProtocols in Mollecular Biology，John Wiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。嚴格雜交條件的一個優選的非限制性實例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中於約45℃雜交，然後在0.2 X SSC，0.1％SDS中於50-65℃進行一次或多次洗滌。最好是，在嚴格條件下與本發明核苷酸序列雜交的本發明分離的核酸分子對應於天然存在的核酸分子。本文所用的「天然存在的」核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(例如編碼天然蛋白質)的RNA或DNA分子。在一個實施方案中，所述核酸編碼一種天然穀氨酸棒桿菌MCT蛋白。
除了在群體中可能存在的所述MCT序列的天然存在的變異體外，本領域技術人員還會認識到，可以通過在本發明核苷酸序列中進行突變而導入改變，由此導致所編碼MCT蛋白胺基酸序列的改變，而不改變所述MCT蛋白的功能能力。例如，可以在本發明核苷酸中進行導致在「非必需」胺基酸殘基上胺基酸取代的核苷酸取代。「非必需」胺基酸殘基是可以在所述MCT蛋白之一的野生型序列(例如序列表的偶數SEQ ID NO)中被改變、而不改變所述MCT蛋白活性的殘基，而「必需」胺基酸殘基是MCT蛋白活性所需的。然而，其它胺基酸殘基(例如在具有MCT活性的結構域中不保守或僅半保守的那些殘基)可能不是活性必需的，因此可能適合改變而不改變MCT活性。
因此，本發明的另一方面涉及編碼MCT蛋白、含有MCT活性非必需的胺基酸殘基改變的核酸分子。這類MCT蛋白在胺基酸序列上不同於序列表中偶數SEQ ID NO的序列，但仍保留至少一種本文所述的MCT活性。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包含編碼蛋白質的核苷酸序列，其中所述蛋白質包含與本發明胺基酸序列至少約50％同源的胺基酸序列，並且能夠參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運，或具有表1中所述的一種或多種活性。最好是，所述核酸分子編碼的蛋白質與序列表中一種奇數SEQ ID NO的胺基酸序列至少約50-60％同源，更優選與這些序列之一至少約60-70％同源，甚至更優選與這些序列之一至少約70-80％、80-90％、90-95％同源，最優選與一種本發明的胺基酸序列至少約96％、97％、98％或99％同源。
為了確定兩種胺基酸序列(例如一種本發明的胺基酸序列和其突變體形式)或兩種核酸的同源性百分比，將所述序列進行序列比對，以進行最佳比較(例如可以在一種蛋白質或核酸的序列引入空位，以與另一種蛋白質或核酸進行最佳序列比對)。然後比較對應胺基酸位置或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸。當一個序列(例如一種本發明的胺基酸序列)中的一個位置被另一個序列(例如所述胺基酸序列的突變體形式)中相應位置的同一胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述兩種分子在該位置是同源的(即本文所用的胺基酸或核酸「同源性」等同於胺基酸或核酸「同一性」)。這兩個序列之間的同源性百分比隨所述序列共享的相同位置數而變化(即同源性百分比＝相同位置數/位置總數×100)。
編碼本發明蛋白序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO序列)同源的MCT蛋白的分離的核酸分子可以通過以下步驟構建在本發明的核苷酸序列中，導入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，使得在所編碼的蛋白質中導入一個或多個胺基酸取代、添加或缺失。可以採用標準技術，例如定點誘變和PCR介導的誘變，將突變導入一種本發明的核苷酸序列中。最好是，在一個或多個預測的非必需胺基酸殘基上進行保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」是其中所述胺基酸殘基被具有相似側鏈的一個胺基酸殘基取代的胺基酸取代。在本領域中已經確定了具有相似側鏈的胺基酸殘基類別。這些類別包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側鏈的胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，MCT蛋白中預測的非必需胺基酸殘基最好被來自同一側鏈類別的另一種胺基酸殘基取代。或者，在另一實施方案中，可以沿全部或部分MCT編碼序列隨機導入突變，例如通過飽和誘變導入突變，並且可以根據本文所述的MCT活性對所產生的突變體進行篩選，以鑑定保留MCT活性的突變體。對序列表中奇數SEQID NO之一的核苷酸序列誘變後，可以重組表達所編碼的蛋白質，然後可以採用例如本文所述的測定(參見實施例部分的實施例8)測定所述蛋白質的活性。
除了上述編碼MCT蛋白的核酸分子外，本發明的另一方面涉及反義的分離的核酸分子。「反義」核酸包括與編碼蛋白質的「有義」核酸互補的核苷酸序列，例如與雙鏈DNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義核酸可以與有義核酸形成氫鍵。所述反義核酸與完整的MCT編碼鏈或僅與其部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子是編碼MCT蛋白的核苷酸序列編碼鏈的「編碼區」的反義核酸分子。術語「編碼區」是指包含被翻譯為胺基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(例如SEQ ID NO5(RXA00104)的完整編碼區包含核苷酸1-756)。在另一實施方案中，所述反義核酸分子是編碼MCT的核苷酸序列編碼鏈「非編碼區」的反義核酸分子。術語「非編碼區」是指鄰接所述編碼區、不被翻譯為胺基酸的5』序列和3』序列(即也稱為5』和3』非翻譯區)。
已知本文公開的編碼MCT的編碼鏈序列(例如序列表中奇數SEQID NO中所示的序列)，因此可以依照Waston和Crick鹼基配對原則，設計本發明的反義核酸。所述反義核酸分子可以與MCT mRNA的完整編碼區互補，但更優選是作為僅MCT mRNA編碼區或非編碼區一部分的反義分子的寡核苷酸。例如，所述反義寡核苷酸可以與MCTmRNA翻譯起始位點周圍的區域互補。所述反義寡核苷酸可以例如長約5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個或50個核苷酸。可以採用化學合成以及採用本領域已知的方法的酶連接反應，構建本發明的反義核酸。例如，可以用天然存在的核苷酸或設計用以增加所述分子生物學穩定性或增加所述反義核酸和有義核酸之間所形成的雙鏈體物理穩定性的各種修飾的核苷酸，化學合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸衍生物以及吖啶取代的核苷酸。可以用來產生所述反義核酸的經修飾的核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5』-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。另一方面，可以採用已經以反義方向亞克隆了一種核酸(即由所插入的核酸轉錄出的RNA將具有所感興趣的靶核酸的反義方向，在以下小節中進一步描述)的表達載體，用生物學方法產生所述反義核酸。
通常將本發明的反義核酸分子給予細胞或使其原位產生，使得它們與編碼MCT蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結合，以由此抑制所述蛋白的表達，例如通過抑制轉錄和/或翻譯抑制表達。可以藉助常規的核苷酸互補性進行雜交，以形成穩定的雙鏈體，或例如在與DNA雙鏈體結合的反義核酸分子的情況下，通過雙螺旋主溝中的特定相互作用，而進行雜交。可以對所述反義分子進行修飾，使得它例如通過使所述反義核酸分子與結合於細胞表面受體或抗原的肽或抗體連接，而特異性地結合於所選定細胞表面表達的受體或抗原。也可以用本文描述的載體將所述反義核酸分子傳遞至細胞。為了獲得足夠胞內濃度的所述反義分子，優選其中所述反義核酸分子置於強原核生物、病毒或真核生物啟動子控制之下的載體構建體。
在再一實施方案中，本發明的反義核酸分子是α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與互補RNA形成特定的雙鏈雜交體，其中與通常的β單位相反，所述鏈互補平行(Gaultier等(1987)Nucleic Acids.Res.156625-6641)。所述反義核酸分子也可以包含2』-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
在又一實施方案中，本發明的反義核酸是一種核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它們能夠切割與其具有互補區的單鏈核酸，例如mRNA。因此，可以用核酶(例如錘頭核酶(描述於Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591)來催化切割MCTmRNA轉錄物，由此抑制MCT mRNA的翻譯。可以根據本文公開的MCT DNA分子的核苷酸序列(即SEQ ID NO.5(RXA00104)，設計對MCT編碼核酸具有特異性的核酶。例如，可以構建一種四膜蟲屬(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列與MCT編碼mRNA中待切割的核苷酸序列互補。參見例如Cech等的美國專利號4,987,071和Cech等的美國專利號5,116,742。或者，可以用MCT mRNA，從RNA分子庫中選擇具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見例如Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418。
另一方面，通過靶向與MCT核苷酸序列調節區(例如MCT啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，以形成阻止靶細胞中MCT基因轉錄的三螺旋結構，可以抑制MCT基因的表達。一般參見Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
B.重組表達載體和宿主細胞本發明的另一方面涉及含編碼MCT蛋白(或其部分)的核酸的載體，優選表達載體。本文所用的術語「載體」是指能夠轉運與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，質粒是指其中可以連接另外的DNA區段的環狀雙鏈DNA環。另一種類型的載體是病毒載體，其中可以將另外的DNA區段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入到宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與其有效連接的基因的表達。這類載體在本文中稱為「表達載體」。一般而言，在重組DNA技術中使用的表達載體通常是質粒形式的載體。在本說明書中，「質粒」和「載體」可以互換使用，因為質粒是最常使用的載體形式。然而，本發明將包括這類其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，它們發揮等同的功能。
本發明的重組表達載體包含適合於在宿主細胞中表達本發明核酸的形式的本發明核酸，這是指所述重組表達載體包括根據用於表達的宿主細胞選擇的一個或多個調節序列，所述調節序列有效連接於待表達的核酸序列。在重組表達載體中，「有效連接的」是指將所感興趣的核苷酸序列以允許所述核苷酸序列表達的方式(例如在體外轉錄/翻譯系統中或當將所述載體導入宿主細胞時在所述宿主細胞中)連接於所述調節序列。術語「調節序列」將包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。這類調節序列描述於例如Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。調節序列包括在許多類型宿主細胞中指導核苷酸序列組成型表達的那些調節序列、以及在某些宿主細胞中指導所述核苷酸序列表達的那些調節序列。優選的調節序列是例如啟動子，例如coS-、tac-、trp-、tet-、trp-tet、lpp-、lac-、lpp-lac、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SPO2、λ-PR-或λPL，它們優選用於細菌中。其它調節序列是例如來自酵母和真菌的啟動子，例如ADCl、MFα、AC、P-60、CYCl、GAPDH、TEF、rp28、ADH；來自植物的啟動子，例如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLSl、B33、nos或遍在蛋白啟動子或菜豆蛋白啟動子。也有可能使用人工啟動子。本領域技術人員會認識到，所述表達載體的設計可取決於諸如待轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白的表達水平等的因素。可以將本發明的表達載體導入宿主細胞中，由此產生由本文所述的核酸編碼的蛋白質或肽，包括融合蛋白或肽(例如MCT蛋白、突變形式的MCT蛋白、融合蛋白等)。
可以設計本發明的重組表達載體用於在原核細胞或真核細胞中表達MCT蛋白。例如，可以在細菌細胞例如穀氨酸棒桿菌、昆蟲細胞(使用杆狀病毒表達載體)、酵母和其它真菌細胞(參見Romanos，M.A.等(1992)「酵母中的外源基因表達綜述」，Yeast 8423-488；van denHondel，C.A.M.J.J.等(1991)「絲狀真菌中的異源基因表達」，載於More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet和L.L.Lasure編著，第396-428頁Academic PressSan Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)，「用於絲狀真菌的基因轉移系統和載體開發」，載於Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等編著，第1-28頁，Cambridge University PressCambridge)、藻類和多細胞植物細胞(參見Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)「高效根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的擬南芥(Arabidopsis thaliana)和子葉外植體的轉化」Plant Cell Rep.583-586)或哺乳動物細胞中，表達MCT基因。合適的宿主細胞在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有進一步的描述。或者，所述重組表達載體可以在體外例如用T7啟動子調節序列和T7聚合酶進行轉錄和翻譯。
原核生物中的蛋白表達最常用合有指導或者融合蛋白或者非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子的載體來進行。融合載體將多個胺基酸加至其中所編碼蛋白上，通常加至所述重組蛋白的氨基末端，但也加至C末端，或在所述蛋白質中的合適區中融合。這類融合載體通常用於三個目的1)為了增加重組蛋白的表達；2)為了增加所述重組蛋白的溶解性；和3)為了通過用作親和純化中的配體而有助於所述重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋白的接點處引入一個蛋白酶切割位點，以使得能夠將重組蛋白與融合部分分開，以隨後純化所述融合蛋白。這類酶及其相關的識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。
典型的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別將穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或A蛋白與靶重組蛋白融合。在一個實施方案中，將所述MCT蛋白的編碼序列克隆到pGEX表達載體中，以產生編碼融合蛋白的載體，所述融合蛋白從N末端至C末端包含GST-凝血酶切割位點-X蛋白。所述融和蛋白可以用穀胱甘肽-瓊脂糖樹脂通過親和層析純化。不與GST融合的重組MCT蛋白可以通過用凝血酶切割所述融合蛋白進行回收。
合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19，pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、pBdC1和pET 11d(Studier等，GeneExpression TchnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)60-89；和Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.ElsevierNew York IBSN 0 444 904018)。來自pTrc載體的靶基因的表達依賴於來自雜種trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉錄。來自pET11d載體的靶基因的表達依賴於通過共同表達的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介導的T7 gn10-lac融合啟動子的轉錄。這種病毒聚合酶由來自含有lacUV5啟動子轉錄控制下的T7 gn1基因的居留(resident)λ原噬菌體的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)供應。關於其它細菌變種的轉化，可以選擇合適的載體。例如，已知質粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361可用於轉化鏈黴菌屬(Streptomyces)，質粒pUB110、pC194或pBD214適用於轉化芽孢桿菌屬(Bacilllus)菌種。用於將遺傳信息轉移到棒桿菌屬的幾種質粒包括pHM1519、pBL1、pSA77或pAJ667(Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.ElsevierNew York IBSN 0 444904018)。
使重組蛋白表達最大化的一種策略是在蛋白酶剪切所述重組蛋白能力受損的宿主細菌中表達所述蛋白(Gottesman，S.，GeneExpression Technology Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)119-128)。另一種策略是改變待插入到表達載體中的核酸的核酸序列，使得每個胺基酸的各個密碼子是在選定用於表達的細菌(例如穀氨酸棒桿菌)中優先使用的密碼子(Wada等(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。這種本發明核酸序列的改變可以用標準DNA合成技術來進行。
在另一實施方案中，所述MCT蛋白表達載體是一種酵母表達載體。用於在酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari等(1987)Embo J.6229-234)、2μ、pAG-1、Yep6、Yep13、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。適用於其它真菌例如絲狀真菌的載體以及載體的構建方法包括在以下文獻中詳述的載體和方法van denHondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)「用於絲狀真菌的基因轉移系統和載體開發」，載於Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等編著，第1-28頁，Cambridge University PressCambridge，和Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.ElsevierNew York(IBSN 0 444904018)。
另一方面，本發明的MCT蛋白可以用杆狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達。可用於在培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白的杆狀病毒載體包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在另一實施方案中，本發明的MCT蛋白可以在單細胞植物細胞(例如藻類)或在來自高等植物(例如種子植物，諸如作物)的植物細胞中表達。植物表達載體的實例包括詳述於以下文獻中的表達載體Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)「具有位於左邊界鄰近的選擇標記的新型植物雙元載體」，Plant Mol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)「用於植物轉化的農桿菌雙元載體」，Nucl.Acid.Res.128711-8721，並且包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51(Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.ElsevierNew YorkIBSN 0 444 904018)。
在再一實施方案中，本發明的核酸用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6187-195)。當用於哺乳動物細胞中時，所述表達載體的控制功能通常由病毒調節元件提供。例如，常用的啟動子得自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。對於用於原核細胞和真核細胞的其它合適的表達系統，參見Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningALaboratory Manual.第2版的第16和17章，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。
在另一實施方案中，哺乳動物重組表達載體能夠指導所述核酸優先在特定的細胞類型中表達(例如用組織特異性調節元件來表達所述核酸)。組織特異性調節元件是本領域已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括清蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1268-277)、淋巴(lymphoid)特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)、特別是T細胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J. 8729-733)和免疫球蛋白的啟動子(Banerji等(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33741-748)、神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS865473-5477)、胰腺特異性啟動子(Edlund等(1985)Science 230912-916)和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子；美國專利號4,873,316和歐洲申請公布號264,166)。也包括發育調節型啟動子，例如鼠類hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science 249374-379)和甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3537-546)。
本發明還提供包含以反義方向克隆到表達載體中的本發明DNA分子的重組表達載體。亦即所述DNA分子與調節序列有效地連接，其連接方式提供MCT mRNA的反義RNA分子的表達(通過轉錄所述DNA分子)。可以選擇有效連接於反義方向克隆的核酸的、指導在多種細胞類型中連續表達所述反義RNA分子的調節序列，例如病毒啟動子和/或增強子，或者可以選擇指導反義RNA的組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達的調節序列。反義表達載體可以為重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調節區的控制之下產生，其活性可以由所述載體所導入的細胞類型決定。對於使用反義基因的基因表達調節的討論，參見Weintraub，H.等，作為遺傳分析分子工具的反義RNA，Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986。
本發明的另一方面涉及已經導入本發明重組表達載體的宿主細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在本文中可互換使用。不言而喻，這種術語不僅是指特定的題述細胞，而且也指這種細胞的子代或潛在的子代。因為在連續世代中由於或者突變或者環境影響而可能存在某些修飾，所以這類子代事實上可能與親代細胞不完全相同，但仍包括在本文所述的術語範圍內。
宿主細胞可以是任何原核細胞或真核細胞。例如，MCT蛋白可以在細菌細胞例如穀氨酸棒桿菌、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞)中表達。其它合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。與穀氨酸棒桿菌相關的、可以方便地用作本發明核酸和蛋白分子的宿主細胞的微生物示於表3中。
可以通過常規轉化或轉染技術，將載體DNA導入原核細胞或真核細胞中。本文所用的術語「轉化」和「轉染」、「接合」和「轉導」是指本領域公知的用於將外源核酸(例如，線性DNA或RNA(例如線性化載體或無載體的單獨的基因構建體))或載體形式(例如質粒、噬菌體、噬菌粒(phasmid)、噬菌粒(phagemid)、轉座子或其它DNA)的核酸導入宿主細胞的多種技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染、天然感受態、化學物質介導的轉移或電穿孔。用於轉化或轉染宿主細胞的合適方法可以在Sambrook等(MolecularCloningA Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它實驗指南中找到。
關於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知根據所用的表達載體和轉染技術，僅一小部分細胞可以將外源DNA整合到其基因組中。為了鑑定和選擇這些整合子，通常將編碼選擇標記(例如抗生素抗性)的基因與所感興趣的基因一起導入宿主細胞中。優選的選擇標記包括賦予對藥物例如G418、潮黴素和氨甲蝶呤的抗性的那些選擇標記。可以將編碼選擇標記的核酸在編碼MCT蛋白的同一載體上導入宿主細胞，或者可以將其在單獨的載體上導入。用所導入核酸穩定轉染的細胞可以通過例如藥物選擇進行鑑定(例如已經摻入選擇標記基因的細胞將存活，而其它細胞死亡)。
為了產生同源重組微生物，製備含有其它已經引入缺失、添加或取代以由此改變(例如功能性破壞)所述MCT基因的至少一部分MCT基因的載體。最好是，該MCT基因是穀氨酸棒桿菌MCT基因，但它可以是來自相關細菌或甚至來自哺乳動物、酵母或昆蟲來源的同系物。在一個優選實施方案中，設計所述載體，使得在同源重組後，所述內源MCT基因被功能性破壞(即不再編碼功能性蛋白；也稱為「剔除」載體)。或者，可以設計所述載體，使得在同源重組後，所述內源MCT基因被突變或者被改變，但仍編碼功能性蛋白(例如可以改變上遊調節區，以由此改變所述內源MCT蛋白的表達)。在所述同源重組載體中，所述MCT基因的被改變的部分在其5』端和3』端鄰接另一種MCT基因的核酸，使得能夠在所述載體所攜帶的外源MCT基因和微生物中的內源MCT基因之間發生同源重組。所述另一種側翼MCT核酸具有足以與內源基因成功同源重組的長度。通常，在所述載體中包含數千鹼基的側翼DNA(5』端以及3』端)(有關同源重組載體的描述，參見例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503)。將所述載體導入微生物中(例如通過電穿孔)，然後用本領域已知的技術選擇其中所導入的MCT基因與內源MCT基因同源重組過的細胞。
在另一實施方案中，可以產生含有選定系統的重組微生物，所述選定系統提供受調節的所導入基因的表達。例如，在載體上包含在置於lac操縱子控制之下的MCT基因，允許所述MCT基因僅在IPTG存在時表達。這類調節系統是本領域眾所周知的。
在另一實施方案中，破壞宿主細胞中的內源MCT基因(例如通過同源重組或本領域已知的其它遺傳方法)，使得不發生其蛋白產物的表達。在另一實施方案中，通過一個或多個點突變、缺失或倒位，已經改變了宿主細胞中內源的或所導入的MCT基因，但它仍編碼功能性MCT蛋白。在再一實施方案中，改變了微生物中MCT基因的一個或多個調節區(例如啟動子、阻抑蛋白或誘導物)(例如通過缺失、截短、倒位或點突變)，使得調節所述MCT基因的表達。本領域技術人員會認識到，含有一種以上的所述MCT基因和蛋白修飾的宿主細胞可以採用本發明的方法容易地產生，並且意味著將包括在本發明內。
本發明的宿主細胞(例如培養物中的原核宿主細胞或真核宿主細胞)可以用來產生(即表達)MCT蛋白。因此，本發明還提供使用本發明的宿主細胞生產MCT蛋白的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在合適的培養基中培養本發明的宿主細胞(其中已經導入了編碼MCT蛋白的重組表達載體，或其中基因組已經導入了編碼野生型的或改變的MCT蛋白的基因)，直至產生MCT蛋白。在另一實施方案中，所述方法還包括從培養基中或從宿主細胞中分離MCT蛋白。
C.分離的MCT蛋白本發明的另一方面涉及分離的MCT蛋白及其生物活性部分。「分離的」或「純化的」蛋白或其生物活性部分當通過重組DNA技術產生時基本上不合細胞物質，或在化學合成時基本上不含化學前體或其它化學物質。用語「基本上不合細胞物質」包括其中所述蛋白質與細胞中天然產生或重組產生的細胞組分分離的MCT蛋白製備物。在一個實施方案中，用語「基本上不含細胞物質」包括所具有非MCT蛋白(本文中也稱為「汙染蛋白」)低於約30％(以乾重計)、更優選低於20％、再更優選低於約10％、最優選低於約5％的MCT蛋白製備物。當MCT蛋白或其生物活性部分重組產生時，也優選基本上不含培養基，即培養基低於所述蛋白製備物體積的約20％，更優選低於約10％，最優選低於約5％。用語「基本上不含化學前體或其它化學物質」包括其中MCT蛋白與參與所述蛋白合成的化學前體或其它化學物質分離的MCT蛋白製備物。在一個實施方案中，用語「基本上不含化學前體或其它化學物質」包括所具有的化學前體或非MCT化學物質低於約30％(以乾重計)、更優選低於20％、再更優選低於約10％、最優選低於約5％的MCT蛋白製備物。在優選實施方案中，分離的蛋白質或其生物活性部分沒有來自所述MCT蛋白所來源的同一生物的汙染蛋白。通常，這類蛋白通過在微生物例如穀氨酸棒桿菌中重組表達例如穀氨酸棒桿菌MCT蛋白來產生。
本發明的分離的MCT蛋白或其部分可以參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運，或具有表1中所述的一種或多種活性。在優選實施方案中，所述蛋白質或其部分包含與一種本發明胺基酸序列(例如序列表中一種偶數SEQ ID NO序列)足夠同源的胺基酸序列，使得所述蛋白質或其部分保留參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運的能力。所述蛋白的所述部分最好是本文所述的生物活性部分。在另一優選實施方案中，本發明的MCT蛋白具有序列表中一個偶數SEQID NO中所示的胺基酸序列。在再一優選實施方案中，所述MCT蛋白具有與一種本發明核苷酸序列(例如序列表中的奇數SEQ ID NO序列)雜交(例如在嚴格條件下雜交)的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。在又一優選實施方案中，所述MCT蛋白具有由下述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列或其部分，其中所述核苷酸序列與一種本發明核酸序列的同源性為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高。本發明也包括上述數值之間的範圍和標識數值(例如70-90％相同或80-95％相同)。例如，將包括採用上述值作為上限和/或下限的任何組合的標識值範圍。本發明優選的MCT蛋白也最好具有本文所述的至少一種MCT活性。例如，本發明的優選MCT蛋白包括由與一種本發明核苷酸序列雜交、例如在嚴格條件下雜交的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，並且可以參與穀氨酸棒桿菌細胞膜構成所必需化合物的代謝或參與跨越這些膜的分子轉運，或者具有表1中所述的一種或多種活性。
在其它實施方案中，所述MCT蛋白與一種本發明的胺基酸序列(例如序列表中的偶數SEQ ID NO序列)基本上同源，並且保留本發明胺基酸序列之一的蛋白的功能活性，但由於天然變異或誘變在胺基酸序列有所不同，如以上I小節中詳細描述的。因此，在另一實施方案中，所述MCT蛋白是這樣一種蛋白質，所述蛋白質所具有的氨基序列與一種本發明的完整胺基酸序列的同源性為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高，並且具有本文所述的至少一種MCT活性。本發明也包括上述數值之間的範圍和標識數值(例如70-90％相同或80-95％相同)。例如，將包括採用上述值作為上限和/或下限的任何組合的標識值範圍。在另一實施方案中，本發明涉及與一種本發明的完整胺基酸序列基本上同源的全長的穀氨酸棒桿菌蛋白。
MCT蛋白的生物活性部分包括包含衍生自MCT蛋白的胺基酸序列(例如序列表中偶數SEQ ID NO的胺基酸序列)的胺基酸序列、或與MCT蛋白同源的蛋白的胺基酸序列的肽，這包括小於全長MCT蛋白或與MCT蛋白同源的全長蛋白質、並且表現出至少一種MCT蛋白活性的胺基酸。通常，生物活性部分(肽，例如長度例如為5個、10個、15個、20個、30個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、50個、100個或更多個胺基酸的肽)包含具有至少一種MCT蛋白的活性的結構域或基序。此外，其中所述蛋白質的其它區缺失的其它生物活性部分可以通過重組技術製備，並且根據本文所述的一種或多種活性進行評價。最好是，MCT蛋白的生物活性部分包括具有生物活性的一種或多種選定結構域/基序或其部分。
MCT蛋白最好通過重組DNA技術產生。例如，將編碼所述蛋白質的核酸分子克隆到表達載體(如上所述)中，將所述表達載體導入宿主細胞(如上所述)，然後在所述宿主細胞中表達所述MCT蛋白。然後可以通過合適的純化方案，採用標準蛋白質純化技術，從所述細胞中分離出所述MCT蛋白。作為重組表達的替代方法，可以用標準肽合成技術，化學合成MCT蛋白、多肽或肽。此外，可以例如採用通過標準技術、利用本發明的MCT蛋白或其片段產生的抗MCT抗體，從細胞(例如內皮細胞)中分離天然MCT蛋白。
本發明也提供MCT嵌合蛋白或融合蛋白。本文所用的MCT「嵌合蛋白」或「融合蛋白」包含與非MCT多肽有效連接的MCT多肽。「MCT多肽」是指具有對應於MCT蛋白的胺基酸序列的多肽，而「非MCT多肽」是指所具有的胺基酸序列對應於與所述MCT蛋白基本上不同源的蛋白質的多肽，例如不同於所述MCT蛋白並且得自同一生物或不同生物的蛋白質。在所述融合蛋白中，術語「有效連接的」甚至是指所述MCT多肽和所述非MCT多肽相互符合讀框地融合。所述非MCT多肽可以融合至所述MCT多肽的N末端或C末端。例如，在一個實施方案中，所述融合蛋白是其中MCT序列融合至GST序列的C末端的GST-MCT融合蛋白。這類融合蛋白可以便於純化重組MCT蛋白。在另一實施方案中，所述融合蛋白是在其N末端含有一個異源信號序列的MCT蛋白。在某些宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中，可以通過利用異源信號序列增加MCT蛋白的表達和/或分泌。
最好是，本發明的MCT嵌合蛋白或融合蛋白採用標準重組DNA技術來生產。例如，依照常規技術，例如通過利用平端或交錯切口末端進行連接，進行限制性酶消化以提供合適的末端，適當地補平粘性末端，進行鹼性磷酸酶處理以避免不希望有的連接，然後進行酶連接，將編碼不同多肽序列的DNA片段符合讀框地連接在一起。在另一實施方案中，通過常規技術，包括自動DNA合成儀，可以合成所述融合基因。或者，採用錨定引物進行基因片段的PCR擴增，所述錨定引物在兩個連續基因片段之間產生互補突出端，隨後將其退火併重新擴增，產生嵌合基因序列(參見例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編著，John Wiley Sons1992)。此外，許多表達載體是市售的，已經編碼一個融合部分(例如GST多肽)。可以將MCT編碼核酸克隆到這樣一種表達載體中，使得所述融合部分與所述MCT蛋白符合讀框地連接。
通過對所述MCT蛋白進行誘變，例如離散的點突變或截短，可以產生所述MCT蛋白的同系物。本文所用的術語「同系物」是指用作所述MCT蛋白活性激動劑或拮抗劑的所述MCT蛋白的變異形式。所述MCT蛋白的激動劑可以基本上保留所述MCT蛋白的相同生物活性或一個亞類的生物活性。所述MCT蛋白的拮抗劑通過例如競爭性地與包括所述MCT蛋白在內的細胞膜組分代謝級聯下遊或上遊成員結合，或通過與介導跨越這類膜的化合物轉運的MCT蛋白結合，由此阻止發生轉運，可以抑制天然存在形式的所述MCT蛋白的一種或多種活性。
在一個替代實施方案中，通過篩選具有MCT蛋白激動劑或拮抗劑活性的所述MCT蛋白的突變體例如截短突變體的組合文庫，可以鑑定出所述MCT蛋白的同系物。在一個實施方案中，通過在核酸水準上進行聯合誘變，產生MCT變異體的一個花斑文庫(variegatedlibrary)，所述花斑文庫由一個花斑基因文庫編碼。通過例如酶法將合成的寡核苷酸混合物連接到基因序列中，使得一組簡併潛在的MCT序列可作為單個多肽表達，或者作為其中含有一組MCT序列的一組較大的融合蛋白表達(例如用於噬菌體展示)，可以產生MCT變異體花斑文庫。有多種方法可以用來由簡併的寡核苷酸序列產生潛在的MCT同系物文庫。可以在自動DNA合成儀中進行簡併基因序列的化學合成，然後將所述合成基因連接到合適的表達載體中。應用一組簡併基因，使得可以在一種混合物中提供所有編碼一組所需潛在MCT序列的序列。合成簡併寡核苷酸的方法是本領域已知的(參見例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic AcidRes.11477)。
另外，所述MCT蛋白編碼的片段的文庫可以用來產生MCT片段的花斑群，用來篩選和隨後選擇MCT蛋白的同系物。在一個實施方案中，通過在每個分子僅發生一個缺口的條件下用核酸酶處理MCT編碼序列的雙鏈PCR片段，使所述雙鏈DNA變性，將所述DNA復性，以形成可以包括來自不同缺口產物的有義/反義對的雙鏈DNA，通過用S1核酸酶處理從重新形成的雙鏈體中去除單鏈部分，然後將所產生的片段文庫連接到表達載體中，可以產生一個編碼序列片段文庫。用這種方法，可以得到一個表達文庫，所述表達文庫編碼各種大小的所述MCT蛋白的N末端片段、C末端片段和內部片段。
本領域已知幾種技術用於篩選通過點突變或截短製備的組合文庫的基因產物、以及篩選具有選定特性的基因產物的cDNA文庫。這類技術適用於快速篩選通過組合誘變MCT同系物產生的基因文庫。適合於高通量分析、用於篩選大基因文庫的最為廣泛使用的技術，通常包括將所述基因文庫克隆到複製型表達載體中，用所產生的載體文庫轉化合適的細胞，並且使所述組合基因在所需活性的檢測有助於載體分離的條件下表達，而所述載體編碼其基因產物被檢測的基因。循環總體誘變(REM)是一種提高文庫中功能型突變體頻率的新技術，可以與鑑定MCT同系物的篩選測定結合使用(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 897811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
在另一實施方案中，可以採用本領域中眾所周知的方法，用基於細胞的測定來分析花斑MCT文庫。
D.本發明的應用和方法本文所述的核酸分子、蛋白質、蛋白質同系物、融合蛋白、引物、載體和宿主細胞可以用於一種或多種以下方法中穀氨酸棒桿菌和相關生物的鑑定；與穀氨酸棒桿菌相關的生物的基因組作圖；所感興趣的穀氨酸棒桿菌序列的鑑定和定位；進化研究；功能所需的MCT蛋白區的測定；MCT蛋白活性的調節；一種或多種細胞膜組分代謝的調節；一種或多種化合物膜轉運的調節；以及細胞產生所需化合物(例如精細化學品)的調節。
本發明的MCT核酸分子具有多種用途。首先，它們可以用來鑑定作為穀氨酸棒桿菌或其密切相關菌種的生物。此外，它們可以用來鑑定微生物混合群體中穀氨酸棒桿菌或其相關菌種的存在。本發明提供許多穀氨酸棒桿菌基因的核酸序列；通過在嚴格條件下用跨越該生物特有的穀氨酸棒桿菌基因區域的探針，探測特有微生物群體或混合微生物群體培養物的所提取的基因組DNA，人們可以確定該生物是否存在。
雖然穀氨酸棒桿菌自身是非致病性的，但它與致病菌種例如白喉棒桿菌相關。白喉棒桿菌是一種快速發展的、涉及局部和系統病理學的急性熱性感染-白喉的病原體。在這種疾病中，局部病變在上呼吸道中發展，包括對上皮細胞的壞死性損傷；所述桿菌分泌毒素，毒素通過這種損害彌散到機體的遠端易感組織。所產生的變性性改變通過抑制包括心臟、肌肉、外周神經、腎上腺、腎、肝和脾在內的這些組織中的蛋白質合成，導致該疾病的系統病理學。白喉在世界許多地區包括非洲、亞洲、歐洲東部和前蘇聯許多獨立的州中發病率一直很高。自從1990年以來，在後兩個地區的一次白喉流行已經導致至少5,000人死亡。
在一個實施方案中，本發明提供一種鑑定受治療者體內白喉棒桿菌的存在或活性的方法。這種方法包括檢測受治療者體內一種或多種本發明核酸序列或胺基酸序列(例如分別為序列表中奇數或偶數SEQID NO中所示的序列)，由此檢測所述受治療者體內白喉棒桿菌的存在或活性。穀氨酸棒桿菌和白喉棒桿菌是相關細菌，穀氨酸棒桿菌中的許多核酸和蛋白質分子與白喉棒桿菌核酸和蛋白質分子同源，因此可以用來檢測受治療者體內的白喉棒桿菌。
本發明的核酸分子和蛋白質分子也可以用作基因組特定區的標記。這不僅可應用於基因組作圖中，也可應用於穀氨酸棒桿菌蛋白的功能研究。例如，為了鑑定基因組中特定穀氨酸棒桿菌DNA結合蛋白所結合的區域，可以將穀氨酸棒桿菌基因組消化，然後將所述片段與所述DNA結合蛋白一起溫育。結合所述蛋白的那些區域可以另外用本發明的核酸分子來探測，最好是用可容易檢測的標記來探測；這種核酸分子與所述基因組片段的結合使得能夠將上述片段定位至穀氨酸棒桿菌的基因組圖譜上，並且當用不同酶進行多次時，有助於所述蛋白所結合的核酸序列的快速測定。此外，本發明的核酸分子可能與相關菌種的序列具有足夠的同源性，因此這些核酸分子可以用作在相關細菌例如乳發酵短桿菌中構建基因組圖譜的標記。
本發明的MCT核酸分子也可用於進化研究和蛋白質結構研究。種類繁多的原核細胞和真核細胞利用本發明分子所參與的代謝過程和轉運過程；通過將本發明核酸分子的序列與來自其他生物的編碼相似酶的那些序列進行比較，可以評價所述生物的進化相關性。同樣，這種比較允許評價所述序列的哪些區保守、哪些區不保守，這有助於確定酶功能所必需的蛋白區。這種類型的測定對於蛋白質工程研究是有價值的，並且可以給出蛋白質在誘變方面可以耐受而不喪失功能的指標。
對本發明的MCT核酸分子的操作可以導致產生功能上不同於野生型MCT蛋白的MCT蛋白。這些蛋白質可能效率方面或活性方面得到改進，在細胞中的存在數量可能大於通常的數量，或可能效率或活性降低。
本發明提供篩選方法，篩選或者通過與蛋白質自身或所述MCT蛋白的底物或者結合配偶體相互作用、或者通過調節本發明MCT核酸分子的轉錄或翻譯而調節MCT蛋白活性的分子。在這類方法中，使表達一種或多種本發明MCT蛋白的微生物與一種或多種試驗化合物接觸，並且評價每種試驗化合物對所述MCT蛋白活性或表達水平的影響。
有多種的機制使得改變本發明MCT蛋白可以直接影響得自摻入這種改變蛋白的穀氨酸棒桿菌菌株的精細化學品的收率、產量和/或產率。如果穀氨酸棒桿菌分泌所述所需化合物，則從穀氨酸棒桿菌大規模培養物中精細化學品化合物的回收得到顯著改進，因為可以從培養基中容易地純化這類化合物(與從穀氨酸棒桿菌細胞塊提取相反)。通過或者增加將精細化學品輸出細胞的轉運蛋白分子的數量或者活性，有可能增加胞外培養基中存在的所得精細化學品的量，因此使得更加容易地收集和純化。相反，為了有效地過量產生一種或多種精細化學品，需要增加量的所述合適生物合成途徑的輔因子、前體分子和中間體化合物。因此，通過增加參與營養物(例如碳源(即糖)、氮源(即胺基酸、銨鹽)、磷酸和硫)輸入的轉運蛋白的數量和/或活性，有可能改善精細化學品的生產，因為除去了對所述生物合成過程的任何營養物供應的限制。此外，脂肪酸和脂質本身是理想的精細化學品，因此通過對一種或多種參與這些化合物生物合成的本發明MCT蛋白進行活性優化或增加其數量，或者通過降低參與這些化合物降解的一種或多種MCT蛋白的活性，有可能增加得自穀氨酸棒桿菌的脂肪酸和脂質分子的收率、產量和/或產率。
對一種或多種本發明MCT基因的工程改造也可以產生改變活性、間接影響得自穀氨酸棒桿菌的一種或多種所需精細化學品生產的MCT蛋白。例如，代謝的正常生物化學過程導致產生多種廢物(例如過氧化氫和其它活性氧種類)，它們可能主動幹擾所述代謝過程(例如已知過亞硝酸鹽使酪氨酸側鏈硝化，由此使在活性部位具有酪氨酸的某些酶失活(Groves，J.T.(1999)Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)226-235)。雖然這些廢物通常被排洩掉，但對用於大規模發酵生產的穀氨酸棒桿菌菌株進行優化以用於過量生產一種或多種精細化學品，因此可能產生比野生型穀氨酸棒桿菌通常所具有的更多的廢物。通過對參與廢物分子輸出的一種或多種本發明MCT蛋白的活性進行優化，則有可能提高細胞的生存力並且保持有效的代謝活性。此外，高胞內水平的所需精細化學品的存在可能實際上對細胞有毒性，因此通過提高細胞分泌這些化合物的能力，可以提高細胞的生存力。
此外，可以對本發明的MCT蛋白進行操作，使得改變所產生的各種脂質和脂肪酸分子的相對量。這可能對細胞膜脂質組成有深遠的影響。由於每種類型的脂質具有不同的物理特性，故膜脂質組成的改變可能顯著改變膜流動性。膜流動性的改變可能影響跨越所述膜的分子轉運，如前所述這可能改變廢物或所產生的精細化學品的輸出或必需營養物的輸入。這類膜流動性的改變也可以顯著影響細胞的完整性；膜相對較弱的細胞在大規模發酵罐環境中更易受到機械應力的影響，這可能損傷或殺死所述細胞。通過對參與膜構成脂肪酸和脂質產生的MCT蛋白進行操作，使得所得膜的膜組成更加適應於用來生產精細化學品的培養物中存在的環境條件，應該有更大比例的穀氨酸棒桿菌細胞存活並且繁殖。培養物中更大數量的穀氨酸棒桿菌細胞應該轉化為得自所述培養物的精細化學品的更大收率、產量或產率。
導致得自穀氨酸棒桿菌的精細化學品收率提高的上述MCT蛋白誘變策略，並不意味著是限制性的；這些策略的變化對於本領域技術人員是顯而易見的。採用這些策略並且加入本文公開的機制，可以利用本發明的核酸分子和蛋白質分子來產生表達突變型MCT核酸分子和蛋白質分子的穀氨酸棒桿菌或相關細菌菌株，使得所需化合物生產的收率、產量和/或產率得以改善。這種所需化合物可以是穀氨酸棒桿菌的任何天然產物，包括生物合成途徑的終產物和天然存在的代謝途徑的中間體、以及在穀氨酸棒桿菌代謝中不是天然存在的、但由本發明的穀氨酸棒桿菌菌株產生的分子。
本發明通過以下實施例進一步說明，所述實施例不應解釋為是限制性的。在本申請中引用的所有參考文獻、專利申請、專利、公布的專利申請、表和序列表的內容，通過引用結合到本文中。
表1本申請中的基因
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表3可以用於實施本發明的棒桿菌屬和短桿菌屬菌株
ATCC美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD，USAFERM發酵研究所，Chiba，日本NRRL農業研究機構培養物保藏中心，Northern Regional ResearchLaboratory，Peoria，IL，USACECT西班牙典型培養物保藏中心，Valencia，西班牙NCIMB國立工業和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，英國CBS真菌菌種保藏中心，Baarn，荷蘭NCTC國立典型培養物保藏中心，London，英國DSMZ德意志微生物保藏中心，Braunschweig，德國有關參考文獻參見Sugawara，H.等(1993)World directory of collections ofcultures of microorganismsBacteria，fungi and yeasts(第4版)，World federation forculture collections World data center on microorganisms，Saimata，Japan。
表4序列比對結果
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順序片段。
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述序列。
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實施例部分實施例 1穀氨酸棒桿菌ATCC13032 的總基因組DNA的製備讓穀氨酸棒桿菌(ATCC 13032)的培養物於30℃下在BHI培養基(Difco)中劇烈振蕩生長過夜。通過離心收集細胞，棄去上清液，將細胞重懸於5ml緩衝液I(培養物原始體積的5％--所有指定的體積均已經根據100ml培養物體積來計算)。緩衝液I的組成140.34g/l蔗糖、2.46g/l MgSO4x7H2O、10ml/l KH2PO4溶液(100g/l，用KOH調至pH6.7)、50ml/l M12濃縮物(10g/l(NH4)2SO4、1g/l NaCl、2g/l MgSO4x7H2O、 0.2g/l CaCl2、 0.5g/l酵母膏(Difco)、10ml/l微量元素混合物(200mg/lFeSO4xH2O、10mg/l ZnSO4x7H2O、3mg/l MnCl2x4H2O、30mg/lH3BO3、20mg/l CoCl2x6H2O、1mg/l NiCl2x6H2O、3mg/l Na2MoO4x2H2O、500mg/l絡合劑(EDTA或檸檬酸)、100ml/l維生素混合物(0.2mg/l生物素、0.2mg/l葉酸、 20mg/l對氨基苯甲酸、20mg/l核黃素、40mg/l泛酸鈣(ca-panthothenate)、140mg/l煙酸、40mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l肌醇)。 將溶菌酶加入懸浮液中至終濃度2.5mg/ml。於37℃溫育約4小時後，細胞壁被降解，通過離心收穫所產生的原生質體。沉澱用5ml緩衝液I洗滌1次，用5mlTE緩衝液(10mM Tris-HCl、1mMEDTA，pH8)冼滌1次。將沉澱重懸於4mlTE緩衝液中，加入0.5mlSDS溶液(10％)和0.5ml NaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至終濃度200μg/ml後，將懸浮液於37℃溫育約18小時。採用標準方法，通過用苯酚、苯酚-氯仿-異戊醇和氯仿-異戊醇抽提，純化DNA。然後，通過加入1/50 體積的3M乙酸鈉和2體積乙醇，然後於-20℃溫育30分鐘，在高速離心機中用SS34轉子(Sorvall)以12,000rpm離心30分鐘，沉澱所述DNA。將DNA溶於1ml含有20μg/ml RNA酶A的TE緩衝液中，於4℃對1000ml TE緩衝透析至少3小時。在此期間，更換緩衝液3次。向0.4ml等份的經透析的DNA溶液中，加入0.4ml 2M LiCl和0.8ml乙醇。於-20℃溫育30分鐘後，通過離心(13,000rpm，BiofugeFresco，Heraeus，Hanau，德國)收集DNA。將DNA沉澱溶於TE緩衝液中。用該方法製備的DNA可以用於所有目的，包括DNA印跡法或基因組文庫的構建。
實施例2構建穀氨酸棒桿菌ATCC13032在大腸桿菌中的基因組文庫採用實施例1所述製備的DNA按照已知的明確方法(參見例如Sambrook，J.等，(1989)「Molecular CloningA Laboratory Manual」，ColdSpring Harbor Laboratory Press，或Ausubel，F.M.等(1994)「CurrentProtocols in Molecular Biology」，John Wiley Sons.)構建粘粒和質粒文庫。
可以使用任何質粒或粘粒。具體使用的質粒是質粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，753737-3741)、pACYC177(Change Cohen(1978)J.Bacteriol 1341141-1156)、pBS質粒系列(pBSSK+、pBSSK-和其它系列；Stratagene，LaJolla，USA)或粘粒如SuperCosl(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.，Rosenthal A.和Waterson，R.H.(1987)Gene 53283-286)。使用質粒pSL109可構建特別用於穀氨酸棒桿菌的基因文庫(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)。
實施例3DNA測序和計算功能分析應用實施例2描述的基因組文庫按照標準方法、尤其是利用ABI377測序儀的鏈終止法(參見例如Fleischman，R.D.等(1995)「流感嗜血桿菌Rd.的隨機全基因組測序和裝配」，Science，269496-512)進行DNA測序。使用具有以下核苷酸序列的測序引物 5』-GGAAACAGTATGACCATG-3』(SEQ ID NO677)或5』-GTAAAACGACGGCCAGT-3』(SEQ ID NO678)。
實施例4體內誘變將質粒(或其它載體)DNA通過保持其遺傳信息完整性的能力受損的大腸桿菌或其它微生物(例如芽孢桿菌或酵母如釀酒酵母)進行傳代，從而可在體內誘變穀氨酸棒桿菌。典型增變株的DNA修復系統基因存在突變(例如mutHLS、mutD、mutT等；參考文獻見Rupp，W.D.(1996)DNA修復機制，載於Escherichia coli and Salmonella，第2277-2294頁，ASMWashington.)。這類菌株是本領域技術人員周知的。例如Greener，A.和Callahan，M.(1994)Strategies 732-34中介紹了所述菌株的使用。
實施例5大腸桿菌和穀氨酸棒桿菌之間的DNA轉移若干棒桿菌屬和短桿菌屬菌種含有自主複製(綜述參見例如Martin，J.F.等(1987)Biotechnology，5137-146)的內源性質粒(例如pHM1519或pBL1)。採用其中加入複製起點和穀氨酸棒桿菌合適標記的大腸桿菌標準載體(Sambrook，J.等(1989)，「Molecular CloningALaboratory Manual」，Cold Spring Harbor Laboratory Press或Ausubel，F.M.等(1994)「Current Protocols in Molecular Biology」，John Wiley Sons)能夠容易地構建大腸桿菌和穀氨酸棒桿菌的穿梭載體。所述複製起點優選取自分離自棒桿菌屬和短桿菌屬菌種的內源性質粒。具體使用的這些菌種的轉化標記為卡那黴素抗性基因(例如Tn5或Tn903轉座子產生的卡那黴素抗性基因)或氯黴素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)，From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology，VCH，Weinheim)。所述文獻中列舉了許多關於構建各種穿梭載體的實施例，所述穿梭載體可在大腸桿菌和穀氨酸棒桿菌中複製而且可用於若干目的，包括基因過量表達(參考文獻參見例如Yoshihama，M.等(1985)J.Bacteriol.162591-597，Martin J.F.等(1987)Biotechnology，5137-146和Eikmanns，B.J.等(1991)Gene，10293-98)。
應用標準方法可將目的基因克隆到一種上述穿梭載體並將這種雜合載體導入穀氨酸棒桿菌菌株中。可採用以下方法轉化穀氨酸棒桿菌原生質體轉化(Kastsumata，R.等(1984)J.Bacteriol.159306-311)、電穿孔(Lieb1，E.等(1989)FEMS Microbiol. Letters，53399-303)，如果使用特殊載體，也可以採用接合方法(見例如Schfer，A等(1990)J.Bacteriol.1721663-1666)。通過製備穀氨酸棒桿菌質粒DNA(利用本領域周知的標準方法)並將其轉化入大腸桿菌，也可以使穿梭載體從穀氨酸棒桿菌轉移到大腸桿菌。採用標準方法可進行這種轉化步驟，但是最好使用Mcr缺陷型大腸桿菌菌株如NM522(Gough和Murray(1983)J.Mol.Biol.1661-19)。
可使用包含pCG1(美國專利號4,617,267)或其片段和任選包含TN903卡那黴素抗性基因(Grindley，N.D.和Joyce，C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12)7176-7180)的質粒在穀氨酸棒桿菌菌株中過量表達各種基因。此外，也可以使用質粒pSL109在穀氨酸棒桿菌菌株中過量表達各種基因(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)。
除了使用複製型質粒之外，也可以通過整合入基因組實現基因過量表達。利用周知的方法可實現在穀氨酸棒桿菌或其它棒桿菌屬或短桿菌屬菌種中的基因組整合，例如與基因組區的同源重組、限制性內切核酸酶介導的整合(REMI)(參見例如DE專利19823834)或應用轉座子。也可以採取以下措施修飾調節區(例如啟動子、阻抑蛋白和/或增強子)而調節目的基因的活性利用定點方法(例如同源重組)或基於隨機事件的方法(例如轉座子誘變或REMI)進行序列修飾、插入或缺失。也可以在本發明一個或多個基因編碼區的3』插入轉錄終止子作用的核酸序列；所述終止子是本領域周知的，例如在Winnacker，E.L.(1987)FromGenes to Clones-Introduction to Gene Technology.VCHWeinheim)中有其介紹。
實施例6評價突變蛋白的表達觀測轉化宿主細胞中的突變蛋白活性依賴於這樣的事實突變蛋白以與野生型蛋白相似的方式和相似的量表達。一種確定突變基因轉錄水平(有效翻譯出基因產物的mRNA量的指標)的有用方法是進行RNA印跡(參考文獻見例如Ausubel等(1988)Current Protocols inMolecular Biology，Wiley紐約)，其中用可檢測標記(通常為放射性或化學發光)標記結合目的基因的設計引物，使得當提取所述生物培養物的總RNA、在凝膠上電泳、轉移至穩定基體上以及與所述探針溫育時，所述探針的結合以及結合量可說明所述基因的存在而且指示該基因的mRNA量。這樣的信息是突變基因轉錄程度的證據。應用若干本領域周知的方法可從穀氨酸棒桿菌製備總細胞RNA，例如Bormann，E.R.等(1992)Mol.Microbiol.6317-326介紹的方法。
為了評價所述mRNA翻譯蛋白的存在或相對量，可使用標準技術例如蛋白質印跡(參見例如Ausubel等(1988)Current Protocols inMolecular Biology，Wiley紐約)。在此過程中，提取總細胞蛋白，經凝膠電泳分離，轉移至如硝酸纖維素的基體上以及與特異性結合所需蛋白的探針如抗體溫育。這種探針一般用容易檢測的化學發光或比色標記物標記。觀測到標記物存在和標記物量說明所述細胞中存在所需突變蛋白及其量。
實施例7遺傳改良的穀氨酸棒桿菌的培養-培養基和培養條件用合成或天然生長培養基培養遺傳改良棒桿菌。用於棒桿菌的許多不同生長培養基是眾所周知的而且容易獲得(Lieb等(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32205-210；von der Osten等(1998)Biotechnology Letters，1111-16；專利DE 4,120,867；Lieb1(1992)「棒桿菌屬」，載於The Procaryotes，第II卷，Balows，A.等編著，Springer-Verlag)。這些培養基的組成是一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和微量元素。優選碳源為糖如單糖、二糖或多糖。例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、澱粉或纖維素為非常好的碳源。也可以通過複合化合物如糖蜜或精製糖的其它副產品為培養基提供糖。提供不同碳源的混合物也可能是有益的。其它可能的碳源為醇類和有機酸，例如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常為有機或無機氮化合物，或者含有這些化合物的物質。典型氮源包括氨氣或銨鹽，例如氯化銨或硫酸銨、氫氧化銨、硝酸鹽、尿素、胺基酸或複合氮源如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母膏、肉膏等。
培養基可含有的無機鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的鹽酸鹽、亞磷酸鹽或硫酸鹽。所述培養基中可加入螯合化合物，以保持溶液中的金屬離子。特別有效的螯合化合物包括二羥基酚(例如兒茶酚或原兒茶酸)或有機酸(例如檸檬酸)。所述培養基還常規含有其它生長因子，例如維生素或生長促進劑，其實例包括生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽和吡哆醇。生長因子和鹽通常源自複合培養基組分，例如酵母膏、糖蜜、玉米漿等。培養基化合物的確切組成與直接實驗密切相關而且具體取決於各特定情況。關於培養基優化的信息可在教科書「Applied Microbiol.Physiology，A PracticalApproach(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury編著，IRL Press(1997)，第53-73頁，ISBN 0 19 963577 3)中獲得。也可以從商業供應商選擇生長培養基，例如標準1號(Merck)或BHI(grain heart infusion，DIFCO)等。
所有培養基組分通過加熱滅菌(於1.5帕和121℃20分鐘)或過濾除菌。所述組分可一起滅菌，如果需要可分別滅菌。所有培養基組分可培養開始時就存在，或者可以任選連續或分批加入。
每個實驗分別規定培養條件。溫度應為15℃-45℃。培養溫度可保持恆定或實驗中改變。培養基的pH應為5-8.5、優選約7.0，可在培養基中加入緩衝劑維持pH。用於該目的的典型緩衝劑為磷酸鉀緩衝劑。可選擇或同時使用合成緩衝劑如MOPS、HEPES、ACES等。也可以在培養期間加入氫氧化鈉或氫氧化銨維持恆定培養pH。如果使用複合培養基組分如酵母膏，額外緩衝劑需要可能降低，因為實際上許多複合化合物具有高緩衝能力。如果使用發酵罐培養所述微生物，也可以使用氨氣控制pH。
培養時間通常為數小時至數天。選擇培養時間以使液體培養基累積的產物量最多。可用各種容器進行所公開的生長實驗，例如微量滴定板、玻璃試管、玻璃燒瓶或不同大小的玻璃或金屬發酵罐。為了篩選大量克隆，培養微生物應使用微量滴定板、玻璃試管或搖瓶(帶有或沒有擋板)。優選使用100ml搖瓶，其中裝有10％(體積)需要的生長培養基。培養瓶應在使用100-300rpm速度範圍的旋轉式振搖器(振幅為25mm)上振搖。維持溼潤氣氛使蒸發喪失最少；或者應進行數學校正蒸發損失。
如果測試經遺傳修飾的克隆，也應該測試未經修飾的對照克隆或含沒有任何插入片段的基礎質粒的對照克隆。利用已經於30℃溫育的瓊脂平板如CM平板(10g/l葡萄糖、2.5g/l氯化鈉、2g/l尿素、10g/l聚腖、5g/l酵母膏、5g/l肉膏、22g/l氯化鈉、2g/l尿素、10g/l聚腖、5g/l酵母膏、5g/l肉膏、22g/l瓊脂、pH6.8，2M氫氧化鈉)上生長的細胞接種培養基至OD600為0.5-1.5。加入得自CM平板的穀氨酸棒桿菌細胞的鹽水懸浮液或加入該菌的液體預培養物，從而完成培養基接種。
實施例8體外分析突變蛋白的功能本領域已有明確的酶活性和動力學參數測定法。必須使測定任何給定改變酶活性的實驗適合野生型酶的比活，這完全在本領域一般技術人員能力範圍內。關於酶的一般概述以及涉及結構、動力學、原理、方法、應用的具體細節和許多酶活性測定實例可見於例如以下文獻Dixon，M.和Webb，E.C.，(1979)Enzymes，LongmansLondon；Fersht，(1985)Enzyme Structure and Mechanism，Freeman紐約；Walsh，(1979)Enzymatic Reaction Mechanisms.FreemanSan Francisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)Fundamentals of Enzymology.Oxford Univ.PressOxford；Boyer，P.D.編著(1983)The Enzymes，第三版，Academic Press紐約；Bisswanger，H.，(1994)Enzymkinetik，第二版，VCHWeinheim(ISBN 3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβ1，M.編著(1983-1986)Methods of Enzymatic Analysis，第三版，第I-XII卷，VerlagChemieWeinheim；以及Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1987)，第A9卷，「Enzymes」，VCHWeinheim，第352-363頁。
可應用數種明確的方法如DNA條帶移位測定(也稱為凝膠阻滯測定)測定結合DNA的蛋白活性。可用報導基因測定(例如Kolmar，H.等(1995)EMBOJ.143895-3904以及其中的引用文獻介紹的測定)測量所述蛋白對其它分子表達的影響。報導基因測試系統是眾所周知的而且明確用於原核生物細胞和真核生物細胞，利用酶如β半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白等。
按照例如Gennis，R.B.(1989)「膜孔、通道與轉運蛋白」，載於Biomembranes，Molecular Structure and Function，SpringerHeidelberg，第85-137、199-234和270-322頁介紹的技術可測定膜轉運蛋白的活性。
實施例9分析突變蛋白對所需產物產量的影響可如下評價穀氨酸棒桿菌的遺傳改進對所需化合物(例如胺基酸)產量的影響使經修飾的微生物在合適條件(例如上述條件)下生長，然後分析所述培養基和/或細胞組分中的所需產物(即胺基酸)的產量增加情況。所述分析技術是本領域一般技術人員周知的，包括光譜檢測法、薄層層析、各種染色法、酶法以及微生物學方法、以及分析型層析法如高效液相層析(參見例如Ullman，Encyclopedia of IndustrialChemistry，第A2卷，第89-90和443-613頁，VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.等，(1987)「HPLC在生物化學中的應用」，載於LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等(1993)Biotechnology，第3卷，第III章「產物的回收純化」，第469-714頁，VCHWeinheim；Belter，P.A.等(1988)Bioseparationsdownstream processing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological materials，John Wiley和Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化學分離純化(Biochemical separations)，載於Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第B3卷，第11章，第1-27頁，VCHWeinheim；以及DechoW，F.J.(1989)Separation and purification techniques inbiotechnology，Noyes Publications)。
除了檢測發酵終產物之外，也可以分析利用產生所需產物的代謝途徑的其它組分，例如中間體和副產物，以確定產生所述化合物的總體效率。分析方法包括測量培養基中的營養物水平(例如糖、烴類、氮源、磷酸鹽和其它離子)、檢測生物量組成和生長、分析生物合成途徑共同代謝物的產量以及發酵期間產生的氣體。這些檢測的標準方法概述於Applied Microbial Physiology，A Practical Approach，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編著，IRL Press，第103-129、131-163和165-192頁(ISBN0199635773)以及其中引用的參考文獻。
實施例10從穀氨酸棒桿菌培養物純化所需產物可用本領域周知的各種方法從上述培養物的穀氨酸棒桿菌細胞或上清液中回收所需產物。如果所需產物不從細胞中分泌出來，可以通過低速離心從培養物收穫細胞，應用標準技術裂解細胞，例如機械力或超聲。離心去除細胞碎片，保留含有所述可溶性蛋白的上清液部分供進一步純化所需要的化合物。如果產物從穀氨酸棒桿菌細胞分泌出來，則通過低速離心從所述培養物中去除細胞，保留上清液部分供進一步純化。
使得自任一純化方法的上清液部分在合適樹脂上進行層析，其中所需分子保留在層析樹脂上而樣品中的大多數雜質被洗出，或者雜質保留在樹脂上而所述樣品被洗出。根據需要可重複所述層析步驟，使用相同或不同層析樹脂。本領域一般技術人員在選擇合適層析樹脂和最有效利用待純化的特定分子方面是非常精通的。純化產物可通過過濾或超濾濃縮，貯藏在產物最穩定的溫度狀態下。
有許多本領域已知的純化方法，上述純化方法僅僅是舉例說明本發明。這樣的純化技術描述於例如Bailey，J.E. Ollis，D.F.，BiochemicalEngineering Fundamentals，McGraw-Hill紐約(1986)。
應用本領域的標準技術可評價分離化合物的身份和純度。所述標準技術包括高效液相層析(HPLC)、光譜法、染色法、薄層層析、NIRS、酶測定法或微生物學測定法。所述分析方法的綜述見Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；以及Schmidt等(1998)BioprocessEngineer，1967-70；Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90、521-540、540-547、559-566、575-581和581-587頁；Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)HPLC在生物化學中的應用，載於LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷。
實施例11分析本發明的基因序列比較序列並確定兩種序列的同源性百分率是本領域已知的技術，可以採用數學算法完成，例如Karlin和Altschul的算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68)及其改良算法(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77。這種算法摻入了Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可應用NBLAST程序，分值＝100，字節長度＝12進行BLAST核苷酸檢索，以便獲得與本發明MCT核酸分子同源的核苷酸序列。可應用XBLAST程序，分值＝50，字節長度＝3進行BLAST蛋白質檢索，以便獲得與本發明MCT蛋白分子同源的胺基酸序列。為了獲得比較目的的空位對比序列，可按照Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述，使用引入空位的(Gapped) BLAST。當使用BLAST和引入空位的BLAST程序時，本領域技術人員將知道如何優化用於分析特定序列的程序(例如XBLAST和NBLAST)參數。
用於序列比較的另一個數學算法實例是Meyers和Miller算法((1988)Comput.Appl.Biosci.411-17)。這種算法摻入了ALIGN程序(2.0版)，ALIGN程序是GCG序列比對軟體包的組成部分。當使用ALIGN程序比較胺基酸序列時，可使用PAM120加權殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。其它序列分析算法是本領域已知的，包括Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.103-5介紹的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)P.B.A.S.852444-8介紹的FASTA。
也可以使用GCG軟體包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com獲得)，選用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣以及空位加權為12、10、8、6或4而長度加權為2、3或4，獲得兩種胺基酸序列的同源性百分率。應用GCG軟體包中的GAP程序，使用標準參數，例如空位加權為50而長度加權為3，可獲得兩種核酸序列的同源性百分率。
採用本領域已知的技術(參見例如Bexevanis和Ouellette編著(1998)BioinformaticsA Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，John Wiley和Sons紐約)，可進行本發明基因序列與Genbank中的序列的比較分析。以3步驟方法比較本發明基因序列與Genbank中的基因。第一步，對本發明各序列與Genbank核苷酸序列進行BLASTN分析(例如局部比對分析)，保留前500個命中序列供進一步分析。接下來，對500個命中序列進行FASTA檢索(例如聯合的局部和全局序列比對分析，其中比對序列的限定區)。最後，採用GCG軟體包中的GAP程序(使用標準參數)，對本發明各基因序列與各前3個FASTA命中序列進行全局性序列比對。為了獲得正確的結果，應用本領域周知的方法使從Genbank取出的序列長度調整為查詢序列長度。分析結果見表4。獲得的數據與單獨對本發明各基因與Genbank各參考序列進行GAP(全局)分析獲得的數據相同，但是與這樣的資料庫-寬GAP(全局)分析相比，需要顯著減少計算時間。沒有獲得高於閾值的序列比對的本發明序列在表4中指示為沒有序列比對信息。本領域技術人員進而應該知道的是，表4表頭「同源性(％)(GAP)」下的GAP序列比對同源性百分率是以歐洲數字格式列出的，其中「,」代表小數點。例如該欄中的數值「40,345」是指「40.345％」。
實施例12構建和操作DNA微陣列此外，本發明序列可以用於構建和應用DNA微陣列(DNA陣列的設計、方法學以及使用是本領域眾所周知的，例如在以下文獻中有其介紹Schena，M等(1995)Science 270467-470；Wodicka，L.等(1997)Nature Biotechnology 151359-1367；DeSaizieu，A.等(1998)NatureBiotechnology 1645-48；以及DeRisi，J.L.等(1997)Science 278680-686)。
DNA微陣列是固體或柔性支持物，例如硝酸纖維素、尼龍、玻璃、矽酮或其它物質構成的材料。核酸分子與支持物表面有序結合。適當標記後，其它核酸或核酸混合物可與固定化核酸分子雜交，標記物可用來監測和測量限定區域中的雜交分子的各信號強度。該方法可同時定量所施用的核酸樣品或混合物中全部或選定核酸的相對量或絕對量。因此，DNA微陣列可平行分析多種(多達6800種或更多)核酸的表達(參見例如Schena，M.(1996)BioEssays 18(5)427-431)。
本發明序列可用來設計寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物能夠通過諸如聚合酶鏈式反應的核酸擴增反應擴增一種或多種穀氨酸棒桿菌基因的規定區域。選擇和設計5』或3』寡核苷酸引物或合適接頭，可使所產生的PCR產物與上述支持物介質表面共價連接(也參見例如Schena，M.等(1995)Science 270467-470介紹)。
按照Wodicka，L.等(1997)Nature Biotechnology 151359-1367介紹，也可以通過原位寡核苷酸合成構建核酸微陣列。應用光刻法使基體精確限定的區域曝光。由此活化光不穩定性保護基團而加入核苷酸，而避光區則不會發生任何改變。隨後的保護和光活化循環使得在限定位置合成不同的寡核苷酸。通過固相合成寡核苷酸，可在微陣列上合成所限定區域的本發明基因。
樣品或核苷酸混合物中存在的本發明核酸分子可與所述微陣列雜交。按照標準方法可標記這些核酸分子。簡而言之，例如逆轉錄或DNA合成時通過摻入同位素或螢光標記核苷酸而標記核酸分子(例如mRNA分子或DNA分子)。已有關於標記核酸與微陣列雜交的介紹(例如載於Schena，M等(1995)同上；Wodicka，L等(1997)，同上；以及DeSaizieu A.等(1998)，同上)。雜交分子的檢測和定量須適合具體摻入的標記物。例如按照Schena，M等(1995)(同上)介紹可檢測放射性標記物，而例如按照Shalon等((1996)Genome Research6639-645)的方法可檢測螢光標記物。
將本發明序列用於上述DNA微陣列技術可比較分析穀氨酸棒桿菌或其它棒桿菌屬的不同菌株。核酸陣列方法學有助於例如根據各個轉錄物分布研究菌株間變異和鑑定特定和/或所需菌株特性如致病性、生產能力和脅迫耐受性的重要基因。此外，利用核酸陣列技術可以比較發酵反應期間本發明基因的表達分布。
實施例13分析細胞蛋白群動力學(蛋白質組學(Proteomics))本發明基因、組合物和方法可用於研究蛋白群相互作用和動力學，稱為「蛋白質組學」。目的蛋白群包括但不限於穀氨酸棒桿菌總蛋白群(例如與其它生物的蛋白群比較)、在特定環境或代謝條件下(例如發酵期間的高溫或低溫，或者高pH或低pH)具有活性的蛋白、在生長和發育的特定時期具有活性的蛋白。
可用本領域周知的各種技術如凝膠電泳分析蛋白質群。例如通過裂解或提取可獲得細胞蛋白，應用各種電泳技術可使細胞蛋白彼此分開。十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)主要根據蛋白質的分子量分離蛋白。等電聚焦聚丙烯醯胺凝膠電泳(IEF-PAGE)通過其等電點(它不僅反映胺基酸序列，而且反映所述蛋白翻譯後修飾)分離蛋白。另一個更優選的蛋白分析方法是連續組合的IEF-PAGE和SDS-PAGE，稱為2-D-gel電泳(例如見以下文獻介紹Hermann等(1998)Electrophoresis 193217-3221；Fountoulakis等(1998)Electrophoresis 191193-1202；Langen等(1997)Electrophoresis 181184-1192；Antelmann等(1997)Electrophoresis 181451-1463)。也可以使用其它蛋白分離技術進行蛋白質分離，例如毛細管凝膠電泳；所述技術是本領域周知的技術。
可用標準技術如染色或標記顯現所述方法分開的蛋白。合適染色法是本領域已知的，包括考馬斯亮藍、銀染色或螢光染料如Sypro Ruby(Molecular Probes)。在穀氨酸棒桿菌培養基中含有放射性標記胺基酸或其它蛋白前體(例如35S-甲硫氨酸、35S-半胱氨酸、14C-標記胺基酸、15N-胺基酸、15NO3或15NH4+或13C-標記胺基酸)可在其分離前標記這些細胞的蛋白。同樣可使用螢光標記物。可按照前述技術提取、分開和分離所述標記蛋白。
通過測量所用染料或標記物量可進一步分析所述技術顯現的蛋白。採用例如光學方法可定量測定給定蛋白量，而且可以與相同凝膠或其它凝膠上的其它蛋白的量比較。例如採用光學比較、光譜法、圖象掃描和凝膠分析、或者通過應用照相膠片和篩選可進行凝膠上的蛋白比較。這樣的技術產本領域周知的。
為了確定任何給定蛋白的身份，可採用直接測序或其它標準技術。可使用例如N-和/或C-末端胺基酸測序(例如Edman降解法)，也可以使用質譜法(尤其是MALDI或ESI技術(參見例如Langen等(1997)Electrophoresis 181184-1192))。本文提供的蛋白序列可用於通過所述技術鑑定穀氨酸棒桿菌蛋白。
所述方法獲得的信息可用於比較各種生物條件(例如不同生物、發酵時間點、培養基條件或不同群落生境等)的不同樣品之間的蛋白存在、活性或修飾的模式。這些實驗單獨或與其它技術聯合獲得的資料可用於各種用途，例如比較給定(例如代謝)情況的各種生物行為、提高生產精細化學品的菌株生產能力或提高生產精細化學品的產率。
等同實施方案本領域技術人員知道或者僅採用常規實驗就能夠確定本文介紹的本發明的具體實施方案的許多等同實施方案。以下的權利要求書包括這樣的等同實施方案。
權利要求
1.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子包含選自SEQID NO1至675的各奇數核酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的基因組成。
2.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子編碼包含選自SEQ ID NO2至676的各偶數胺基酸序列的多肽，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的基因組成。
3.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子編碼一種多肽的天然存在的等位基因變異體，所述多肽包含選自SEQ ID NO2至676的各偶數胺基酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的基因組成。
4.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子包含與選自SEQ ID NO1至675的任意奇數完整核苷酸序列具有至少50％同一性的核苷酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的基因組成。
5.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子包含選自SEQID NO1至675的任意奇數核苷酸序列的至少15個連續核苷酸的片段，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的基因組成。
6.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含權利要求1-5中任一項的核酸分子和一種編碼異源多肽的核苷酸序列。
7.一種載體，所述載體包含權利要求1-6中任一項的核酸分子。
8.權利要求7的載體，所述載體為表達載體。
9.一種宿主細胞，所述宿主細胞是用權利要求8的表達載體轉染的宿主細胞。
10.權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞來源於微生物。
11.權利要求10的宿主細胞，其中所述細胞屬於棒桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。
12.權利要求9的宿主細胞，其中所述核酸分子的表達導致對由所述細胞產生精細化學品進行調節。
13.權利要求12的宿主細胞，其中所述精細化學品選自有機酸、生成蛋白質的胺基酸和非生成蛋白質的胺基酸、嘌呤和嘧啶鹼基、核苷、核苷酸、脂質、飽和和不飽和脂肪酸、二元醇、糖類、芳族化合物、維生素、輔因子、聚酮化合物和酶。
14.一種生產多肽的方法，該方法包括在合適培養基中培養權利要求9的宿主細胞，由此生產所述多肽。
15.一種分離的多肽，所述多肽包含選自SEQ ID NO2至676的各偶數胺基酸序列，前提是所述胺基酸序列不由表1給出的任何F標誌的基因編碼。
16.一種分離的多肽，所述多肽包含一種含有選自SEQ ID NO2至676的各偶數胺基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變異體，前提是所述胺基酸序列不由表1給出的任何F標誌的基因編碼。
17.一種分離的多肽，所述多肽由一種核酸分子編碼，所述核酸分子包含與SEQ ID NO1至675的任意奇數完整核酸序列具有至少50％同一性的核苷酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的核酸分子組成。
18.一種分離的多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO2至676的任意偶數完整胺基酸序列至少有50％同一性的胺基酸序列，前提是所述胺基酸序列不由表1給出的任何F標誌的基因編碼。
19.一種分離的多肽，所述多肽包含一種含有SEQ ID NO2至676的任意偶數胺基酸序列的多肽的片段，前提是所述胺基酸序列不由表1給出的任何F標誌的基因編碼，其中所述多肽片段保持包含胺基酸序列的多肽的生物活性。
20.一種分離的多肽，所述多肽由包含SEQ ID NO1至675的任意奇數核苷酸序列的核酸分子編碼，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標誌的核酸分子組成。
21.權利要求15-20中任一項的分離多肽，所述多肽還包含至少一種異源胺基酸序列。
22.一種生產精細化學品的方法，所述方法包括培養權利要求9的細胞，由此生產所述精細化學品。
23.權利要求22的方法，其中所述方法還包括從所述培養物回收所述精細化學品的步驟。
24.權利要求22的方法，其中所述細胞屬於棒桿菌屬或短桿菌屬。
25.權利要求22的方法，其中所述細胞選自穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、力士棒桿菌(Corynebacterium herculus)、百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)、嗜乙醯乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒桿菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙醯棒桿菌(Corynebacterium acetophilum)、產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Corynebacterium fujiokense、Corynebacterium nitrilophilus、產氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium butahicum、穀氨酸棒桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、希氏短桿菌(Brevibacterium healii)、酮戊二酸短桿菌(Brevibacteriumketoglutamicum)、Brevibacterium ketosoreductum、乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactoferrmentum)、擴展短桿菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium paraffinolyticum和表3中給出的菌株。
26.權利要求22的方法，其中來自所述載體的所述核酸分子的表達導致對所述精細化學品的生產產生調節。
27.權利要求22的方法，其中所述精細化學品選自有機酸、生成蛋白質的胺基酸和非生成蛋白質的胺基酸、嘌呤和嘧啶鹼基、核苷、核苷酸、脂質、飽和和不飽和脂肪酸、二元醇、糖類、芳族化合物、維生素、輔因子、聚酮化合物和酶。
28.權利要求22的方法，其中所述精細化學品為胺基酸。
29.權利要求28的方法，其中所述胺基酸選自賴氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
30.一種生產精細化學品的方法，所述方法包括培養其基因組DNA因為含有權利要求1-6中任一項的核酸分子而改變的細胞。
31.一種診斷受治療者體內白喉棒桿菌的存在或其活性的方法，所述方法包括檢測所述受治療者體內是否存在權利要求1-5的核酸分子或權利要求15-20的多肽分子中的至少一種，由此診斷所述受治療者體內白喉棒桿菌的存在或活性。
32.一種分離的宿主細胞，所述宿主細胞包含選自SEQ ID NO1至675的各奇數核酸分子，其中所述核酸分子被破壞。
33.一種分離的宿主細胞，所述宿主細胞包含選自SEQ ID NO1至675的各奇數核酸分子，其中所述核酸分子與SEQ ID NO1至675的任意奇數序列相比包含一個或多個核酸修飾。
34.一種分離的宿主細胞，所述宿主細胞包含選自SEQ ID NO1至675的各奇數核酸分子，其中相對於所述核酸分子的野生型調節區而言，所述核酸分子的調節區被修飾。
全文摘要
本發明描述了命名為MCT核酸分子的分離的核酸分子，它編碼穀氨酸棒桿菌的新型MCT蛋白。本發明也提供反義核酸分子、含有MCT核酸分子的重組表達載體和已經導入所述表達載體的宿主細胞。本發明還提供分離的MCT蛋白、突變型MCT蛋白、融合蛋白、抗原性肽和用於基於穀氨酸棒桿菌中MCT基因的基因工程而改進穀氨酸棒桿菌的所需化合物生產的方法。
文檔編號C12N1/21GK1962870SQ20061010589
公開日2007年5月16日 申請日期2000年6月23日 優先權日1999年6月25日
發明者M·波姆佩朱斯, B·克雷格爾, H·施雷德爾, O·策爾德, G·哈伯豪爾 申請人:Basf公司