活性增強的酮還原酶突變體、編碼序列及其製備方法

2023-06-08 01:34:21

活性增強的酮還原酶突變體、編碼序列及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種活性增強的酮還原酶突變體，其源於木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的野生型酮還原酶，能將4-氯乙醯乙酸乙酯轉化生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，具有中E9R、S42Q、T190L、E234M的一個或多個突變。本發明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了2-20倍；且本發明反應條件溫和，對設備要求低，生產過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由於酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產他汀類藥物關鍵中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯無副產物產生，純化方便；此外本發明反應絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環保。
【專利說明】活性增強的酮還原酶突變體、編碼序列及其製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酮還原酶，本發明涉及酮還原酶突變體及其製備方法，特別涉及一種源於木蘭假絲酵母的酮還原酶突變體、編碼序列及其製備方法

【背景技術】
[0002]阿託伐他汀鈣(商品名LIPIT0R由輝瑞公司銷售)、羅蘇伐他汀鈣(商品名CREST0R由阿斯利康公司銷售)以及匹伐他汀(商標名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本銷售)，是重要的降膽固醇他汀類藥物。而手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯是這些重要的他汀類藥物的關鍵的手性中間體。國內2009年該中間體的產量為400噸，預計未來幾年內，國內產量將達到1000噸以上，直接經濟效益在數億元。在已知的製備這些手性中間體的諸多途徑中，包括化學法和酶法，都具有很多缺點。由於化學法合成過程條件苛刻，副反應多，產品分離純化難度大，得率低，成本高，使其難以成為用於商品規模合成的理想方法。採用酶法製備及手性(S) -4-氯-3-羥基-丁酸乙酯需要使用具有立體選擇性的酮還原酶，但現有的野生型酮還原酶催化活性很較低，使用10g/L粗酶粉20小時僅可轉化lg/L的酮底物，也使其難以成為用於商品規模合成的理想方法。
[0003]木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)中天然存在的野生型酮還原酶,能將4_氯乙醯乙酸乙酯(COBE)轉化為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是供一種活性增強的酮還原酶突變體，其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強2-20倍
[0005]實現本發明目的的技術方案是:本公開內容的發明人已發現包括在一定位置突變的酮還原酶與木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)產生的野生型酮還原酶(SEQ ID NO:2)相比表現出增加的催化活性。「野生型酮還原酶」、「野生型KRED酶」及「野生型KRED酮還原酶」指由源自木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的野生型酮還原酶基因SEQ ID NO:1編碼的，並具有SEQ ID NO:2的胺基酸序列的酮還原酶。該酶可將4-氯乙醯乙酸乙酯不對稱還原生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。「野生型」指與自然中所發現的一樣的材料或物質的形式。例如野生型的蛋白質或核酸序列是可以從自然界中的分離並且未經過人為修飾的，在生物體中存在的原始序列形式。「增加的催化活性」指在體外或體內試驗中所測量的與野生型酮還原酶相比，表現出使底物(例如4-氯乙醯乙酸乙酯)向產物(例如S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯)轉化率增加的酮還原酶。
[0006]本發明提供一種酮還原酶突變體,其源於木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的野生型酮還原酶，能夠將4-氯乙醯乙酸乙酯轉化為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。所述酮還原酶突變體，與SEQ ID N0.2的野生型酮還原酶相比表現出更強的催化活性。酮還原酶突變體和編碼這種突變體的多核苷酸可以使用本領域技術人員通常使用的方法製備。突變體可以通過使編碼該酶的體外重組、多核苷酸誘變、DNA改組、易錯PCR和定向進化方法等獲得。
[0007]上述酮還原酶突變體，具有選自以下特徵中的一個或多個突變:E9R，S42Q，T190L，E234M。
[0008]上述酮還原酶突變體，優選自序列SEQ ID N0.4。全長突變的酮還原酶對於保持酶的催化活性並不是必需的。相應地，應考慮酮還原酶突變體的截短的類似物和有催化活性的片段。例如，在一些實施方案中，C端或N端的數個胺基酸可以被刪去。任何特定的截短的類似物或片段可以利用相應的試驗來評估催化活性。同樣的，額外的胺基酸殘基可以被添加到一個或兩個末端而不影響催化活性。額外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，額外胺基酸序列可以被用來幫助純化，做為標記，或執行一些其它的功能。因此，本公開內容的酮還原酶突變體可以是融合蛋白的形式，其中酮還原酶突變體(或其片段)諸如通過助溶標籤(如SUMO蛋白)、純化標籤(如結合金屬的His標籤)和細菌定位信號(如分泌信號)的實例而非限制的方式被融合到其它蛋白質。
[0009]上述酮還原酶突變體，其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強2-20倍。
[0010]本發明提供一種編碼酮還原酶酶突變體的基因，其優選自SEQ ID N0.3，其已經過序列優化以適於在大腸桿菌中表達。在一些實施方案中，多核苷酸包括被優化用於在特定類型的宿主細胞中表達的密碼子。用於各種不同類型的微生物的密碼子的使用和偏好性是已知的，因為其是用於在這些微生物的表達特定的胺基酸的優化的密碼子。
[0011]本發明提供一種重組質粒，其源自SEQ ID N0.5，比PET系列及PQE系列表達載體相比其具有更嚴謹的表達控制。在一些實施方案中，控制序列包括啟動子、前導序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列和轉錄終止子等。對於細菌宿主細胞，指導編碼序列的轉錄的適合的啟動子包括但不限於從噬菌體T5、噬菌體T7、噬菌體lambda、大腸桿菌lacUV5操縱子、大腸桿菌trp操縱子、大腸桿菌tac操縱子等。
[0012]本發明提供一種宿主細胞，優選自大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的一種。表達酮還原酶突變體的表達載體可以包含允許載體整合到宿主細胞基因組中或者載體在細菌中獨立於基因組自主複製的元件。為整合到宿主細胞基因組中，載體可以通過recombineering重組工程使載體整合到基因組中。
[0013]本發明提供一種製備酮還原酶突變體的方法，其特徵在於包括以下步驟:(a)採用木蘭假絲酵母構建表達酮還原酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細胞，表達載體以及酮還原酶突變體基因；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養所述基因工程菌；(d)誘導表達所述基因工程菌；(e)收集和製備酮還原酶突變體。
[0014]所述步驟(a)為將來自木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的編碼野生型酮還原酶的多核苷酸(SEQ ID NO:I)進行序列優化後通過全基因合成的方式獲得。將優化後的編碼酮還原酶的多核苷酸克隆到改進後的表達載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達野生型酮還原酶的質粒。將所得質粒通過標準方法轉化到大腸桿菌DHl中。所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為:
[0015]F:5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTC 3』；
[0016]R:5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTACGGCAGGGTGTAACCAC 3』。
[0017]類似的，將編碼酮還原酶突變體的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到改進後的表達載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達酮還原酶突變體的質粒。將所得質粒通過標準方法轉化到大腸桿菌DHl中。
[0018]所述步驟(c)為挑取含有目的表達載體的大腸桿菌DHl單菌落接種於1ml高壓滅菌後的第一培養基中:胰蛋白腖10 g/L，酵母提取物5 8/1，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵
0.027 g/L,甘油5g/L,葡萄糖0.8g/L,滅菌後添加氨節青黴素至100mg/L。30°C,250rpm過夜培養。次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌後的第二培養基中:胰蛋白腖10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L,氯化銨2.68 g/L,硫酸鈉0.71 g/L,七水硫酸鎂0.493 g/L,六水氯化鐵0.027 g/L,甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。滅菌後添加卡那黴素至50mg/L。於30°C中培養至菌體OD 5-6,立刻將三角瓶置於25°C搖床中，250rpm培養lh。加入IPTG至終濃度0.1mM，並於25°C，250rpm繼續培養12h。
[0019]本發明具有積極的效果:(1)本發明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了 2-20倍，利用該酶可生物催化4-氯乙醯乙酸乙酯製備
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯；(2)本發明反應條件溫和，對設備要求低，生產過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由於酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產他汀類藥物關鍵中間體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯無副產物產生，純化方便；(3)本發明反應絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環保，因此利用本發明研究開發的節能減排、環境友好的高新生物技術生產藥物手性中間體，具有非常廣闊的市場前景。

【具體實施方式】
[0020](實施例1)
[0021]野生型及酮還原酶突變體表達載體的構建
[0022]將來自木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的編碼野生型酮還原酶的多核苷酸(SEQ ID NO: I)進行序列優化後通過全基因合成的方式獲得。將優化後的編碼酮還原酶的多核苷酸克隆到改進後的表達載體(SEQ ID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達野生型酮還原酶的質粒。將所得質粒通過標準方法轉化到大腸桿菌DHl中。所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為:
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[0024]R:5』 AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTACGGCAGGGTGTAACCAC 3』 。
[0025]類似的，將編碼酮還原酶突變體的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表達載體(SEQID N0.5)的啟動子的控制下，得到可以表達酮還原酶突變體的質粒。將所得質粒通過標準方法轉化到大腸桿菌DHl中。
[0026]酮還原酶突變體的製備
[0027]挑取含有目的表達載體的大腸桿菌DHl單菌落接種於1ml高壓滅菌後的培養基中:胰蛋白腖10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氫二鈉3.55 g/L,磷酸二氫鉀3.4 g/L,氯化銨2.68 g/L,硫酸鈉0.71 g/L,七水硫酸鎂0.493 g/L,六水氯化鐵0.027 g/L,甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，滅菌後添加氨苄青黴素至100mg/L。30°C，250rpm過夜培養。次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌後的培養基中:胰蛋白腖10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。滅菌後添加卡那黴素至50mg/L。於30°C中培養至菌體OD 5-6，立刻將三角瓶置於25°C搖床中，250rpm培養lh。加入IPTG至終濃度0.1mM,並於25°C，250rpm繼續培養12h。
[0028]培養結束後，將培養液於4°C，6000g下離心30min最終得到溼菌體2.6g。然後將沉澱用蒸餾水清洗兩次，收集菌體。再次用蒸餾水重懸，在超聲破碎儀下破碎至澄清。破碎後於4°C，12000g下離心30min，收集上清，預冷至_70°C後用冷凍乾燥機製備凍乾粉。最終得到粗酶凍乾粉0.41g。
[0029]酮還原酶活性的測定
[0030]由於NADPH在340nm處有吸收峰，而NADP在340nm處無吸收峰，故可通過檢測反應過程中NADPH吸光值的變化，而計算酮還原酶的活性。酮還原酶活力測定體系為:2ml反應體系中，依次加入0.5ml 10mM pH7.0 PBS緩衝液，加入終濃度0.2mM NADPH，2mM 4-氯乙醯乙酸乙酯，加雙蒸水補至1.9ml，充分混勻後置於25°C水浴中。將實施2中製備的酮還原酶乾粉按適當的比例稀釋後，取10ul加入反應體系中，混勻後於340nm處檢測每分鐘的吸光度變化值。參照NADPH標準曲線計算酮還原酶的酶活。單位酶活(U)定義為每分鐘生成lymol NADP所需要的酶量。用同樣方法檢測野生型酮還原酶的酶活。根據檢測的結果計算得到改進後的酮還原酶突變體比野生型酮還原酶酶活提升至少12.5倍。
[0031]以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，並不用於限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
[0032]序列表
[0033]南京朗恩生物科技有限公司
[0034]〈120〉活性增強的酮還原酮及其編碼序列
[0035]〈130〉2013
[0036]〈160〉4
[0037]〈170〉PatentIn vers1n 3.3
[0038]〈210〉I
[0039]〈211〉852
[0040]〈212〉DNA
[0041]〈213〉木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)
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[0214]atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcattggaaaacgt3000
[0215]tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttcgatgtaaccc3060
[0216]actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttctgggtgagca 3120
[0217]aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaaatgttgaata 3180
[0218]ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattgtctcatgagc3240
[0219]ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcgcacatttccc3300
[0220]cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaacctataaaaat3360
[0221]aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac3390
【權利要求】
1.一種活性增強的酮還原酶突變體，其源於木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的野生型酮還原酶，能將4-氯乙醯乙酸乙酯轉化生成(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯，具有以下特徵中的一個或多個突變:E9R，S42Q, T190L, E234M。
2.根據權利要求1所述的活性增強的酮還原酶突變體，其特徵在於:序列為SEQIDN0.4。
3.根據權利要求1或2所述的活性增強的酮還原酶突變體，其特徵在於:其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強2-20倍。
4.一種多核苷酸，其編碼如權利要求1-3中任一項所述的重組多肽。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於:序列為SEQID N0.3。
6.—種重組質粒,其包括表達載體連接權利要求5所述的多核苷酸，所述載體序列為SEQ ID N0.5。
7.—種宿主細胞，其包含權利要求6所述的重組質粒。
8.根據權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於:所述細胞是大腸桿菌，為大腸桿菌W3110、DHlJP JM109 中的一種。
9.根據權利要求7或8所述的宿主細胞，其特徵在於:所述重組質粒的密碼子已經為在所述宿主細胞中表達而進行了優化。
10.一種如權利要求1、所述活性增強的酮還原酶突變體的製備方法，包括以下步驟:(a)採用木蘭假絲酵母構建表達酮還原酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細胞，表達載體以及酮還原酶突變體基因，所述宿主細胞，為大腸桿菌W3110，DHlJP JM109中的一種；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養所述基因工程菌；(d)誘導表達所述基因工程菌；(e)收集和製備酮還原酶突變體。
11.根據權利要求10所述活性增強的酮還原酶突變體的製備方法，其特徵在於:所述步驟(c)為挑取含有目的表達載體的大腸桿菌單菌落接種於1ml高壓滅菌後的第一培養基中，30°C，250rpm過夜培養；次日取IL三角瓶，按1:100的接種比例接入到10ml高壓滅菌後的第二培養基中，於30°C中培養至菌體OD 5-6，立刻將三角瓶置於25°C搖床中，250rpm培養lh，加入IPTG至終濃度0.1mM,並於25°C，250rpm繼續培養12h。
12.—種生產他汀類藥物的關鍵的手性中間體的方法，包括在與權利要求1-3任一項所述的酮還原酶突變體的存在下，將4-氯乙醯乙酸乙酯轉化生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
【文檔編號】C12N15/53GK104342411SQ201310321129
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月26日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】丁雪峰 申請人:南京朗恩生物科技有限公司