一種同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法

2023-06-27 22:57:51

專利名稱：：一種同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法
技術領域：
：本發明屬於獸藥殘留檢測領域，具體涉及一種同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法。
背景技術：
：目前國內外對甲碸黴素、氟苯尼考及代謝產物氟苯尼考胺的殘留檢測方法雖然有不少報導，但主要集中在水產品的研究，檢測方法主要有高效液相色譜紫外檢測法(HPLC/UV)、高效液相色譜螢光檢測法(HPLC/FLU)、高效液相色譜質譜聯用檢測法(HPLC-MS)。HPLC/UV法樣品雜質峰較多，幹擾較大，對樣品的淨化要求較高，而且紫外檢測器的靈敏度較低。HPLC-MS法雖然靈敏度很高，但是其價格昂貴，很難在實際生產中普及。HPLC/FLU法靈敏度高，樣品雜質峰較少，對樣品的淨化要求較低。HPLC/FLU法同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留國內尚未見報導。
發明內容為了使待測組分峰與雜質峰完全分開，且均為基線分離峰，使檢測限低於0.1個MRLs，使定量限低於0.2個MRLs，本發明提供了一種高效液相色譜螢光檢測法，能同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留。本發明所採用的技術方案是一種同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法，是將雞蛋樣品經過提取、淨化、濃縮後，以乙腈_磷酸二氫鈉溶液為流動相，採用〇18柱(5線250mmX4.6mm)，流速為1.01.2mL/min，在激發波長225nm、發射波長為285nm處用螢光檢測器檢測；其中所說的乙腈_磷酸二氫鈉溶液為0.01mo1/L，含O.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.1%三乙胺，乙腈和NaH2P04溶液體積比為3035:7065。本發明中雞蛋樣品提取、淨化、濃縮可採用常規的乙腈、丙酮提取，但因乙腈、丙酮提的回收率低，所以本發明推薦使用體積比49:49:2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取，具體操作是將雞蛋製成勻漿後，加入30%-50%乙腈溶液中混勻，再用體積比49:49:2的乙酸乙酯_乙腈_氨水提取振蕩萃取，離心，將上清液移出，重複萃取3-4次，合併上清液，即得提取液；提取液在氮吹儀上吹乾，用乙腈溶解殘渣，再用經純乙腈飽和的正己烷重複脫脂，然後氮吹儀上再次吹乾，用30%_35%乙腈溶液溶解殘渣，離心，過濾，得濾液，即濃縮液。濃縮液即可用於HPLC檢測。本發明方法與HPLC/FLU法檢測水產品中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝產物氟苯尼考胺的方法相比(l)流動相不同。本方法選擇的流動相為乙腈-磷酸二氫鈉溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.1%三乙胺)(體積比3035:7065)，報導的流動相為乙腈-乙酸銨溶液(0.025mol/L，含0.Olmol/L庚烷磺酸鈉)(體比15:85)，本方法所用離子對試劑十二烷基硫酸鈉比庚烷磺酸鈉便宜很多；(2)出峰順序不同。本方法選擇的流動相分析出峰順序為甲碸黴素、氟苯尼考、氟苯尼考胺，而報導的流動相分析出峰順序為甲碸黴素、氟苯尼考胺、氟苯尼考，相比之下本方法峰形相對較好，分析時間縮短；(3)檢測波長不同。本方法採用螢光檢測器檢測(激發波長225nm，發射波長285nm)，報導的方法採用螢光檢測器檢測(激發波長224nm，發射波長295nm)，相比之下本方法靈敏度高。圖1是雞蛋空白對照樣品色譜圖；圖2是TAP(200iig/L)+FF(200iig/L)+FFA(40iig/L)標準溶液色譜圖(25iiL進樣)；圖3是.TAP(100iig/kg)+FF(100iig/kg)+FFA(20iig/kg)空白雞蛋添加色譜圖(100ilL進樣)；圖4是口服給藥樣品色譜圖。具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。本發明中所涉及到的溶液百分濃度，除特別說明外均為質量百分濃度。1.實驗雞的飼養、給藥和樣品採集1.l實驗雞選擇及分組選取28周齡京海黃雞175隻，體重1.75±0.20kg，隨機分成7組，每組25隻，單籠飼養。A、B、C組為甲碸黴素試驗組，D、E、F組為氟苯尼考試驗組，G組為空白對照組。給藥前分別稱重、編號。試驗前預飼1周，飼餵不含任何抗菌藥物的全價飼料，自由飲水。1.2給藥劑量、途徑及樣品採集各試驗組產蛋雞投藥劑量如表l所示。給藥前先將甲碸黴素和氟苯尼考灌注於空心膠囊中，然後分別直接投入到雞的嗦囊中。試驗組每天給藥一次，給藥時間均在上午8:00-9:00，連續5d，自給藥日起至停藥後15d內收集每天的雞蛋。表1給藥方案tableseeoriginaldocumentpage52(1)乙酸乙酯_乙腈_氨水提取、淨化與濃縮步驟①用勻槳機將雞蛋製成勻槳；②準確稱取2.0-3.0g雞蛋勻漿樣品，放於30-50mL具塞離心管中；③加入1-1.5mL30%-50%乙腈溶液置漩渦混合器上混勻；④加入4-6mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49:49:2，V/V)，旋渦振蕩混勻1-2min，再用超聲波振蕩萃取15min;⑤6000-8000r/min離心10-15min，上清液轉移至20_25mL玻璃管中；⑥重複提取3-4次，合併上清液；⑦在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；⑧加入1.OmL-l.5mL乙腈溶解，渦旋振蕩混勻1-2min;⑨加3.0-5.0mL飽和正己烷(用純乙腈飽和)脫脂，棄去上層正己烷，重複脫脂2次；在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；冷凍保存；上機前用1.0mL30%_35%乙腈溶解，轉移至1.5mL離心管中；⑩12000-13400r/min離心15分鐘，上清液經0.22ym濾膜過濾，濾液供HPLC測定。(2)乙腈提取、淨化與濃縮步驟①用勻槳機將雞蛋製成勻槳；②準確稱取2.0g雞蛋勻漿樣品，放於50mL具塞離心管中；③加入lmL35%乙腈溶液置漩渦混合器上混勻；加入4mL乙腈，渦旋振蕩混勻l-2min，再用超聲波振蕩萃取15min;⑤6000-8000r/min離心10-15min，上清液轉移至25mL玻璃管中；⑥重複提取3-4次，合併上清液；⑦在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；⑧加入1.OmL乙腈溶解，旋渦振蕩混勻1-2min;⑨加3.OmL飽和正己烷(用純乙腈飽和)脫脂，棄去上層正己烷，重複脫脂2次；在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；冷凍保存；上機前用1.OmL35%乙腈溶解，轉移至1.5mL離心管中；12000-13400r/min離心15分鐘，上清液經0.22ym濾膜過濾，濾液供HPLC測定。(3)丙酮提取、淨化與濃縮步驟①用勻槳機將雞蛋製成勻槳；②用勻槳機將雞蛋製成勻槳；③準確稱取2.0g雞蛋勻漿樣品，放於50mL具塞離心管中；加入2mLpH7.0的磷酸鹽緩衝液，旋渦振蕩混勻1-2min;⑤加入4mL丙酮旋渦振蕩混勻1-2min，再用超聲波振蕩萃取15min;⑥6000-8000r/min離心5min;⑦將溶液轉移到另一支15mL離心管中；⑧再向溶液中加入3mL二氯甲烷，旋渦振蕩混勻lmin，再用超聲波振蕩萃取15minj⑨6000-8000r/min離心5min;⑩棄去上層水相，置45t:氮吹儀上吹乾；(11)用lmL35%乙腈溶解殘渣，渦旋振蕩混勻lmin;(12)加入3mL正己烷(用純丙酮飽和)渦旋振蕩混勻lmin，脫脂，棄去上層正己烷，重複脫脂2次；(13)水相轉移至1.5mL離心管，上清液經0.22ym濾膜過濾，濾液供HPLC測定。3回收率的測定準確稱取3.Og勻漿後的空白雞蛋勻漿液，置50ml聚丙烯離心管中，添加不同濃度的標準工作液，使得空白空白蛋液中甲碸黴素添加量分別為0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg;氟苯尼考添加量分別為0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg;氟苯尼考胺添加量分別為0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg。每個添加量設6個平行，經上述樣品的提取、淨化和濃縮後，進樣80iiL作HPLC檢測。HPLC檢測條件色譜柱為C18，5ym，250mmX4.6mm;流動相為乙腈NaH2P04溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.10%三乙胺)=3035:7065(V/V)，用85%H3P04調pH至4.5-4.8;螢光檢測器，激發波長225nm，發射波長285nm;流速1.01.2mL/min;柱溫2530°C。根據峰面積計算添加回收率。本發明方法提取樣品的結果見表2。乙腈、丙酮提取樣品的結果見表3、表4。表2雞蛋中TAP、FF和FFA的添加回收率及變異係數(n=6)tableseeoriginaldocumentpage6表3雞蛋中甲碸黴素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及變異係數(n=6)抗生素添加濃度平均回收率/%相對標準偏差/%日內變異係數/%日間變異係數/%1527.97.55.57.8TAP5029.85.45.17.950033.03.94.96.21528.53.85.18,8FF5039.57.64.86.950032.85.34.69.550FFA5005000表4雞蛋中甲碸黴素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及變異係數(n=6)抗生素添加濃度平均冋收率/%相對標準偏差/%日內變異係數/%日間變異係數/%1526.96.56.57.4TAP5037.64.75.67.350036.26.95.97.21527.55.95.78.4FF5039.84.35.47.950023.54.14.99.2537.03.86.78.6FFA5036.36.95.99.450038.97,46.19.64、色譜條件色譜柱C18，5iim，250mmX4.6mm;流動相乙腈:NaH2P04溶液(0.Olmol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.10%三乙胺)=3035:7065(V/V)，用85%H3P04調pH至4.5-4.8;檢測器螢光檢測器，激發波長225nm，發射波長285nm;流速1.01.2mL/min;柱溫2530。C。5定量方法標準曲線的繪製用35%乙腈分別將甲碸黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺儲備液稀釋成質量濃度為10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05、0.025mg/L，10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05、0.Olmg/L和2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025mg/L的系列工作標準液，進行HPLC色譜分析。每個濃度點重複測定3次，取平均值繪製色譜峰面積(s)-濃度(C)標準曲線。檢測限及定量限的確定(1)向空白雞蛋中加入定量的藥物標準品混勻，配置成藥物濃度在標準曲線末端並逐漸降低的一組樣品，然後對每種濃度樣品測定6次，以測定結果的精密度(RSD)達到7《20%和準確度達到(平均濃度偏離配置濃度)達到《±20%時，樣品中藥物的最低濃度為定量限(L0Q)。(2)測定時記錄各濃度樣品每次測定得到的藥物信號強度S與噪音(或背景信號)強度N，然後取S和N的平均值，以能達到以其平均值之比等於3時樣品最低藥物濃度為檢測限(L0D)。6精密度的測定日內精密度方法將高、中、低三種濃度的樣品，每種樣品分別測定6次，在同日內早、中、晚用同一條標準曲線及同一臺儀器設備分別進行分析測定。日間精密度方法將高、中、低三種濃度的樣品，每種樣品分別測定6次，在一周內不同日用不同的標準曲線分別進行分析測定。本發明採用螢光檢測器檢測(激發波長225nm，發射波長285nm)，與紫外檢測器檢測(A=224nm或225nm)相比，樣品雜質峰少，幹擾少，可將甲碸黴素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺與雞蛋樣品中其它組份完全分開，甲碸黴素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺保留時間分別為4.5、8.0和11.0min左右，色譜峰峰形較佳，且均為基線分離峰，空白雞蛋樣品提取液在上述保留時間無幹擾峰出現，見圖1-4。篩選出的高效液相色譜螢光檢測(HPLC/FLU)方法，甲碸黴素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺靈敏度高、最低檢測限分別為5、5、1iig/kg。甲碸毒素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺分別在0.02510.0、0.0110.0、0.00255.Omg/mL範圍內線性關係良好(r=0.9997，r=0.9998，r=0.9998，n=7)，可滿足雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺殘留檢測的要求。其結果見表5。表5TAP、FF和FFA的回歸方程和相關係數、線性範圍、檢測限tableseeoriginaldocumentpage8權利要求一種同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法，其特徵在於，是將雞蛋樣品經過提取、淨化、濃縮後，以乙腈-磷酸二氫鈉溶液為流動相，採用C18柱5μm，250mm×4.6mm，流速為1.0～1.2mL/min，在激發波長225nm、發射波長為285nm處用螢光檢測器檢測；所說的乙腈-磷酸二氫鈉溶液為0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.1％三乙胺，乙腈和NaH2PO4溶液體積比為30～35∶70～65。2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所說雞蛋樣品的提取、淨化、濃縮步驟是將雞蛋製成勻漿後，加入30%-50%乙腈溶液中混勻，再用體積比49:49:2的乙酸乙酯_乙腈_氨水提取振蕩萃取，離心，將上清液移出，重複萃取3-4次，合併上清液，即得提取液；提取液在氮吹儀上吹乾，用乙腈溶解殘渣，再用經純乙腈飽和的正己烷重複脫脂，然後氮吹儀上再次吹乾，用30%_35%乙腈溶液溶解殘渣，離心，過濾，得濾液，即濃縮液。全文摘要本發明涉及一種同時檢測雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法。該方法是將雞蛋樣品經過提取、淨化、濃縮後，以乙腈-磷酸二氫鈉溶液為流動相，採用C18柱5μm，250mm×4.6mm，流速為1.0～1.2mL/min，在激發波長225nm、發射波長為285nm處用螢光檢測器檢測；所說的乙腈-磷酸二氫鈉溶液為0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.1％三乙胺，乙腈和NaH2PO4溶液體積比為30～35∶70～65。本發明具有成本低、靈敏度高的優點。文檔編號G01N1/28GK101726553SQ20091026444公開日2010年6月9日申請日期2009年12月22日優先權日2009年12月22日發明者姚宜林,徐東,李洋靜,裴燕,謝愷舟,謝星,陳書琴申請人:揚州大學