癭蜂防治劑的製作方法

2023-06-27 11:17:41

癭蜂防治劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及昆蟲物種中RNA介導的基因沉默領域。本發明部分地基於本發明人對來自桉樹入侵物種癭蜂害蟲桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybe?invasa)(Li)和桉幹癭姬小蜂(Ophelimus?maskelli)(Om)的基因的測序。在某些方面，本發明提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此類核酸和衍生物作為癭蜂防治劑的用途。
【專利說明】癭蜂防治劑
[0001]序列表
[0002]本申請包含以ASCII格式經EFS-Web提交的序列表，在此將其全部內容引入以作參考。將2012年3月30日製作的所述ASCII副本命名為34702W01.txt，其大小為312，664位元組。
[0003]相關申請的交叉參考
[0004]本申請要求2011年3月30日提交的美國臨時申請61/469，469和2012年I月30日提交的美國臨時申請61/592，175的優先權。將前述臨時申請各自的全部內容引入於此
以作參考。
【技術領域】
[0005]本發明涉及昆蟲物種中雙鏈RNA(dsRNA)介導的基因沉默領域。
【背景技術】
[0006]在南北半球均發生了桉樹的癭蜂(gall wasp)侵擾,並且對中國、澳大利亞、以色列和巴西的商業桉樹種植造成威脅。防治桉樹感染癭蜂的努力包括嘗試分離天然抗性植物和天然捕食者。這些努力已遇到了限制或並未成功。癭蜂產生的癭瘤(gall)的保護性環境使化學殺蟲劑防治癭蜂產生困難。
[0007]即使可行，化學殺蟲劑防治也具有劣勢。化學殺蟲劑可能不利於環境，不是選擇性的，且可能對非目標作物和動物群有害。化學殺蟲劑存留於環境中並通常代謝緩慢，或根本不代謝。化學殺蟲劑在食物鏈中，`特別是在較高的捕食者物種內積累，它們可在較高的捕食者物種中充當誘變劑和/或致癌物以引起不可逆且有害的遺傳修飾。此外，由於重複使用相同的殺蟲劑或具有相同作用模式的殺蟲劑可使作物害蟲發展出對化學殺蟲劑的抗性。
[0008]RNA幹擾或「RNAi」為由與要下調的靶基因區序列互補的雙鏈RNA(dsRNA)弓丨發的序列特異性下調基因表達的過程(還稱作「基因沉默」或「RNA介導的基因沉默」)。多細胞生物中藉助RNA幹擾(RNAi)的靶基因下調已成為行之有效的技木。美國專利申請公布US2009/0285784 Al和US2009/0298787涉及dsRNA作為昆蟲防治劑，並在此將其各自的全部內容引入於此以作參考。美國專利6，506，559號、美國專利申請公布2003/00150017 Al、國際公布 WO 00/01846,WO 01/37654,WO 2005/019408、TO 2005/049841、WO 05/047300 涉及RNAi保護植物抵抗昆蟲的用途。在此將前述專利和公布的申請的全部內容分別引入於此以作參考。

【發明內容】

[0009]本發明部分地基於本發明人對來自桉樹入侵物種癭蜂害蟲,桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybe invasa) (Li)和按乾瘦姬小蜂(Ophelimus maskelli) (Om)的基因的測序。在某些方面，本發明由此提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此類核酸和衍生物作為癭蜂防治劑的用途。[0010]在某些方面,本發明提供在高嚴格雜交(high stringency hybridization)條件下與 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10,SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQID NO:45-123, SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和 SEQ ID NO:234-244 中所示的序列及其互補序列選擇性雜交的分離的核酸。[0011]在某些方面，本發明提供與SEQ ID NO: U SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45-123,SEQ ID NO:127-132,SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互補序列的同一1注(identical)為90-99.99%的分離的核酸。[0012]在某些方面，本發明提供包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:45_123、SEQ ID NO:127-132,SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互補序列的至少17個鄰接核苷酸(contiguousnucleotides)的分離的核酸。[0013]在某些方面，本發明提供來自Li或Om的核酸，所述核酸包括如上所示的與所述核酸的蜜蜂直向同源物(ortholog)的同一『丨生為約80%以下的核酸。[0014]在某些方面，本發明提供包括可操作地連接至表達調控序列(expressioncontrol sequence)的來自Li或Om的核酸或此類序列的反向互補體的載體。[0015]在某些方面，本發明提供轉化有和/或承載有包括可操作地連接至表達調控序列的來自Li或Om的核酸或此類序列的反向互補體的載體的宿主細胞。[0016]在某些方面，本發明提供轉化有和/或承載有包括可操作地連接至表達調控序列的來自Li或Om的核酸的載體的植物組織，例如葉組織和種子。[0017]在某些方面，本發明提供抑制Li或Om核酸表達的分離的小抑制性核糖核酸(siRNA)分子。[0018]在某些方面，本發明提供分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，所述分子包括SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12，SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQID NO:45-123, SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和 SEQ ID NO:234-244 中的至少17個鄰接核苷酸基本上同一的第一鏈核苷酸和與第一鏈核苷酸基本上互補的第二鏈核苷酸。[0019]在某些方面，本發明提供雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其與來自Li或Om的mRNA(Li或Om靶dsRNA)高度同源(大於80%)，包括與dsRNA的蜜蜂直向同源物的同一性為約80%以下的上述所示的dsRNA分子。
[0020]在某些方面，本發明提供包括可操作地連接至為來自Li或Om的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達調控序列的載體。
[0021]在某些方面，本發明提供轉化有和/或承載有載體的宿主細胞，所述載體包括可操作地連接至為來自Li或Om的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達調控序列。
[0022]在某些方面，本發明提供轉化有和/或承載有載體的植物組織，所述載體包括可操作地連接至為來自Li或Om的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達調控序列。
[0023]在某些方面，本發明提供抑制Li或Om的必需基因的表達的分離的小抑制性核糖核酸(siRNA)分子。
[0024]在某些方面，本發明提供通過在植物中或者在植物的繁殖或生殖材料中表達Li或Om的dsRNA來生產抗害蟲植物的方法。
[0025]在某些方面，本發明提供通過在桉樹中或者在桉樹的繁殖或生殖材料中表達Li或Om的dsRNA來生產抗害蟲桉樹的方法。
[0026]在某些方面，本發明提供通過在桉樹中或者在桉樹的繁殖或生殖材料中表達Li或Om的靶向dsRNA來生產抗癭蜂感染和/或侵擾的桉樹的方法。
[0027]在某些方面，本發明·提供抗植物病原害蟲的植物的生產方法，所述方法用表達dsRNA的重組DNA構建體或構建體的組合來轉化植物細胞；由轉化的植物細胞再生植物；和在適於所述重組DNA構建體表達的條件下使轉化的植物細胞生長。
[0028]本發明的一個或多個實施方案的細節將於下述附圖和說明書中示出。從說明書和附圖以及從權利要求來看，本發明的其他特徵、目的和優勢將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1描述了根據本發明的某些非限制性核酸。(A)構建有三個轉基因的核酸構建體#I (SEQ ID NO: 37)的示意圖。轉基因P1-T1編碼用於沉默Li外被體(Coatomer)亞單位a-樣(a C0P)、染色質域-解旋酶DNA-結合蛋白M1-2同系物(Cdh3)和毒羧酸酯酶-6 同エ型 I (venom carboxyl esterase-6 isoforml) (VCE-F2)基因的髮夾 RNA(hpRNA)。轉基因P2-T2編碼用於沉默Oma C0P、Cdh3和VCE-F2基因的hpRNA。轉基因P3-T3編碼具有Li a COP、Cdh3和VCE-F2基因以及0m a COP、Cdh3和VCE-F2基因的正義序列的mRNA。由轉基因P3-T3轉錄的mRNA為細胞質增強沉默信號(cytoplasmic enhancement of thesilencing signal)的模板。(B)通過核酸構建體#I (左-Li RNAil, SEQ ID NO: 137 ;右-OmRNAil, SEQ ID NO: 138)轉錄產生的hpRNA分子。定義:Pl_CaMV35S啟動子(SEQ ID NO:27)；P2-AtUBQl 啟動子(SEQ ID NO: 28) ;P3 - At肌動蛋白 7 (AtActin7)啟動子(SEQ ID NO: 29)；Tl-AtRiboProS40 終止子(SEQ ID NO:32) ;T2_AtUBQl 終止子(SEQ ID NO:33) ;T3_N0S 終止子(SEQ ID NO:34) ;i 1-lOObp Li a COP 基因(SEQ ID NO:1) ；i2-100bp Li VCE-F2 基因(SEQ ID NO:2) ；i3-100bp Li Cdh3 基因(SEQ ID NO:3);帶有 A93C 置換(change)以消除預測的聚腺苷酸化位點的ml-lOObp Om a COP基因(SEQ ID NO:7) ;ml*(P3和T3之間的 ml)-1OObp Om a COP 基因(SEQ ID NO:234) ；m2-100bp Om Cdh3 基因(SEQ ID NO:8)；m3-100bp Om VCE-F2 基因(SEQ ID NO:9);帶有 XhoI 位點的 L1-環 #1 (SEQ ID NO: 13)；帶有 AscI 位點的 L2-環 #2 (SEQ ID NO: 14)。Poly A 尾如 SEQ ID NO: 245 所公開。
[0030]圖2描述根據本發明的某些非限制性核酸。(A)構建有三個基因的核酸構建體#2 (SEQ ID NO: 38)的示意圖。轉基因P1-T4編碼用於沉默Li幾丁質合成酶、鐵蛋白和保幼激素環氧化物水解酶(JHEH)基因的髮夾RNA (hpRNA)。轉基因P4至T5編碼用於沉默Om幾丁質合成酶、鐵蛋白和JffiH基因的hpRNA。轉基因P5-T3編碼具有Li幾丁質合成酶、鐵蛋白和JHEH基因以及Om幾丁質合成酶、鐵蛋白和JHEH基因的正義序列的mRNA。由轉基因P5-T3轉錄的mRNA為細胞質增強沉默信號的模板。(B)通過核酸構建體#2轉錄產生的hpRNA分子。(左-Li RNAi 2, SEQ ID NO: 141;右-Om RNAi 2, SEQ ID NO: 142)。定義:Pl_CaMV35S啟動子(SEQ ID NO:27) ;P4 - At Y TI (AtGammTI) P2 啟動子(SEQ ID NO:30) ；P5-sgFIMV B雲カ子(SEQ ID N0:31) ；T4 - At 8 (AtDelta)TIP 終止子(SEQ ID NO:35) ；T5-AtGammTI P2終止子(SEQ ID NO:36) ;T3_N0S 終止子(SEQ ID NO:34) ；i4-100bp Li 幾丁質合成酶基因(SEQ ID NO:4) ；i5-100bp Li鐵蛋白基因(SEQ ID NO:5) ；i6-100bp Li JHEH基因(SEQ IDNO:6) ；m4-100bp Om 幾丁質合成酶基因(SEQ ID NO: 10) ；m5-100bp Om 鐵蛋白基因(SEQID NO: 11) ；m6-100bp Om JHEH 基因(SEQ ID NO: 12) ；L1 -環 #1 (SEQ ID NO: 13) ；L2 -環#2 (SEQ ID NO: 14)。Poly-A 尾如 SEQ ID NO:245 所公開。[0031]圖3描述根據本發明的某些非限制性核酸。(A)構建有三個轉基因的核酸構建體#3 (SEQ ID NO: 124)的示意圖。轉基因P1-T6編碼用於沉默Limor-SWI/SNF複合體亞單位SMARCC2 (MOR)、真核轉錄起始因子3亞單位1-樣(TIF)和蛋白質磷酸化酶PP2A 55 kDa調節亞單位樣同エ型I (PPR)基因的髮夾RNA(hpRNA)。轉基因P6-T4編碼用於沉默Om M0R、TIF和PPR基因的hpRNA。轉基因P5-T3編碼具有Om M0R、TIF和PPR基因以及Li M0R、TIF和PPR基因的正義序列的mRNA。由轉基因P5-T3轉錄的mRNA編碼非功能性蛋白質並且為細胞質增強沉默信號的模板。(B)通過核酸構建體#3轉錄產生的hpRNA分子。定義=Pl-CaMV35S 啟動子(SEQ ID NO: 27) ;P6_AtDelta TIP 啟動子(SEQ ID NO: 125) ;P5_sgFMV 啟動子(SEQ ID N0:31) ;T6-At 肌動蛋白 7(AtActin7)終止子(SEQ ID NO: 126) ;T4_AtDeltaTIP 終止子(SEQ ID NO:35) ;T3_N0S 終止子(SEQ ID NO:34) ；i7-100bp Li MOR(SEQID NO: 127) ；i8-100bp Li TIF 基因(SEQ ID NO: 128) ；i9-100bp Li PPR 基因(SEQ IDNO: 129) ；m7-100bp Om MOR基因(SEQ ID NO: 130) ;m8_100bp 帶有 C98G置換以消除 SacI 位點的Om TIF基因(SEQ ID NO: 131 ;相當於把序列中的C472G) ;m9_81bp帶有T2C置換以消除 XbaI 位點的 Om PPR 基因(SEQ ID NO: 132) ；L1 -環 #1 (SEQ ID NO: 13) ；L3 -環 #3 (SEQID NO: 139)。Poly-A 尾如 SEQ ID NO:245 所公開。
[0032]各圖中相似的參考符號表示相似的元件。
【具體實施方式】
[0033]本發明涉及使用雙鏈RNA(dsRNA)介導的技術來防治植物的昆蟲感染和侵擾。本發明人已進行了天然桉樹害蟲桉樹枝癭姬小蜂(Li)和桉幹癭姬小蜂(Om)的轉錄組測序，並發掘各自的轉錄組來鑑定對應於Li和Om mRNA的Li和Om基因的開放閱讀框。Li和OmRNA的鑑定允許設計介導Li和Om基因下調(沉默)的siRNA和dsRNA。因此，將此類siRNA和dsRNA用作生物防治劑來殺滅或抑制Li和Om進展，並抑制由Li和Om造成的植物感染。
[0034]因此，本發明描述基於核酸來防治癭蜂害蟲的方法。活性成分為核酸，例如雙鏈RNA (dsRNA)或可促進或導致產生dsRNA的核酸，可將其用作殺蟲製劑。dsRNA可在宿主植物、植物部分(plant part)、植物細胞或種子中表達以保護植物抵抗癭蜂。dsRNA的序列對應於癭蜂必需基因的部分或全部，並經RNA幹擾(RNAi)引起昆蟲靶基因的下調。作為mRNA下調的結果，dsRNA阻止昆蟲靶蛋白的表達並引起昆蟲的死亡、生長停滯或不育。
[0035]本發明的方法發現在期望抑制癭蜂的活力、生長、發育或生殖，或者降低昆蟲的病原性或感染性的任何【技術領域】實際應用。本發明的方法進ー步發現在期望具體下調癭蜂昆蟲中的ー種或多種靶基因表達的情況中實際應用。特別有用的實際應用包括，但不限於保護植物抵抗癭蜂害蟲侵擾(pest infestation)。
[0036]用於防止昆蟲侵擾敏感細胞或植物的昆蟲侵擾的siRNA對昆蟲生長的防治通過使昆蟲與通過退火互補鏈產生的dsRNA接觸來起作用，所述互補鏈之一具有與昆蟲靶基因的至少部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。dsRNA在被昆蟲攝食然後由昆蟲經腸吸收的植物組織中表達，從而控制生長或防止侵擾。參見Huvenne等，2010，J InsectPhysiol56:227-350
[0037]用於siRNA介導的幹擾的癭蜂靶基因包括優選非冗餘的活力基因(vital gene)。活力靶基因可為當被抑制時幹擾昆蟲生長或存活或病原性或感染性的任何基因。此類活カ靶基因對於昆蟲的活力、生長、發育或生殖是必需的，或者是參與昆蟲病原性或感染性，以致特異性抑制靶基因導致致死表型或降低或停止昆蟲侵擾的任何基因。此類活力靶基因的下調(其活性不能由其他相關基因補充)導致害蟲幼蟲的嚴重損傷並提供針對無柄(sessile)癭蜂害蟲的有效的害蟲防治系統。靶基因可為在此所述的任何靶基因，例如害蟲活力、生長、發育或生殖所必需的靶基因。靶基因的實例包括，例如參與蛋白質合成和/或新陳代謝和/或RNA合成和代謝和/或細胞進程的基因。這些靶基因的微小敲除將對許多其它基因和進程產生影響，最終導致對靶害蟲的致死效應。此類下調靶基因將導致昆蟲的死亡，或停止或延遲昆蟲的生殖或生長。此類靶基因對於昆蟲活力是至關重要的並稱為活力基因。
[0038]潛在的靶基因可基幹與其它昆蟲物種基因的同源性來鑑定。公布的全基因組RNAi介導的基因幹擾庫(15，16)可用於鑑定當基於這些基因的RNAi表達並通過攝食或任何其它手段引入靶害蟲有機體時使其它有機體致死的基因。因此，果蠅中鑑定為RNA1-致死的基因可用於篩選膜翅目物種的直向同源物。此類膜翅目直向同源物可進ー步用於篩選用於潛在靶標的癭蜂物種。
[0039]Li和Om是無柄害蟲。因此，Li和Om活力靶基因不能僅基於在非無柄害蟲中顯示為活力基因的基因來預測。無柄害蟲，例如不能遷徙至可替代的進食源(feed source) 0在Li和Om的情況中，發育中的害蟲禁閉於癭瘤且在80-120天內進食相同的來源。這種發育模式導致緩慢但持續吸收dsRNA的可能性，其可具有對非無柄害蟲不起作用的累積效應。因此，儘管如此，推定的靶基因，例如蠕蟲中並未描述為活力的靶基因，也可為癭蜂中的活力靶基因。
[0040]靶基因的實例包括但不限於a COP, COPI囊泡外被體複合體的a亞單位；染色質域-解旋酶-DNA-結合蛋白3(Cdh3);幾丁質合成酶，毒羧酸酯酶-6同エ型I ;保幼激素環氧化物水解酶；和鐵蛋白。癭蜂靶基因的核苷酸序列包括，例如SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ IDNO: 127-132,SEQ ID NO: 150-222和SEQ ID NO: 234-244中所列的序列，此類序列的互補體，以及在高嚴格雜交條件下與此類序列和互補體選擇性雜交的序列。 [0041]用於dsRNA介導的癭蜂靶基因下調的核苷酸序列包括，例如(i)SEQ ID NO: USEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132,SEQ ID NO: 150-222和 SEQ ID NO: 234-244 中所列的序列，和此類序列的互補體；Qi)與 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11或 SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和SEQ ID 勵:234-244中所列的序列同ー性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%or99.9%的序列，和此類序列的互補體；(iii)包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID N0:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222和SEQ ID NO:234-244的至少17個鄰接核苷酸的序列，和此類序列的互補體；和(iv)在高嚴格雜交條件下與此類序列和互補體選擇性雜交的序列。
[0042]本文所使用的「分離的」核酸為已從其天然環境的組分中鑑定並分離和/或回收的核酸。
[0043]本文所使用的「防治害蟲」是指殺死害蟲，或防止害蟲發育或生長，或防止害蟲感染或侵擾。本文所使用的防治害蟲還包括防治害蟲的後代(發育的卵)。本文所使用的防治害蟲還包括抑制害蟲活力、生長、發育或生殖，或降低害蟲的病原性或感染性。本文所使用的化合物和/或組合物可用於保持有機體健康並可治療性、預防性或系統性地用於防治害蟲或避免生長或發育或感染或侵擾。
[0044]特別地，設想的通過本文所述方法防治的害蟲為植物病原性有害昆蟲。因此本文所使用的「防治昆蟲」包括防治昆蟲後代(例如發育中的卵)。本文所使用的防治昆蟲包括抑制昆蟲的活力、生長、發育或生殖，或降低昆蟲的病原性或感染性。如本文所使用的，防治昆蟲可指抑制昆蟲的生物學活性，產生ー種或多種下列屬性:昆蟲進食減少、昆蟲活力減少、昆蟲死亡、昆蟲的分化和發育抑制、昆蟲有性生殖能力的缺失或降低。[0045]本文所述的化合物和/或組合物可用於保持有機體健康並可治療性、預防性或系統性地用於防治昆蟲或避免昆蟲生長或發育或感染或侵擾。因此，本發明可允許預先易感的有機體發育出抵抗昆蟲有機體侵擾的抗性。
[0046]術語「與......的至少部分互補」是指與在超過10個核苷酸上，例如在至少15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24或更多個鄰接核苷酸上的靶標的核苷酸序列完全互補的核苷酸序列。儘管有上述，但「與……的至少部分互補」還可包括在超過20個核苷酸的長度上，例如在至少20、21、22、23、24或更多個鄰接核苷酸長度上與靶標序列的核苷酸序列的互補大於80%的互補序列[13，14]。
[0047]在某些方面，本發明提供下調昆蟲中靶基因表達的方法，所述方法包括使昆蟲與dsRNA接觸，其中，dsRNA包括退火的互補鏈，其中之一具有與要下調的昆蟲靶基因的核苷酸序列至少部分互補的核苷酸序列，從而使dsRNA攝入昆蟲內，進而下調昆蟲靶基因的表達。
[0048]術語「昆蟲」包括所有類型和處於包括卵、幼蟲或稚蟲、蛹和成蟲階段的所有發育階段的昆蟲。
[0049]如本文所使用的，術語「植物」包括期望治療以預防或降低昆蟲生長和/或昆蟲侵擾的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如種子、插條、接枝、外植體等，以及植物細胞和組織培養物。植物材料應表達或具有表達RNA分子的能力，所述RNA分子包括為害蟲有機體的至少ー種靶基因的正義鏈的至少部分核苷酸序列的RNA互補體或表示其RNA等同物(equivalent)的至少ー種核苷酸序列，以使RNA分子在植物-害蟲相互作用時被害蟲吸收，所述RNA分子能夠通過RNA幹擾抑制靶基因或下調靶基因的表達。
[0050]術語「基因表達下調」和「基因表達抑制」可交換使用，並且是指在來自靶基因的蛋白質產物和/或mRNA產物水平上，基因表達的可測量或可觀察的減少，或可檢測的基因表達的完全消除。dsRNA對基因表達的下調效果可計算為與正常基因表達相比時的至少30%、40%、50%、60%，優選70%、80%，或甚至更優選90%或95%。根據靶基因的性質，昆蟲細胞中基因表達的下調或抑制可通過細胞或整`個昆蟲的表型分析，或者通過使用分子技術如RNA液相雜交(solution hybridization)、PCR、核酸酶保護、RNA 雜交(Northern hybridization)、反轉錄、利用微陣列的基因表達監控、抗體結合、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白質印跡(Western blotting)、放射免疫測定(RIA)、其他免疫測定或螢光激活細胞分析(FACS)測量mRNA或蛋白質表達來證實。
[0051]必需基因的下調導致生長抑制。取決於所使用的試驗，與已用對照dsRNA處理的害蟲有機體相比，生長抑制可定量為大於約5%、10%，更優選約20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%,最優選約90%、95%，或約99%。
[0052]「靶基因」可為期望受到抑制的必需的任何基因，因為其幹擾昆蟲的生長或病原性或感染性。例如，如果本發明的方法被用於防止昆蟲生長和/或侵擾，則優選篩選對昆蟲活力、生長、發育或生殖必需的靶基因，或者參與昆蟲病原性或感染性的任何基因，以致靶基因的特異性抑制導致致死表型或降低或停止昆蟲侵擾。
[0053]根據ー個非限制性實施方案，靶基因為當使用本發明的方法其表達下調或受抑制時昆蟲死亡或者昆蟲的生殖或生長停止或遲緩的此類靶基因。這種靶基因被認為是對昆蟲活力所必需的，並稱為必需基因。因此，本發明包括如此處所述的方法，其中所述靶基因為必需基因。
[0054] 在不受理論束縛下，靶基因為當其下調時使得昆蟲的侵擾或感染、昆蟲引起的損害、和/或昆蟲侵擾或感染宿主有機體和/或引起此類損害的能力降低的此類靶基因。術語「侵擾」(動詞，infest)和「感染」(動詞，infect)或者「侵擾」(名詞，infestion)和「感染」(名詞，infection)通常全文可交換使用。這種靶基因被認為參與昆蟲的病原性或感染性。因此，本發明延伸至此處所述的方法，其中所述靶基因參與昆蟲的病原性或感染性。選擇後ー種類型的靶基因的優勢在幹，阻斷昆蟲進ー步感染植物或植物部分，並且抑制形成下一代。
[0055]在防治特定昆蟲在宿主細胞或宿主有機體內或上生長或侵擾的dsRNA-介導的方法中，優選dsRNA不與任何宿主基因分享，或至少不與宿主的任何必需基因分享任何顯著同源性。由此而言，優選dsRNA顯示小於30%、更優選小於20%、更優選小於10%和甚至更優選小於5%的與與宿主細胞的任何基因的核酸序列同一『注。百分序列同一『丨生應以dsRNA區的全長計算。如果宿主有機體的基因組序列數據是可獲得的，則可使用標準生物信息學エ具再確認與dsRNA的序列同一性。在一個實施方案中，在dsRNA和宿主序列之間的21個鄰接核苷酸上沒有序列同一性，意味著由此而言，優選dsRNA的21個鄰接鹼基對未出現在宿主有機體的編碼序列(CDS)中。在另ー實施方案中，在dsRNA的24個鄰接核苷酸上與來自宿主物種的任何核苷酸序列的序列同一『丨生小於約10%或小於約12%。
[0056]dsRNA包括退火的互補鏈，其中之一具有與要下調的靶基因的靶核苷酸序列相對應的核苷酸序列。dsRNA的另ー鏈能夠與第一鏈鹼基配對。
[0057]靶昆蟲基因的「靶區」或「靶核苷酸序列」的表述可為基因的任何適合的區域或核苷酸序列。祀區應包括祀基因的至少17、至少18或至少19個連續核苷酸(consecutivenucleotide),更優選祀基因的至少20或至少21個核苷酸,仍更優選祀基因的至少22、23或24個核苷酸。
[0058]優選(至少部分)dsRNA將與昆蟲靶基因的靶區分享100%的序列同一性。然而，將理解，在雙鏈區全長上的100%序列同一性對於功能性RNA抑制不是必需的。相對於靶基因具有插入、缺失和單點突變的RNA序列也被發現對RNA抑制是有效的。
[0059]術語「對應幹」或「與……互補」在此可交換使用，並且當這些術語用於指dsRNA與革巴基因的祀區之間的序列對應性(sequence correspondence)時，它們可以相應地解讀為，即不絕對要求100%的序列同一性。然而，dsRNA與靶區之間的百分序列同一性通常為至少80%或85%同一，優選至少90%、95%、96%，或更優選至少97%、98%，並仍更優選至少99%。當兩條核酸鏈的至少85%的鹼基配對時，這兩條核酸鏈「基本上互補」。
[0060]本文所使用的術語「互補」涉及DNA-DNA互補、RNA-RNA互補和DNA-RNA互補的全部。在同此類推中，術語「RNA等同物」基本上是指在DNA序列中，鹼基「T」可由核糖核酸中通常存在的相應鹼基「U」所代替。
[0061]儘管dsRNA包含對應於靶基因的靶區的序列，但對應於靶區序列的整個dsRNA不是必要的。例如，dsRNA可包含位於特異性靶序列側翼的短的非靶區，條件是此類序列在RNA抑制中不對dsRNA的性能影響到實質程度(material extent)。
[0062]dsRNA可包含一種或多種置換鹼基以便優化在RNAi中的性能。如何依次改變dsRNA的各鹼基並(例如在適合的體外試驗體系中)測試所得dsRNA的活性從而優化所的dsRNA的性能，對於本領域普通技術人員來說將是顯而易見的。
[0063]dsRNA可進ー步包含DNA鹼基、非天然鹼基或糖-磷酸骨架的非天然骨架連接或修飾，從而例如增強保存期間的穩定性或增強被核酸酶降解的抗性。
[0064]約21bp的幹擾RNA (siRNA)對於基因沉默的是有用的。優選將dsRNA的長度增加到至少約SO-1OObp可提高dsRNA被害蟲有機體吸收的效率。此類較長的片段可在基因沉默中更加有效，可能是由於這些長dsRNA被無脊椎動物更有效地吸收。
[0065]由具有29bp莖區(stem)和2_nt3』突出端的27-mer平端的或短髮夾(sh)RNA的RNA雙鏈體(duplex)也可用作siRNA。因此，基於上述鑑定的靶標且為具有29bp莖區和2-nt3』突出端的27-mer平端或短髮夾(sh)RNA的靶標的分子也包括在本發明的範圍內。
[0066]因此，在一個實施方案中，dsRNA片段(或區域)本身將優選為至少17bp長，優選18或19bp長,更優選至少20bp,更優選至少21bp、或至少22b、或至少23bp、或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp長。「雙鏈RNA片段」或「雙鏈RNA區」的表述是指對應於靶基因(的部分)的dsRNA的小實體(entity)。
[0067]更普遍地，雙鏈RNA優選在約17_1500bp之間、甚至更優選在約80_1000bp之間，並最優選在約17-27bp之間或在約80-250bp之間；例如約17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、lOObp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、lOObp、llOObp、1200bp、1300bp、1400bp 或1500bp的雙鏈RNA區。
[0068]dsRNA長度的上限可取決於i) dsRNA被昆蟲吸收的要求和ii) dsRNA在細胞中被加エ成指導RNAi的片段的要求 。所選長度還可受到RNA合成方法和RNA運送至細胞的模式的影響。優選在本發明的方法中要使用的dsRNA將為小於10，OOObp長，更優選1000bp以下、更優選500bp以下、更優選300bp以下、更優選IOObp以下。對於任何給定的靶基因和昆蟲，為了有效抑制的dsRNA的最佳長度可通過實驗確定。
[0069]dsRNA可完全或部分雙鏈化。部分dsRNA可在雙鏈部分的一端或兩端包含短單鏈突出端，條件是RNA仍能夠被昆蟲吸收並指導RNAi。dsRNA還可包含內部非互補區。
[0070]本發明的方法包括向同一昆蟲同時或連續供給兩種或更多種不同的dsRNA或RNA構建體，以便實現多種靶基因的下調或抑制，或者實現單個靶基因更強有力的抑制。
[0071]可選地，通過提供中多種靶序列的ー種dsRNA來命中多種靶標，通過存在對應於靶基因的雙鏈RNA片段的超過ー個拷貝來更有效地抑制單個靶標。因此，在某些方面，dsRNA構建體包括多個dsRNA區，每ー個dsRNA區的至少一條鏈包括與昆蟲靶基因的靶核苷酸序列的至少部分互補的核苷酸序列。RNA構建體中的dsRNA區可與相同或不同的靶基因互補和/或dsRNA區可與來自相同或不同昆蟲物種的靶標互補。
[0072]術語「命中(hit、hits和hitting) 」是表示至少一條dsRNA鏈與祀基因或核苷酸序列互補並且其本身可結合至靶基因或核苷酸序列的可選詞彙。
[0073]在一個實施方案中，雙鏈RNA區包括與靶基因互補的核苷酸序列的多個拷貝。可選地，dsRNA命中相同靶基因的超過ー個靶序列。本發明因而包括包含與昆蟲靶標的核苷酸序列的至少部分互補的所述核苷酸序列的至少兩個拷貝的分離的雙鏈RNA構建體。
[0074]如本文所述的術語「多個(種)」是指至少兩個(種)、至少三個(種)、至少四個(種)、至少五個(種)、至少六個(種)等。[0075]「其它靶基因」或「至少ー種其它靶基因」的表述是指例如第二種、第三種或第四種
等革El基因。
[0076]開發命中超過ー種上述靶標的dsRNA或者與上述靶標不同的不同dsRNA的組合併用於本發明的方法。
[0077]雙鏈RNA中的dsRNA區(或片段)可如下組合:a)當靶向單個靶基因的多個dsRNA區組合時，它們可以在RNA構建體中以原始順序組合(即，其中所述區域出現在靶基因中的順序)山)可選地，片段的原始順序可忽略，以便它們以任何順序隨機或有意地顛倒(scrambled)和組合為雙鏈RNA構建體中；c)可選地,在dsRNA構建體中一個單獨片段可重複多次，例如1-10次，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或d) dsRNA區(靶向單個或不同革巴基因)可以以正義或反義方向組合。
[0078]靶向單個或不同弱基因(weak gene)的多個dsRNA區可組合來獲得更強的RNAi效果。「昆蟲特異性」基因或序列，例如癭蜂特異性、特別是Li或Om特異性基因和序列，包括當可通過生物信息學同源性檢索，例如通過BLAST檢索來確定時，在非昆蟲有機體中不具有實質上同源的對應物(counterpart)的基因。特異性靶基因的選擇產生種特異性RNAi效果，而對非IE標有機體(non-target organism)沒有效果或沒有實質(不利)效果。「保守基因」包括在靶標有機體和非靶標有機體之間保守(在胺基酸水平上)的基因。為了減少對非靶標物種可能的作用，分析此類有效但保守的基因，並選擇來自這些保守基因的可變區的序列被RNA構建體中的dsRNA區靶向。在核酸序列水平上評價保守性。此類可變區因而至少包括保守靶基因的在核酸序列水平上的保守部分。根據本發明的RNA構建體從不同的生物學途徑靶向多基因，導 致廣泛的細胞RNAi效果和更佳有效的昆蟲防治。在某些實施方案中，dsRNA由例如與蜜蜂直向同源物，例如但不限於SEQ ID N0:39_44和SEQ IDNO: 134-136中所列的本文所公開的Li和Om序列的蜜蜂直向同源的序列的同一性為80%以下的Li和Om轉錄組的序列構建。
[0079]在某些方面，dsRNA構建體構建有影響不同類型細胞功能的基因序列。此類細胞功能類型的實例包括，但不限幹，(i)蛋白質合成和代謝，(ii)RNA合成和代謝，和(iii)細胞進程。在某些實施方案中，dsRNA構建體包括來自前述各權利要求即三種類型的序列。在某些實施方案中，dsRNA構建體包括來自前述類型中的兩種類型，如蛋白質合成和代謝以及RNA合成和代謝；蛋白質合成和細胞進程；或RNA合成和代謝以及細胞進程的序列。
[0080]dsRNA區包括與本文所記載的任ー種靶基因的核苷酸序列的至少部分或一部分互補的至少一條鏈。然而，假如雙鏈RNA區之一包括與本文所記載的任ー種靶基因的核苷酸序列的一部分互補的至少一條鏈，則其它雙鏈RNA區可包括與任何其它昆蟲靶基因(包括已知的靶基因)的一部分互補的至少一條鏈。
[0081 ] 在某些構建體中，dsRNA可包括附加序列和任選的連接子。附加序列可包括，例如(i)促進dsRNA構建體大規模生產的序列；(ii)影響dsRNA穩定性的提高或降低的序列；
(iii)允許蛋白質或其他分子結合以促進RNA構建體被昆蟲吸收的序列；(iv)為結合昆蟲表面上或胞質中的受體或分子以促進被昆蟲吸收、內吞和/或胞轉的適配體(aptamer)的序列；或(V)催化dsRNA區加工的附加序列。在一個實施方案中，連接子為附有條件地自剪切RNA序列，優選pH敏感性連接子或疏水敏感性連接子。
[0082]dsRNA構建體的多個dsRNA區可直接連接或者通過ー個或多個連接子連接。連接子可存在於RNA構建體中的位點，將dsRNA區與另ー個感興趣區分隔。dsRNA構建體的多個dsRNA區可在沒有連接子的情況下連接。
[0083]當連接子存在時，其可用於斷開害蟲有機體中的較小的dsRNA區。有利地，在該情況下，連接子序列可在特定情況下促使長dsRNA分成較小的dsRNA區，導致在這些情況下分離的dsRNA區的釋放，並由這些較小的dsRNA區產生更有效的基因沉默。適合的附有條件的自剪切連接子的實例為在高PH條件下自剪切的RNA序列。此類RNA序列的適合的實例由 Borda 等人記載(Nucleic Acids Res.2003Mayl5 ;31 (10): 2595-600)，將該文獻引入於此以作參考。該序列源自錘頭狀核酶HH16的催化中心。
[0084]連接子還可定位於dsRNA構建體的位點，將dsRNA區與另一例如感興趣的附加序列分隔，所述感興趣的附加序列優選為RNA構建體提供某些附加功能。
[0085]dsRNA構建體可包括適配體以促進dsRNA被昆蟲吸收。將適配體設計結合被昆蟲吸收的物質。此類物質可來自昆蟲或植物來源。適配體的ー個具體實例為結合跨膜蛋白，例如昆蟲的跨膜蛋白的適配體。可選地，適配體可結合被昆蟲吸收的(植物)代謝物或營養素。
[0086]連接子可在內涵體中進行自剪切。當本發明的構建體經胞吞或胞轉被昆蟲吸收，並且因而在昆蟲物種的內涵體中被區室化時這可是有利的。內涵體可具有低PH環境，導致連接子的剪切。
[0087]當疏水條件下自剪切的連接子用於經細胞壁運輸從ー個細胞轉移至另ー個細胞時，例如當穿過有害昆蟲有機體的細胞壁時，其在dsRNA構建體中特別有用。
[0088]內含子可用作連接子。本文所使用的「內含子」可為信使RNA的任何非編碼RNA序列。
·[0089]還可將範圍在約I鹼基對至約10，000鹼基對的非互補性RNA序列用作連接子。
[0090]在不希望受任何特定理論或機理的束縛下，認為長dsRNA被昆蟲從它們的附近環境中吸收。dsRNA被吸收進入腸並轉移至腸上皮細胞，然後在細胞中通過內源核酸內切酶的作用加工成短dsRNA，稱為小幹擾RNA (siRNA)。所得siRNA然後通過形成稱為RISC或RNA幹擾沉默複合體的多組分RNase複合體來介導RNAi。
[0091]為了實現昆蟲細胞內靶基因的下調，添加至細胞壁外部的dsRNA可為可吸收進入細胞，接著在細胞內加工成siRNA，進而介導RNAi的任何dsRNA或dsRNA構建體，或者添加至細胞外部本身可為可吸收進入細胞且從而指導RNAi的siRNA的RNA。
[0092]siRNA通常為長度在19-25鹼基對或20_24鹼基對範圍內的短的dsRNA。在優選實施方案中，可使用對應於要下調的靶基因，具有19、20、21、22、23、24或25個鹼基對、特別是21或22個鹼基對的siRNA。然而，本發明不意欲限制此類siRNA的用途。
[0093]siRNA可包括在雙鏈部分的側翼的一端或兩端的單鏈突出端。siRNA可包含3』突出核苷酸，優選兩個3』突出胸苷(dTdT)或尿苷(UU)，如果包括在dsRNA雙鏈部分中的序列的緊接上遊靶基因序列為AA，則3』TT或UU突出端可包括在siRNA中。這使得siRNA中的TT或UU突出端與靶基因雜交。儘管3』 TT或UU突出端還可位於siRNA的另一端，但是包括在siRNA雙鏈部分中序列的靶序列的下遊序列不必具有AA。由此而言，為RNA/DNA嵌合體的siRNA也是預期的。這些嵌合體包括，例如如上所述包括具有DNA鹼基3』突出端(如，dTdT)的dsRNA以及為其中ー個或多個RNA鹼基或核糖核苷酸、甚至整個鏈上的所有核糖核苷酸被DNA鹼基或脫氧核糖核苷酸代替的多聚核苷酸的dsRNA的siRNA。
[0094]dsRNA可由兩個單獨的(正義和反義)RNA鏈通過(非共價)鹼基配對退火在一起而形成。可選地，dsRNA可具有折回莖-環或髮夾結構，其中dsRNA的兩個退火鏈共價連接。在該實施方案中，dsRNA的正義和反義鏈由部分自補的單個多核苷酸分子的不同區域形成。如果dsRNA通過在體內例如在宿主細胞或有機體中表達,或者通過體外轉錄來合成，則具有該結構的RNA是便利的。連接兩個RNA鏈的「環」的確切性質和序列，除了不應損害分子的雙鏈部分介導RNAi的能力以外，對本發明通常是不重要的。用於RNAi的「髮夾」或「莖-環」 RNA的特徵通常是本領域已知的(例如參見WO 99/53050，將其內容引入於此以作參考)。在本發明的其他實施方案中，環結構可包括如上所述的連接子序列或附加序列。
[0095]在某些方面，本文公開的Li和Om序列及此類序列的互補體還可通過使用本領域內已知的方法表達反義RNA或過表達正義RNA來用於抑制Li或Om核酸的表達。所述已知方法，參見例如 Frizzi 等，Plant Biotech J, (2010) 8:655-677 ;Brodersen 等，Trends inGenetics, (2008)22:268-280 ;和美國專利5，759，829號。使用本文所述的表達元件、載體和方法，針對Li和Om靶基因的反義RNA或正義RNA在桉樹植物中表達。在被Om或Li害蟲攝食後，反義或正義RNA抑制靶基因的表達，從而防治害蟲侵擾。 [0096]用於設計dsRNA構建體的靶核苷酸序列優選至少17個，優選至少18、19、20或21個，更優選至少22、23或24個核苷酸長。優選的靶核苷酸序列的非限制性實例示於實施例中。
[0097]靶序列可包括與本文所述序列同源的序列。靶基因的同源物可使用本領域普通技術人員公知的方法來發現。優選的同源物為包括與本文所公開的序列的同一性為至少約85%或87.5%、仍更優選至少約90%、仍更優選至少約95%和最優選至少約99%或99.9%的序列的基因，或其互補體。用於確定序列同一性的方法在本領域是常規的，並包括使用 Blast 軟體和 EMBOSS 軟體(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(2000), Rice, P.Longden,1.和 Bleasby, A.Trends in Geneticsl6, (6)pp276_277)。本文所使用的術語「同一性」是指核苷酸水平上序列之間的關係。「％同一性」的表述通過在比較窗口上比較例如兩個或更多個最佳比對序列來確定，其中比較窗口中的序列部分可包括與序列最佳比對用參考序列相比的插入或缺失。參考序列不包括插入或缺失。參考窗ロ選自至少10個鄰接核苷酸至約50、約100或至約150個核苷酸之間，優選選自約50和150個核苷酸之間。然後通過確定窗口中序列之間相同的核苷酸數，將相同的核苷酸數除以窗ロ中的核苷酸數，再乘以100來計算「百分率同一性」。
[0098]術語「選擇性雜交」包括涉及在嚴格雜交條件下的核酸序列與特定核酸靶序列的雜交使得可檢測程度大於其與非靶核苷酸序列的雜交(例如相對於背景至少2倍)，並基本上排除非靶核酸。選擇性雜交序列典型地彼此具有約至少40%的序列同一性，優選60-90%的序列同一『丨生，和最優選100%的序列同一『注(即，互補)。
[0099]術語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」包括涉及在該條件下探針將與其靶序列雜交使得可檢測程度大於其他序列(例如，相對於背景至少2倍)的條件。嚴格條件是序列依賴的並且由不同環境而不同。通過控制雜交的嚴格性和/或洗滌條件，可識別可與探針達100%互補的靶序列(同源探測)。可選地，可調整嚴格條件來允許序列中的某些錯配從而檢測較低程度的相似性(異源探測)。最佳地，探針長度為約500個核苷酸，但長度可從小於500個核苷酸至等於靶序列全長大幅變化。
[0100]典型地，嚴格條件將是其中在pH7.0至8.3和溫度為至少約30 (短探針，例如10至50個核苷酸)和至少約60°C (長探針，例如大於50個核苷酸)下鹽濃度小於約1.5M Na離子，典型地約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽)的那些。嚴格條件還可添加去穩定劑如甲醯胺或Denhardt』 s來實現。示例性低嚴格條件包括用在37°C下的30至35%甲醯胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩衝溶液雜交並在50至55°C下的IX至2X SSC (20XSSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性溫和嚴格條件包括在37°C下的40至45%甲醯胺、IM NaCl、l%SDS中雜交並在55至60°C下的0.5X至IX SSC中洗滌。示例性高嚴格條件包括在37°C下的50%甲醯胺、IM NaCl、l%SDS中雜交並在60至65°C的0.1X SSC中洗滌。
[0101]特異性典型地起到後雜交洗滌的作用，關鍵因素為最終洗滌液的離子強度和溫度。對於 DNA-DNA 雜交，！?可從 Meinkoth 和 Wahl, (1984)Anal.Biochem., 138:267-84 等式估算:Tm=81.5°C +16.6 (log M) +0.41 (%GC) -0.61 (%form)-500/L ;其中 M 為單價陽離子的摩爾濃度，%GC為鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，%form為甲醯胺在雜交液中的百分比，和L為鹼基對中雜交體的長度。、為(在確定的離子強度和pH下)其中50%的互補靶序列與優選匹配的探針雜交的溫度。Tm相對於每1%的錯配降低約1°C;因此，可調整Tm、雜交和/或洗滌條件來與期望同一性的序列雜交。例如，如果搜尋到>90%同一性的序列，Tm可降低10°C。通常，嚴格條件選擇在確定的離子強度和pH下比特異序列及其互補體的熱熔點(Tm)低約5°C。然而，非常嚴格條件可在比熱熔點(Tm)低1、2、3或4°C下用於雜交和/或洗滌；溫和嚴格條件可在比熱熔點(Tm)低6、7、8、9或10°C下用於雜交和/或洗滌；低嚴格條件可在比熱熔點(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下用於雜交和/或洗滌。使用該等式、雜交和洗滌組成以及期望的！，普通技術人員將理解雜交和/或洗滌液的嚴格性的變化是固有描述。如果期望的錯配程度產生低於45°C (水溶液)或32°C (甲醯胺溶液)的Tm，則優選增加SSC濃度以便可 使用更高的溫度。
[0102]對核酸雜交的廣義指導見Ti jssen, Laboratory Techniques in Bihemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章，「Overview of principles oi hybridization and tne strategy of nucleic acid probeassays」，Elsevier, N.Y.(1993);和 Current Protols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等，eds, Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)。除非另有說明，在本申請中，高嚴格性定義為在65°C下的4X SSC、5X Denhardt』 s (500ml水中5g聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸的鮭魚精子DNA和25mM磷酸鹽鈉中雜交和在65°C下的0.1X SSC、0.1%SDS中洗滌。
[0103]dsRNA可通過宿主細胞或宿主有機體表達(例如在其中轉錄)。宿主細胞或有機體可以是或可以不是對昆蟲侵擾敏感或易受其侵害的宿主細胞或有機體。如果宿主細胞或有機體為對昆蟲侵擾敏感或易受其侵害的宿主細胞或有機體，作為控制昆蟲在宿主有機體內或上生長和/或防止或減少宿主有機體的昆蟲侵擾的機理，可使用RNAi介導的ー種或多種靶基因在昆蟲中的基因沉默。因此，dsRNA在宿主有機體的細胞內的表達可因此賦予對特定昆蟲或對ー類昆蟲的抗性。假如dsRNA命中超過ー個昆蟲靶基因，dsRNA在宿主有機體的細胞中的表達可賦予對超過ー個昆蟲或超過ー類昆蟲的抗性。[0104]在優選的實施方案中，宿主有機體為植物，昆蟲為植物病原昆蟲。在該實施方案中，通過在受植物昆蟲侵擾或對昆蟲侵擾敏感或被植物昆蟲攝食的植物、植物組織或植物細胞中表達dsRNA而使昆蟲與dsRNA相接觸。優選的植物宿主有機體為桉樹。桉樹的實例包括，但不限於以下物種:葡萄桉(E.botryoides)、蘋果桉(E.bridge si ana)、赤按(E.camaldulensis)、灰按(E.cinerea)、藍按(E.globule)、巨按(E.grandis)、西達按(E.gunii)、尼克爾按(E.nicholii)、圓葉按(E.pulverulenta)、大葉按(E.robusta)、野按(E.rudis)、柳葉按(E.saligna)、細葉按(E.Tereticornis)、尾葉按(E.Urophilla)、多枝桉(E.viminalis)和前述物種的任一種特別是巨桉和尾葉桉的雜交種。優選的植物病原昆蟲為癭蜂，例如Li或Om。
[0105]術語「植物」包括期望處理以防止或減少昆蟲生長和/或昆蟲侵擾的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如種子、插條、接枝、外植體等，以及植物細胞和組織培養物。植物材料應當表達對應於昆蟲的ー種或多種靶基因的dsRNA或具備表達對應於昆蟲的一種或多種祀基因的dsRNA的能力。
[0106]在某些方面，本發明提供表達或能夠表達至少ー種dsRNA的植物，優選轉基因植物、或(轉基因)植物用繁殖或生殖材料、或植物細胞培養物，其中dsRNA包括退火的互補鏈，其中之一具有與昆蟲的靶基因的至少部分靶核苷酸序列互補的核苷酸序列，以便使dsRNA在植物-昆蟲相互作用時被昆蟲吸收，所述雙鏈RNA能夠通過RNA幹擾抑制靶基因或下調靶基因的表達。靶基因可為本文所述靶基因的任ー種，例如昆蟲活力、生長、發育或生殖所必須的靶基因。
[0107]植物可以以在一種或多種細胞、細胞類型或組織中活躍表達(轉錄)dsRNA的形式提供。可選地，植物可為「能夠表達」的，意指其利用編碼期望的dsRNA的轉基因轉化，但當提供該植物吋(並且以其 中提供植物的形式)轉基因在該植物中不活躍。包括編碼dsRNA或dsRNA構建體的核苷酸序列的重組DNA構建體可因而可操作地連接至至少ー個調控序列。優選地，調控序列選自包括如下所述的組成型啟動子或組織特異性啟動子的組。
[0108]靶基因可為本文所述的任ー種靶基因。優選地，調控元件為在植物細胞中活躍的調控元件。更優選地，調控元件源自植物。術語「調控序列」將在廣義上理解，井指能夠影響可操作地連接的序列表達的調控核酸。
[0109]前述術語包括啟動子和激活或增強核酸的轉錄的所謂的激活子或增強子的核酸或合成融合分子或其衍生物。本文所使用的術語「可操作地連接」是指啟動子序列與目標基因之間的功能性連接，以使啟動子序列能夠起始目標基因的轉錄。
[0110]舉例來說，編碼dsRNA的轉基因核苷酸序列可位於誘導性或者生長或發育階段-持異性啟動子控制下，通過添加誘導型啟動子的誘導物或當達到生長或發育特定階段時所述啟動子允許dsRNA轉錄的開啟。
[0111]可選地，編碼dsRNA的轉基因位於強組成型啟動子如選自包括CaMV35S啟動子、CaMV35S雙啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶(rubisco)啟動子、G0S2啟動子、玄參花葉病毒(Figwort mosaic virus, FMV) 34S啟動子、木薯葉脈(cassayavein)花葉病毒(CsVMV)啟動子的組的任一種的調控下(Verdaguer B.等，Plant Mol.Biol.199837(6):1055-67)。
[0112]可選地，編碼dsRNA的轉基因位於組織特異性啟動子如選自包括編碼PsMTA類型III幾丁質酶基因的根特異性啟動子，光合組織特異性啟動子如cabl和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LSl蛋白的啟動子，JAS啟動子，查耳酮合成酶啟動子和來自草莓的RJ39的啟動子的組的任ー種的調控下。
[0113]編碼dsRNA的轉基因還可位於昆蟲誘導型啟動子，例如馬鈴薯蛋白酶抑制劑II (PinII)啟動子(Duan X 等，Nat.Biotechnol.1996，14 (4): 494-8));或傷害誘導型啟動子，例如茉莉酸(jasmonate)和乙烯誘導型啟動子、F1DFl.2啟動子(Manners J M等，Plant Mol.Biol.1998, 38 (6): 1071-80)的調控下；或者防禦相關的啟動子，例如水楊酸誘導型啟動子和植物病原相關蛋白(PR蛋白)啟動子(PRl啟動子(Cornelissen B J等，Nucleic Acids Res.1987，15(17):6799-811 ；C0MT 啟動子(Toquin V 等，Plant Mol.Biol.2003，52(3):495-509)下。
[0114]當使用本文所述的方法用於開發抗昆蟲的轉基因植物吋，將編碼dsRNA的核酸位於組織特異性啟動子控制下可以是有益的。為了改善dsRNA從植物細胞向昆蟲的轉移，植物可優選在首先被植物害蟲接近或破壞的植物部分表達。在植物病原性昆蟲的情況下，優選的表達dsRNA的組織為葉、莖、根和種子。因此，在本文所公開的方法中，可使用植物組織-優選的啟動子，例如葉特異性啟動子、莖特異性啟動子、韌皮部特異性啟動子、木質部特異性啟動子、根特異性啟動子或種子特異性啟動子(蔗糖轉運蛋白基因(sucrosetransporter gene) AtSUC 啟動子(Baud S 等，Plant J.2005，43 (6):824-36)、小麥高分子量麥谷蛋白基因啟動子(Robert L S 等，Plant Cell.1989，I (6):569-78.))。
[0115]根特異性啟動子的適合的實例為PsMTA(Fordam-Skelton，A.P.，等，1997PlantMolecular Biology34:659_668.)和類型III幾丁質酶啟動子。同樣被光活化的葉和莖特異性或光合組織特異性啟動子的實例為來自甜菜的兩種葉綠素結合蛋白(cabl和cab2)的啟動子(Stahl D.J.,等，2004BMC Biotechnology20044:31)、由;rbcS 編碼的核酮糖-二憐酸羧化酶(Rubisco) (Nomura M.等,2000Plant Mol.Biol.44:99-106)、葉綠體甘油醛-3-磷酸脫氫酶A(gapA)和B(gapB)亞單位(Conley T.R.等? 1994Mol.Cell.Biol.19:2525-33 ；Kwon H.B.等.1994Plant Physiol.105:357-67)、編碼葉和莖特異性蛋白的馬鈴薯(Solanum tuberosum)基因的啟動子(Zaidi M.A.等，2005TransgenicRes.14:289-98)、莖調控的防禦誘導性基因，如JAS啟動子(專利公布號20050034192/US-A1)。花特異性啟動子的實例為例如，查耳酮合成酶啟動子(Faktor 0.等.1996PlantMol.Biol.32:849)，果實特異性啟動子的實例為例如來自草莓的RJ39 (W0 9831812)。
[0116]使用用於表達dsRNA的其他啟動子，其包括但不限於來自RNA Poll.RNA PoIURNAPolII1、I7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的啟動子。這些啟動子典型地用於體外生產dsRNA，之後將dsRNA誘導入抗殺蟲劑，例如誘導入抗殺蟲液、噴霧劑或粉劑中。
[0117]本文所描述的dsRNA或RNA構建體可通過以下步驟產生:(i)使分離的核酸或重組DNA構建體與無細胞組分接觸；或(ii)在允許核酸或重組DNA構建體轉錄的條件下將分離的核酸或重組DNA構建體導入(例如，通過轉化、轉染或注射)細胞中，從而產生dsRNA或RNA構建體。
[0118]任選地，還可將一種或多種轉錄終止序列引入重組構建體中。術語「轉錄終止序列」包括轉錄單元末端的控制序列，其傳導初級轉錄本的3』加工和多聚腺苷醯化以及轉錄終止的信號。可將額外的調控元件，例如轉錄或翻譯增強子引入表達構建體中。[0119]重組構建體可進一步包括特定的細胞類型中保持和/或複製所需的複製起點。一個實例為當需要表達構建體作為細胞中的附加型遺傳元件(例如，質粒或柯斯質粒分子) 保持於細菌細胞中時，優選的複製起點包括，但不限於fl-ori和colElori。
[0120]重組構建體可任選地包括選擇標記基因。如本文所述，術語「選擇標記基因」包括任一種基因，其在細胞上賦予表型，其中該基因的表達促進轉染或轉化有本發明的表達構建體的細胞的識別和/或選擇。適合的選擇標記的實例包括抗氨苄青黴素(Amp1O、四環素 (Tc1)、卡那黴素(Kan1)、膦絲菌素(phosphinothricin)和氯黴素(CAT)基因的抗性基因。 其它適合的標記基因提供代謝特性，例如manA。還可使用可視化標記基因，並且包括例如
3-葡糖醛酸酶(GUS)、螢光素酶和綠色螢光蛋白(GFP)。
[0121]已穩定轉化有編碼dsRNA的轉基因的植物可提供為不活躍表達dsRNA但具有活躍表達dsRNA的能力的種子、生殖材料、繁殖材料或細胞培養材料。植物可以以其中在一種或多種細胞、細胞類型或組織中活躍表達(轉錄)RNA分子的形式提供。可選地，植物可為「能夠表達」的，意指利用編碼期望的RNA分子的轉基因轉化，但當提供該植物時(並且以其中提供植物的形式)轉基因在該植物中不活躍。許多載體可用於該目的，並且適合的載體的選擇將主要取決於插入載體的核酸大小和要轉化有載體的特定宿主細胞。
[0122]出於RNAi的目的在植物中表達外源dsRNA的通用技術是本領域已知的(參見 Baulcombe D, 2004, Nature.431 (7006):356-63.RNA silencing in plants,將其內容共引入於此以作參考)。更特別地，出於下調植物害蟲如線蟲或昆蟲中的基因表達的目的而在植物中表達dsRNA的方法也是本領域已知的。類似的方法可以以類似的方式應用，從而在植物中表達dsRNA用於下調植物病原昆蟲中靶基因的表達。為了實現該效果，對於植物來說， 必須僅在要與昆蟲接觸的植物的部分表達(轉錄)dsRNA，由此dsRNA可被昆蟲吸收。取決於昆蟲的性質及其與宿主植物的關係，dsRNA的表達可發生在昆蟲在其生命周期期間存在的植物細胞或組織內，或者RNA可分泌至細胞之間，例如在昆蟲的生命周期期間被昆蟲佔據的質外體。此外，dsRNA可位於植物細胞如細胞溶膠中，或者位於植物細胞細胞器如葉綠體、線粒體、液泡或內質網中。
[0123]發育期間，癭蜂幼蟲由於攝食(例如攝食質外體)或細胞溶解而暴露於細胞外環境以及細胞內的內容物。因此，癭蜂幼蟲可暴露於存在於癭瘤細胞中的dsRNA或由癭瘤內部或周圍的細胞分泌的dsRNA。
[0124]可選地，dsR NA可由植物細胞分泌,並由植物分泌至植物外部。由此,dsRNA可在植物表面上形成保護層。
[0125]在另一方面，本發明還提供用於預防或保護植物免受害蟲侵擾的方法和組合物的組合。例如，一種手段提供使用植物轉基因方法與使用dsRNA分子表達的方法和使用此類 Bt殺蟲蛋白表達的方法相結合。
[0126]在進一步的實施方案中，本發明涉及用於控制昆蟲生長和/或防止或減少昆蟲侵擾的組合物，其至少包括包含至少一種dsRNA的植物部分、植物細胞、植物組織或種子，其中所述dsRNA包括退火的互補鏈，其中之一具有與昆蟲靶基因的至少部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。任選地，組合物進一步包括至少一種適合的載體、賦形劑或稀釋劑。靶基因可為本文所述的任何靶基因。優選地，昆蟲靶基因對於昆蟲的活力、生長、發育或生殖是必須的。[0127]其中術語「一種」在「一種靶基因」的語境中使用，這是指「至少一種」靶基因。對於「一種」靶有機體是指「至少一種」靶有機體，和「一種」 RNA分子或宿主細胞是指「至少一種」 RNA分子或宿主細胞同樣適用。
[0128]根據一個實施方案，本發明的方法依賴於存在於昆蟲外部的dsRNA被昆蟲吸收 (如，進食)，並且不需要在昆蟲細胞內表達dsRNA。此外，本發明還包括如上所述的其中昆蟲與包括dsRNA的組合物接觸的方法。癭蜂幼蟲典型地不在癭瘤外部進食，因而優選經轉基因植物材料將癭蜂幼蟲暴露於dsRNA。
[0129]本發明進一步提供用於下調靶有機體(其能夠攝食植物、植物部分、植物細胞或種子)中至少一種靶基因表達的方法，所述方法包括向靶有機體餵養植物、植物部分、植物細胞或種子，所述植物、植物部分、植物細胞或種子表達dsRNA。
[0130]在更優選的方面，本發明提供用於下調靶有機體(其能夠攝取宿主細胞或其提取物)中至少一種靶基因的方法，所述方法包括向靶有機體餵養宿主植物、植物部分、植物細胞或種子，所述宿主植物、植物部分、植物細胞或種子表達dsRNA，所述dsRNA包括與至少一種靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物互補或表示至少一種靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的核苷酸序列，從而宿主植物、植物部分、植物細胞或種子被靶有機體的攝食引起和/或導致至少一種靶基因的表達下調。
[0131]本發明提供如本文所定義的植物、植物部分、植物細胞或種子用於下調昆蟲靶基因表達的用途。在更詳細的方面，本發明提供如本文所定義的宿主細胞和/或包括核苷酸序列的RNA分子用於下調靶基因表達的用途，所述核苷酸序列包括來自靶有機體的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的RNA互補體或表示來自靶有機體的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物，所述包括核苷酸序列的RNA分子通過，例如在商品製造時，在植物、植物部分、植物細胞或種子中轉錄核酸分子來生產。
[0132]根據一個實施方案，本發明的方法依賴於遺傳改良生物(GMO)法，其中dsRNA通過受昆蟲侵擾或對昆蟲侵擾敏感的細胞或有機體表達。優選地，所述細胞為植物細胞或所述有機體為植物。
[0133]對於siRNA介導的昆蟲基因的下調，dsRNA直接或間接地引入和/或表達於昆蟲細胞中。dsRNA可人工添加至昆蟲食物或通過轉基因食物來源如細菌和植物來生產[2，8]。 包含昆蟲基因特異性序列的反向重複RNA被轉基因植物轉錄，可將其加工成dsRNA並稍後加工成siRNA(為沉`默通路中的第一產物的小幹擾RNA)。消化此類轉基因植物的昆蟲受植物合成的dsRNA和siRNA的影響[5]。該昆蟲防治法可用於保護植物有效對抗特定的害蟲 [2，8]。然而，不需要在植物材料中將dsRNA加工成siRNA。dsRNA可被有害昆蟲攝食並在昆蟲細胞內首次加工成siRNA。
[0134]用於向植物引入外源基因的許多方法是已知的，並可用於將NT多核苷酸插入植物宿主中，包括生物學和物理植物轉化法。例如，參見Miki等,「Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants, 」in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds.，CRC Press,Inc.，Boca Raton, pp.67-88 (1993)。所選方法根據宿主植物而變化，並包括化學轉染法如磷酸鈣、微生物介導的基因轉移如農桿菌屬(Horsch等，Science 227:1229-31 (1985))、電穿孔、顯微注射和生物射彈轟擊(biolistic bombardment)。[0135]用於植物細胞或組織轉化和植物再生的表達盒和載體以及體外培養方法是已知且可獲得的。參見例如 Gruber 等，「Vectors for Plant Transformation，」in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，supra，pp.89—119。
[0136]分離的多核苷酸或多肽可通過一種或多種典型用於直接遞送進入細胞的技術引入植物中。此類方法可取決於基因修飾所靶向的有機體、細胞、植物或植物細胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物而變化。適合的轉化植物細胞的方法包括顯微注射(Crossway， 等，(1986)Biotechniques4:320-334 ；和 U.S.Pat.N0.6，300，543)、電穿孔 (Riggs,等， (1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606、直接基因轉移(Paszkowski 等，(1984) EMBO J.3:2717-2722)和彈道粒子加速(參見，例如Sanford，等，美國專利號4，945，050 ; WO 91/10725 ；和 McCabe,等，(1988)Biotechnology6:923-926)。還參見，Tomes 等， 「Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment，，.第 197-213 頁，Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, eds.0.L Gamborg&G.C.Phillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg N.Y.，1995 ;美國專利號 5，736，369 (分生組織)；Weissinger,等，(1988) Ann.Rev.Genet.22:421-477 ；Sanford, 等，(1987) Particulate Science and Technology5:27-37 (洋蔥)；Christou,等，(1988) Plant Physiol.87:671-674(大豆)；Datta，等，(1990) Biotechnology8:736-740 (水稻);Klein，等，(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309 (玉米)；Klein，等， (1988)Biotechnology6:559-563(玉米)；W091/10725(玉米)；Klein，等，(1988) Plant Physiol.91:440-444 (玉米)；Fromm，等，(1990)Biotechnology8:833_839 ; 和 Gordon-Kamm，等，(1990)Plant Cel12:603-618 (玉米)；Hooydaas_Van Slogteren&Hooykaas (1984)Nature (英國)311:763-764 ;Bytebierm，等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349 (Liliaceae) ；De Wet,等，(1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.G.P.Chapman,等，pp.197-209.Longman，N.Y.(花粉)；Kaeppler，等，(1990)Plant Cell Reports9:415-418 ；和 Kaeppler，等，(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶須介導的轉化)；美國專利號5，693，512 (聲處理)； Dj Halluinj 等，(1992)Plant Cell4:1495-1505 (電穿孔)；Li,等，(1993)Plant Cell Reportsl2:250-255 ；和 Christou and Ford, (1995)Annals of Botany75:407-413 (水稻)；0sjoda，等，(1996)Nature Biotech.14:745-750 ;農桿菌介導的玉米轉化(美國專利號 5，981，840);碳化矽晶須法(Frame,等，(1994)Plant J.6:941-948);雷射法(Guoj 等，(1995)Physiologia Plantarum93:19-24);聲處理法(Baoj 等，(1997) Ultrasound in Medicine&Biology23:953-959 ；Finer and Finer, (2000)Lett Appl Microbiol.30:406-10 ；Amoah,等，(2001) J Exp Bot52:1135-42);聚乙二醇法(Krens,等， (1982)Nature296:72-77);單子葉和雙子葉植物細胞的原生質可使用電穿孔(Fromm，等， (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:5824-5828)和顯微注射(Crossway,等，(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185)轉化；將其所有引入於此以作參考。
[0137]用於將表達載體引入植物的最廣泛利用的方法是基於農桿菌的自然轉化系統。根癌農桿菌(A.tumefaciens)和毛根農杆 菌(A.rhizogenes)為植物病原土壤細菌，其在遺傳學上轉化植物細胞。根癌農桿菌和毛根農桿菌的Ti和Ri質粒分別攜帶負責植物遺傳轉化的基因。參見，例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sc1.10:1。農桿菌載體系統和農桿菌介導的基因轉移的方法的描述提供於Gruber,等,上述；Miki,等,上述JPMoloney,等，(1989) Plant Cell Reports8:238。
[0138]類似地，基因可插入分別來源於根癌農桿菌或毛根農桿菌的Ti或Ri質粒的T-DNA 區。因此，表達盒可使用這些質粒如上構建。已知許多調控序列當其與異源編碼序列結合併轉化至宿主有機體中時相對於原始編碼序列的組織/器官特異性在基因表達中顯示保真性。參見例如Benfey和Chua, (1989) Science244:174-81。特別適合的用於這些質粒的調控序列為在各種靶植物中的基因的組成型葉特異性表達的啟動子。其它有用的調控序列包括來自胭脂鹼合酶基因(NOS)的啟動子和終止子。NOS啟動子和終止子存在於質粒 pARC2,可由美國模式培養物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得並指定為ATCC67238。如果使用此類系統，則來自Ti或Ri質粒的毒性(vir)基因也必須與T-DNA 部分或者經其中vir基因存在於單獨載體的二元體系而存在。在其中使用的此類系統、載體和轉化植物細胞的方法記載於美國專利4，658，082號；1986年10月I日提交的美國專利申請系列號913，914，參考1993年11月6日公布的美國專利5，262，306號;和Simpson, 等，(1986)Plant Mol.Biol.6:403_15m，將其全部內容引入於此以作參考。
[0139]一旦構建，這些質粒可置於毛根農桿菌或根癌農桿菌中以及用於轉化通常對鐮刀菌屬(Fusarium)或鏈格孢屬(Alternaria)感染敏感的植物物種的細胞的這些載體中。根癌農桿菌或毛根農桿菌的選擇將取決於由此轉化的植物。通常根癌農桿菌是優選的轉化用有機體。大多數雙子葉植物、一些裸子植物和少數單子葉植物(如百合目(Liliales) 和天南星目(Arales)的某些成員)對根癌農桿菌感染敏感。毛根農桿菌還具有廣泛的宿主範圍，包含大多數雙子葉植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科 (Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成員。如今可轉化單子葉植物已取得了一些成功。歐洲專利申請604 662 Al號公開了使用農桿菌轉化單子葉植物的方法。歐洲專利申請672 752 Al號公開了使用未成熟胚胎的盾片(scutellum)利用農桿菌轉化單子葉植物的方法。Ishida等討論了通過將未成熟胚胎暴露於根癌農桿菌來轉化玉米的方法(Nature Biotechnologyl4:745-50(1996))。
[0140]一旦轉化，這些細胞可用於再生轉基因植物。例如，可通過造成植物創傷然後將載體引入傷口部位，用這些載體感染整個植物。植物的任何部分可造成創傷，包括葉、莖和根。可選地，外植體形式的植物組織，例如子葉組織或葉盤可接種這些載體，並在促進植物再生的條件下培養。通過用包含編碼伏馬菌素(fumonisin)降解酶基因的毛根農桿菌或根癌農桿菌接種植物組織而轉化的根或嫩枝可用作植物組織來源，從而經體細胞胚胎發生或器官發生來再生伏馬菌素-抗性轉基因植物。此類用於再生植物組織的方法的實例公開於 Shahin, (1985) Theor.Appl.Genet.69:235-40 ;美國專利號 4，658，082 ；Simpson,等，上述； 和美國專利申請913，913和913，914號，二者均於1986年10月I日提交，參考1993年11 月16日公布的美國專利5，262，306號，將其中全部公開內容引入於此以作參考。
[0141]作為農桿菌-介導的轉化的替代方法已開發了幾種植物轉化方法(統稱為直接基因轉移)。
[0142]植物轉化的普遍適用的方法為微粒-介導的轉化，其中地尺寸為約I至4iim的微粒表面上攜帶DNA。利用將微粒加速至300至600m/s速度，足以穿透植物細胞壁和膜的生物射彈裝置(biolistic device)將表達載體引入的植物組織(Sanford,等，(1987)Part.Sc1.Technol.5:27 ；Sanford, (1988)Trends Biotech6:299 ；Sanford, (1990)Physiol.Plant79:206 ;和 Klein,等，(1992)BiotechnologylO:268)。
[0143]物理遞送DNA至植物的另一方法為如Zang等描述的靶細胞的聲處理((1991) BioTechnology9:996)。可選地,脂質體或原生質體融合已用於將表達載體引入植物中。參見例如 Deshayes 等，(1985) EMBO J.4:2731 ;和 Christou,等，(1987) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:3962。也已報導了使用CaC12沉澱、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接吸收進入原生質體中。參見例如 Hain 等，(1985)Mol.Gen.Genet.199:161 ;和 Draper 等，(1982) Plant Cell Physiol.23:451。
[0144]還已記載了原生質體和整個細胞和組織的電穿孔。參見例如Donn等，(1990) Abstracts of the VIIth Int' 1.Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53 ;D，Halluin 等，(1992)Plant Cell4:1495-505 ;和 Spencer 等，(1994) Plant Mol.Biol.24:51-61。
[0145]穩定轉化後，進行植物繁殖。最常見的植物繁殖方法是通過種子。然而，通過種子繁殖的再生具有由於因種子根據孟德爾法則支配的遺傳變化由植物產生，所以使作物中缺少均勻性的雜合性引起的缺陷。基本上，每個種子在遺傳學上是不同的，且每個將以其自身特有的特徵生長。因此，優選轉化植物以使再生植物具有親本轉基因植物同一的特徵和特性這樣的方式產生。
[0146]轉化植物可通過微體繁殖(micropropagation)來再生,所述微體繁殖提供轉化植物的迅速、一致的生殖。微體繁殖為由從選擇的親本植物或培養植物中切離的單塊組織長成新一代植物的方法。該方法允許具有表達融合蛋白的優選組織的植物的規模化繁殖。 所產生的新一代植物在遺傳學上與原始植物同一，並具有原始植物所有的特性。微體繁殖使得優質植物材料在短時間內規模化生產，並使所選栽培植物快速增殖，保留原始轉基因或轉化植物的特性。克隆植物的優勢為植物增殖速度和所產生植物的品質和一致性。
[0147]微體繁殖為多階段步驟，需要在階段之間改變培養基或生長條件。因此，微體繁殖方法涉及四個基本階段:階段一，初始組織培養；階段二，組織培養增殖；階段三，分化和植物形成；和階段四，溫室培養和強化(hardening)。在階段一初始組織培養期間，建立組織培養並證實無汙染物。在階段二期間，繁殖初始組織培養物，直至產生足以滿足生產目標數量的組織樣品。在階段三期間，將在階段二中生長的組織樣品分離並生長為單獨的小植株。 在階段四中，將轉化的小植株轉移至溫室來強化，其中植物對光的耐受性逐漸增加，從而可在自然環境中生長。
[0148]在某些方面，本 發明提供抗植物病原害蟲的植物的生產方法，所述方法為用重組 DNA構建體或表達dsRNA的構建體的組合轉化植物細胞；由轉化的植物細胞再生植物；和在適於表達所述重組DNA構建體的條件下使轉化植物細胞生長。
[0149]本發明的方法適用於癭蜂物種，例如對由RNA幹擾產生的基因沉默敏感且能夠從其周圍環境內在化dsRNA的桉樹枝癭姬小蜂(Li)和桉幹癭姬小蜂(Om)。本發明適用於處於任何發育階段的昆蟲。由於昆蟲具有非生命的外骨骼，它們不能以均一的速度生長，而是在通過周期性脫落其外骨骼的各階段中生長。該過程稱為蛻皮或換羽。蛻皮之間的階段稱為「齡」，且根據本發明可靶向這些階段。另外，根據本發明還可靶向昆蟲的卵或幼蟲。根據本本發明可靶向包括有翅昆蟲的變形在內的發育周期中的所有階段。因此，個體階段如幼蟲、蛹、稚蟲等發育階段都可靶向。
[0150]Li和Om為桉樹的害蟲。因此，本文所述的核酸、dsRNA和方法對於處理或抑制Li 和Om感染和侵染桉樹是有用的。
[0151]在優選的方面，本發明提供RNAi介導的害蟲防治以產生抗癭蜂的轉基因桉樹。兩種桉樹癭蜂入侵物種桉樹枝癭姬小蜂(Li)和桉幹癭姬小蜂(Om)目前已蔓延出澳大利亞分布至全世界的種植園中[6，9]。雌性可有性或孤雌生殖，且全部生命周期經歷約130天。這些害蟲在樹的葉脈和葉表面下產下卵，誘導靶組織中癭瘤形成來充當發育中的幼蟲的宿主掩蔽所和食物儲存。誘導癭瘤形成的確切化合物或信號還未闡明。因此，化合物從卵和幼蟲中而不是從母體中的分泌與癭蜂形成相關。幼葉中的分生組織或全能細胞(omnipotent cell)受引發其增殖的化學、機械、病毒或DNA操作的誘導。癭瘤發展與幼蟲發育相對應，因此癭瘤的大小和年齡可與幼蟲發育階段相關。Stone等,2002，「The population biology of oak gall wasps (Hymenoptera: Cynipidae)，，? Annu.Rev.Entomol.47:633-68。幼蟲成熟誘導癭瘤的進一步發展直至蛹期。當成年癭蜂出現時，它們能夠飛走並產下數百隻卵，在它們死亡前的3-6天期間感染同一棵樹以及附近和遠處的樹木。大量癭蜂攻擊引起生長停滯、葉子脫落和死亡，結果可能導致大量森林產量損失。無柄發育的幼蟲，在產生對活力基因有活性的RNAi的轉基因植物上進食，受到持續且相對長期地吸收為沉默特定活力癭蜂基因而定製設計的si/dsRNA分子的影響。最後沉默作用導致早期生長階段中的幼蟲死亡， 由此保護宿主並使癭蜂種群大小最小化，保護宿主植物免受損害。
[0152]癭蜂在非轉基因樹中的幼蟲階段可長達130天，因此dsRNA的致死效果可在整個潛在的幼蟲生長期累積。一旦幼蟲死亡，癭瘤的發展被遏止，並減少成蟲數量，隨後防止對該樹木、鄰近或遠處的樹木的感染。
[0153]轉基因抗性樹的特徵在於對「癭蜂發育規模」的如下結果中的一個或多個:
[0154]1.無癭瘤發展。
[0155]2.與WT相比，發展小型癭瘤(低幼蟲質量測量的指標)[測量最大長度、直徑、面積和/或體積]。
[0156]3.與WT相比的低幼蟲質量測量:與WT相比，總幼蟲重量降低。
[0157]4.與WT相比，更多的癭瘤聚`集死亡的幼蟲。
[0158]5.與WT相比，更多的癭瘤聚集死亡的蛹。
[0159]6.與WT相比，未從癭瘤中出現成蟲。
[0160]7.與WT相比，發育上受損的成蟲，與在野生型樹上生長的成蟲相比缺乏繁殖或傳播的能力。
[0161]實施例
[0162]實施例1
[0163]癭蝰轉錄糹目測序
[0164]從來自以色列埃梅克(Emek)的感染的赤桉中收集癭蜂感染的葉。通過在雙目顯微鏡下用尖刀切割並打開癭瘤來從在樹葉和/或葉柄中發現的癭瘤中除去癭蜂幼蟲。使用來自各種幼蟲發育階段的幼蟲混合物。將各批100隻幼蟲置於冰上的微管中。然後將管密封並立即冷凍於液氮中並保存在-80°C直至進一步處理。使用MasterPure RNA純化試劑盒和操作手冊(MRC85102_Epicentere Biotechnologies)分離總 RNA。總 RNA 體積為 50 U I。然後用DNAse處理總RNA以除去任何剩餘的殘留DNA，接著分離poly A mRNA (MicroPoly (A) Purist,小規模mRNA純化試劑盒，AM1919Ambion)。mRNA終體積為20 U I。純化的mRNA保存在-80°C直至進行454測序。根據標準操作手冊進行454測序，從而提供靶害蟲的轉錄組。
[0165]實施例2
[0166]Li矛口 Om革F1基因矛口序歹Il的盤定
[0167]選擇對特定組織或整個有機體的細胞進程或適當的發育進程至關重要的唯一的活力Li和Om基因作為基因沉默的靶標。首先，將使用基於已知同源膜翅目序列的簡併引物的標準步驟來鑑定靶基因的片段。其後，將Li和Om癭蜂幼蟲的各轉錄組使用454測序儀深度測序平臺測序(454Life Sciences ；Branford, CT, USA ；now Roche, Basel)。使用 Roche 軟體包並使用Blast2Go程序注釋(可於http://www.blast2g0.0rg/獲得)，基於與已知公開的膜翅目昆蟲轉錄組的序列比對來組裝序列並對結果進行注釋。
[0168]表1給出SEQ ID NO:來自Li和Om的所鑑定的基因1_9的完整或部分基因序列。
[0169]表1.Li和Om某因
[0170]
【權利要求】
1.一種分離的核酸，其包括在高嚴格雜交條件下與選自由SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132,SEQ ID NO:234-244組成的組的序列及其互補序列選擇性雜交的序列。
2.根據權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸與所述選自由SEQID NO: 15,SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45-123,SEQID NO: 127-132,SEQ ID NO: 234-244組成的組的序列及其互補序列的同一性為90-99.99%。
3.根據權利要求1或2所述的分離的核酸，其中所述核酸包括選自由SEQID NO: 15、SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ IDNO:45-123、SEQ ID NO: 127-132,SEQ ID NO:234-244組成的組的序列及其互補序列的至少17個鄰接核苷酸。
4.根據權利要求3所述的分離的核酸，其中所述核酸包括選自由SEQID NO: 1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 150-222、SEQ IDNO:234-244組成的組的序列及其互補序列的至少25個鄰接核苷酸。
5.根據權利要求1-4任一項所述的分離的核酸，其中所述核酸與所述核酸的蜜蜂直向同源物的同一性小於約80%。
6.ー種載體，其包括可操作地連接至表達調控序列的根據權利要求1-5任一項所述的分離的核酸。
7.—種宿主細胞，其包括根據權利要求6所述的載體。
8.ー種植物組織，其包括根據權利要求6所述的載體。
9.根據權利要求8所述的植物組織，其中所述組織選自由葉組織、葉脈、葉柄、小枝、枝、花、幹、果實和種子組成的組。
10.一種分離的小抑制性核糖核酸分子(SiRNA)，其抑制編碼外被體亞單位a ( a COP)、染色質域解旋酶DNA結合蛋白、毒羧酸酯酶6同エ型1、幾丁質合成酶、鐵蛋白或保幼激素環氧化物水解酶的桉樹枝癭姬小蜂或桉幹癭姬小蜂核酸分子的表達。
11.一種分離的雙鏈核糖核酸分子(dsRNA)，其包括與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45-123、SEQ IDNO: 127-132,SEQ ID NO:234-244中所示的至少17個鄰接核苷酸基本上同一的第一鏈核苷酸和與所述第一鏈核苷酸基本上互補的第二鏈核苷酸的単元。
12.根據權利要求11所述的分離的dsRNA，其中所述第一鏈核苷酸與SEQID NO: USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,SEQ ID N0:131、SEQ ID NO:132或SEQ IDNO: 150-222中所示的至少17個鄰接核苷酸基本上同一。
13.根據權利要求11或12所述的dsRNA，其中所述第一鏈和第二鏈核苷酸為至少約.25、35、50、70或100個核苷酸長度。
14.根據權利要求11-13任一項所述的dsRNA,其中所述第一鏈和第二鏈核苷酸在它們各自的長度上與 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25,SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:45-123,SEQ ID NO:127-132 或 SEQ ID NO:234-244 的同一性為70-100%。
15.根據權利要求11-14任一項所述的dsRNA，其中所述第一鏈和第二鏈核苷酸的序列與所述第一鏈和第二鏈核苷酸的蜜蜂直向同源物的序列的同一性小於約80%。
16.根據權利要求11-15任一項所述的dsRNA，其包括至少兩(2)個所述單元。
17.根據權利要求16所述的dsRNA，其中所述至少兩個單元源自選自由SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45_123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和 SEQ ID NO:234-244 組成的組的不同序列。
18.根據權利要求11-17任一項所述的dsRNA，其進ー步包括分隔所述第一鏈和所述第二鏈核苷酸的環區。
19.ー種載體，其包括可操作地連接至為根據權利要求11-18任一項所述的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達調控序列。
20.ー種宿主細胞，其包括根據權利要求19所述的表達載體。
21.根據權利要求20所述的宿主細胞，其中所述宿主為細菌細胞或酵母細胞。
22.根據權利要求21所述的宿主細胞，其中所述宿主為農桿菌。
23.ー種植物組織，其被根據權利要求22所述的宿主細胞轉化。
24.ー種植物組織，其包括根據權利要求11-22任一項所述的dsRNA。
25.一種分離的小抑制性核糖核酸分子(dsRNA)，其抑制桉樹枝癭姬小蜂或桉幹癭姬小蜂的必需基因的表達。
26.根據權利要求25所述的dsRNA，其包括與來自所述必需基因的至少17個鄰接核苷酸基本上同一的第一鏈核苷酸和與所述第一鏈核苷酸基本上互補的第二鏈核苷酸的単元。
27.根據權利要求26所述的dsRNA，其中所述第一鏈和第二鏈核苷酸為至少約25、35、.50、70或100個核苷酸長度。
28.根據權利要求25-27任一項所述的dsRNA,其中所述第一鏈和第二鏈核苷酸在它們各自的長度上與所述必需基因的同一性為70-100%。
29.根據權利要求26-28任一項所述的dsRNA，其包括至少兩(2)個所述單元。
30.根據權利要求29所述的dsRNA，其中所述至少兩個單元源自不同的必需基因。
31.根據權利要求30所述的dsRNA，其中所述至少兩個單元源自單一物種。
32.根據權利要求30所述的dsRNA，其中所述至少兩個單元源自不同物種。
33.根據權利要求26-32任一項所述的dsRNA，其進ー步包括分隔所述第一鏈和所述第二鏈核苷酸的環區。
34.ー種載體，其包括可操作地連接至為根據權利要求26-33任一項所述的dsRNA的一條鏈或兩條鏈的模板的核苷酸序列的表達調控序列。
35.ー種宿主細胞，其包括根據權利要求34所述的表達載體。
36.ー種植物組織，其包括根據權利要求25-33任一項所述的dsRNA。
37.ー種植物組織，其包括根據權利要求34所述的載體。
38.ー種植物組織，其包括根據權利要求35所述的宿主細胞。
39.ー種抗害蟲植物的生產方法，其包括在所述植物中表達根據權利要求11-18或權利要求25-33任一項所述的dsRNA，或者在所述植物的生殖材料中繁殖根據權利要求11_18或權利要求25-33任一項所述的dsRNA。
40.根據權利要求39所述的方法，其中所述植物為桉樹。
41.根據權利要求39或40所述的方法，其中所述害蟲為癭蜂。
42.根據權利要求41所述的方法，其中所述害蟲為桉樹枝癭姬小蜂或桉幹癭姬小蜂。
43.—種害蟲侵擾的抑制方法,其包括培養包含根據權利要求11-18或權利要求25-33任一項所述的dsRNA的植物，從而抑制所述侵擾。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述植物為桉樹。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述害蟲為桉樹枝癭姬小蜂或桉幹癭姬小蜂。
46.ー種抗植物病原害蟲的植物的生產方法，其包括: (a)用表達根據權利要求11-18或權利要求25-33任一項所述的dsRNA的重組DNA構建體或構建體的組合來轉化植物細胞； (b)由轉化的所述植物細胞來再生植物；和 (c)在適於所述重組DNA構建體轉錄的條件下使轉化的所述植物細胞生長， 由此所述長成的轉化植物與未轉化植物相比抗所述害蟲。
47.根據權利要求46所述的方法，其進ー步包括用表達與所述dsRNA的一條鏈或其片段互補的單鏈RNA的重組DNA構建體轉化所述植物細胞。
48.根據權利要求46或47所述的方法，其中所述植物為桉樹。
49.根據權利要求48所述的方法，其中所述害蟲為桉樹枝癭姬小蜂或桉幹癭姬小蜂。
【文檔編號】A61K31/713GK103596575SQ201280027060
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月30日 優先權日:2011年3月30日
【發明者】D·阿維薩爾, H·斯坦因, Z·薩尼, D·西格爾 申請人:富優基尼以色列股份有限公司