用於皮膚護理的組合物和方法

2023-06-27 06:09:01

專利名稱：用於皮膚護理的組合物和方法
專利說明用於皮膚護理的組合物和方法 發明領域 本發明涉及用於實現皮膚外觀和觸感改善的組合物。特別的是，本發明提供了包括維生素D3或其特異性類似物作為其中的主要成分並結合尼克醯胺、cADPR或其衍生物的局部施用組合物，其用於預防和治療與皮膚老化以及光老化關聯的症狀。

背景技術：
皮膚與老化 皮膚是身體最大的器官並且其主要起保護身體免受外部因素傷害的功能，其中所述外部因素如微生物、化學藥品、UV輻射和溫度。皮膚遭受到環境以及內在因素的傷害。環境因素包括暴露於陽光、煙燻和空氣汙染，而內在因素包括應激和時間性老化(chronological aging)。無論是外在的還是內在的，對皮膚所造成的明顯傷害症候如細紋(fine lines)、皺紋和變色。這些症候的預防、消除或減少已經產生出數十億美元的市場，治療手段包括非處方(over-the-counter)的局部乳膏和保溼劑以及多種化妝品外科技術。正常的時間性老化導致皮膚變薄、彈性缺失以及普通的萎縮。光老化、由於暴露於UV輻射而使皮膚過早老化等可以加速時間性老化(在Fisher等人評述，2002)。氧化也可以通過產生對皮膚有害的不穩定分子(稱為自由基)而加速老化的過程。
化妝品工業所需解決的一個最重要的問題之一是皮膚的過早老化。皺紋對自尊心可能具有深遠的影響。實際上，看起來顯老的有關的標誌通過美國自己的事實就得以證明，每年有超過120億美元花費在化妝品上以逆轉或遮掩老化的症狀。
維生素D與皮膚 術語維生素D指開環甾醇(secosterol)——麥角鈣化醇(維生素D2)和膽鈣化甾醇(維生素D3)以及它們的代謝物和類似物，包括α骨化二醇(alfacalcidol)(1-羥基膽鈣化甾醇)、鈣三醇(1α，25-二羥膽鈣化甾醇)和二氫速甾醇(DHT)。
維生素D是激素原，一些活性代謝物具有激素作用。在皮膚中，前維生素D3由7-脫氫膽甾醇光化學合成並且緩慢地異構化為通過維生素D結合蛋白除去的維生素D3。在肝中，維生素D3轉化為主要的循環形式——25(OH)D3，其經過腸肝循環並從腸進行重吸收。在腎中，該循環形式被進一步羥基化為更具代謝活性的形式——1α，25(OH)2D3(1α，25-二羥膽鈣化甾醇、鈣三醇、維生素D激素)。
實驗證據顯示維生素D起抗增殖劑的作用並促進角質形成細胞的最終分化。在銀屑病的病灶中，表皮的角質形成細胞表現出過度增殖並且表現出炎症觸發的受損的分化。因此，維生素D和某些類似物在尋常性銀屑病的治療中是非常有效的(Lehmann等人進行了評述，2004)。卡泊三醇(calcipotriol)(局部抗銀屑病的維生素D3衍生物)在美國以商品名Dovonex進行銷售。卡泊三醇在細胞增殖調節中與天然形成的鈣三醇一樣強效，而且卡泊三醇所具有的益處在於其對鈣代謝的全身副作用的更低活性。
本領域公開了維生素D衍生物和維生素D類似物，以及包括所述維生素D衍生物和維生素D類似物的組合物。
維生素D類似物在以下的美國專利中描述美國專利第4,851,401號(環戊並維生素D類似物)、美國專利第5,120,722號(三羥基鈣化醇衍生物)、美國專利第5,446,035號(20-甲基取代的維生素D)、美國專利第5,411,949號(23-氧雜衍生物)、美國專利第5,237,110號(19-去甲維生素D化合物)、美國專利第4,857,518號(羥基化的24-同型-維生素D衍生物)。除其他專利外，另外的維生素D類似物在美國專利第4,804,502、4,866,048、5,145,846、5,374,629、5,403,940、5,446,034和5,447,924號中被教導。
美國專利第6,552,009號公開了包括維生素D類似物和類視黃醇衍生物的組合物，其用於治療由異常的細胞增殖和/或細胞分化表徵的疾患。在某些優選的實施方案中，維生素D類似物選自鈣三醇和卡泊三醇。
美國專利第6,288,249號涉及新型的維生素D衍生物與用於治療骨質疏鬆和增殖疾病的方法以及包括皮膚乾燥和皺紋的皮膚狀況的改善。美國專利第6,831,106號教導了新型的維生素D化合物和包括該維生素D化合物的藥物組合物與化妝品組合物。專利′249和′106中教導的化合物不同於維生素D和傳統的維生素D類似物，原因是該化合物不具有通有的9，10開環甾醇結構。
美國專利第6,753,013號描述了包括維生素D類似物與皮質甾類的組合的、皮膚使用的藥物組合物，該組合物減少了兩組分方案(regimen)治療銀屑病及其他炎症性皮膚疾病的不便之處。
美國專利第6,262,041號教導了用於降低人皮膚老化速率或用於治療皮膚癌、痤瘡或酒渣鼻的方法，所述方法包括以每天為基礎向皮膚施用抗氧化量的26，27-六氟-1，25-二羥基維生素D3，並施用足夠的時間以降低皮膚老化的速率。
美國專利第5,747,479、5,804,574和5,811,414號公開了維生素D3類似物，其為26，27-六氟膽鈣化甾醇，用於逆轉暴曬皮膚的光損傷。Mitani等人(Mitani等人，2004)公開了局部施用麥角鈣化醇(維生素D2)以抑制皮膚的光損傷。
本發明一部分發明人的國際專利申請公布文本WO 01/51051教導了治療良性或惡性的表皮過度增殖疾病的組合物和方法，所述方法包括向受治療者施用皮膚病學有效量的藥物，所述藥物選自尼克醯胺和/或環腺苷二磷酸核糖(cyclic adenosine diphosphate-ribose)(cADPR)及其類似物組成的組。
本發明一部分發明人的國際專利申請公布文本WO 2004/006887教導了用於治療良性或惡性的表皮過度增殖疾病的組合物和方法，所述方法包括施用任選地與維生素D3類似物或維生素B類似物結合的尼克醯胺和/或cADPR。該申請既未教導也未建議使用維生素D3拮抗衍生物來治療與老化相關的皮膚症狀。
已知維生素D3和維生素D3類似物具有抗增殖性能和前分化(prodifferentiating)性能，因而其在皮膚過度增殖疾患(例如，銀屑病)的治療中是有效的。因此，本領域的技術人員可合理地預期在角質化形成細胞中表現出抗增殖活性的藥劑對於皮膚萎縮中所觀察到的症狀的治療是禁忌的。事實上，Fujimura等人(Fujimura等人，2000)報導1α，25-二羥基維生素D3的局部施用誘導了無毛小鼠的皮膚皺紋。
現有技術既未教導也未建議單獨使用或結合尼克醯胺和/或cADPR使用維生素D3類似物來預防、治療或減緩與皮膚老化相關聯的疾患。
仍然存在對用於預防和治療與自然的、早熟的或誘發的老化相關聯的症狀的組合物和方法的未滿足的醫療需求。


發明內容
本發明以下述令人意想不到的觀察結果為基礎單獨或與尼克酸和或cADPR結合的維生素D3及其特異性類似物事實上有效地預防、減弱和治療了與皮膚萎縮關聯的症狀，所述症狀包括彈性的缺失、細紋、皺紋和色素沉著。在使用根據本發明的製劑來延緩皮膚病變部位的過度增殖(如，銀屑病)時，本發明的發明人驚奇地發現該製劑對於正常的皮膚外觀和質感具有有益的效果。
因此，包括維生素D3或其特異性類似物與尼克醯胺和或cADPR、或其類似物或衍生物的組合的組合物在預防、減弱和治療與皮膚老化相關聯的症狀中令人意想不到地有效。
一方面，本發明提供了在預防、延緩、阻止或逆轉哺乳動物皮膚萎縮中有用的局部施用皮膚病學組合物，其包括作為活性成分的皮膚病學上有效量的至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；以及皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺(NA)、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的賦形劑或載體。
在一些實施方案中，維生素D3類似物包括9，10開環甾醇化學結構。在某些實施方案中，維生素D3類似物選自鈣三醇和卡泊三醇。在特定的實施方案中，維生素D3類似物為卡泊三醇。
在特定的實施方案中，該組合物包括皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)和尼克醯胺組成的組的活性劑。在一些實施方案中，該組合物包括NA和cADPR。
在優選的實施方案中，哺乳動物皮膚為人皮膚。在某些實施方案中，皮膚的萎縮與甾族化合物誘導的萎縮、絕經誘導的萎縮或老化相關聯。
在特定的實施方案中，所述組合物主要由皮膚病學上有效量的至少一種選自維生素D3、維生素D3類似物組成的組的活性劑；以及皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑及其前藥組成的組的活性劑組成。
在其他實施方案中，所述組合物主要由皮膚病學上有效量的至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；以及皮膚病學上有效量的至少一種選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑組成。
第二方面，本發明提供了在預防或治療與老化相關的表皮病中有用的局部施用組合物，所述組合物包括至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；和皮膚病學上可接受的賦形劑或載體。
在一些實施方案中，維生素D3類似物包括9，10開環甾醇化學結構。在某些實施方案中，維生素D3類似物選自鈣三醇和卡泊三醇。在特定的實施方案中，維生素D3類似物為卡泊三醇。
在特定的實施方案中，該組合物包括皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)和尼克醯胺組成的組的活性劑。
在一種實施方案中，與老化相關的表皮病與時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關聯。在特定的實施方案中，表皮病選自細紋、皺紋、變色、下垂、擴大的毛孔、皮膚粗糙、皮膚乾燥、痤瘡、脫髮和妊娠紋(stretch marks)組成的組。
另一方面，本發明提供了在預防、延緩、阻止或逆轉哺乳動物皮膚萎縮中有用的局部施用皮膚病學組合物，其主要由皮膚病學上有效量的至少一種選自鈣三醇、卡泊三醇及其混合物組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的賦形劑或載體組成。
又一方面，本發明提供了在預防或治療與老化相關的表皮病中有用的局部施用皮膚病學組合物，其包括至少一種選自鈣三醇、卡泊三醇及其混合物組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的賦形劑或載體。
本發明進一步提供了包裝在適合分配所述組合物的容器中的本發明組合物以及書面的使用說明書。
因此，根據本發明進一步的方面，提供了藥物試劑盒、化妝品試劑盒或藥物化妝品試劑盒，所述試劑盒包括組合物，該組合物包括皮膚病學上有效量的選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的藥劑；皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；和皮膚病學上可接受的賦形劑或載體。
本發明的組合物可以配製成選自水溶液、非水溶液、洗劑、乳膏、凝膠、軟膏劑、泡沫、摩斯(mousse)、噴霧劑、乳劑、微乳、和散劑的形式。所述組合物可以直接施用於皮膚或者經由粘合貼劑(adhesive patch)或繃帶施用於皮膚。
在其他方面，本發明提供了用於預防、延緩、阻止或逆轉萎縮的方法，其用於預防或治療與哺乳動物皮膚老化相關的表皮病，所述方法包括將本發明的組合物局部施用於皮膚的步驟。
因此，本發明提供了用於預防、延緩、阻止或逆轉哺乳動物皮膚萎縮的方法，其包括以下步驟 向皮膚局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物包括至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體。
在優選的實施方案中，哺乳動物皮膚為人皮膚。在某些實施方案中，皮膚的萎縮與甾族化合物誘導的萎縮、絕經誘導的萎縮或老化相關聯。老化指時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合。
另一方面，本發明提供了預防或治療與老化相關的表皮病的方法。所述方法包括向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物包括至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的賦形劑或載體。
在特定的實施方案中，維生素D3類似物為卡泊三醇。
在某些實施方案中，所述組合物包括皮膚病學上有效量的選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)和尼克醯胺組成的組的藥劑。
在優選的實施方案中，所述受治療者為人類受治療者。在一個實施方案中，與老化相關的表皮病與時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關聯。在特定的實施方案中，所述表皮病選自細紋、皺紋、變色、下垂、擴大的毛孔、皮膚粗糙、皮膚乾燥、痤瘡、脫髮和妊娠紋組成的組中的至少一種。
在某些實施方案中，本發明的方法包括以下步驟向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物主要由至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；和至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體組成。
在其他實施方案中，所述方法包括以下步驟 向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物主要由至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；和至少一種選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的賦形劑或載體組成。
一方面，本發明提供了至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；以及至少一種選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑用於製備治療與皮膚萎縮、時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關的表皮病的局部施用的治療組合物或化妝品組合物的用途。
另一方面，本發明提供了至少一種選自鈣三醇和卡泊三醇組成的組的活性劑用於製備治療與皮膚萎縮、時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關的表皮病的局部施用的治療組合物或化妝品組合物的用途。
結合附圖、說明書和所附的權利要求，本發明的這些和其他的實施方案將變得顯而易見。
附圖簡述


圖1A顯示維生素D的9，10開環甾醇結構以及維生素D3的側鏈。
圖1B顯示卡泊三醇的化學結構。
圖2a和2b顯示NA與鈣三醇(1α25(OH)2D3)的組合對HaCat細胞株增殖的抗增殖效應(圖2a)以及該組合與這些化合物中單獨每種(NA和1α25(OH)2D3)的抗增殖效應相比對該細胞株的協同效應，其顯示為聯合治療的效應減去每種化合物的效應(圖2b)。
發明詳述 本發明涉及藥物、化妝品或藥物化妝品的組合物、試劑盒及方法，所述組合物、試劑盒及方法可用於治療與皮膚萎縮和老化相關的皮膚疾患，包括減少細紋、皺紋、變色和妊娠紋。通過參考附圖和隨附的說明可以更好地理解本發明的組合物和方法的原理以及操作。
維生素D和維生素D類似物已顯示出具有抗增殖活性並且進一步增強了尼克醯胺和尼克醯胺衍生物的抗增殖活性。目前，本發明公開了組合物令人意想不到的、有益的和美容的作用，所述組合物包括維生素D3和維生素D3類似物與選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑的組合。這些組合物在預防、減弱和治療皮膚萎縮中是有效的。
令人意想不到地發現了與其他活性劑結合的維生素D3和維生素D3類似物在預防和減少與皮膚萎縮、時間性老化皮膚和光老化皮膚相關聯症狀的出現中具有協同的抗增殖效應，其中所述其他活性劑包括尼克醯胺和或cADPR及其衍生物。
隨著個人年齡的增長，皮膚經歷了明顯的變化 細胞分裂更為緩慢，並且皮膚內層(真皮)開始變薄。真皮下的脂肪細胞開始萎縮。彈性蛋白和膠原纖維的基礎網狀構造為表面的皮膚層提供了支架，而該支架的鬆弛和散開導致彈性的缺失並伴有下垂和皺紋。
分泌汗和分泌油的腺體萎縮，剝奪了對皮膚具有保護性的水-脂乳液。皮膚保留水份的能力下降從而使得皮膚變幹並呈鱗狀。
由於小部分的肌肉持久地收縮，因而似乎形成了眉毛之間的皺眉紋(Frown lines)和從眼睛拐角處呈放射狀的魚尾紋(crow′s feet)。其他的皺紋可能由習慣性的面部表情形成。重力加劇了所述情況，從而促使下顎垂肉和下垂眼瞼的形成。
紫外線輻射在引起皮膚過早地老化(稱為光老化)以及皮膚癌中起到至關重要的作用。總而言之，暴露於日光發出的紫外線(稱為UVA或UVB)輻射是大約90％皮膚過早老化症狀的成因，並且這些作用中的大部分均出現在20歲左右。即使只有少量的UV輻射也會觸發導致皮膚皺紋的過程。
長期反覆並累積地暴露於日光似乎是造成絕大多數不希望的皮膚老化後果的原因，其中所述皮膚老化包括基底細胞癌和鱗狀細胞癌。
UVA和UVB射線引起的損傷會導致皺紋、對感染免疫力降低(lowerimmunity against infection)、皮膚老化疾患和癌症。但是，這兩種射線似乎通過不同的方式來損傷細胞。
UVB是造成曬斑的主要原因。UVB在日光最明亮時的中午最為強烈。但是，UVA穿透得更深、更有效。UVA的強度與UVB相比，在每天以及全年都趨向於更恆定(less variable)。例如，在夏季接收到的UVA大約只有一年UVA數量的一半，並且該平衡遍及一年中剩餘的時間。UVA也不能被窗玻璃過濾掉。UVA和UVB射線均引起損傷——包括皮膚損傷。
即使是少量的UV輻射也會觸發可引起皺紋的過程。陽光損傷膠原纖維，皮膚中的主要結構蛋白，並且造成異常的彈性蛋白蓄積。響應這種陽光誘導的彈性蛋白蓄積，產生了大量稱為金屬蛋白酶的酶。
儘管金屬蛋白酶的正常功能是通過製造並改良膠原來重塑受陽光傷害的組織，但是由日光產生的一些金屬蛋白酶實際上卻降解膠原。其結果是稱為日光性瘢痕(solar scars)的紊亂膠原纖維的不平坦基質。這種有缺陷的皮膚再三反覆地重建引起皺紋。
另一件重要的事情是起皺過程為自由基的過度產生。儘管不希望受到理論的束縛，但是氧化和氧化應激可以通過激活降解結締組織的特異性金屬蛋白酶而明確地促進皺紋的形成。
除了日光之外，其他因素也可以加速皺紋的形成 吸香菸吸菸產生氧自由基，已知氧自由基加速起皺和皮膚老化疾患並且增加黑色素瘤皮膚癌的風險。研究還表明吸菸和隨後的氧化產生了更高水平的金屬蛋白酶； 空氣汙染臭氧可能是造成皮膚中維生素E耗竭的原因。
快速的重量減輕如果重量減輕得過快，襯墊(cushion)面部的脂肪細胞體積可能會減少並且可能造成皮膚下陷。
定義 為方便和清楚起見，此處描述了說明書、實施例和權利要求中所採用的某些術語。
如上文所描述的，已知維生素D3及其類似物是銀屑病和其他炎症性皮膚疾病的治療中有用的藥劑(Morimoto等人，1986)。但是，迄今為止仍未觀察到維生素D3代謝物與活性劑相結合而發揮的抗老化效應，其中所述活性劑選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組。
根據本發明，維生素D3類似物是維生素D3的任何類似物，例如，但不限於維生素D3代謝物、維生素D3激動劑和維生素D3衍生物。維生素D3藥劑可以進一步為以上每種藥劑的前藥。優選地，維生素D3類似物包括9，10開環甾醇結構。

圖1顯示與維生素D相關聯的9，10開環甾醇化學結構以及維生素D3的R1殘基和R2殘基。
根據某些實施方案，維生素D3類似物選自膽鈣化甾醇、鈣化二醇、鈣三醇和卡泊三醇。在一些實施方案中，維生素D3選自鈣三醇和卡泊三醇。在特定的實施方案中，維生素D3為卡泊三醇。
如此處所用，短語「有效量」和「皮膚病學有效量」描述了足以充分地消除、充分地抑制、減慢或逆轉皮膚萎縮進程或者與衰老關聯的表皮症狀出現的藥物量。
「活性劑」指當獨自使用或結合一種或多種能夠充分消除、充分抑制、減慢或逆轉皮膚萎縮的進程或者與老化相關聯的表皮症狀出現的化合物而用於例如改善皮膚外觀和質感的化合物。
包括至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑的皮膚病學上有效量的組合物涉及包括約0.0001％至約1％維生素D3和或維生素D3類似物的單位劑量組成。在特定的實施方案中，維生素D3和維生素D3類似物以包括約0.001％至約0.1％單位劑量的組成存在於組合物中。
根據本發明，維生素D3代謝物的最終濃度範圍通常在0.2μM和200μM之間，並且更優選在約1.0μM和約100μM之間。維生素D3及類似物在單位劑型中的有效濃度優選在約0.1μg/g劑量單位至約100μg/g劑量單位之間，並且優選在約5μg/g劑量單位至約50μg/g劑量單位之間。
如此處所用，「皮膚萎縮」指真皮變薄和/或一般的真皮降解，其通常經由膠原和/或彈性蛋白的減少以及成纖維細胞數目和大小的減少來表徵。皮膚萎縮是絕經、時間性老化以及光老化的自然結果，並且通常是皮質類甾醇治療所引起的不希望的副作用。絕經可以是生理的絕經或者是外科手術或治療誘發的絕經。
在此，術語「治療」包括消除、充分地抑制、減弱或逆轉進程、充分改善臨床症狀或充分預防與老化和皮膚萎縮關聯的症狀出現。術語「治療」預期進一步包括皮膚外觀和質感的改善、水化、癒合或使皮膚光滑。所述症狀包括，但不限於細紋、皺紋、老年斑(age spots)及其他皮膚變色、皮膚鬆弛、生長、皮膚乾燥、皮膚粗糙、皮膚灰暗(dull skin)、痤瘡、脫髮和妊娠紋。
根據本發明，諸如皮膚萎縮或表皮細胞老化狀況的治療包括上文描述的表皮細胞老化症狀的治療。這種治療進一步包括在這些症狀出現之前進行預防——尤其是老化症狀。
本發明包括的組合物進一步含有皮膚病學上有效量的藥劑，所述藥劑選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組。
合適的尼克醯胺藥劑不是尼克醯胺本身就是已知起類似於其自身作用的任何尼克醯胺類似物，例如，但不限於尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物或尼克醯胺代謝物。所述尼克醯胺藥劑可以進一步為所描述的每種尼克醯胺藥劑的前藥。
在某些實施方案中，尼克醯胺的有效量範圍在約1mM和約50mM之間。在特定的實施方案中，尼克醯胺的有效量範圍在約1mM和約30mM之間，並且優選在約5mM和約25mM之間。NA或NA類似物在單位劑型中的有效濃度為約0.1mg/g劑量單位到6mg/g劑量單位，且優選約0.1mg/g劑量單位到3mg/g劑量單位，並且更優選約0.5mg/g劑量單位至約2.5mg/g劑量單位。
同樣地，cADPR藥劑不是cADPR本身就是已知起類似於其自身作用的任何cADPR類似物，例如，但不限於cADPR激動劑、cADPR衍生物或cADPR代謝物。所述cADPR藥劑可以進一步為所描述的每種cADPR藥劑的前藥。在某些實施方案中，根據本發明的cADPR的皮膚病學有效量範圍在約1μM和100μM之間。在某些實施方案中，本發明組合物中cADPR的有效量範圍為約10μM到約50μM，並且優選在約25μM和約50μM之間。在單位劑型中的有效濃度優選在約0.5μg/g劑量單位至約55μg/g劑量單位之間，且優選約5μg/g劑量單位至約27μg/g劑量單位，並且優選約13μg/g至約27μg/g。
本發明包括的組合物主要由皮膚病學上有效量的選自鈣三醇和卡泊三醇的維生素D3類似物以及皮膚病學上有效量的選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑及其前藥組成的組的藥劑組成。
本發明進一步包括本發明的主要由皮膚病學上有效量的選自鈣三醇和卡泊三醇的維生素D3類似物以及皮膚病學上有效量的選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的藥劑組成的組合物。
因此，根據本發明的優選藥物組合物、化妝品組合物或藥用化妝品組合物包括終濃度範圍在約10μM和100μM之間的維生素D類似物、終濃度範圍在約10mM和約50mM之間的尼克醯胺、終濃度範圍在約25μM和約50μM之間的cADPR以及皮膚病學上可接受的載體。
優選地，維生素D3代謝物為1α，25二羥基-維生素D3。
如此處所用，短語「皮膚病學上可接受的載體」指不對皮膚產生明顯刺激並且不消除所用活性劑的生物活性和性能的載體或稀釋劑。
在本發明範圍內有用的皮膚病學上可接受的載體實例包括，但不限於乳劑、乳膏、水溶液、油劑、軟膏劑、糊劑、凝膠、洗劑、乳、泡沫、混懸劑和散劑。
本發明的皮膚病學上可接受的載體可以包括，例如，增稠劑、軟化劑、乳化劑、潤溼劑、表面活性劑、助懸劑、成膜劑、起泡劑(foam buildingagent)、防腐劑、消泡劑、香料、低級單醇聚醇(lower monoalcoholic polyol)、高沸點溶劑、推進劑、著色劑、顏料或其混合物。
因此，本發明組合物的形式可以為，例如油、凝膠、固體棒(solid stick)、洗劑、乳膏、乳、氣溶膠、噴霧劑、泡沫、摩斯、軟膏劑或含脂肪的軟膏劑或散劑。
優選地，本發明的組合物經局部施用。
本發明的組合物可以通過本領域公知的工藝來製造，例如，藉助於常規的混合、溶解、粒化、製糖衣片(dragger-making)、水飛、乳化、包囊、包埋(entrapping)或冷凍乾燥工藝。
因此，可以使用一種或多種生理學上可接受的包括賦形劑和輔助劑的載體來將依據本發明使用的組合物配製成常規形式，所述載體有助於將活性化合物加工成可在藥學上使用的製劑。適當的製劑取決於所選擇的給藥途徑。
製劑 本發明的治療組合物或化妝品組合物包括皮膚病學上或化妝品上可接受的載體以起維生素D稀釋劑、分散劑或載體的作用，從而使得該組合物應用於皮膚時促進其分布。不同於水或者除水之外的載體包括液體或固體的軟化劑、溶劑、潤溼劑、增稠劑和散劑。本發明可以配製成局部施用的水溶液或非水溶液、洗劑、乳膏、凝膠、軟膏劑、泡沫、摩斯、噴霧劑、乳劑、微乳、粘合貼劑、散劑等等形式。例如，所述製劑可以是基於含油的遮光(occlusive)組合物，其包括白凡士林和或礦物油。在一些實施方案中，該組合物為非油脂的或主要為非油脂的，並且可以為基於水的製劑。
對於所述製劑而言，維生素D3及類似物在單位劑型中的有效濃度優選在約0.1μg/g劑量單位至約100μg/g劑量單位之間，並且優選約5μg/g劑量單位至約50μg/g劑量單位；NA或NA類似物在單位劑型中的有效濃度為約0.1mg/g劑量單位到6mg/g劑量單位，且優選約0.1mg/g劑量單位到3mg/g劑量單位，並且更優選約0.5mg/g劑量單位至約3mg/g劑量單位；並且在單位劑型中的有效濃度優選在約0.5μg/g劑量單位至約55μg/g劑量單位之間，且優選約5μg/g劑量單位至約27μg/g劑量單位，並且優選約13μg/g至約27μg/g。
合適的局部製劑的非限制性實例如下 洗劑和乳膏 洗劑含有有效濃度的一種或多種選自維生素D和維生素D類似物的化合物，以及選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的一種活性劑。
本發明的組合物還可以包括至少一種或多種軟化劑，所述軟化劑可以起潤滑劑和增稠劑的任一種或兩種功能。所述軟化劑總計可佔組合物重量的約0.1％至約50％，優選約1％至約10％。可以使用本領域技術人員已知的適合向人皮膚應用的任何軟化劑。這些軟化劑包括，但不限於烴油和蠟，包括礦物油、凡士林、石蠟、純地蠟、地蠟、微晶石蠟、聚乙烯和全氫化角鯊烯；矽油；甘油三酯脂肪和甘油三酯油，包括由植物、動物和海洋來源獲得的那些；包括霍霍巴油和牛油樹脂；乙醯甘油酯，如乙醯化單甘油酯；乙氧基化甘油酯，如乙氧基化硬脂酸甘油酯；脂肪酸、脂肪醇及其衍生物。其他合適的軟化劑包括羊毛脂和羊毛脂衍生物；多元醇和聚醚衍生物；多元醇酯；蠟酯；植物蠟；磷脂，如卵磷脂及衍生物；甾醇，包括但不限於膽甾醇和膽甾醇脂肪酸酯；醯胺，如脂肪酸醯胺、乙氧基化的脂肪酸醯胺和固體脂肪酸鏈烷醇醯胺。
洗劑可以進一步包括約1％至約10％，更優選2％至5％的乳化劑。所述乳化劑可以是非離子的、陰離子的、陽離子的或其混合物。合適的乳化劑對於本領域所屬技術人員是已知的。
這樣的洗劑和乳膏可以包括其他常規的組分。一種這樣的添加劑為增稠劑，其濃度為組合物的1％至10％。合適的增稠劑的實例包括，但不限於交聯的羧基聚亞甲基聚合物(cross-linked carboxypolymethylenepolymers)、乙基纖維素、聚乙二醇、黃蓍樹膠、刺梧桐樹膠、黃原酸膠、膨潤土及其他粘土、羥乙基纖維素和羥丙基纖維素。
通過將所有的組分簡單地混合在一起而配製所述洗劑和乳膏。優選地將維生素D或維生素D類似物溶解、懸浮或以其他方式均勻地分散於該混合物中。
溶液和混懸劑 將可以為水或非水的溶液配製成含有有效濃度的一種或多種選自維生素D和維生素D類似物的化合物，以及選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的一種活性劑。
在單位劑型中，維生素D3類似物的有效濃度優選在每克劑量單位約0.1μg至約100μg之間，優選約5μg至約50μg之間。用作溶劑或溶劑系統一部分的合適的有機材料如下丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、山梨糖醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇、異丙醇、酒石酸二乙酯、丁二醇及其混合物。這樣的溶劑系統還可以含有水。
當本發明的組合物作為乳劑配製時，脂肪相相對於該組合物總重量的比例範圍可以為約5％至約80％(以重量計)，並且優選約5％至約50％(以重量計)。用於乳劑形式組合物中的油、乳化劑和輔助乳化劑從化妝品或皮膚病學領域所屬技術人員已知的那些中選擇。
凝膠和固體物 可以通過將合適的增稠劑簡單地混合於先前描述的溶液或懸浮液組合物來配製凝膠組合物。合適的增稠劑實例先前已就洗劑進行描述。
凝膠化的組合物含有有效濃度的至少一種選自維生素D和維生素D類似物的化合物，以及選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的一種活性劑。
所述組合物進一步含有如前所述的約5％至約75％的有機溶劑、約0.5％至約20％的增稠劑和使其平衡的水或其他含水載體。
可以將固體形式的組合物配製成預期應用於唇或身體其他部分的棒型(stick-type)組合物。這樣的組合物含有有效量的至少一種選自維生素D和維生素D類似物的化合物。該固體物還含有約50％至約98％的先前描述的軟化劑。這種組合物可以進一步含有約1％至約20％的合適的增稠劑，並且如果希望或需要，可以含有乳化劑和水或緩衝液。固體形式的組合物適於採用先前洗劑部分描述的增稠劑。
本領域已知諸如防腐劑的其他成分提供了應用於皮膚的組合物的所期望的穩定性、香味或顏色或其他期望的性能，其中所述防腐劑包括羥苯甲酸甲酯或羥苯甲酸乙酯、香料、染料等。
本發明的配製品有效地預防和治療了與老化相關聯的皮膚疾患，所述皮膚疾患包括皮膚彈性的減少、皺紋和變色的產生以及歸因於由正常的和光老化引起的皮膚老化的皮膚下垂。
配製為溶液或懸浮液的組合物可以直接應用於皮膚，或者可以將其配製為氣溶膠並作為噴霧劑、泡沫或摩斯應用於皮膚。所述氣溶膠組合物進一步含有約20％至80％，優選30％至50％的合適的推進劑。這樣的推進劑的實例為氯化的、氟化的以及氯氟化的較低分子量的烴。一氧化二氮、二氧化碳、丁烷和丙烷也作為推進劑氣體使用。這些推進劑以本領域已知的量和在適合排出容器內容物的壓力下使用。在加壓的氣溶膠的情況中，可以通過提供投遞計量的閥來確定劑量單位。
在其他實施方案中，將配製為本發明溶液、懸浮液、洗劑和凝膠的組合物配製為皮膚應用的泡沫或摩斯。例如，國際專利申請公布號WO2004/037225和美國專利第6,730,288號中教導了用於配製為泡沫或摩斯的相關載體。
添加劑 對於在本發明範圍內使用的任何藥劑或藥劑的組合而言，可以根據細胞培養試驗來初步估計皮膚病學上的有效量或劑量。例如，如在細胞培養中所測定的，可以在動物模型中配製獲得包括IC50的循環濃度範圍的劑量(如，測試化合物獲得表皮細胞增殖最大半數抑制的濃度)。可以使用這樣的信息來更為精確地確定人類中有用的劑量。
添加劑的其他實例包括防曬劑(sunscreens)和鞣劑。防曬劑包括那些通常用來阻擋紫外線的材料。例證性的化合物為PABA衍生物、肉桂酸酯和水楊酸酯。例如，甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(也稱為羥苯甲酮(oxybenzone))。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮也分別稱為parsol MCX和二苯甲酮-3。組合物中採用的防曬劑的量可以根據所希望的UV輻射保護程度而改變。所述防曬劑必須與活性化合物相容，而且組合物通常可以包括約1％至約20％的防曬劑。精確的量將根據所選擇的防曬劑和所希望的防曬因子(SPF)而改變。
本發明的組合物可以進一步包括抗氧化劑/自由基捕獲劑。抗氧化劑/自由基捕獲劑的加入增加了組合物的益處。可以向本發明的組合物中加入濃度範圍為組合物總重量約0.1％至約10％的抗氧化劑/自由基捕獲劑。抗氧化劑/自由基捕獲劑包括抗壞血酸(維生素C)及其鹽和生育酚(維生素E)。
除了視黃醇和類視黃醇衍生物之外，可以將某些維生素A代謝物以及維生素A的激動劑、衍生物和前藥引入本發明的組合物中。在本發明範圍內有用的其他維生素A藥劑的實例非限制性地包括多種公知的視黃酸受體(RAR)激動劑。這些激動劑非限制性地包括苯並二氫吡喃、二氫苯並噻喃、四氫喹啉、取代的四氫化萘、取代的二氫萘、三取代的苯基、芳香族的四環化合物、取代的環己烷、取代的環己烯、取代的環己烷二稀酸、取代的金剛烷(adamentanes)、取代的二芳基和雜芳基化合物以及更多的激動劑。
維生素C(或抗壞血酸)是極強效的抗氧化劑並且甚至可以保護性地對抗UVA和UVB射線。研究表明維生素E——特別是α生育酚(維生素E的一種形式)的局部乳膏減少了皮膚的粗糙度、面部細紋的長度以及皺紋的深度。小鼠研究還報導使用該局部乳膏減少了UV誘發的皮膚癌。維生素K還可用於治療毛細管損傷。
綠茶和紅茶及其提取物作為添加劑是合適的。其他源自植物的藥劑包括石榴提取物和大豆提取物、蘆薈提取物、生薑提取物、葡萄種子提取物以及珊瑚提取物。
某些含銅的化合物可以保護皮膚並且有助於修復皮膚。值得注意的是，銅本身是有毒的金屬並且其只應在含有與銅結合的物質的產品中使用。大部分研究採用銅肽甘氨醯-1-組氨醯基-1-賴氨酸銅(II)或GHK-Cu來進行。
調色劑(Color correctors)是合適的添加劑並且當瑕疵突出時可以期望使用。例如，綠色的中和劑(neutralizers)遮蓋紅色的病變部位；黃色掩蓋黑眼圈(dark circles)和擦傷；而白色有助於減少皺紋。
其他的添加劑包括氨基葡聚糖(glycosaminoglycans)，如透明質酸等。
產品包裝和試劑盒 在使用中，將少量的組合物(例如約0.1ml至約100ml)從合適的容器或塗藥器應用於皮膚的暴露區域，並且如果需要，隨後用手、手指或合適的裝置使其遍布皮膚上方和/或擦進皮膚。該產品可以專門配製來用於手或面部的治療。
當配製時，所述組合物可以包裝入與其粘度相配的合適的容器中並且預期由消費者使用。例如，洗劑或乳膏可以包裝在瓶中，或包裝在設置有適合手指操作的泵的推進劑驅動的氣溶膠裝置或容器中。當所述組合物為乳膏時，其可以簡單地貯存在不變形的瓶或擠壓容器中，比如管或有蓋子的罐。因此，本發明還提供了含有如此處所定義的皮膚病學上或化妝品上可接受的組合物的密封容器。所述容器的形狀不受限於本發明，並且可以為管、泵分配器、壓縮分配器、瓶、噴霧器、香袋等。
本發明所要求保護的組合物中的多種藥劑可以作為生理學上可接受的鹽而提供，其中所述藥劑可以形成負電荷或正電荷的形式。藥劑形成鹽中的正電荷部分的實例非限制性地包括季銨鹽(在本文的別處定義)，如鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽等，其中季銨基團的氮原子是本發明化合物中與適當的酸反應的氮原子。藥劑形成鹽中負電荷形式的非限制性地包括由分子中的羧酸基團與適當的鹼(如，氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈣(Ca(OH)2)等)反應形成的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和鎂鹽。
如果需要，本發明的組合物可以存於包裝或分配裝置中——比如管理機構批准的試劑盒，該試劑盒可以包括含有活性成分的一個或多個單位劑型。例如，該包裝可以包括金屬或塑料箔，如泡罩包裝(blister pack)。所述包裝或分配器裝置可以附帶有施用說明書。該包裝或分配器還可以附帶有管理該組合物的製造、使用或銷售的政府機構規定形式的與容器關聯的注意事項，該注意事項是政府機構批准的組合物形式或人或獸醫施用的反映。在其他實施方案中，製備該組合物用於非處方藥(OTC)使用和銷售。
配入相容載體的含有本發明藥劑的組合物也可被製備、置入適當的容器中，並貼上預防和治療與衰老關聯的皮膚疾患的標籤。
因此，根據本發明的進一步方面，提供了化妝品和藥用化妝品(cosmeceutical)試劑盒。本發明的化妝品和藥用化妝品試劑盒包括上文描述的任何藥劑或藥劑的組合。
如上文所討論的並且如隨後的實施例部分中進一步證實的，儘管這些藥劑或藥劑組合具有抑制表皮細胞增殖的能力，但是本發明的藥劑或藥劑組合在治療與時間性老化和光老化關聯的皮膚疾患中的高效力也變得顯而易見。
一經考察以下的非限制性的的實施例後，本發明另外的目的、優勢和新穎特徵對於本領域一名普通技術人員而言將變得顯而易見。此外，如上文所敘述的以及如下文的權利要求部分中所要求保護的本發明的每一個不同的實施方案和方面均在以下的實施例中找到實驗支持。
實施例 以下實施例本質上僅被認為是解釋性的而非限制性的。對本發明所涉及領域的技術人員顯而易見的是，可以做出多種改進、改變和變化而不脫離本發明的範圍。
實施例1體外實驗 細胞培養 在兩種模型體系中對維生素D3、尼克醯胺和cADPR及其衍生物和類似物的抗增殖活性進行了測試(i)自發無限增殖化人角質形成細胞，在本文中將其稱為「HaCat細胞株」或「HaCat細胞」，其用作高度增殖表皮的模型，例如，但不限於銀屑病表皮(psoriatic epidermis)(Okenfels等人，1995)，以及用作外源調節劑對表皮分化作用的模型(Paramio等人，1997)。
這些化合物的抗增殖效果進一步在快速增殖的人角質形成細胞上證實，在本文中將所述角質形成細胞稱為「培養的人表皮角質形成細胞」，其用作檢測銀屑病治療中的抗增殖劑的模型(Nikoloff等人，1988)。
可以根據本發明使用這些模型來測試此處描述的藥劑的抗增殖效力，其中所述藥劑包括其衍生物、代謝物、激動劑和前藥。使用添加有5％胎牛血清(FCS)和1％抗生素(青黴素20單位/ml；鏈黴素20μg/ml和制黴菌素2.5單位/ml)的Eagle′s最低必需培養基(MEM-EAGLE)在37℃的95％空氣/5％CO2下於75cm2的燒瓶中常規培養無限增殖化人角質形成HaCat細胞。每3-4天更換培養基。
通過在常規使用的添加有10mM或20mM維生素D的培養基中培養HaCat細胞六個月來獲得與維生素D或維生素D衍生物一起生長的HaCat細胞長期培養物。
通過在常規使用的添加有NA和cADPR、維生素D和維生素A的組合的培養基中長時間培養HaCat細胞來同樣地獲得細胞與其他藥劑的其他長期培養物。
將通過正常整容手術(face-lift surgery)獲得的人表皮角質形成細胞(傳代3-6)在具有低鈣的無血清KGM-2BulletKit(Clonetics，USA)培養基中進行培養，以加速角質形成細胞的增殖。
試劑 尼克醯胺(NA)、環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、鈣三醇(1α，25-二羥基-維生素D3)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑(MTT)、碘化丙啶、二甲基亞碸(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、檸檬酸三鈉、igepal CA-630(NP-40)、三(羥甲基)氨基甲烷、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、核糖核酸酶A、四鹽酸精素(spermin-tetrahydrochloride)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇和過氧化氫(H2O2)均從Sigma(USA)獲得。
Eagle′s最低必需培養基(MEM-EAGLE)、DMEM、抗生素、胎牛血清(FCS)、L-穀氨醯胺、Dulbecco′s磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)和胰蛋白酶0.05％-EDTA溶液均從Biological Industries(Israel)獲得。
Keratinocyte Growth Medium-2Bullet KitCC-3107(用於使增殖加速)從Bio Whittaker，Inc.(Cambrex Company，Clonetics，USA)獲得。
抗人細胞角蛋白10(NCL-CK 10)和外皮蛋白(NCL-INV)鼠單克隆抗體從Novocastra Laboratories Ltd.(UK)獲得，CyTM 2-共軛羊抗鼠IgG從Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.(USA)獲得。
將HaCat細胞在25cm2或75cm2的組織培養燒瓶(Corning，USA)中進行繁殖，並採用24孔和96孔組織培養板(Corning，USA)來孵育使用了不同劑量NA(1-50mM/I)、cADPR(1-50μM)、維生素D3(1-10000nM)的細胞。
增殖試驗(MTT法) 根據製造商的方法在96孔微量滴定板上通過MTT法來測定使用不同濃度的維生素D、尼克醯胺(NA)和/或不同濃度的cADPR及其衍生物處理後HaCat細胞和培養的人表皮角質形成細胞的存活率和/或增殖情況。
簡而言之，將等量的細胞接種於每個孔中並孵育24小時。之後將NA或NA與另一種藥劑的組合(NA和cADPR、NA和維生素D3代謝物、NA與維生素A代謝物)以不同的濃度加入並將孔板另外孵育72小時。然後向每個孔中加入不含Ca+2和Mg+2的20微升(20μl)5mg/ml MTT磷酸鹽緩衝液(PBS)。將板置入培養箱中，在該培養箱中，MTT於大約3.5小時的期間內由線粒體脫氫酶轉化為不溶的MTT甲臢(formazan)晶體。然後除去培養基並將獲得的甲臢晶體溶解於0.2ml的DMSO。在ELISA讀數儀中於550nm對甲臢的數量進行量化。減去650nm處的背景值。重複進行三次實驗。
分化試驗 角質化包膜的形成 通過根據Sun和Green，H，1976中所描述的步驟測定角質化細胞包膜的形成來測量使用維生素D或其衍生物處理的HaCat細胞的晚期分化過程。
簡而言之，將細胞接種於24孔組織培養板並在附著之後(24小時)使該細胞暴露於不同濃度的NA(0、5、10、15和20mM)96小時。之後將細胞分離並重新懸浮於培養基中。採用血細胞計數器對四份等分樣品中的全部細胞和基底(小的、圓的)細胞進行計數。將剩餘的細胞倒出(spundown)，使用添加有1％β-巰基乙醇和1％SDS的10mM Tris-HCl(pH 7.4)處理10分鐘，並使用血細胞計數器對四份等分樣品中角質化的包膜細胞進行計數。所示出的數據是三項獨立實驗的結果。
間接免疫螢光 通過間接免疫螢光來估計維生素D對HaCat細胞早期(角蛋白k10表達)以及晚期(外皮蛋白表達)分化過程的影響。
簡而言之，將在玻璃蓋玻片上接種的2×104個細胞/ml轉移到含有0、5、10和20mM的維生素D或卡泊三醇的Petri碟中。在孵育72小時之後，使用PBS洗滌玻璃蓋玻片上的細胞，使用甲醇∶丙酮(1∶1)的冰冷混合物固定細胞並在-20℃下孵育10分鐘。之後使用PBS洗滌固定的細胞並與封閉緩衝液(1％BSA的PBS)一起孵育10分鐘，以減少蓋玻片對一級抗體(primary antibody)的非特異性吸收。此後，在37℃下於潮溼的室中將細胞與一級單克隆抗體孵育1小時(通過以1/50最終稀釋的抗人鼠單克隆抗體來檢測角蛋白10的表達；通過以1/100最終稀釋的抗人外皮蛋白鼠單克隆抗體來檢測外皮蛋白的表達)。在室溫下，將PBS徹底洗滌的細胞與以1/50最終稀釋的螢光體(fluorophor)共軛的羊抗鼠IgG一起培養30分鐘。在配備有表面螢光光學裝置(epifluorescence optics)和避免通道交叉汙染的適當濾光器的Zeiss顯微鏡(Axioskop-2)下觀察載玻片。通過計數相對於細胞總數的陽性細胞數來估計角蛋白10和外皮蛋白的表達水平。在每個載玻片上計算至少500-1000個細胞。所給出的數據是三項獨立實驗的平均值。
統計分析 結果以平均±平均的標準偏差(平均±SD)表示。由Student′st檢驗得出其具有統計學意義(P＜0.05)。
結果 圖2a示出在HaCat細胞株中採用維生素D3和尼克醯胺獲得的結果。圖2b示出當1α25(OH)2D3和NA如上文所描述地單獨應用於細胞株時抗增殖效應的減少，其來自於圖2a中示出的NA與1α25(OH)2D3的組合的抗增殖效應。
如圖2b所示，NA與1α25(OH)2D3的組合的抗增殖效應明顯高於這些化合物中每種單獨抗增殖效應的總和。當在HaCat細胞中使用100nM1α25(OH)2D3與5mM NA的組合時，觀察到細胞增殖抑制作用增強12％。這些結果清楚地證明了NA與維生素D3代謝物的組合在抑制表皮細胞增殖中的協同效應。鑑於這些結果，包括NA和維生素D3類似物的組合物在皮膚老化症狀的治療中是有用的觀察結果是令人意想不到的。
實施例2製劑 所述製劑主要由約0.1μg/g至約100μg/g的卡泊三醇單獨組成或者與約0.5mg/g至約3mg/g的NA，和/或約5μg/g至約27μg/g的cADPR一起組成。除非另有說明，否則本發明的製劑示範如下——但是不限於(W/W(g/100g) Carbopol0.3 丙二醇2.0 甘油 1.0 白凡士林 1.5 環二甲基矽酮 6.0 鯨蠟醇0.5 Lubrajel 10.0 三乙醇胺 0.3 卡泊三醇 0.005 尼克醯胺(任選的) 0.21 cADPR(任選的) 0.0013 水和賦形劑加至100g Steareth-20 2.4 Steareth-22.6 Prostearyl 15 8.0 蜂蠟 0.5 AbilZP 2434 3.0 丙二醇3.0 Carbopol941 0.25 三乙醇胺 0.25 卡泊三醇 0.005 尼克醯胺(任選的) 0.21 cADPR(任選的) 0.0013 水、賦形劑加至100g 白凡士林 5-50 礦物油10-50 羊毛脂0-5 維生素E 0-0.5 十八烷醇 1-15 Steareth-20-10 Steareth-20 1-5 EDTA 0-0.5 卡泊三醇 0.005 尼克醯胺(任選的) 0.21 cADPR(任選的) 0.0013 水、賦形劑加至100g 實施例3體內動物模型 將模擬諸如萎縮和老化等人皮膚疾患的動物模型用於測試化合物預防和治療所述疾患的效力。
將加速衰老的小鼠(SAM)確立為一組用作加速衰老和老化關聯疾患動物模型的相關純系小鼠(Takeda等人，1981)。為了分析SAM的皮膚特徵，進行了各種組織學和超微結構水平的研究來考察其形態學(Luo等人，2002)。傾向於加速衰老的小鼠(SAM P10)與耐受的小鼠(SAM R1)的皮膚組織學比較顯示SAM P10最具特色的特徵是肥大細胞數目以及真皮中膠原纖維密度的顯著增加。膠原束是紊亂的並且觀察到各種直徑的膠原纖維。SAM P10與SAM R1相比，皮膚中成纖維細胞的增殖能力下降。SAM P10小鼠是有用的老化的人皮膚動物模型，原因是其具有多種類似的形態學特徵，包括皮膚過敏性反應的減少及其減少的成纖維細胞增殖。
Chiba(Chiba等人，2003)已經開發了用於皮膚老化研究的有用的小鼠模型，特別是就基於角鯊烯單氫過氧化物(Sq-OOH)局部施用於無毛小鼠皮膚的膠原含量進行研究的小鼠模型。Sq-OOH治療的無毛小鼠提供了用於皮膚老化研究的有用的模型，特別是就膠原含量進行研究的模型。
對無毛小鼠反覆局部施用10nM Sq-OOH 15周減少了明顯的(definite)皮膚皺紋。使用圖像分析來對比由紫外線B(UVB)輻射和Sq-OOH治療誘導的皺紋形成，並且觀察到在暴露的皮膚中起皺紋的程度相似。然而，生物化學分析顯示每單位面積和質量的Sq-OOH處理的皮膚中膠原含量顯著下降，而在UVB輻射的皮膚中每單位面積無變化並且每單位質量的膠原減少。至於每單位面積的糖胺聚糖(GAG)含量，在Sq-OOH處理的皮膚和UVB輻射的皮膚中均觀察到顯著的增加。組織學觀察結果顯示Sq-OOH治療的皮膚中的表皮增生以及表皮變更(如，膠原降解和GAG)增加。由Sq-OOH誘發的組織學變化不如由UVB輻射誘發的那些明顯。
Takema等人(Takema等人，2000)已經開發了用於研究藥劑對老化和UV損傷皮膚的效應的模型。通過採用次紅斑劑量(suberythemal doses)的UVA或UVB長期輻射無毛小鼠(HR/ICR)所顯示出UV輻射引起的皮膚彈性變化結果相似。在UVB輻射後皮膚厚度顯著增加，而在UVA和UVB輻射後皮膚的彈性顯著下降，並且在UVA輻射後粘度與彈性的比值顯著增加。這些變化與先前在採用相同手段進行的人面部皮膚體內研究中所報導的那些相似。
用於研究化合物和組合物對老化皮膚的效應的其他動物模型包括美國專利第5,648,061和6,689,936號中所公開的皮膚光老化轉基因小鼠模型。
實施例4在人類受治療者中的抗皺效應 描述了在對人類受治療者施用本發明的組合物後所獲得的抗皺效應。選擇35到70歲的成年女性志願者並將不同製劑的抗皺效果與安慰劑(無活性成分的相同製劑)的效果進行對比。根據隨機分配，將製劑施用到位於左眼或右眼拐角處的精確劃分的部位，每天兩次，共28天。所測量的參數是眼睛拐角處的皮膚細紋和皺紋(稱為眼角皺紋)的減輕。通過本領域已知的方法來實現不同程度減輕的量化(Sauerman等人，2002；在Corcuff和Pierard，1998中進行評論)。
儘管已特別地描述了本發明，但是本領域技術人員應理解的是可以做出多種變化和改進。因此，本發明不應解釋為限制於特別描述的實施方案，相反，通過參考隨後的權利要求能夠更容易地理解本發明的範圍、實質和概念。
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權利要求
1.一種用於預防、延緩、阻止或逆轉哺乳動物皮膚萎縮的方法，其包括以下步驟
向皮膚局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物包括至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述維生素D3類似物包括9，10開環甾醇化學結構。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述維生素D3類似物選自鈣三醇和卡泊三醇。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述維生素D3類似物為卡泊三醇。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物皮膚為人皮膚。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述皮膚萎縮與甾族化合物誘導的萎縮、絕經誘導的萎縮或老化相關聯。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述皮膚萎縮與老化相關聯。
8.一種預防或治療與老化相關的表皮病的方法，其包括以下步驟
向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物包括至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；皮膚病學上有效量的至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑、尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述維生素D3類似物包括9，10開環甾醇化學結構。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述維生素D3類似物選自鈣三醇和卡泊三醇。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述維生素D3類似物為卡泊三醇。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述受治療者為人類受治療者。
13.根據權利要求8所述的方法，其中所述與老化相關的表皮病與時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關聯。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述表皮病選自細紋、皺紋、變色、下垂、擴大的毛孔、皮膚粗糙、皮膚乾燥、痤瘡、脫髮和妊娠紋組成的組中的至少一種。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述表皮病為皺紋。
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述表皮病為細紋。
17.一種預防或治療與老化相關的表皮病的方法，其包括以下步驟
向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物主要由至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑及其前藥組成的組的藥劑；以及皮膚病學上可接受的載體組成。
18.一種預防或治療與老化相關的表皮病的方法，其包括以下步驟
向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物主要由至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；至少一種選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體組成。
19.一種預防或治療與老化相關的表皮病的方法，其包括以下步驟
向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物主要由至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；至少一種選自環腺苷二磷酸核糖(cADPR)、cADPR衍生物、cADPR代謝物、cADPR激動劑及其前藥組成的組的藥劑；至少一種選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體組成。
20.一種預防或治療與老化相關的表皮病的方法，其包括以下步驟
向需要其的受治療者局部施用皮膚病學上有效量的組合物，所述組合物主要由至少一種選自卡泊三醇和鈣三醇組成的組的活性劑；以及皮膚病學上可接受的載體組成。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述組合物主要由卡泊三醇組成。
22.至少一種選自維生素D3和維生素D3類似物組成的組的活性劑；以及至少一種選自尼克醯胺、尼克醯胺激動劑、尼克醯胺衍生物、尼克醯胺代謝物及其前藥組成的組的活性劑用於製備治療與皮膚萎縮、時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關的表皮病的局部施用的治療組合物或化妝品組合物的用途。
23.至少一種選自鈣三醇和卡泊三醇組成的組的活性劑用於製備治療與皮膚萎縮、時間性老化、光老化或時間性老化與光老化的組合相關的表皮病的局部施用的治療組合物或化妝品組合物的用途。
全文摘要
公開了用於治療皮膚萎縮以及改善皮膚外觀和質感的組合物。該方法包括將維生素D3或特異性的維生素D3類似物作為主要成分單獨或結合cADPR和或尼克醯胺局部施用。所述組合物在預防和治療時間性老化和或光老化症狀中特別有效，其中所述症狀包括細紋(fine lines)、皺紋和變色。
文檔編號A01N25/00GK101217868SQ200680022061
公開日2008年7月9日 申請日期2006年5月10日 優先權日2005年5月10日
發明者艾維凱姆·海瑞爾, 澤夫·艾文-陳 申請人:德米普瑟爾有限公司