基於抗重組ul51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲elisa法的製作方法

2023-06-26 16:23:56

專利名稱：基於抗重組ul51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲elisa法的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物醫學領域，特別涉及基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原 捕獲ELISA法。
背景技術：
鴨瘟(Duckplague，DP)，又稱鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鴨、 鵝、天鵝等雁形目動物的一種急性接觸性傳染病，其致病特徵是血管損傷、組織出血、消化 道和淋巴器官損傷。該病可導致商品水禽的產蛋量下降和死亡，對野生水禽也有不同的致 死率。DP的病原為DPV (Duck plague virus, DPV)，DPV是一種泛嗜性全身性感染的病毒， 目前大多數學者把其暫時列為α皰疹病毒亞科，但尚未分屬。目前，已報導的DPV檢測方 法有病毒分離鑑定、聚合酶鏈式反應(PCR)、螢光實時定量PCR、間接免疫酶組化法、間接免 疫螢光法、電鏡觀察、原位雜交、間接原位PCR法、血清中和試驗(SNT)、瓊脂凝膠擴散試驗、 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、反向被動血凝試驗、微量固相放射免疫測定法、生物素標記寡 核苷酸探針原位檢測、地高辛標記核酸探針法和光敏生物素標記法等，這些方法各有特點。 但是，傳統的病毒分離鑑定方法大約需4 5d，且方法繁瑣，費時費力。一些免疫學方法以 及PCR方法也往往需要特殊的儀器、設備以及熟練的技術人員。此外，許多血清學檢測方法 都是基於純化的DPV全病毒產生的抗體來檢測DPV，由於病毒純化的複雜性和純化後的病 毒中會摻雜有許多宿主細胞成分，而導致許多假陽性結果出現。ELISA方法是免疫學檢驗中最重要、也是最常用的方法，目前，應用抗原捕獲 ELISA (AC-ELISA)方法對病毒進行檢測的研究已有許多報導。在檢測DPV方法中，賈仁勇在 《鴨瘟病毒蛋白質組二維電泳特性和UL24基因的發現、原核表達及應用研究》中公開了已有 基於UL24重組蛋白抗體的AC-ELISA的報導，該方法用兔抗UL24重組蛋白多克隆抗體包被 酶標板，以鴨抗重組UL24蛋白多克隆抗體作為抗原捕獲抗體，建立了敏感性、特異性、重複 性好的DPV抗原捕獲ELISA檢測方法。UL51蛋白為鴨瘟病毒的一種皮層蛋白，具有良好的 免疫原性和反應原性，用抗重組UL51蛋白多克隆抗體建立檢測DPV的AC-ELISA方法至今 無報導。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗 原檢測方法，該方法特異性和敏感性高的鴨瘟病毒抗原檢測方法，其能捕獲16ng/mL鴨瘟 病毒抗原。為實現上述目的，本發明的技術方案為基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，具體步驟為a固相抗體的製備將濃度大於或等於12. 5μ g/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG 與固相載體連結，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗體及雜質，得固相抗體；b加待測樣品將待測樣品與步驟a所得固相抗體保溫反應並洗滌去雜質，得抗原-A抗複合物；c與B抗重組UL51蛋白抗體IgG反應將濃度大於或等於25 μ g/mL的B抗重組 UL51蛋白抗體IgG與步驟b所得抗原-A抗複合物保溫反應並洗滌去雜質，得抗原-A抗-B 抗複合物；d與酶標抗體反應將酶標抗體作體積小於或等於2000倍的稀釋，得酶標抗體稀 釋液，將酶標抗體稀釋液與步驟c所得抗原-A抗-B抗複合物保溫反應，得抗原-A抗-B抗 複合物_酶標抗體複合物；e顯色在步驟d所得酶標抗體複合物中加入色原底物避光顯色後，加入終止液終 止反應得顯色樣品液；f檢測及結果判定將步驟e所得顯色樣品液用酶標儀測定OD45tlnm值，當OD45tlnm值
>0. 265時判為陽性，當OD450nm彡0. 265時判為陰性。步驟a所述的A抗重組UL51蛋白抗體IgG中A為免疫學研究中常規實驗動物中 除鴨外的任一種動物，步驟c所述的B抗重組UL51蛋白抗體IgG中B為免疫學研究中常規 實驗動物中除A外的任一種動物，步驟d中所述酶標抗體為HRP標記的免疫學研究中常規 實驗動物中除A和B外的動物抗B IgG。進一步，所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，具體步 驟為a固相抗體的製備將濃度等於12. 5 μ g/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG與固 相載體連結，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗體及雜質，得固相抗體；b加待測樣品將待測樣品與步驟a所得固相抗體保溫反應並洗滌去雜質，得抗 原-A抗複合物；c與B抗重組UL51蛋白抗體IgG反應將濃度等於25 μ g/mL的B抗重組UL51蛋 白抗體IgG與步驟b所得抗原-A抗複合物保溫反應並洗滌去雜質，得抗原-A抗-B抗複合 物；d與酶標抗體反應將酶標抗體作體積等於2000倍的稀釋，得酶標抗體稀釋液， 將酶標抗體稀釋液與步驟c所得抗原-A抗-B抗複合物保溫反應，得抗原-A抗-B抗複合 物_酶標抗體複合物；e顯色在步驟d所得酶標抗體複合物中加入色原底物避光顯色後，加入終止液終 止反應得顯色樣品液；f檢測及結果判定將步驟e所得顯色樣品液用酶標儀測定OD45tlnm值，當OD45tlnm值
>0. 265時判為陽性，當OD450nm彡0. 265時判為陰性。進一步，步驟a中所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG、步驟b中所述待測樣品、步驟 c中所述B抗重組UL51蛋白抗體IgG及步驟d中酶標抗體稀釋液的加入量為等體積；進一步，步驟a中所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG、步驟b中所述待測樣品、步驟c 中所述B抗重組UL51蛋白抗體IgG及步驟d中酶標抗體稀釋液的加入量為100 200 μ 1 ；進一步，步驟a中所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG為鼠抗重組UL51蛋白抗體IgG， 步驟c中所述B抗重組UL51蛋白抗體IgG為兔抗重組UL51蛋白抗體IgG，步驟d中所述酶 標抗體為羊抗兔IgG-HRP ；進一步，步驟d中所述色原底物為四甲基聯苯胺；
進一步，步驟e中避光顯色的時間為20分鐘；進一步，所述方法還包括空白對照實驗和陰性對照實驗。本發明的有益效果在於本發明基於抗重組UL51蛋白抗體建立的抗原捕獲 ELISA(AC-ELISA)法，其特異性好，可以檢測陽性DPV(鴨瘟病毒)細胞培養液及臨床採 集樣品洩殖腔棉拭紙中的DPV抗原，而檢測含DHV的鴨胚尿囊液、含RA的菌體培養液和 含E. coli菌體培養液等結果均為陰性；該方法批內和批間重複試驗顯示變異係數分別為
0.81% 1. 68%禾Π 0. 99% 2. 82%，小於5%，能檢出16ng/mL病毒抗原。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖I-A為DPV UL51基因的PCR擴增M指DL2000相對分子質量標準，1指以正常 DEF基因組DNA為模板的PCR擴增產物，2指以DPV CHv毒株基因組DNA為模板的PCR擴 增產物(箭頭所示的是其分子量大小，約為760bp)；圖I-B為重組質粒pMD18-UL51的雙 酶切鑑定M指相對分子質量標準III，1指重組質粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I雙酶 切得到的兩個片段(箭頭所示小片段的分子量大小約為760bp)；圖I-C為重組表達載體 pET28a-UL51的雙酶切鑑定M指相對分子質量標準III，1指重組表達載體pET28a_UL51，2 指重組表達載體pET28a-UL51用EcoR I和Xho I雙酶切得到的兩個片段(箭頭所示小片 段的分子量大小約為760bp)。圖2-A為重組表達蛋白的SDS-PAGE鑑定M為蛋白質相對分子質量標準，1為陰性 對照(未加IPTG誘導)，2為IPTG誘導(箭頭所示的蛋白質分子量大小約為34KD)；圖2-B 為誘導劑IPTG不同終濃度誘導表達結果1-7的IPTG濃度分別為0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. O 和1. 2mmol/L ；圖2-C為不同溫度誘導pET28a_UL51表達結果1_3的溫度分別為20、30和 37°C ；圖2-D為不同時間誘導pET28a-UL51表達結果1_7的誘導時間分別為1、2、3、4、5、6、 7 禾口 8h。圖3-A為重組UL51蛋白純化產物的SDS-PAGE分析M為蛋白質分子量，1為IPTG 誘導的Iml菌液，2為粗提的UL51蛋白包涵體，3為50mM咪唑洗脫峰(不含純化的重組UL51 蛋白)；4為300mM咪唑洗脫峰(含有純化的重組UL51蛋白)；圖3-B為純化的兔抗重組 UL51蛋白抗體IgG的SDS-PAGE分析M指標準蛋白質分子量，1指過柱純化的兔抗UL51蛋 白抗體IgG0圖4為瓊脂糖凝膠擴散試驗檢測兔抗重組UL51蛋白高免血清效價測定。圖5為純化的抗重組UL51蛋白抗體的SDS-PAGE分析M.標準蛋白質分子量(KD)；
1.過柱純化兔抗UL51蛋白抗體IgG;2.過柱純化鼠抗UL51蛋白抗體IgG。圖6為本方法的特異性試驗結果照片圖。圖7為本方法的敏感性試驗結果照片圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明的優選 實施例進行詳細的描述。本實施例中將所述重組UL51蛋白的獲得是通過構建原核表達質粒pET28a-UL51、轉化表達菌並發酵培養，收集到大量的含有重組UL51蛋白的菌體沉澱，再 通過超聲波破碎菌體、重組UL51蛋白包涵體冼滌、純化及梯度透析而獲得的；用所述重組 UL51蛋白對兔和鼠進行常規免疫程序和純化，獲得兔抗重組UL51蛋白抗體IgG和鼠抗重 組UL51蛋白抗體IgG;進一步確定了兔抗重組UL51蛋白抗體IgG和鼠抗重組UL51蛋白抗 體IgG的最佳濃度範圍及酶標抗體最適濃度及陰陽性臨界值的確定，制定了一種特異性和 敏感性高的鴨瘟病毒抗原檢測方法，其能捕獲16ng/mL鴨瘟病毒抗原。實施例基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA檢測方法一鴨瘟病毒UL51基因的克隆、原核表達及UL51蛋白的純化1材料準備1. 1菌株、質粒和毒株質粒pMD18-T，購自大連寶生物工程有限公司；原核表達質粒pET28a(+)，Novagen 公司產品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv強毒株，由 四川農業大學禽病研究中心提供。1. 2試驗動物10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性；健康雄性白兔4隻，體重2_3kg/只，購 自雅安某兔場；健康Vi sta大鼠20隻，購自四川大學。2實驗方法2. IDPV UL51 基因的克隆2. 1. 1引物設計利用Primer Premier5. O 軟體，參考 UL51 基因序列(GenBank 登錄號DQ072725)， 由寶生物生物技術有限公司合成。引物DPV-UL51F 5，-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3『(劃線部分為 EcoRI 位點)；弓丨物 DPV-UL51R 5』 -TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3』 (劃線部分為 XhoI 位點)。合成後，以適 量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmol/L，_20°C保存備用。2. 1. 2DPV基因組DNA的提取a、正常鴨胚成纖維細胞(DEF)的製作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用5%碘酒 和75%酒精消毒蛋殼表面。無菌操作條件下將胚體取出並用PBS將胚體洗淨，剪去頭、翅、 腿和內臟，PBS衝洗後將胚體剪成Imm大小的小塊，加PBS適量，之後置於三角瓶內，加細胞 分散劑(2.5%胰蛋白酶)15(^1/胚，於371水浴中消化31^11。立即將細胞懸液以4000r/ min離心5min，傾棄上清，細胞沉澱用適量的MEM懸浮後，用5層紗布過濾，向濾液中加入 10%小牛血清和100IU/mL雙抗後，分裝於IOOmL細胞培養瓶中，7mL/瓶，水平靜置於37°C 細胞培養箱中進行培養。b、DPV增殖取剛剛長成緻密單層的DEF，棄生長營養液，用滅菌PBS清洗細胞表面 2次後，加入DPV病毒液2 3mL覆蓋細胞表面進行吸附，37°C吸附120min後棄病毒液，然 後加含3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM維持營養液，之後37°C培養。同時做未接毒的 DEF對照。c,DNA提取方法直接從感染細胞中提取DPV基因組DNA的具體步驟如下⑴選 取用DPV種毒感染後細胞病變(CPE)達60% 70%的DEF (IOOmL細胞瓶)；同時選取細 胞形態正常的DEF作對照；(2)傾去細胞培養液，加入500yL的細胞裂解液，同時加蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為200 μ g/mL，輕輕混勻後，37°C孵育IOmin ； (3)將細胞懸浮液倒入 EP離心管中，並用500 μ L的飽和酚洗滌殘存於細胞瓶內的裂解物，倒入離心管中；(4)用飽 和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/LNaAC，混 勻後，加入2倍體積冷無水乙醇，-20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min離心20min，沉澱 用預冷的70%乙醇洗滌兩次；(7)真空抽乾後，溶於適量TE緩衝液中，加入IyL RNA酶， 37°C作用30min，-20°C保存備用。2. 1. 3PCR 擴增 DPV UL51 基因PCR反應體系為
權利要求
基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，其特徵在於，具體步驟為a固相抗體的製備將濃度大於或等於12.5μg/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG與固相載體連結，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗體及雜質，得固相抗體；b加待測樣品將待測樣品與步驟a所得固相抗體保溫反應並洗滌去雜質，得抗原 A抗複合物；c與B抗重組UL51蛋白抗體IgG反應將濃度大於或等於25μg/mL的B抗重組UL51蛋白抗體IgG與步驟b所得抗原 A抗複合物保溫反應並洗滌去雜質，得抗原 A抗 B抗複合物；d與酶標抗體反應將酶標抗體作體積小於或等於2000倍的稀釋，得酶標抗體稀釋液，將酶標抗體稀釋液與步驟c所得抗原 A抗 B抗複合物保溫反應，得抗原 A抗 B抗複合物 酶標抗體複合物；e顯色在步驟d所得酶標抗體複合物中加入色原底物避光顯色後，加入終止液終止反應得顯色樣品液；f檢測及結果判定將步驟e所得顯色樣品液用酶標儀測定OD450nm值，當OD450nm值＞0.265時判為陽性，當OD450nm≤0.265時判為陰性。步驟a所述的A抗重組UL51蛋白抗體IgG中A為免疫學研究中常規實驗動物中除鴨外的任一種動物，步驟c所述的B抗重組UL51蛋白抗體IgG中B為免疫學研究中常規實驗動物中除A外的任一種動物，步驟d中所述酶標抗體為HRP標記的免疫學研究中常規實驗動物中除A和B外的動物抗B IgG。
2.根據權利要求1所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，其 特徵在於，具體步驟為a固相抗體的製備將濃度等於12. 5 μ g/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG與固相載 體連結，用封閉液封閉，洗滌去除未結合的抗體及雜質，得固相抗體；b加待測樣品將待測樣品與步驟a所得固相抗體保溫反應並洗滌去雜質，得抗原-A 抗複合物；c與B抗重組UL51蛋白抗體IgG反應將濃度等於25 μ g/mL的B抗重組UL51蛋白抗 體IgG與步驟b所得抗原-A抗複合物保溫反應並洗滌去雜質，得抗原-A抗-B抗複合物； d與酶標抗體反應將酶標抗體作體積等於2000倍的稀釋，得酶標抗體稀釋液，將酶標 抗體稀釋液與步驟c所得抗原-A抗-B抗複合物保溫反應，得抗原-A抗-B抗複合物-酶 標抗體複合物；e顯色在步驟d所得酶標抗體複合物中加入色原底物避光顯色後，加入終止液終止反 應得顯色樣品液；f檢測及結果判定將步驟e所得顯色樣品液用酶標儀測定OD45tlnm值，當OD45tlnm值> 0. 265時判為陽性，當OD450nm≤0. 265時判為陰性。
3.根據權利要求1或2所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA 法，其特徵在於步驟a中所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG、步驟b中所述待測樣品、步驟c 中所述B抗重組UL51蛋白抗體IgG及步驟d中酶標抗體稀釋液的加入量為等體積。
4.根據權利要求3所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，其特徵在於步驟a中所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG、步驟b中所述待測樣品、步驟c中所 述B抗重組UL51蛋白抗體IgG及步驟d中酶標抗體稀釋液的加入量為100 200 μ 1。
5.根據權利要求1或2所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA 法，其特徵在於步驟a中所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG為鼠抗重組UL51蛋白抗體IgG， 步驟c中所述B抗重組UL51蛋白抗體IgG為兔抗重組UL51蛋白抗體IgG，步驟d中所述酶 標抗體為羊抗兔IgG-HRP。
6.根據權利要求1所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，其 特徵在於步驟d中所述色原底物為四甲基聯苯胺。
7.根據權利要求1所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，其 特徵在於步驟e中避光顯色的時間為20分鐘。
8.根據權利要求1所述的基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒抗原捕獲ELISA法，其 特徵在於所述方法還包括空白對照實驗和陰性對照實驗。
全文摘要
本發明涉及動物醫學領域，特別涉及基於抗重組UL51蛋白抗體的鴨瘟病毒(DPV)抗原捕獲ELISA法，具體步驟包括固相抗體的製備、加待測樣品、與B抗重組UL51蛋白抗體IgG反應、酶標抗體反應、顯色及檢測並判定；本方法特異性好，可以檢測陽性DPV細胞培養液及臨床採集樣品洩殖腔棉拭紙中的DPV抗原，而檢測含DHV的鴨胚尿囊液、含RA的菌體培養液和含E.coli菌體培養液等結果均為陰性；該方法批內和批間重複試驗顯示變異係數分別為0.81％～1.68％和0.99％～2.82％，小於5％，能檢出16ng/mL病毒抗原。
文檔編號C07K14/115GK101982777SQ20101029951
公開日2011年3月2日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者汪銘書, 沈嬋娟, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農業大學實驗動物工程技術中心