透明顫菌血紅蛋白基因表達盒及其提高黑麴黴產糖化酶產量的方法

2023-06-30 17:39:31 1

專利名稱：透明顫菌血紅蛋白基因表達盒及其提高黑麴黴產糖化酶產量的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種透明顫菌血紅蛋白基因表達盒及其提高 黑麴黴產糖化酶產量的方法。
背景技術：
葡萄糖是生物體內新陳代謝不可缺少的營養物質，其氧化反應所釋放出的熱 量是人類生命活動所需能量的重要來源。工業生產中一般使用糖化酶-澱粉酶雙酶法 生產葡萄糖，糖化酶是澱粉轉化為葡萄糖過程的主要酶類之一，屬於食品工業生產中常 用的一種酶製劑，又稱葡萄糖澱粉酶(Glucoamylase，EC. 3. 2.1.3.)或澱粉葡萄糖苷酶 (Amyloglucosidase)、Y_澱粉酶(Y-amylase)。糖化酶是一種具有外切活性的酶，通過水解 澱粉、澱粉糊精、糖原等碳鏈上的1，4連接的非還原端，而得到終產物-D-葡萄糖。黑麴黴(Aspergillus niger)是國內外產糖化酶的常用菌種，屬於好氧微生物，此 類微生物的生長及產物的形成受多種參數的影響，例如培養基、發酵PH值、溫度、溶解氧的 濃度、真菌的形態等。在黑麴黴代謝過程中，對氧的需求主要是通過通風與攪拌來供給，因 供氧過程是一個高能耗的過程，而且氧往往也是制約產物產率水平的一個限制因素，所以 提高發酵過程中氧的利用率對發酵工業提高生產水平和節能降耗均有很大意義。只有溶解 於培養液中的氧才有可能為其中的微生物細胞所利用，發酵液中的溶氧水平變化取決於發 酵罐的供氧能力和微生物的耗氧速率。在好氧發酵中，將溶氧水平控制在臨界氧濃度以上， 即可避免因供氧不足發生代謝異常，也可避免過度的供氧操作引起的能量消耗和對細胞可 能的傷害。因此，要提高氧傳遞和利用效率，除了必須配置合適的發酵通風設備外，還要充 分利用現有設備的供氧能力，同時根據不同的發酵過程合理控制溶氧水平。透明顫菌血紅蛋白是至今唯一在原核生物中發現的血紅蛋白，是目前研究的最清 楚的一種原核生物蛋白之一。血紅蛋白能使透明顫菌這一專性好氧的革蘭氏陰性菌在貧氧 環境中生長。目前透明顫菌血紅蛋白(Vffi)基因已被克隆到多種異源好氧微生物體內，促 進了微生物發酵過程中同等條件下氧的利用率，尤其在限氧條件下，大大提高了菌體的生 長密度、促進有氧代謝、加快生物修復促進基因工程菌蛋白和相關代謝產物。由此可見，異 源表達透明顫菌血紅蛋白可以提高細胞對溶氧的利用能力，促進細胞生長，提高產物的產 量和收率。目前，尚未見關於利用透明顫菌血紅蛋白提高黑麴黴菌種限氧條件下的溶氧能 力，進而提高其產糖化酶能力的報導。

發明內容
為解決限氧條件下黑麴黴菌種溶氧不足的問題，本發明的第一個目的在於提供一 種透明顫菌血紅蛋白基因表達盒，所述表達盒由透明顫菌血紅蛋白基因、三磷酸甘油醛脫 氫酶基因的啟動子和終止子組成。
所述三磷酸甘油醛脫氫酶基因為黑麴黴三磷酸甘油醛脫氫酶基因。所述啟動子由1261個鹼基組成，如SEQ ID NO. 1所示。所述終止子由3 個鹼基組成，如SEQ ID NO. 2所示。所述透明顫菌血紅蛋白基因由441個鹼基組成，如SEQ ID NO. 3所示。本發明的第二個目的在於提供一種含有透明顫菌血紅蛋白基因表達盒的重組黑 麴黴菌。本發明的第三個目的在於提供一種含有透明顫菌血紅蛋白基因表達盒的重組黑 麴黴菌的製備方法，包括以下步驟1)構建透明顫菌血紅蛋白基因表達盒Pgpd-vhb-Tgpd ；2)利用 Pgpd-vhb-Tgpd 表達盒構建質粒 pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd ；3)用質粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd和質粒pAN7-l共轉化黑麴黴，獲得含有透明顫菌 血紅蛋白基因表達盒Pgpd-vhb-Tgpd的重組黑麴黴菌。本發明的技術路線為1、利用分子生物學方法克隆黑麴黴三磷酸甘油醛脫氫酶基因的強啟動子和終止 子序列；2、利用上述強啟動子和終止子，通過重疊PCR方法，構建透明顫菌血紅蛋白基因 (vhb)表達盒 Pgpd-vhb-Tgpd 和質粒 pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd ；3、用質粒pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd和質粒pAN7-l共轉化黑麴黴，獲得含有透明顫菌 血紅蛋白基因(vhb)表達盒Pgpd-vhb-Tgpd的重組黑麴黴；4、貧氧條件下，驗證重組黑麴黴產糖化酶的能力有所提高。本發明針對黑麴黴菌株實施分子改造，從分子水平解決限氧條件下黑麴黴菌種溶 氧不足的問題，為黑麴黴液體深層發酵產糖化酶降低能耗。


圖1是黑麴黴GAPDH基因啟動子序列電泳檢測圖，M :250bp marker，1為黑麴黴 GAPDH啟動子序列；圖2是黑麴黴GAPDH基因終止子序列電泳檢測圖，M :250bp marker, 1為黑麴黴 GAPDH終止子序列；圖3是透明顫菌血紅蛋白基因電泳檢測圖，M :250bp marker ;1，2為透明顫菌血紅 蛋白基因序列；圖4是overlap PCR連接GAPDH的啟動子序列及vtib序列電泳檢測圖，M :250bp marker ；1為GAPDH的啟動子序列及vtib序列連接後片段；圖 5 是重疊延伸 PCR 構建 vhb 表達盒(Pgpd-vhb-Tgpd)，M :250bp marker ；1 為表 達盒 Pgpd-vhb-Tgpd ；圖6是含vhb基因陽性轉化子電泳檢測圖，M :250bp marker ； 1，2，3，4，5，9為陽性
轉化子圖7是重組菌與對照菌的SDS-PAGE電泳檢測圖，M 蛋白質marker ；0為對照菌；1 為陽性重組菌；2為陰性重組菌；圖8是質粒pPICZ α A-vhb構建流程圖9是質粒pMD19-Pgpd-vhb_Tgpd構建流程圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。實施例1透明顫菌血紅蛋白基因(vhb)表達盒Pgpd-vhb-Tgpd的構建(一 )菌種、質粒及培養基黑麴黴(Aspergillus niger)購於中國工業微生物菌種保藏中心，CICC編 號40125 ；含vtib基因的質粒pPICZaA-vhb，其構建流程參見圖8。質粒pPICZaA購自 Invitrogen 公司。黑麴黴的培養固體復甦採用PDA培養基，培養溫度；液體擴增培養採用YPD或玉米漿粉培 養基(玉米漿粉1 %，麥芽糊精12%，硫酸銨2 %。)，培養溫度為，轉速為200rpm。黑麴黴發酵產糖化酶培養基配方玉米澱粉8%，藥媒4. 3%，麥麩1 %。其中玉米 澱粉在配製的過程中需要經高溫α-澱粉酶液化。(二)vtib基因、啟動子和終止子的克隆根據NCBI公布的黑麴黴的三磷酸甘油醛脫氫酶基因序列，找到三磷酸甘油醛脫 氫酶基因的啟動子序列(U61bp)和終止子序列(3^bp)。分別設計三磷酸甘油醛脫氫酶 基因的啟動子序列的上下遊引物Pgpdl、Pgpd2和終止子序列上下遊引物Tgpdl、Tgpd2，以 黑麴黴HEOl基因組DNA為模板，以Pgpdl、Pgpd2引物擴增的三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟 動子序列；以Tgpdl、Tgpd2引物擴增三磷酸甘油醛脫氫酶基因的終止子序列。取上述5yL 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見圖1和圖2。用TaKaRa Agarose Gel DNA Pufification Kit 回收PCR產物。連接TaKaRa公司的pMD19_T simple vector，轉入大腸杆 菌Ε. coliToplOF'，通過驗證獲得陽性克隆，並送至^witrogen公司測序驗證，對比分析 測序結果，對含有啟動子和終止子序列的質粒分別命名pMD19-T-Pgpd和pMD19-T-Tgpd，。提取質粒pPICZ α -vhb作為PCR擴增vhb的模板，根據GeneBank中vtib基因的核 苷酸序列設計引物vhbB l、vhbB2，擴增vtib基因序列，取上述5 μ L擴增產物進行瓊脂糖凝 膠電泳檢測，電泳結果見圖3。(三)Pgpd-vhb-Tgpd表達盒的構建1.以pMD19-T_Pgpd為模板，gpdAl和gpdA2為上、下遊引物，採用 TaKaRaPrimeSTAR HS DNA Polymerase進行擴增三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列。 瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收1261bp大小的片段，命名為Pgpd，取上述5 μ L擴增產物進行瓊 脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見圖4。2.以pMD 19-T-Tgpd為模板，gpdCl和gpdC2為上、下遊引物，採用 TaKaRaPrimeSTAR HS DNA Polymerase進行擴增三磷酸甘油醛脫氫酶基因的終止子序列。 瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收329bp大小的片段，命名為Tgpd，取上述5μ L擴增產物進行瓊 脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見圖4。3.以 Pgpd、vhb 為模板，gpdAl 和 vhbB2 為上、下遊引物，採用 TaKaRaPrimeSTAR HS DNA Polymerase進行overlap PCR擴增便可將三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列 和νΙΛ拼接起來。瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收約1702bp大小的片段，命名為Pgpd-vhb。
4.以 Pgpd-vhb、Tgpd 為模板，gpdAl 和 gpdC2 為上、下遊引物，採用 TaKaRaEx TaqTM進行overlap PCR擴增便可將三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列、vtib及三磷酸 甘油醛脫氫酶基因的終止子序列拼接起來。瓊脂糖凝膠電泳後切膠回收約2031bp大小的 片段，命名為Pgpd-vhb-Tgpd，取上述5 μ L擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見 圖5。5.上述回收產物連接TaKaRa公司的pMD19T質粒simple vector，轉入大腸桿菌 E. coli ToplOF'，通過驗證獲得陽性克隆，命名為pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd，構建流程參見圖 9，並送去hvitrogen公司測序，比對分析測序結果。
本實施例所用引物序列見表1. 表1序列擴增及表達盒構建中所需的引物
引物名稱
引物序列(5，-3』)
Pgpdl Pgpd2 Tgpdl Tgpd2
gpdAl gpdA2 vhbBl
GCG TTT AAA ACA GAG GCC AGA GCA TCA CCA ACA TGG TGC GAA TTC TGT TTA GAT GTG TCTATG TGG CGG GG GTG TCT AGA GAA TCA GGA CGG CAA ACT G ATA GGA TCC CTG CAG AGC TTA GTC AC
ACA GAG GCC AGA GCA TCA CCA ACA TGG TAC CCT CAG CAA TAA TAT GCA
TAC GGT TTG TTG GTC TAA CAT TGT TTA GAT GTG TCT ATG TGG CGG GG
CCC CGC CAC ATA GAC ACA TCT AAA CAA TGT TAG ACC AAC AAA CCG TA
vhbB2CCT GAT TCT TAT TCA GCG TCT TGA GCG TAC AAA TCC GCT TCC
Γ TGT ACG CTC AAG ACG CTG AAT AAG AAT CAG GAC GGC AAAgpdClCTG AAT
CTG CAG AGC TTA GTC ACC ACC GCA GCA TTG CAT CTG GGG gpdC2_CCG ACG TCT___實施例2製備含有Pgpd-vhb-Tgpd表達盒的重組黑麴黴菌(一)黑麴黴菌原生質體製備1)吸取1. 5mL無菌水從PDA培養平板上新鮮且成熟的黑麴黴孢子，製備成濃度為 0. 8 1. OX IO8個/mL的孢子懸浮液，接種於40 50mL的YPD/Mandels液體基礎培養基 中，28°C，250rpm 培養 Ilh 左右。2)取培養Ilh左右的菌液在光學顯微鏡下觀察，大部分孢子已萌發時，將培養液 轉入25mL大離心管，8000rpm，離心7min，去上清，用IM MgSO4IOmL洗滌兩次，8000rpm,離心 IOmin,去上清。3)酶解液的製備和酶解反應準確稱取IOOmg溶壁酶(Sigma)錫紙包裹，酒精滅 菌送入超淨工作檯，加入IOmLlM MgSO4溶解後，用一次性過濾器過濾除菌。將上述菌體沉 澱中加入到裝有IOmL酶解液的三角瓶中，置於^°C，70rpm搖床酶解2 2.證。4)將酶解溶液轉移至25mL大離心管中，用STC溶液補滿，8000rpm，離心20min，去 上清，用IOmL STC溶液洗滌兩次，8000rpm，離心lOmin，去上清。5)將沉澱用500 600 μ LSTC溶液重懸，取少許懸濁液在光學顯微鏡下計數，並用 STC溶液將其稀釋到1. 0 X IO8個/mL。( 二)質粒 pMD 19-Pgpd-vhb-Tgpd 和 pAN7_l 的轉化
1)取上述方法(一)製備的原生質體懸濁液200yL，加入10 15yL質粒 pMD19-Pgpd-vhb-Tgpd (約 10 μ g)和 pAN7_l (約 10 μ g)，輕輕混勻。溫控板上熱激2min，立即加入60% PEG400050 μ L，室溫靜置20min。3)加入4mL STC溶液吹打混勻，8000rpm離心20min，去上清，加入ImLSTC溶液重
懸沉澱。4)將ImL原生質體懸濁液加到IOmL原生質體再生培養基中，觀°C，70rpm培養 24h。5) 8000rpm,離心15min，去上清，加入再生培養基重懸，取100 200 μ L塗布到含 有潮黴素100 μ g/mL的PDA培養平板上，培養觀察3 5天。待平板上長出菌絲，用滅 菌牙籤挖取單菌落菌絲，接種到新鮮PDA(hph+)培養小平板上，28°C培養7天左右。質粒pAN7_l購自Biovector Science Lab公司，地址為北京市西直門外大街19號。(三)陽性轉化子的篩選與驗證將篩選平板上長出的潮黴素抗性轉化子分別轉接到含100 μ g/mL潮黴素B的小 PDA平板上進行進一步篩選培養；一周後用無菌水刮洗各轉化子的菌絲並分別接種於含 100 μ g/mL潮黴素B的液體培養基中，，250rpm培養3_4天，用65%甘油保種；提取各 轉化子的基因組DNA作為模板，用vtib引物進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢 測，取上述5 μ L擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果見圖6，有符合預期大小的轉 化子即為陽性轉化子。由於VHB為胞內蛋白，將上述陽性轉化子離心收集菌體，經液氮破壁後，用緩衝 液PBS抽提獲得VHB粗蛋白，SDS-PAGE分析按照分子生物學實驗指南進行(Sam-brook et al.，1989)。所使用的凝膠濃度15 %，上樣量為25 μ L (20 μ L培養液加5 μ L載樣液)，電泳 檢測結果見圖7。在16kd左右有蛋白條帶的為vtib基因正確表達的重組菌株。實施例3重組黑麴黴產糖化酶能力的驗證(一)發酵分別對實施例2得到的重組黑麴黴菌與原始對照菌株黑麴黴HEOl進行發酵，通過 測定在正常條件下及貧氧條件下重組菌和原始對照菌的糖化酶酶活力，以檢測VHB在貧氧 條件下對重組菌產糖化酶酶活力的影響。通過調節搖床的轉速來控制貧氧條件，具體實驗方法如下菌種種子培養階段將甘油保種的重組菌及對照原始菌種分別接入黑麴黴種子 培養基中活化3-4天左右，28-3(TC，2(K)r/min。待菌種生長旺盛，再重新接入種子培養基， 進行二次活化，生長約3天左右，各個菌種生長一致，有大量菌絲體，便可以6 %的接種量 (25mL/250mL 發酵培養基/三角瓶容量)接入發酵培養基中進行發酵培養。菌種發酵培養階段將上述接入到發酵培養基中的重組菌種和原始菌種(每個樣 分別轉接三瓶)分別放入100rpm、150rpm及200rpm 3個不同轉速的搖床中，發酵培 養，5天左右達到產酶高峰，開始測定糖化酶酶活。( 二)糖化酶活性測定標準曲線繪製準確稱取1克葡萄糖，用蒸餾水溶解，定容至500毫升容量瓶中，分 別按順序在試管中加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8毫升葡萄糖溶液，和1、0. 9、0.8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2毫升蒸餾水。塞上塞子，沸水浴10分鐘，冷卻後，加入蒸餾 水，搖勻，於550nm比色測定。酶活力測定定義在40°C，pH4. 6條件下，每小時水解澱粉產生1毫克葡萄糖作 為一個酶活力單位(1個酶活力單位用IU表示)。方法稱取酶液2. OOml定容至IOOml 搖勻，供測定用。於甲、乙兩支25ml比色管中，分別加入可溶性澱粉溶液5. Oml及緩衝液
1.OOml搖勻後，於40 士 0. 2°C恆溫水浴中預熱5min。在甲管(樣品)中加入待測酶液0. 4ml， 立刻搖勻，在此溫度下準確反應30min，立即各加200g/L氫氧化鈉溶液0. (Mml，將兩管取出 迅速冷卻，並於乙管(空白)中補加待測酶液0.細1。準確反應30分鐘，取0.2毫升反應液 於有3毫升DNS (3，5- 二硝基水楊酸)的試管中，沸水浴10分鐘，冷卻後加入蒸餾水，搖勻， 550nm測定吸光值。糖化酶活力計算公式如下糖化酶活力=AXKXNX2X6.44+ (ΜΧ0. 4)A 為樣品OD平均值；K 為比色常數；N 為稀釋倍數；M 酶液質量6. 44:反應液體積；2 為將30min的反應時間換算成一個小時；0.4:稀釋酶液體積。不同轉速下發酵不同時間黑麴黴糖化酶活力測定結果見表2。表2出發菌與重組菌正常及限氧條件下糖化酶酶活測定
不同轉速下菌種酶活測定(酶活單位為U/g)
時間 144h168h192h
權利要求
1.一種透明顫菌血紅蛋白基因表達盒，其特徵在於所述表達盒由透明顫菌血紅蛋白 基因、三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子和終止子組成。
2.根據權利要求1所述的透明顫菌血紅蛋白基因表達盒，其特徵在於所述三磷酸甘 油醛脫氫酶基因為黑麴黴三磷酸甘油醛脫氫酶基因。
3.根據權利要求1或2所述的透明顫菌血紅蛋白基因表達盒，其特徵在於所述啟動 子由1261個鹼基組成，如SEQ ID NO. 1所示。
4.根據權利要求1所述的透明顫菌血紅蛋白基因表達盒，其特徵在於所述終止子由 329個鹼基組成，如SEQ ID NO. 2所示。
5.根據權利要求1所述的透明顫菌血紅蛋白基因表達盒，其特徵在於所述透明顫菌 血紅蛋白基因由441個鹼基組成，如SEQ ID NO. 3所示。
6.一種含有權利要求1-5任意一項所述透明顫菌血紅蛋白基因表達盒的重組黑麴黴菌。
7.含有透明顫菌血紅蛋白基因表達盒的重組黑麴黴菌的製備方法，包括以下步驟1)構建透明顫菌血紅蛋白基因表達盒Pgpd-vhb-Tgpd；2)利用Pgpd-vhb-Tgpd 表達盒構建質粒 pMD19-T-Pgpd-vhb-Tgpd ；3)用質粒pMD19-T-Pgpd-vhb-Tgpd和質粒pAN7-l共轉化黑麴黴，獲得含有透明顫菌血 紅蛋白基因表達盒Pgpd-vhb-Tgpd的重組黑麴黴菌。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，公開了一種透明顫菌血紅蛋白基因表達盒及其提高黑麴黴產糖化酶產量的方法，所述表達盒由透明顫菌血紅蛋白基因、三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子和終止子組成。本發明針對黑麴黴菌株實施分子改造，從分子水平解決限氧條件下黑麴黴菌種溶氧不足的問題，為黑麴黴液體深層發酵產糖化酶降低能耗。
文檔編號C12R1/685GK102061295SQ20101028815
公開日2011年5月18日 申請日期2010年9月20日 優先權日2010年9月20日
發明者餘少文, 王娟, 胡萍 申請人:深圳大學