產石房蛤毒素的鞭毛藻的檢測的製作方法
2023-06-30 04:54:46
產石房蛤毒素的鞭毛藻的檢測的製作方法
【專利摘要】本披露總體上涉及石房蛤毒素和能夠生產它們的微生物的鑑別的領域。具體地說，在許多鞭毛藻物種中鑑別了包含催化域序列石房蛤毒素A1（sxtA1）和石房蛤毒素A4（sxtA4）的石房蛤毒素A（sxtA）基因。本披露涉及通過擴增和檢測sxtA基因（尤其通過PCR）來檢測產石房蛤毒素的鞭毛藻的方法，並且還披露了用於該方法的試劑盒和引物。通過該方法檢測的產石房蛤毒素的鞭毛藻屬包括亞歷山大藻（Alexandrium）、盾甲藻（Pyrodinium）或裸甲藻（Gymnodinium）。
【專利說明】產石房蛤毒素的鞭毛藻的檢測
[0001]通過交叉引用結合
[0002]本申請要求2011年5月16日提交的美國臨時專利申請號61/486，633的優先權，該專利申請的全部內容通過交叉引用結合在此。
【技術領域】 [0003]本發明總體上涉及石房蛤毒素和能夠生產它們的微生物的鑑別的領域。更確切地說，本發明涉及鞭毛藻中的編碼石房蛤毒素的基因的鑑別，和用於特異性檢測作為石房蛤毒素的生產者的鞭毛藻的方法。
【背景技術】
[0004]石房蛤毒素(STX)是在全世界水生環境中存在的強力神經毒素並且具有顯著經濟、環境和人體健康影響。攝取病媒物種可能導致麻痺性貝類中毒，一種可能導致麻痺和死亡的嚴重人類疾病。在全球範圍內每年估計發生2000例人類麻痺性貝類中毒，死亡率為15%。監測和減輕STX的成本已導致經計算為8.95億美元的來自有害浮遊生物的水華的年度經濟損失。在淡水環境中，STX主要由原核藍藻細菌而產生。但是，在海洋環境中，真核鞭毛藻已與STX的存在相關聯。儘管多種鞭毛藻物種與STX的生產相關聯，這些微生物中的STX生產的遺傳基礎仍難以理解。
[0005]對於檢測海洋樣品中(或不存在)產STX的鞭毛藻存在的方法有一種需要。
[0006]發明概述
[0007]多個研究已未成功地嘗試通過酶特徵化、PCR方法、表達序列標記(EST)庫的電腦模擬分析或其他公開可供使用的核苷酸序列的使用來鑑別鞭毛藻中的STX路徑基因和/或酶類。此外，若干先前研究已提出STX可能事實上並非由鞭毛藻生產，而是由共培養細菌生產。
[0008]諸位發明人已確定鞭毛藻事實上為STX的生產者並且已鑑別在這些微生物中負責STX生產的基因。負責STX生產的基因的鑑別為檢測淡水和海洋環境兩者中的產STX鞭毛藻的許多分子測試提供基礎。
[0009]在第一方面中，本發明提供一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的方法，該方法包括:
[0010]獲得用於該方法的一種樣品，並且
[0011]分析該樣品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽中的一種或多種的存在，
[0012]其中所述聚核苷酸或多肽的存在指示該樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的存在。
[0013]在第二方面中，本發明提供一種用於確定樣品中產石房蛤毒素的鞭毛藻不存在的方法，該方法包括:
[0014]獲得用於該方法的一種樣品，並且
[0015]分析該樣品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽中的一種或多種的存在，
[0016]其中所述聚核苷酸或多肽的不存在指示該樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在。
[0017]在第一或第二方面的一個實施例中，該聚核苷酸包含石房蛤毒素A核苷酸序列，該石房蛤毒素A核苷酸序列選自以SEQ ID NO: 5-197,224-227,230-242以及247中的任一種所示的那些序列或那些序列中的任一種的片段或變異體。
[0018]在第一或第二方面的一個實施例中，該聚核苷酸包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段。
[0019]在第一或第二方面的一個實施例中，該石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或變異體。
[0020]在第一或第二方面的一個實施例中，該石房蛤毒素A4催化域序列或其片段由以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或變異體組成。
[0021]在第一或第二方面的一個實施例中，該石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或變異體。
[0022]在第一或第二方面的一個實施例中，該石房蛤毒素Al催化域序列由以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或變異體組成。
[0023]在第一或第二方面的一個實施例中，該分析包括通過聚合酶鏈式反應來擴增來自該樣品的聚核苷酸。
[0024]在第一或第二方面的一個實施例中，該聚合酶鏈式反應利用一種或多種引物，該一種或多種引物包含以SEQ ID NO: 198或SEQ ID NO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或變異體。
[0025]在第一或第二方面的一個實施例中，該聚合酶鏈式反應利用一種或多種引物，該一種或多種引物由以SEQ ID NO: 198或SEQ ID NO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或變異體組成。
[0026]在第一或第二方面的一個實施例中，該聚合酶鏈式反應利用一種或多種引物，該一種或多種引物包含或其組成為以SEQ ID N0:198-199、200-211、220-223、228-229以及243-244中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的片段或變異體。
[0027]在第一或第二方面的一個實施例中，該多肽包含以SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4所示的石房蛤毒素A胺基酸序列或二者之一的序列的片段或變異體。
[0028]在第一或第二方面的一個實施例中，該多肽由以SEQ ID NO: 2或SEQID NO: 4所示的石房蛤毒素A胺基酸序列或二者之一的序列的片段或變異體組成。
[0029]在第一或第二方面的一個實施例中，該產石房蛤毒素的鞭毛藻是來自亞歷山大藻(Alexandrium)、盾甲藻(Pyrodinium)或裸甲藻(Gymnodinium)屬的。
[0030]在第一或第二方面的一個實施例中，該產石房蛤毒素的鞭毛藻是選自下組，該組由以下各項組成:鏈狀 亞歷山大藻(A.catenella)、芬迪灣亞歷山大藻(A.fundyense)、無菌亞歷山大藻(A lusitanicum)、微小亞歷山大藻(A.minutum)、當烏氏亞歷山大藻(A.0stenfeldii)、塔瑪亞歷山大藻(A.tamarense)、鏈狀裸甲藻(G.catenatum)以及巴哈馬麥甲藻扁平變種(P.bahamense var compressum)。
[0031 ] 在第一或第二方面的一個實施例中，使用第十一或第十二方面的引物對進行所述分析。
[0032]在第三方面中，本發明提供一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的試劑盒，該試劑盒包含至少一種用於檢測鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽的存在的試劑。
[0033]在第四方面中，本發明提供一種用於確定樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在的試劑盒，該試劑盒包含至少一種用於檢測鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽的存在的試劑。
[0034]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑特異性地結合到包含石房蛤毒素A核苷酸序列的聚核苷酸上，該石房蛤毒素A核苷酸序列選自以SEQ ID NO:5-197,224-227,230-242以及247中的任一種所示的那些序列或那些序列中的任一種的片段或變異體。
[0035]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑特異性地結合到包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段的聚核苷酸上。
[0036]在第三或第四方面的一個實施例中，該石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或變異體。
[0037]在第三或第四方面的一個實施例中，該石房蛤毒素A4催化域序列或其片段由以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或變異體組成。
[0038]在第三或第四方面的一個實施例中，該石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或變異體。
[0039]在第三或第四方面的一個實施例中，該石房蛤毒素Al催化域序列由以SEQ IDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或變異體組成。
[0040]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑是一種引物、探針或抗體。
[0041]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑是包含以SEQ ID N0:198或SEQ IDNO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或變異體的引物。
[0042]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑是由以SEQ ID N0:198或SEQ IDNO: 199所示的序列或二者之一的序列的片段或變異體組成的引物。
[0043]在第三或 第四方面的一個實施例中，該試劑是包含或其組成為以SEQ IDNO: 198-199,200-211,220-223,228-229以及243-244中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的片段或變異體的引物。
[0044]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑特異性地結合到以SEQ ID NO: 2或SEQID NO:4所示的石房蛤毒素A胺基酸序列或二者之一的序列的片段或變異體上。
[0045]在第三或第四方面的一個實施例中，該試劑盒包含兩種試劑，其中這兩種試劑是第十一或第十二方面的引物對。
[0046]在第一、第二、第三或第四方面的一個實施例中，該樣品是環境樣品。
[0047]在第一、第二、第三或第四方面的一個實施例中，該樣品是鹽水樣品。
[0048]在第一、第二、第三或第四方面的一個實施例中，該樣品是淡水樣品。
[0049]在第一、第二、第三或第四方面的一個實施例中，該樣品是海洋樣品。
[0050]在第五方面中，本發明提供一種分離的聚核苷酸，其包含以SEQ ID N0:1所示的序列或其變異體或片段。
[0051]在第五方面的一個實施例中，該分離的聚核苷酸由以SEQ ID N0:1所示的序列或其變異體或片段組成。
[0052]在第六方面中，本發明提供一種分離的聚核苷酸，其包含以SEQ ID N0:3所示的序列或其變異體或片段。
[0053]在第六方面的一個實施例中，該分離的聚核苷酸由以SEQ ID N0:3所示的序列或其變異體或片段組成。
[0054]在第七方面中，本發明提供一種分離的聚核苷酸，其包含以SEQ ID N0:5_197、224-227,230-242以及247中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的變異體或片段。
[0055]在第七方面的一個實施例中，該分離的聚核苷酸由以SEQ ID NO:5_197、224_227、230-242以及247中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的變異體或片段組成。
[0056]在第八方面中，本發明提供一種分離的多肽，該多肽由根據第五、第六或第七方面的聚核苷酸中的任一種編碼。
[0057]在第九方面中，本發明提供一種特異性地結合到根據第五、第六或第七方面的聚核苷酸上的引物或探針。
[0058]在第十方面中，本發明提供一種特異性地結合到根據第八方面的多肽上的抗體。
[0059]在第^^一方面中，本發明提供一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的引物對，其中所述引物對包含第一引物，其包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或其片段或變異體，和第二引物，其包含SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或其片段或變異體。
[0060]在第^^一方面的一個實施例中，該引物對包含由SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或其片段或變異體組成的第一引物，和由SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或其片段或變異體組成的第二引物。
[0061 ] 在第十二方面中，本發明提供一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的引物對，其中所述引物對包含:
[0062]包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0063]包含SEQ ID NO:200的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:201的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0064] 包含SEQ ID NO:202的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:203的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0065]包含SEQ ID NO:204的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:205的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或[0066]包含SEQ ID NO:206的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:207的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0067]包含SEQ ID NO:208的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:209的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0068]包含SEQ ID NO:210的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID N0:211的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0069]包含SEQ ID NO:220的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID N0:221的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 [0070]包含SEQ ID N0:222的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID N0:223的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0071]包含SEQ ID NO:228的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:229的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或
[0072]包含SEQ ID NO:243的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQ ID NO:244的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物。
[0073]附圖簡要說明
[0074]現在將參看附圖僅通過舉例描述本發明的優選實施例，在這些附圖中:
[0075]圖1是展示鞭毛藻和藍藻細菌中的sxtA的結構的簡圖。A.芬迪灣亞歷山大藻CCMP1719中的sxtA轉錄物的轉錄結構。B.擬柱胞藻(C.raciborskii) T3的基因組sxtA結構。C.STX的結構，其中以粗體標記通過sxtA引入的鍵和分子。
[0076]圖2是展示芬迪灣亞歷山大藻sxtA轉錄物和藍藻sxtA基因的GC含量的圖。在1000bp的窗口大小下每IObp計算GC含量。
[0077]圖3展示SxtAl系統發生樹。該圖為按比例繪製的示意性圖示(對於完整樹參見圖5)。展示最大似然拓撲。節點上的數字對應地表示最大似然和貝葉斯分析(Bayesiananalyses)的自引導值(bootstrap value)。
[0078]圖4A展示SxtA4系統發生樹。該圖為按比例繪製的系統發生樹的示意性圖示(對於完整樹參見圖6)。展示最大似然拓撲。節點上的數字對應地表示最大似然和貝葉斯分析的自引導值。
[0079]圖4B是展示在生長周期期間的三個不同時間點在鏈狀亞歷山大藻ACSH02中的sxtA4的基因組拷貝數的圖。
[0080]圖5展示SxtAl系統發生樹。展示最大似然拓撲。節點上的數字對應地表示最大似然和貝葉斯分析的自引導值。粗體的序列是轉錄衍生序列；這些序列是使用RACE產生的或是來自454測序數據集合的重疊群的。
[0081]圖6展示SxtA4系統發生樹。展示最大似然拓撲。節點上的數字對應地表示最大似然和貝葉斯分析的自引導值。粗體的序列是轉錄衍生序列；這些序列是使用RACE產生的或是來自454測序數據集合的重疊群。
[0082]圖7是展示實例2提及的浮遊植物和團聚牡蠣(S.glomerata)取樣地點的地圖。
A.澳大利亞新南威爾斯(NewSouth Wales, Australia)和取樣其中的水華的三個河口:
B.布裡斯班(Brisbane)水域，C.喬治河(GeorgesRiver)以及D.睡貢嘎海灣(WagongaInlet)。D中的比例尺表示插頁地圖B、C和D中的1km。[0083]圖8是展示基於來自3株指數增長的鏈狀亞歷山大藻菌株的已知數目的細胞的DNA的稀釋液的sxtA4引物對的標準曲線的圖。使用表示不同菌株中的30-2600個細胞的DNA濃度測試該檢驗。
[0084]圖9提供展示基於使用2010年11月期間在A.喬治河和B.哇貢嘎海灣取樣地點的LSU rDNA引物對的微觀細胞鑑別計數和qPCR的sxtA4基因拷貝的豐度(第一 y軸)和鏈狀亞歷山大藻細胞的估值(第二 y軸)的兩幅圖。
[0085]圖10提供展示如每周在取樣地點在光學顯微鏡下使用手動計數確定的sxtA4 L-1和鏈狀亞歷山大藻的細胞的數目或拷貝的圖。
[0086]圖11提供展示鏈狀亞歷山大藻細胞豐度和sxtA4拷貝之間的回歸方程的圖。
[0087]圖12展示塔瑪亞歷山大藻ATNWBOI的SEM圖像。A)腹面觀，細胞膜完整，展示一般細胞大小和形狀，比例尺=5 μ m，B)背面觀，細胞膜完整，展示細胞形狀，比例尺=10 μ m,C)頂面觀的上錐，展示I』板上的APC和孔，比例尺=5 μ m，D)底面觀的下錐，展示板模型，比例尺=10 μ m, E)頂孔複合物,展示逗點形狀，F)後溝板,展示孔，比例尺=2 μ m。
[0088]圖13展示塔瑪亞歷山大藻ATCJ33、ATEB01以及ATBBOl的菌株(用於比較，從哈勒格雷夫(Hallegraeff)等人，1991獲取)的SEM圖像。A-D, ATCJ33，A)展示2個細胞的鏈，和一般細胞大小和形狀的ATCJ33，比例尺=IOym, B)第一頂板，展示腹孔，C)APC，展示逗點形狀，D)第一頂板，展示腹孔，E、F、H ATEBOl0 E)展示細胞的一般大小和形狀的ATEB01，t匕例尺=10 μ m, F) ATEBOl，展示腹孔的第一頂板，G)展示腹孔和APC的ATBBOl，H)展示APC的 ATEBOI。
[0089]圖14展示塔瑪亞歷山大藻複合物的18S+ITS1-5.8S-1TS2+28S rDNA級聯繫統發生(2821個特徵)。使用貝葉斯推理(Phylobayes)重構該樹。內節點上的數字表示Phylobayes和RAxML (有序的；Phylobayes/RaxML)的後驗概率和自引導值(>50%)。黑色圓圈表明1.00的後驗概率值和自引導>90%。組1-4進化枝已合併，系統發生的擴展版本參見
[0090]圖15是使用HPLC的ATNWB01的毒素特徵曲線，針對PSP毒素標準確定如所指示的峰值。
[0091]圖16展示塔瑪亞歷山大藻複合物的18S+ITS1-5.8S-1TS2+28S rDNA級聯繫統發生(2821個特徵)。使用貝葉斯推理(Phylobayes)重構該樹。內節點上的數字表示Phylobayes和RAxML (有序的；Phylobayes/RaxML)的後驗概率和自引導值(>50%)。黑色圓圈表明1.00的後驗概率值並且自引導>90%。
[0092]定義
[0093]除非上下文 另外明確規定，否則如本申請中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」包括多個參考物。例如術語「一個鞭毛藻」還包括多個鞭毛藻。
[0094]如在此所用，術語「包含(comprising)」意味著「包括(including)」。「包含(comprising)」 一詞的變化形式，如「包含(comprise)」和「包含(comprises)」具有相應地變化的含義。因此，舉例來說，「包含」編碼一個蛋白質的序列的聚核苷酸可能僅由那個序列組成或可能包括一個或多個另外序列。
[0095]如在此所用，術語「石房蛤毒素」包涵純石房蛤毒素和其類似物，這些類似物的非限制性實例包括新石房蛤毒素(neosaxitoxin) (neoSTX)、膝溝藻毒素(gonyautoxin)(GTX )、去氨甲醯基石房蛤毒素(decarbamoy lsaxi toxin) (dcSTX )、非硫酸化類似物、單硫酸化類似物、二硫酸化類似物、去氨甲醯化類似物和疏水性類似物。
[0096]在此的現有技術文檔的任何描述，或衍生自或基於那些文檔的在此的陳述不是對於這些文檔或衍生的陳述是相關技術的公共常識的一部分的承認。
[0097]出於描述的目的，將在此提及的所有文檔和基因庫序列通過引用全文結合。
[0098]詳細說明
[0099]諸位發明人已確定鞭毛藻是石房蛤毒素(STX)的生產者並且已鑑別在這些微生物中負責STX生產的基因。基於此發現，諸位發明人已開發一種能夠分清產STX的鞭毛藻物種和不生產STX的鞭毛藻物種之間的差別的檢驗。
[0100]因此，本發明的某些方面涉及存在於鞭毛藻中的STX聚核苷酸和多肽序列的提供。
[0101]還提供用於給定樣品中的產STX的鞭毛藻的檢測的方法，這些方法基於檢測在樣品中一個或多個本發明的序列的存在(或不存在)。
[0102]還提供用於給定樣品中的產STX的鞭毛藻的檢測的試劑盒，這些試劑盒包含用於檢測在樣品中一個或多個本發明的序列的存在(或不存在)的試劑。
[0103]聚核苷酸和多肽
[0104]在此披露鞭毛藻石房蛤毒素聚核苷酸和多肽序列(對應地為「本發明的聚核苷酸」和「本發明的多肽」)。本發明的聚核苷酸可能是脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或互補脫氧核糖核酸(cDNA)。
[0105]在某些實施例中，這些序列是石房蛤毒素A基因(sxtA)聚核苷酸序列或石房蛤毒素A多肽(STXA)序列。
[0106]sxtA聚核苷酸序列可以包含任何一個或多個sxtA基因催化域(即sxtAl、sxtA2、sxtA3或sxtA4催化域)，或其片段。僅通過非限制性實例，sxtAl序列可能是由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022定義的。sxtA2序列可能是由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸1837-2415或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2038-2604定義的。sxtA3序列可能是由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2479-2694或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2722-2949定義的。sxtA4序列可能是由以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721定義的。
[0107]本發明的sxtA基因聚核苷酸序列的其他非限制性實例包括以基因庫保藏號JF343238 和 JF343239 (SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:3)提供的那些序列。
[0108]STXA多肽序列可以包含任何一個或多個STX蛋白質催化域(即STXA1、STXA2、STXA3或STXA4催化域)或其片段。僅通過非限制性實例，STXAl序列可能是由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的胺基酸殘基1-554或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基1-582定義的。STXA2序列可能是由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的胺基酸殘基560-752或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基588-776定義的。STXA3序列可能是由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的胺基酸殘基774-845或以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基816-891定義的。STXA4序列可能是由以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基947-1281定義的。
[0109]本發明的STX多肽序列的其他非限制性實例包括以基因庫保藏號JF343238和JF343239 (SEQ ID N0:2 和 SEQ ID NO:4)提供的那些序列。
[0110]優選地，聚核苷酸和多肽序列來自產石房蛤毒素鞭毛藻。例如，聚核苷酸和多肽序列可能來自膝溝藻目(Gonyaulacales)或裸甲藻目(Gymnodiniales)的鞭毛藻。優選地,鞭毛藻是亞歷山大藻(以前為膝溝藻)、盾甲藻或裸甲藻屬的。
[0111]優選的亞歷山大藻物種的非限制性實例包括鏈狀亞歷山大藻(例如菌株ACCCO1、ACSHO2、ACTRAO2以及CCMP1493)、芬迪灣亞歷山大藻(例如菌株CCMP1719和CCMP1979)、海洋原甲藻、微小亞歷山大藻(例如菌株CCMP1888、CCMPl 13, ALSPOU ALSP02以及AMD16/AMAD16)、當烏氏亞歷山大藻(A.0stenfeldii)以及塔瑪亞歷山大藻(例如菌株CCMP1771、ATBB01、ATEB01、ATCJ33以及ATNWB01)。優選的裸甲藻物種的非限制性實例包括鏈狀裸甲藻(例如菌株GCTRA01和CS-395)。優選的盾甲藻物種的非限制性實例包括巴哈馬麥甲藻扁平變種。
[0112]還在此提供本發明的聚核苷酸和本發明的多肽兩者的片段。
[0113]在此涵蓋的聚核苷酸「片段」是一種聚核苷酸分子，該聚核苷酸分子是本發明的聚核苷酸或其變異體的成分。聚核苷酸的片段不一定需要編碼保留生物活性的多肽，儘管不排除這種情況。在某些實施例中，片段可能用作雜交探針或PCR引物。該片段可以通過裂解本發明的聚核苷酸衍生，或作為替代方案，可以通過一些其他方式，例如通過化學合成來合成。在此涵蓋的聚核苷酸片段可以是長度為小於約5000個核苷酸，長度為小於約4500個核苷酸或長度為小於約 4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、400、300、250、200、150、100、75、50、25或15個核苷酸。另外地或可替代地，在此涵蓋的聚核苷酸片段可以是長度為超過約15個核苷酸，長度為超過約25個核苷酸或長度為超過約50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000個核苷酸。另外地或可替代地，在此涵蓋的聚核苷酸片段可以是長度在約25個與約50個核苷酸之間；長度在約25個與約75個核苷酸之間；或長度在約25個與約100、100和250、100和500、250和500、100和1000、500和2000、1000和2000個核苷酸之間。
[0114]本發明的聚核苷酸片段包含sxtA基因的片段。例如，本發明的聚核苷酸片段可以包含sxtAl、sxtA2、sxtA3或sxtA4催化域中的任何一種或多種,或其片段。本發明的多肽片段包含STX蛋白質的片段。例如，本發明的聚核苷酸片段可以包含STXA1、STXA2、STXA3或STXA4催化域中的任何一種或多種，或其片段。
[0115]本發明的sxtA基因聚核苷酸序列片段的具體和非限制性實例包括以基因庫保藏號 JF343240-JF343432 (SEQ ID N0:5_SEQ ID NO: 197)提供的那些序列片段，和以 SEQ IDNO:224-227,230-242和247所示的那些序列片段。
[0116]本發明的sxtA基因聚核苷酸序列片段的另外的具體和非限制性實例包括由以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121和核苷酸3597-3721定義的那些序列片段，和其片段和變異體。
[0117]sxtAl催化域序列的具體和非限制性實例包括以SEQ ID NO:224-227和247陳述的那些序列。
[0118]sxtA4催化域序列的具體和非限制性實例包括以SEQ ID NO:230-242陳述的那些序列。
[0119]在此涵蓋的多肽「片段」是一種多肽分子，該多肽分子是本發明的多肽或其變異體的成分。典型地，片段與該片段為其中的一種成分的多肽具有相同定性生物活性，或儘管這不一定為所需的。在此涵蓋的多肽片段可以是長度為小於約1500個胺基酸殘基，長度為小於約1400個胺基酸殘基，或長度為小於約1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、75、50、25或15個胺基酸殘基。另外地或可替代地，在此涵蓋的多肽片段可以是長度為超過約15個胺基酸殘基，長度為超過約25個胺基酸殘基或長度為超過約 50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200 或 1300個胺基酸殘基。另外地或可替代地，在此涵蓋的多肽片段可以是長度在約15個與約25個胺基酸殘基之間；長度在約15個與約50個胺基酸殘基之間；或長度在約15個與約75、15和100、15 和 150、25 和 50、25 和 100,50 和 100、50 和 150、100 和 200、100 和 250、100 和 300、100和500,500和750,500和1000或1000和1300個胺基酸殘基之間。
[0120]本發明的STXA多肽序列片段的具體和非限制性實例包括由以基因庫保藏號JF343248 (SEQ ID NO: 3)所示的多肽序列的胺基酸殘基X-Y定義的那些片段、由以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基947-1281定義的那些片段和其片段和變異體。
[0121] 還在此提供本發明的聚核苷酸和本發明的多肽的變異體，和其片段。
[0122]在此涵蓋的「變異體」是指實質上類似序列。一般來說，如果兩個序列在規定區域上，或當未規定時在整個序列上具有規定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸(「序列一致性」百分比)，那麼這兩個序列「實質上類似」。因此，在此披露的聚核苷酸和多肽序列的「變異體」可以與參考序列共享至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、83%、85%、88%、90%、93%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列一致性。
[0123]一般來說，多肽序列變異體具有共同定性生物活性。聚核苷酸序列變異體通常編碼通常具有共同定性生物活性的多肽。在術語「變異體」的含義內還包括本發明的聚核苷酸和本發明的多肽的同系物。聚核苷酸同系物典型地來自不同鞭毛藻物種但與在此披露的對應聚核苷酸共享實質上相同生物功能或活性。多肽同系物典型地來自不同鞭毛藻物種但與在此披露的對應多肽共享實質上相同生物功能或活性。術語「變異體」還包含本發明的多肽的類似物。多肽「類似物」是一種多肽，該多肽是本發明的多肽的衍生物，該衍生物包含一個或多個胺基酸的添加、缺失、取代，使得多肽保持實質上相同功能。術語「保守的胺基酸取代」是指在多肽鏈(蛋白質的主要序列)內的一種胺基酸對於具有類似特性的另一種胺基酸的取代或替代。例如，帶電荷胺基酸穀氨酸(Glu)對於類似帶電荷胺基酸天冬氨酸(Asp)的取代將是保守的胺基酸取代。
[0124]典型地，本發明的聚核苷酸和本發明的多肽是「分離的」。應理解術語「分離的」在此情形中意味著聚核苷酸或多肽已從一些或所有其他組分移除或與這些組分不相關，在該情況下該聚核苷酸或多肽將以其天然狀態被發現。例如，「分離的」聚核苷酸可以是從較大聚核苷酸序列的其他聚核苷酸移除的，或可以是從如不相關聚核苷酸的天然組分移除的。同樣地，「分離的」多肽可以是從較大多肽序列的其他多肽移除的，或可以是從如不相關多肽的天然組分移除的。為清楚起見，「分離的」聚核苷酸或多肽還包含尚未從自然獲取而是已從頭製備(如以化學方式合成和/或通過重組方法製備)的聚核苷酸或多肽。如在此所述，分離的本發明的多肽可以是以更長多肽或融合蛋白質的組成部分的形式包括的。
[0125]在某些實施例中，本發明的聚核苷酸可以被克隆到載體中。該載體可以包含例如DNA、RNA或互補DNA (cDNA)序列。該載體可以是質粒載體、病毒載體或適用於外來序列的插入、將這些序列引入到細胞中以及引入的序列的表達的任何其他合適的媒介。典型地，該載體是表達載體並且可能包括表達控制和處理序列，如啟動子、增強子、核糖體結合位點、聚腺苷酸化信號以及轉錄終止序列。本發明還涵蓋由這些載體轉化的宿主細胞。例如，本發明的聚 核苷酸可以被克隆到一種載體中，該載體轉化成細菌宿主細胞，例如大腸桿菌(E.coli)。用於載體的構建和將這些載體轉化成宿主細胞的方法通常在本領域中已知，並且描述在如例如薩布魯克(Sambrook)等人(1989)分子克隆:實驗室手冊(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第 2 版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),紐約普萊恩維尤(Plainview, New York);和奧斯貝(Ausubel)等人(編)現代分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology) (2007),約翰.威利父子出版公司(John Wiley and Sons, Inc.)的標準文本中。
[0126]探針、引物以及抗體
[0127]本發明的聚核苷酸包括適用作引物和探針的衍生物和其片段。
[0128]這些衍生物和片段可以是呈寡核苷酸形式的。寡核苷酸是適合用於如PCR的核酸擴增反應中的短鏈核苷酸殘基，這些寡核苷酸典型地長度為至少約5個核苷酸至約80個核苷酸，更典型地長度為約10個核苷酸至長度為約50個核苷酸，並且甚至更典型地長度為約15個核苷酸至長度為約30個核苷酸。
[0129]在一個實施例中，該探針包含如以SEQ ID NO:245或SEQ ID NO:246所示的序列或由該序列組成。
[0130]探針是典型地通過雜交用於同源序列的檢測的具有例如在約10個核苷酸與幾千個核苷酸之間的可變長度的核苷酸序列。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。
[0131]用於核苷酸探針和/或引物的設計和/或生產的方法在本領域中已知，並且描述在如薩布魯克等人(1989)分子克隆:實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，紐約普萊恩維尤的標準文本；和如板倉(Itakura)等人(1984)生物化學綜合年刊(Annu.Rev.Biochem.) 53:323 ;英尼斯(Innis)等人(編)(1990) PCR方案:指導方法和應用(PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications),學術出版社(Academic Press),紐約；英尼斯和蓋爾範德(Gelfand)，(編)(1995) PCR策略(PCR Strategies)，學術出版社，紐約；以及英尼斯和蓋爾範德，(編)(1999)PCR方法手冊(PCR Methods Manual)，學術出版社,紐約的出版物中。
[0132]可以例如通過如磷酸二酯和磷酸三酯方法(參見例如納朗(Narang)等人(1979)酶學方法(Meth.Enzymol.) 68:90 ;布朗(Brown)等人(1979)酶學方法68:109 ;以及美國專利號4356270)和二乙基亞磷醯胺方法(參見貝科奇(Beaucage)等人(1981)四面體快報(Tetrahedron Letters), 22:1859-1862)的化學合成技術製備聚核苷酸引物和探針。
[0133]本發明的聚核苷酸，包括前述探針和引物，可以通過標記物的結合標記以便於其檢測。用於標記和檢測核酸的技術例如描述在如奧斯貝等人(編)現代分子生物學實驗指南(2007)，約翰.威利父子出版公司的標準文本中。合適的標記物的非限制性實例包括螢光分子(例如乙醯氨基芴、5-溴脫氧尿苷、地高辛(digoxigenin)以及螢光素)和放射性同位素(例如32P、35S、3H、33P)。可以例如通過化學、光化學、免疫化學、生物化學或光譜技術實現標記物的檢測。
[0134]可以例如使用探針和引物來檢測或分離相關樣品中的鞭毛藻。在某些實施例中，探針和引物可用於檢測相關樣品中的產STX鞭毛藻。另外地或可替代地，探針或引物可用於分離包括例如其他鞭毛藻物種的其他生物體中的對應序列。如聚合酶鏈式反應(PCR)、雜交等的方法可用於基於與在此所示的序列的序列同源性鑑別這些序列。實施例涵蓋基於與在此所示的全部序列或其片段的序列一致性選擇的序列。這些序列包括為所披露的序列的直系同源物的序列。術語「直系同源物」是指來源於共同祖先基因並且由於物種形成發現於不同物種中的基因。當發現於不同物種中的基因的核苷酸序列和/或其編碼蛋白質序列共享如在此其他地方定義的實質性一致性時，將這些基因視為直系同源物。直系同源物的功能在物種中通常是高度地保守的。
[0135]在雜交技術中，已知核苷酸序列的全部或一部分用於產生探針，該探針選擇性地雜交到存在於給定樣品中的其他對應核酸序列。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，並且可以用可檢測標記物來標記。因此，舉例來說，可通過標記基於本發明的序列的合成寡核苷酸製得用於雜交的探針。探針與靶向序列之間的同源性(序列一致性)的水平將很大程度上由雜交條件的嚴密性決定。具體地說，可以在低嚴密性、中等嚴密性或高嚴密性條件下將用作探針的核苷酸序列雜交到在此披露的聚核苷酸的同系物或其他變異體上。存在許多本領域的普通技術人員眾所周知的條件和因素，可以採用這些條件和因素更改雜交的嚴密性，如例如將要雜交到規定核酸上的核酸的長度和性質(DNA、RNA、鹼基組成)；鹽和其他組分的濃度，如甲醯胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇等的存在或不存在；以及更改雜交和/或洗滌步驟的溫度。
[0136]在PCR方法下，可設計寡核苷酸引物以用於PCR反應中以擴增來自提取自任何相關生物體的cDNA或基因組DNA的對應DNA序列。用於設計PCR引物和PCR克隆的方法通常在本領域中已知。PCR的已知方法包括(但不限於)使用成對引物、巢式引物、單一特異性引物、簡併引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分地不匹配引物等的方法。
[0137]有技能的讀者將辨識用於PCR或RT-PCR的在此所描述的引物還可以用作用於鞭毛藻sxt基因序列的檢測的探針。
[0138]本發明還涵蓋能夠特異性地結合到本發明的多肽的抗體。這些抗體可用於定性地或定量地檢測和分析給定樣品中的一種或多種STX多肽。通過「特異性地結合」，應理解抗體能夠以比其結合到不相關蛋白質上更高的親和力結合到目標多肽或其片段上。例如，抗體可以通過在至少約10_4M到約ΙΟ,Μ範圍內的結合常數結合到多肽或其片段上。優選地，結合常數是至少約10_5Μ，或至少約10_6Μ。更優選地，結合常數是至少約10_7Μ、至少約10_8Μ或至少約IO-9M或以上。在本發明的情形下，對於對本發明的STX多肽具有特異性的抗體的提及包括對該多肽的片段具有特異性的抗體。[0139]本發明的抗體可能以多種形式存在，包括例如作為全抗體，或作為抗體片段或其其他免疫學活性片段，如互補性決定區。類似地，抗體可能以具有功能性抗原結合域，也就是說，重和輕鏈可變域的抗體片段形式存在。此外，抗體片段可能以選自下組的形式存在，該組由(但不限於)以下各項組成:Fv、Fab、F(ab)2、scFv (單鏈Fv)、dAb (單域抗體)、嵌合抗體、雙特異性抗體、雙鏈抗體和三鏈抗體。
[0140]可以通過對全抗體的修飾或通過所需抗體片段的合成產生抗體「片段」。產生抗體，包括抗體片段的方法在本領域中已知並且包括例如通過重組DNA技術的合成。有技能的讀者將知道合成抗體的方法，如描述於例如美國專利號5296348和如奧斯貝等人(編)現代分子生物學實驗指南(2007)，約翰.威利父子出版公司的標準文本中的那些方法。
[0141]優選地，從相關STX多肽的離散域或片段製備抗體。相關多肽的抗原部分可以是任何適當的長度的，如約5到約15個胺基酸。優選地，抗原部分含有至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸殘基。
[0142]可例如使用本發明的純化STX多肽或編碼本發明的STX多肽的本發明的純化SXt聚核苷酸序列使用本領域中已知的任何合適的方法製備特異性地結合到本發明的多肽的抗體。例如，可以使用描述於哈洛(Harlow)和蘭尼(Lane)(編)抗體-實驗室手冊(Antibodies-A Laboratory Manual),(1988),冷泉港實驗室，紐約；科林根(Coligan),免疫學實驗指南(Current Protocols in Immunology) (1991);戈定(Goding)，單克隆抗體:原理與實踐(Monoclonal Antibodies !Principles and Practice) (1986)第 2 版；以及科勒(Kohler)和米爾斯坦(Mi I stein), (1975)自然(Nature) 256:495-497中的雜交瘤技術製備典型地含有Fab部分的單克隆抗體。這些技術包括(但不限於)通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體庫選擇抗體進行的抗體製備，以及通過使兔或小鼠免疫進行的多克隆和單克隆抗體的製備(參見例如休斯(Huse)等人(1989)科學(Science)246:1275-1281 ;沃德(Ward)等人(1989)自然 341:544-546)。
[0143]還將理解本發明的抗體包括人源化抗體、嵌合抗體和完全人類抗體。本發明的抗體可以是對於超過一種抗原或表位具有結合特異性的雙特異性抗體。例如，抗體可以對於一種或多種STX多肽或其片段具有特異性，並且另外對於另一抗原具有結合特異性。用於人源化抗體、嵌合抗體、完全人類抗體以及雙特異性抗體的製備的方法在本領域中已知並且包括例如描述於美國專利號6995243中的那些方法。
[0144]通常，潛在地包含本發明的STX多肽的樣品可以與特異性地結合STX多肽或其片段的抗體接觸。任選地，可在抗體與樣品接觸之前將抗體固定到固體支撐物上以便於複合物的洗滌和後續分離。固體支撐物的實例包括例如微量滴定盤、珠粒、十字叉或微珠。抗體還可以附著於如上所述的蛋白質晶片陣列或探針襯底。
[0145]用於結合到本發明的多肽的抗體的鑑別的可檢測標籤包括(但不限於)熒色物、螢光染料、放射性同位素標記、如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等通常用於本領域的酶類以及比色標籤，包括膠態金或有色玻璃或塑料珠。可替代地，可使用間接檢驗檢測抗體，其中例如第二標記抗體用於檢測結合多肽特異性抗體。
[0146]用於檢測抗體-標記物複合物的存在或測量該複合物的量的方法包括例如螢光、化學發光、發光 、吸光率、雙折射率、透射率、反射率或折射率的檢測，如表面等離子共振、橢圓偏振測量法、共振鏡像法、光柵耦合器波導法或幹涉測量。射頻法包括多級共振光譜法。電化學法包括安培法和伏安法。光學法包括成像法和非成像法以及顯微法。
[0147]用於檢測抗體-標記物複合物的存在或測量該複合物的量的有用檢驗包括例如酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)、放射免疫檢驗(RIA)或免疫印跡檢驗(Western blot assay)。這些方法描述在例如斯蒂茨(Stites)和特爾(Terr)，(編)(1991)臨床免疫學(ClinicalImmunology)，第7版；和淺井(Asai)，(編)(1993)細胞生物學方法:在細胞生物學中的抗體(Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology),第 37 卷中。
[0148]用於檢測鞭毛藻的方法
[0149]本發明提供用於本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽的檢測和/或分離的方法(「本發明的方法」)。
[0150]在一個實施例中，本發明提供一種用於檢測樣品中的鞭毛藻的方法。該方法包含獲得用於該方法的樣品，和檢測樣品中的本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽，或其片段或變異體的存在。樣品中的聚核苷酸、多肽或其變異體或片段的存在指示樣品中的鞭毛藻。
[0151]諸位發明人已確定sxtA基因存在於產石房蛤毒素的鞭毛藻中但不存在於不生產石房蛤毒素的鞭毛藻中。具體地說，已鑑別sxtA基因的sxtAl和/或sxtA4催化域的檢測指示產石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0152]因此，在另一個實施例中，本發明提供一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的方法。該方法包含獲得用於該方法的樣品，和檢測樣品中的本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽，或其片段或變異體的存在。樣品中的聚核苷酸、多肽或其變異體或片段的存在指示樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0153]在另一個實施例中，本發明提供一種用於確定樣品中產石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在的方法。該方法包含獲得用於該方法的樣品，和確定樣品中的本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽，或其片段或變異體的不存在。樣品中聚核苷酸、多肽或其變異體或片段的不存在指示產石房蛤毒素的鞭毛藻不存在於樣品中。
[0154]在本發明的方法(包括緊靠的以上段落提及的那些方法)的情形中，聚核苷酸序列可以是石房蛤毒素A基因(sxtA)序列。sxtA聚核苷酸序列可以包含任何一個或多個sxtA基因催化域(即sxtAl、sxtA2、sxtA3或sxtA4催化域),或其片段。優選地，sxtA聚核苷酸序列包含sxtAl和/或sxtA4域,或其片段。更優選地,sxtA聚核苷酸序列包含sxtA4域，或其片段。多肽序列可以是石房蛤毒素A多肽(STXA)序列。
[0155]在一些實施例中，聚核苷酸序列對應於以基因庫保藏號JF343238和JF343239(SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:3)中的任一種或二者之一的序列的片段或變異體提供的序列。
[0156]在其他實施例中，聚核苷酸序列對應於以基因庫保藏號JF343240-JF343432 (SEQID N0:5-SEQ ID NO: 197)中的任一種或這些序列中的任一種的片段或變異體提供的序列。
[0157]在其他實施例中，聚核苷酸序列包含以SEQ ID NO:224-227和247中的任一種或這些序列中的任一種的片段或變異體提供的sxtAl催化域序列。
[0158]在其他實施 例中，聚核苷酸序列包含以SEQ ID NO:230-242中的任一種或這些序列中的任一種的片段或變異體提供的sxtA4催化域序列。
[0159]在其他實施例中，聚核苷酸序列可以包含以基因庫保藏號JF343238 (SEQ IDNO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821 ;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022 ;以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸1837-2415 ;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2038-2604;以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO:1)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2479-2694;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO: 3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸2722-2949 ;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO: 3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121 ;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO: 3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721 ;或這些序列中的任一種的片段或變異體。
[0160]在本發明的方法(包括以上段落提及的那些方法)的情形中，多肽序列可以是石房蛤毒素A蛋白質(STXA)序列。STXA多肽序列可以包含任何一個或多個STXA蛋白質催化域(即STXA1、STXA2、STXA3或STXA4催化域)或其片段。優選地，STXA多肽序列包含STXAl或STXA4域，或其片段。更優選地，STXA多肽序列包含STXA4域，或其片段。
[0161]在一些實施例中，多肽序列對應於以基因庫保藏號JF343238或JF343239(SEQ IDN0:2和SEQ ID N0:4)提供的序列，或二者之一的序列的片段或變異體。
[0162]在其他實施例中，多肽序列可以包含以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID N0:2)所示的多肽序列的胺基酸殘基1-554 ;以基因庫保藏號JF343239(SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基1-582 ;以基因庫保藏號JF343238 (SEQ ID NO: 2)所示的多肽序列的胺基酸殘基560-752 ;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基588-776 ;以基因庫保藏號JF343238(SEQ ID NO:2)所示的多肽序列的胺基酸殘基774-845 ；以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基816-891 ;以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID N0:4)所示的多肽序列的胺基酸殘基947-1281 ;或這些序列中的任一種的片段或變異體。
[0163] 使用本發明的方法在樣品中檢測到的或確定在樣品中不存在的鞭毛藻可以是產石房蛤毒素的鞭毛藻。沒有施加任何具體的限制，鞭毛藻可以是來自膝溝藻目或裸甲藻目的。鞭毛藻可以是來自亞歷山大藻(以前為膝溝藻)、盾甲藻或裸甲藻屬的。亞歷山大藻物種的合適的實例包括鏈狀亞歷山大藻(例如菌株ACCC01、ACSH02、ACTRA02以及CCMP1493)、芬迪灣亞歷山大藻(例如菌株CCMP1719和CCMP1979)、海洋原甲藻、微小亞歷山大藻(例如菌株 CCMP1888、CCMPl 13, ALSPOU ALSP02 以及 AMD16/AMAD16)、當烏氏亞歷山大藻(A.0stenfeldii)以及塔瑪亞歷山大藻(例如菌株CCMP1771、ATBBO1、ATEBO1、ATCJ33以及ATNWBodo裸甲藻物種的合適的實例包括鏈狀裸甲藻(例如菌株GCTRA01和CS-395)。盾甲藻物種的合適的實例包括巴哈馬麥甲藻扁平變種。
[0164]可以通過任何手段「獲得」用於本發明的方法的樣品。例如，可以通過從天然存在狀態(例如來自湖泊、海洋或河流的樣品)移除樣品，或通過從「非天然」狀態(例如在實驗室裝置、障壁、儲集器、貯槽等中的培養物)移除樣品獲得樣品。
[0165]用於本發明的方法的樣品可以被懷疑包含一種或多種鞭毛藻，或一種或多種產石房蛤毒素的鞭毛藻。樣品可以是比較或對照樣品，例如包含已知濃度或密度的鞭毛藻或產石房蛤毒素的鞭毛藻的樣品或包含鞭毛藻或產石房蛤毒素的鞭毛藻的一種或多種已知物種或菌株的樣品。樣品可以是來源於任何來源的。例如，樣品可以是環境樣品。環境樣品可以來源於例如鹽水、淡水、河流、湖泊、海洋或沿岸水。環境樣品可以來源於鞭毛藻水華。作為替代方案，樣品可以來源於實驗室來源，如培養物，或商業來源。作為替代方案，樣品可以來源於生物來源，如例如組織或生物流體。可以例如通過純化、稀釋或任何其他一種或多種組分的添加將樣品從其初始狀態改性。
[0166]在某些實施例中，使用本發明的方法測試的樣品可以提供關於在填充該樣品的來源的動物中石房蛤毒素存在或不存在的信息。例如，可以測試樣品以確定在如例如魚(例如河豚)和尤其是貝類(例如貽貝、蛤蜊、牡蠣、扇貝等)的動物海鮮中石房蛤毒素的存在或不存在。
[0167]用於本發明的方法的聚核苷酸和多肽可以是從呈混合培養物形式或呈個別物種或屬分離株形式的微生物分離(即提取)的。因此，可以在提取之前培養樣品的微生物或可以直接在給定樣品上進行提取。用於分離(即提取)和純化用於使用本發明的方法的分析的聚核苷酸和多肽的合適的方法通常在本領域中已知並且例如描述在如奧斯貝(編)現代分子生物學實驗指南(2007)，約翰.威利父子出版公司；科林根等人(編)現代蛋白科學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology) (2007),約翰.威利父子出版公司；沃克(Walker)(編)(1988),新蛋白質技術:分子生物學方法(New ProteinTechniques:Methods in Molecular Biology),胡馬納出版社(Humana Press)，新澤西州克利夫頓(Clifton, N.J);以及斯科普斯(Scopes)，R.Κ.(1987)蛋白質純化:原理與實踐(Protein Purification:Principles and Practice),第三版，斯普林格出版社(Springer-Verlag),紐約州紐約市(New York, N.Y.)的標準文本中。另外方法描述在尼蘭(Neilan) (1995)應用與環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.>61:2286-2291 中。適合用於本發明的方法中的合適的多肽純化技術包括(但不限於)逆相色譜、疏水性相互作用色譜、離心、凝膠過濾、硫酸銨沉澱以及離子交換。
[0168]在替代實施例中，可以不從樣品分離核酸和/或多肽進行本發明的方法。
[0169]可以使用任何合適的技術進行檢測在給定樣品中本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽的存在(或確定其不存在)。合適的技術可以典型地涉及對於任何一種或多種本發明的聚核苷酸或任何一種或多種本發明的多肽具有特異性的引物、探針或抗體的使用。合適的技術包括例如聚合酶鏈式反應(PCR)和此技術的相關變化形式(例如定量PCR)、基於抗體的檢驗(如ELISA)、免疫印跡法(western blotting)、流動式細胞測量術、螢光顯微法等。這些和其他合適的技術通常在本領域中已知並且例如描述在如科林根等人(編)現代蛋白科學實驗指南(2007)，約翰?威利父子出版公司；沃克(編)(1988)，新蛋白質技術:分子生物學方法，胡馬納出版社，新澤西州克利夫頓；以及斯科普斯(1987)蛋白質純化:原理與實踐，第三版，斯普林格出版社，紐約州紐約市的標準文本中。
[0170]在優選實施例中，檢測給定樣品中的本發明的聚核苷酸的存在(或確定其不存在)是通過使用特異性地雜交到聚核苷酸序列的引物利用聚合酶鏈式反應來擴增提取自相關樣品的核酸，和檢測擴增的序列實現的。在PCR方法下，可以設計寡核苷酸引物以用於PCR反應中以擴增本發明的聚核苷酸，如例如RNA(例如mRNA)、DNA和/或cDNA聚核苷酸。PCR的合適的方法包括(但不限於)使用成對引物、巢式引物、單一特異性引物、簡併引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分地不匹配引物等的那些方法。用於設計PCR和RT-PCR引物的方法通常在本領域中已知並且例如披露在如奧斯貝等人(編)現代分子生物學實驗指南(2007)，約翰?威利父子出版公司；馬尼亞迪斯等人分子克隆(1982)，280-281 ;英尼斯等人(編)(1990) PCR方案:指導方法和應用，(學術出版社，紐約);英尼斯和蓋爾範德，(編)(1995) PCR策略，(學術出版社，紐約)；英尼斯和蓋爾範德，(編)(1999) PCR方法手冊，(學術出版社，紐約)；以及薩布魯克等人(1989)分子克隆:實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，紐約普萊恩維尤的標準文本中。
[0171]有技能的讀者將容易地了解到在不影響獲得所需產物的能力的情況下，PCR和RT-PCR程序的不同參數可以變化。例如，鹽濃度可以變化或變性、退火以及延伸步驟中的一種或多種的時間和/或溫度可以變化。類似地，DNA、cDNA或RNA模板的量還可以取決於可供使用的核酸的量或對於有效擴增所需的模板的最佳量變化。用於本發明的方法和試劑盒的引物典型地是寡核苷酸，這些寡核苷酸典型地長度為至少約5個核苷酸至約80個核苷酸，更典型地長度為約10個核苷酸至長度為約50個核苷酸，並且甚至更典型地長度為約15個核苷酸至長度為約30個核苷酸。 [0172]有技能的讀者將辨識本發明的引物可以適用於多個不同應用，包含但不限於PCR、RT-PCR以及作為用於本發明的聚核苷酸的檢測的探針。可以通過任何合適的方法，包括例如直接化學合成或適當序列的克隆和限制來製備這些引物。並非引物中的所有鹼基需要將模板分子的序列反映到其將雜交的引物。引物僅需要含有充足互補鹼基以使得引物能夠雜交到模板。引物還可以在一個或多個位置包括錯配鹼基，這些鹼基是不與模板中的鹼基互補，而是經設計以在鹼基延伸或擴增時將變化合併到DNA中的鹼基。引物可以包括另外鹼基，例如呈在5』末端的限制酶識別序列形式以促進擴增的DNA的克隆。
[0173]本發明的方法涉及檢測在給定樣品中的本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽的存在(或確定其不存在)。如上文所指出，序列可以包含石房蛤毒素A序列，這些石房蛤毒素A序列包括石房蛤毒素Al、A2、A3或A4催化域序列(或其片段)中的任何一種或多種。優選地，序列包含石房蛤毒素Al和/或石房蛤毒素A4域(或其片段)。更優選地，序列包含石房蛤毒素A4域(或其片段)。
[0174]有技能的讀者將辨識可以在進行本發明的方法時使用任何能夠擴增本發明的聚核苷酸的引物、任何能夠檢測本發明的聚核苷酸的探針或任何能夠檢測本發明的多肽的抗體。在優選實施例中，引物、探針和抗體特異性地結合到前述段落(即正上方的段落)中提及的任何一種或多種石房蛤毒素A序列。
[0175]通過「特異性地結合」，將理解引物、探針或抗體能夠以比其結合到不相關序列上更高的親和力結合到靶向序列上。因此，當暴露於呈潛在結合搭配物形式的多個不同但同樣可接入的序列時，對於靶向序列具有特異性的引物、探針或抗體將選擇性地結合到靶向序列並且其他替代性潛在結合搭配物將與引物、探針或抗體保持實質上非結合。一般來說，對於靶向序列具有特異性的引物、探針或抗體將比結合到非靶向序列的其他潛在序列上至少10倍，優選地是50倍，更優選地是100倍且最優選地是大於100倍地更頻繁地優先結合到靶向序列上。對於靶向序列具有特異性的引物、探針或抗體可以是能夠以較弱但可檢測的水平結合到非靶向序列上的。這通常被稱為背景結合併且例如通過適當對照物的使用容易地分清與特異性結合的差別。
[0176]在優選實施例中，引物、探針或抗體特異性地結合到石房蛤毒素Al或A4催化域聚核苷酸或多肽序列，或其片段。更優選地，引物、探針或抗體特異性地結合到石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸或多肽序列，或其片段。
[0177]合適的引物和探針可以特異性地結合到石房蛤毒素Al催化域聚核苷酸序列的任何片段。合適的抗體可以特異性地結合到通過這些聚核苷酸序列編碼的石房蛤毒素Al催化域多肽序列的片段。
[0178]合適的引物和探針可以特異性地結合到石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸序列的任何片段。僅通過非限制性實例，合適的引物和探針可以特異性地結合到通過以基因庫保藏號JF343239 (SEQ ID NO:3)所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121定義的石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸序列的片段。合適的抗體可以特異性地結合到通過這些聚核苷酸序列編碼的石房蛤毒素A4催化域多肽序列的片段。
[0179]在一些實施例中，本發明的方法可以涉及檢測在使用PCR擴增的樣品中的本發明的聚核苷酸的存在(或確定其不存在)。對於石房蛤毒素A聚核苷酸序列的PCR擴增合適的寡核苷酸引物對可以是能夠擴增sxt基因的任何一個或多個催化域或其片段。優選地，弓丨物擴增包含石房蛤毒素A4催化域聚核苷酸序列或其片段的序列。僅通過非限制性實例，對於此目的合適的引物對可以包含第一引物，其包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或其片段或變異體，和/或第二引物，其包含SEQ ID NO: 199的聚核苷酸序列或其片段或變異體。合適的引物對的其他非限制性實例包括以SEQ ID NO:200-211,220-223,228-229以及243-244所示的那些引物對(包括這些引物對序列的片段和變異體)。
[0180]有技能的讀者將辨識例示的引物一般來說並不打算限制石房蛤毒素A基因擴增的區域或本發明的方法。有技能的讀者還將辨識本發明不限於例示的特異性引物的使用，並且還可以使用替代性引物序列，條件是恰當地設計引物以實現石房蛤毒素聚核苷酸序列，優選地石房蛤毒素A聚核苷酸序列，並且更優選地石房蛤毒素Al和/或A4域聚核苷酸序列的擴增。
[0181] 在其他實施例中，本發明的方法可以涉及通過合適的探針的使用檢測在樣品中的本發明的聚核苷酸的存在(或確定其不存在)。本發明的探針基於本發明的sxt聚核苷酸序列。探針是典型地通過雜交用於同源序列的檢測的具有例如在約10個核苷酸與幾千個核苷酸之間的可變長度的核苷酸序列。本發明的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。可以通過標記物的結合標記本發明的探針以便於這些探針的檢測。合適的標記物的實例包括螢光分子(例如乙醯氨基芴、5-溴脫氧尿苷、地高辛、螢光素)和放射性同位素(例如32P、35S、3H、33P)。可以例如通過化學、光化學、免疫化學、生物化學或光譜技術實現標記物的檢測。用於核苷酸探針的設計和/或生產的方法通常在本領域中已知，並且例如描述在如羅賓遜(Robinson)等人.(編)流式細胞儀實驗指南(CurrentProtocols in Cytometry)約翰.威利父子出版公司；奧斯貝等人(編)現代分子生物學實驗指南(2007)，約翰.威利父子出版公司；薩布魯克等人(1989)分子克隆:實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，紐約普萊恩維尤；以及馬尼亞迪斯(Maniatis)等人(1982)分子克隆(Molecular Cloning), 280-281 的標準文本中。
[0182]在其他實施例中，本發明的方法可以涉及檢測在使用抗體的樣品中的本發明的多肽的存在(或確定其不存在)。抗體可用於定性地或定量地檢測和分析給定樣品中的一種或多種本發明的STX多肽。抗體可以結合到允許例如通過流動式細胞測量術、免疫組織化學法或本領域中已知的其他方法進行檢測的熒色物。可替代地,抗體可以結合到允許比色或化學發光檢測的底物。本發明還涵蓋能夠結合到能夠特異性地結合到本發明的多肽的一種或多種抗體的二級抗體的使用。[0183]用於檢測鞭毛藻的試劑盒
[0184]本發明還提供用於本發明的聚核苷酸和/或本發明的多肽的檢測和/或分離的試劑盒(「本發明的試劑盒」)。
[0185]在某些實施例中，試劑盒用於檢測樣品中的鞭毛藻。
[0186]在其他實施例中，試劑盒用於檢測樣品中的產石房蛤毒素鞭毛藻。
[0187]在其他實施例中，試劑盒用於確定樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在。
[0188]一般來說，本發明的試劑盒包含至少一種用於檢測一種或多種本發明的聚核苷酸和/或一種或多種本發明的多肽，和/或其變異體或片段的存在的試劑(參見名稱為「聚核苷酸和多肽」的以上部分中的描述)。可以在試劑盒中包括任何適合於此目的的試劑。合適的試劑的非限制性實例包括如在名稱為「探針、引物以及抗體」和「用於檢測鞭毛藻的方法」的部分中的上文所描述的那些引物、探針和抗體。
[0189]在優選實施例中，試劑盒用於本發明的方法(參見名稱為「用於檢測鞭毛藻的方法」的以上部分中的描述)。
[0190]在一些實施例中，本發明提供一種用於樣品中的鞭毛藻的檢測的試劑盒，該試劑盒包含至少一種用於檢測樣 品中的一種或多種本發明的聚核苷酸和/或一種或多種本發明的多肽和/或任一者的變異體或片段的存在的試劑。優選地，鞭毛藻是產石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0191]在其他實施例中，本發明提供一種用於確定樣品中的鞭毛藻的不存在的試劑盒，該試劑盒包含至少一種用於確定樣品中的一種或多種本發明的聚核苷酸和/或一種或多種本發明的多肽和/或任一者的變異體或片段的不存在的試劑。優選地，鞭毛藻是產石房蛤毒素的鞭毛藻。
[0192]一般來說，本發明的試劑盒可以包含任何數目的另外組分。通過非限制性實例，另外組分可能包括用於收集和/或存儲樣品的組分、用於細胞培養的試劑、參考樣品、緩衝劑、標籤和/或用於進行本發明的方法的書面說明書。
[0193]使用本發明的試劑盒在樣品中檢測到的或確定在樣品中不存在的鞭毛藻可以是產石房蛤毒素的鞭毛藻。沒有施加任何具體的限制，鞭毛藻可以是來自膝溝藻目或裸甲藻目的。鞭毛藻可以是來自亞歷山大藻(以前為膝溝藻)、盾甲藻或裸甲藻屬的。亞歷山大藻物種的合適的實例包括鏈狀亞歷山大藻(例如菌株ACCC01、ACSH02、ACTRA02以及CCMP1493)、芬迪灣亞歷山大藻(例如菌株CCMP1719和CCMP1979)、海洋原甲藻、微小亞歷山大藻(例如菌株CCMP1888、CCMPl 13、ALSP01、ALSP02以及AMD16/AMAD16)、當烏氏亞歷山大藻(A.0stenfeldii)以及塔瑪亞歷山大藻(例如菌株CCMP1771、ATBBOl、ATEBOl、ATCJ33以及ATNWB01)。裸甲藻物種的合適的實例包括鏈狀裸甲藻(例如菌株GCTRA01和CS-395)。盾甲藻物種的合適的實例包括巴哈馬麥甲藻扁平變種。
[0194]本領域的普通技術人員將了解在不脫離概括地描述的本發明的精神或範圍的情況下，可以對如具體實施例中所述的本發明做出許多變化和/或修改。因此將本發明實施例在各方面視為例示性並且非限制性的。
[0195]實例
[0196]現在將參考具體實例描述本發明，這些實例不應被理解為以任何方式限制性的
[0197]實例1:鞭毛藻中的神經毒素石房蛤毒素的核編碼基因的鑑別[0198]材料和方法
[0199]-培養和毒素測量
[0200]從不同培養物保藏(表1)獲得產石房蛤毒素和非產石房蛤毒素的鞭毛藻培養物。
[0201]表1.用於此研究的鞭毛藻菌株、這些菌株的STX生產以及sxtAl和sxtA4片段是否從其基因組DNA擴增的清單。
[0202]
【權利要求】
1.一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的方法，該方法包括: 獲得用於該方法的一種樣品，並且 分析該樣品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽中的一種或多種的存在， 其中所述聚核苷酸或多肽的存在指示該樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的存在。
2.—種用於確定樣品中產石房蛤毒素的鞭毛藻不存在的方法，該方法包括: 獲得用於該方法的一種樣品，並且 分析該樣品中鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽中的一種或多種的存在， 其中所述聚核苷酸或多肽的不存在指示該樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中該聚核苷酸包含石房蛤毒素A核苷酸序列，該石房蛤毒素A核苷酸序列選自以SEQ ID N0:5-197、224-227、230-242以及247中的任一種所示的那些序列或那些序列中的任一種的片段或變異體。
4.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中該聚核苷酸包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段。
5.根據權利要求4所述的方法，其中該石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQID N0:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或變異體。
6.根據權利要求4所述的方法，其中該石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQID NO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO:3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或變異體。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述分析包括通過聚合酶鏈式反應來擴增來自該樣品的聚核苷酸。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述聚合酶鏈式反應利用一種或多種引物，該一種或多種引物包含以 SEQ ID NO: 198-199,200-211,220-223,228-229 以及 243-244 中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的片段或變異體。
9.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中該多肽包含以SEQIDNO:2或SEQ IDNO:4所示的石房蛤毒素A胺基酸序列或二者之一的序列的片段或變異體。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中該產石房蛤毒素的鞭毛藻是來自亞歷山大藻(Alexandrium)、盾甲藻(Pyrodinium)或裸甲藻(Gymnodinium)屬。
11.根據權利要求10所述的方法，其中該產石房蛤毒素的鞭毛藻是選自下組，該組由以下各項組成:鏈狀亞歷山大藻(A.catenella)、芬迪灣亞歷山大藻(A.fundyense)、無菌亞歷山大藻(A lusitanicum)、微小亞歷山大藻(A.minutum)、當烏氏亞歷山大藻(A.0stenfeldii)、塔瑪亞歷山大藻(A.tamarense)、鏈狀裸甲藻(G.catenatum)以及巴哈馬麥甲藻扁平變種(P.bahamense var compressum)。
12.一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的試劑盒，該試劑盒包含至少一種用於檢測鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽的存在的試劑。
13.一種用於確定樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的不存在的試劑盒，該試劑盒包含至少一種用於檢測鞭毛藻石房蛤毒素A聚核苷酸或由所述聚核苷酸編碼的多肽的存在的試劑。
14.根據權利要求12或權利要求13所述的試劑盒，其中該試劑特異性地結合到包含石房蛤毒素A核苷酸序列的聚核苷酸上，該石房蛤毒素A核苷酸序列選自以SEQ IDNO:5-197,224-227,230-242以及247中的任一種所示的那些序列或那些序列中的任一種的片段或變異體。
15.根據權利要求12或權利要求13所述的試劑盒，其中該試劑特異性地結合到包含石房蛤毒素Al催化域序列、石房蛤毒素A4催化域序列或其片段的聚核苷酸上。
16.根據權利要求15所述的試劑盒，其中該石房蛤毒素A4催化域序列或其片段包含以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3115-4121、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸3597-3721或二者之一的序列的片段或變異體。
17.根據權利要求15所述的試劑盒，其中該石房蛤毒素Al催化域序列包含以SEQIDNO:1所示的聚核苷酸序列的核苷酸160-1821、以SEQ ID NO: 3所示的聚核苷酸序列的核苷酸277-2022或二者之一的序列的片段或變異體。
18.根據權利要求12至17中任一項所述的試劑盒，其中該試劑是一種引物、探針或抗體。
19.根據權利要求12至18中任一項所述的試劑盒，其中該試劑是包含以SEQIDNO: 198-199,200-211,220-223,228-229以及243-244中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的片段或變異體的引物。
20.根據權利要求12或權利要求13所述的試劑盒，其中該試劑特異性地結合到以SEQID NO:2或SEQ ID N0:4所示的石房蛤毒素A胺基酸序列或二者之一的序列的片段或變異體上。
21.一種分離的聚核苷酸，包含以SEQ ID NO:1所示的序列或其變異體或片段。
22.—種分離的聚核苷酸，包含以SEQ ID NO:3所示的序列或其變異體或片段。
23.一種分離的聚核苷酸，包含以SEQ ID N0:5-197、224-227、230-242以及247中的任一種所示的序列或那些序列中的任一種的變異體或片段。
24.一種分離的多肽，由根據權利要求21至23中任一項所述的聚核苷酸編碼。
25.一種用於檢測樣品中的產石房蛤毒素的鞭毛藻的引物對，其中所述引物對包含: 包含SEQ ID NO: 198的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO: 199的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID NO: 200的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:201的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:202的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:203的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:204的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:205的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:206的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:207的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:208的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:209的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或包含SEQ ID N0:210的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:211的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:220的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:221的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:222的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:223的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:228的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:229的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物；或 包含SEQ ID N0:243的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第一引物，和包含SEQID NO:244的聚核苷酸序列或由該聚核苷酸序列組成的第二引物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103748235SQ201280023720
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年5月16日 優先權日:2011年5月16日
【發明者】布雷特·A·尼蘭, 肖納·安·默裡, 安可·斯圖克恩, 謝蒂爾·S·雅各布森, 拉塞爾·J·S·奧爾, 拉爾夫·凱爾曼 申請人:新南創新有限公司, 奧斯陸大學