以成年體細胞胞核重建的去核卵母細胞足月發育成動物的製作方法

2023-05-26 10:08:26 2

專利名稱：以成年體細胞胞核重建的去核卵母細胞足月發育成動物的製作方法
本申請是1998年8月10日提交的美國專利申請No.09/132,104的部分續展申請，該專利申請要求了1998年1月21日提交的美國臨時專利申請No.60/072,002和1998年6月19日提交的No.60/072,002的優先權。
美國政府在本發明中有一個已支付的許可，並且在一定情況下有權根據公眾健康服務部國立衛生研究院資助合同No.R01-HD-03402中的條款要求專利所有人以合理的條件許可他人。
背景技術：
本發明涉及一種克隆動物的方法，該方法是將成年體細胞的細胞核插入去核的卵母細胞，從而使宿主卵母細胞形成胚胎，並能發育成活的動物。在本發明的一個實施方案中，細胞核的插入是通過壓電驅動的顯微注射來實現的。
迅速生產大量幾乎相同的動物是非常希望的。例如，當幾乎相同的動物是基因工程產生的(例如轉基因)動物時，預計可以獲得廣泛的醫學效益。經過遺傳改變的大動物可作為活的藥物「工廠」，在其乳液或其它體液或組織中生產出有價值的藥物製劑(該生產方法有時稱為「產藥(pharming)」)，或可作為活器官或細胞的「工廠」，產生不會被人免疫系統排斥的人類器官或細胞。生產大量幾乎相同的研究動物如小鼠、豚鼠、大鼠和倉鼠也是所希望的。例如，小鼠是研究哺乳動物生物學的主要研究模型，因此幾乎相同的轉基因或非轉基因小鼠的獲得對於(例如)分析胚胎發育、分析人疾病以及測試新藥是非常有益的。因此，出於各種原因(例如在繁殖農場動物方面，或解釋小鼠中產生的資料方面)，希望能可靠地產生在遺傳學上與其親代幾乎相同的特定動物的後代。
另外，在轉基因技術中，目前用來產生轉基因動物的方法並非先進得足以保證整個動物中的基因表達受程序控制。儘管可以最大程度地減小由轉基因整合到宿主基因組中的準隨機方式引起的有害的「位置」效應，但是攜帶插入相同基因座的相同拷貝數的同一轉基因構建物的個體之間仍存在轉基因表達水平的差異。因此，即使是產生為數不多的能產生所需水平給定重組蛋白的轉基因動物仍是非常耗時和昂貴的。由於轉基因後代的數目通常很低(通常只有一個，因為效率低)，且許多轉基因動物是不能生育的，這些問題可能會進一步加劇。
解決這些問題的一種方法是從具有所需性狀或能產生所需水平目標產物的轉基因或非轉基因成年動物細胞「克隆」出遺傳上幾乎相同的動物。所以，能從一個成年動物的細胞相當迅速地產生遺傳上幾乎相同的動物群落(克隆)。另外，選擇性地、可靠地克隆能產生高產量乳液和肉的成年動物，就能迅速地產生大量的高產者。從成年體細胞克隆動物在複製寵物(如狗、貓、馬、鳥等)以及稀有或將要絕種的動物方面也是有益的。本文所用的「克隆」指完全發育至動物成年期，該動物的非線粒體DNA可以通過將供體體細胞的核染色體轉移到已經除去原有染色體的受體細胞(如卵母細胞)中而從該供體體細胞衍生獲得。
在正常的哺乳動物發育中，卵母細胞在第一次減數分裂前期發育停滯在生發泡(GV)階段。在合適的刺激(例如血漿促黃體素驟增)下，繼續開始減數分裂，生發泡破裂，完成第一次減數分裂，然後卵母細胞停滯在第二次減數分裂中期(「MetⅡ」)。然後，MetⅡ卵母細胞能排卵和受精。一旦受精，卵母細胞完成減數分裂，排出第二極體，形成雄性和雌性的前核。胚胎開始發育，經歷一系列的減數分裂然後分化成特異性的細胞，從而導致組成組織和器官。這種發育程序確保了從卵母細胞成功地轉變至後代。
儘管認為早期胚胎的細胞在分類上是全能的(即它們本身能發育成新的個體)，但是這種全能性在幾次分裂後喪失，而動物種類(如鼠和牛的胚胎)之間的分裂次數是不同的。對這種表觀上的全能性喪失的機制尚知之很少，但推測它反映了影響基因表達的DNA環境中的細微變化，總稱為「重新編程(reprogramming)」。不希望受理論的束縛，認為克隆技術可能擾亂或模擬了「重新編程」。
鑑於克隆在實踐上的眾多優點，人們對克服技術障礙和胚胎細胞或胎兒細胞(fetal cell)與去核卵母細胞融合新技術的開發有極大的興趣。然而，迄今還沒報導過一種方法經從成年體細胞再現地產生了足月發育(full term development)的克隆(個體)。例如，曾報導說，將牛卵丘細胞胞核注射到去核卵母細胞內，然後將這些卵母細胞電激活，351個注射後的卵母細胞中有9％發育成胚泡，但沒有一個發育到底。同樣，用仙臺病毒介導成年小鼠胸腺細胞與去核的MetⅡ卵母細胞融合，然後用7％乙醇激活30至60分鐘，結果使20個卵母細胞中70％達到2細胞階段，但是沒有一個發育超過4細胞階段。
最近的一份報告描述了培養的「乳腺細胞」與去核的卵母細胞電融合產生了一個活的後代綿羊，稱為「多利」(Wilmut,Ⅰ.等人(1997),Nature 385,810-813)。據報導，多利羊是去核卵母細胞在血清飢餓條件下培育5天的與乳腺衍生細胞電融合的434個中的一個發育而成。根據報導用來克隆多利羊的方法，系通過顯微移液將「乳腺細胞」插入去核卵母細胞的卵周隙內。Wilmut報導說，立即給予細胞電脈衝，以誘導膜融合併激活卵母細胞以觸發細胞周期的再次開始。將所得的胚胎(在實驗中還有其它28個)轉移到合適的接受者中，在這個唯一的例子中，受孕產生了多利羊。然而，由於該「乳腺細胞」取自6歲處於第三次受孕、受孕三個月的綿羊建立的細胞系，因此公眾懷疑獲得供體細胞胞核的細胞身份，甚至懷疑該細胞是否來源於成年羊。
在我們的共同擁有的待批美國專利申請No.09/132,104(本申請是它的部分續展)中，我們公開並要求了一種從成年體細胞克隆動物的可控制的有效方法，其典型例子是從成年卵丘細胞胞核成功地產生了克隆的能生育的小鼠。我們還公布說，該方法能成功地用於產生該克隆小鼠的克隆。由於供體卵丘細胞的來源是雌性的，因此產生的所有克隆小鼠都是雌性。
本發明的從成年體細胞克隆動物的方法是，將體細胞的細胞核(或一部分核物質，至少包括最低限度的能支持發育的染色體物質)直接插入去核卵母細胞的細胞質中，促進重建的卵母細胞胚胎發育，產生活的後代。本文所用的術語「成年體細胞」指來自出生後動物的細胞，因此它既不是胎兒細胞，也不是胚胎細胞，且不是配子譜系。所得存活後代是最初提供體細胞胞核用於注射入卵母細胞的動物的克隆。本發明適用於克隆所有的動物，包括兩棲動物、魚類、鳥類(例如家雞、火雞、鵝等)以及哺乳動物，如靈長類動物、羊、牛、豬、熊、貓、狗、馬、嚙齒類動物等。
在本發明的一個實施方案中，供體成年體細胞是「兩倍的(2n)」；即，如在細胞周期的G0或G1期所見具有兩套染色體。供體細胞可以從體內來源獲得，或可來自培養的細胞系。兩倍供體胞核(即處於G0或G1期)的體內來源的例子是卵丘細胞。稱卵丘(cumulus，拉丁文意思是「小土丘」)細胞是因為在排卵前它們在發育的卵子周圍形成了卵泡細胞的緊密團塊(堆)。在一些動物如小鼠排卵後，這些細胞有許多仍保持與卵母細胞結合(形成卵丘)，在小鼠中，它們90％以上處於G0/G1期，因此是雙倍體。本發明打算採用的供體胞核取自其它體內或體外的(即培育的)二倍體成年體細胞來源，它們包括，但不局限於，上皮細胞、神經細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、黑色素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、帶核紅細胞、成纖維細胞、足細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞和來自器官的其它細胞，這些器官包括但不局限於，皮膚、肺、胰、肝、腎、膀胱、胃、腸、骨等，以及它們的合適的先祖細胞。
在本發明的另一個實施方案中，供體成年體細胞是「2C至4C」；即，它含有1至2倍的二倍體基因組物質(由細胞周期S期複製產生)。該供體細胞可以從活躍分裂的細胞的體內或體外來源獲得，它包括但不局限於，上皮細胞、造血細胞、表皮細胞、角質細胞、成纖維細胞等，及其合適的先祖細胞。
本發明方法的一個實施方案包括下列步驟(ⅰ)在插入卵母細胞之後、激活卵母細胞之前，使胞核(或其包括染色體的部分)與去核卵母細胞的細胞質接觸一段時間(例如多達約6小時)，和(ⅱ)激活該卵母細胞。在該實施方案中，用不伴隨激活卵母細胞的方法將胞核插入去核卵母細胞的細胞質中。
當採用具有二倍染色體的供體胞核時，該方法還包括在將胞核插入去核卵母細胞之後一定時間內破壞微管和/或微絲裝配(assembly)的步驟，以便抑制極體形成並維持二倍染色體數目。例如，當採用四倍供體胞核時，省略方法中的該步驟，從而形成一個極體，核植入的卵母細胞的染色體倍數可以減少至二倍。
在本發明的一個較佳的實施方案中，通過顯微注射，更佳的是通過壓電驅動的顯微注射插入胞核。壓電顯微操作儀的使用能以一個針頭進行供體胞核的收穫和注射。而且，可以迅速有效地進行卵母細胞的去核以及供體細胞胞核的注射，因此，對卵母細胞的損傷比以前報導的方法(例如通過促進融合的化學物質、通過電或通過融合性病毒介導來融合供體細胞和卵母細胞)更少。
通過顯微注射引入胞核物質在時間上和局部解剖學上均與細胞融合不同。採用顯微注射方法，經一步或多步刺入供體細胞的質膜(以便能抽提出胞核)，這些步驟與刺入質膜後將該胞核(或其一部分，至少包括染色體)輸送入去核卵母細胞的步驟在時間上是分開的。分開刺入的行為並不是細胞融合的特徵。
另外，胞核的除去與導入的時空分開使得能夠控制除胞核外的其它物質的導入。除去外源細胞質和導入額外的物質或試劑的方法是非常需要的。例如，添加物可有利地調節核植入卵母細胞的胚胎學發育。這種試劑可包括抗體、藥理學上的信號轉導抑制劑或它們的組合，其中抗體和/或抑制劑針對和/或抑制在細胞分裂或胚胎發育中起負調節作用的蛋白質或其它分子的作用。該種試劑可包括核酸序列，例如能在胚胎發育期間表達的重組質粒或轉化載體構建物，以編碼對發育具有潛在正效應的蛋白，和/或整合入細胞基因組中的核酸序列，以形成轉化的細胞和遺傳學發生改變的動物。試劑導入細胞可發生在胞核與去核卵母細胞結合之前、同時或之後。


圖1A是卵丘細胞包圍的排卵的活卵母細胞的顯微照片。卵膜(egg coat)(透明帶)看上去是圍繞卵母細胞的相對透明區域。
圖1B是在將卵丘細胞胞核注射入去核卵母細胞的細胞質後10分鐘內拍攝的顯微照片，圖中顯示了在卵母細胞細胞質內的完整的卵丘細胞胞核。對注射了卵丘細胞胞核的卵母細胞進行固定，染色，用相差顯微鏡拍照。
圖1C是顯示胞核注射後3小時胞核轉化進入顯現混亂的染色體的顯微照片。混亂反映了一個不同尋常的狀態，其中每個單倍的凝聚的染色單體與紡錘體的一極相連，因此沒有排列在中期板上。
圖1D是用Sr2-激活卵母細胞後1小時拍攝的顯微照片，圖中顯示染色體分成兩組(mb=中間體)。
圖1E和1E＇是用Sr2-激活卵母細胞後5小時拍攝的顯微照片，圖中顯示了兩個假前核，每個卵具有不同數目的可辨認的核仁樣結構。假前核的大小和數目是變化的，提示卵母細胞激活後染色體是「隨機」分開的。
圖1F是將卵丘細胞胞核注射入去核卵母細胞後產生的活的胚泡的顯微照片。
圖2A是四周齡(克隆小鼠)Cumulina(前者)與其代孕母鼠的照片。
圖2B是Cumulina在2.5個月時與其和CD-1(白化體)雄鼠交配後產下的幼鼠的照片。
圖2C顯示了兩隻B6C3F1衍生的克隆的野灰色(agouti)幼鼠(中間)，以及它們的代孕母鼠(CD-1)(B6D2F1卵母細胞供體，黑色，右側)和B6C3F1卵丘細胞供體(野灰色，左側)。中央的兩隻野灰色後代是野灰色卵丘細胞供體的克隆(相同的「孿生」姐妹)，是系列C(見下文)和表2中描述的後代中的兩隻。
圖3描述了在將足細胞胞核注射入去核卵母細胞後衍生的胚胎轉移到子宮內後的發育。圖3A是交配(coitum)後8.5天(8.5dpc)接受雌鼠的子宮的顯微照片，子宮用布安固定液固定，用苯甲酸苄酯脫水並清潔。所有的子宮植入部位均不能發育，除了一個以外(箭頭處)，在該處胚胎(圖3B)看來正常並處於大約12個體節階段。
圖4顯示了系列C(見下文和表2)中供體與後代的DNA分型，它確證了克隆後代與卵丘細胞供體之間的遺傳相同性，且卵母細胞供體與宿主代孕雌鼠之間的不相同性。將6個克隆的系列C後代的胎盤DNA(泳道10-15)與三隻卵丘細胞供體雌鼠的DNA(泳道1-3)、三隻卵母細胞接受雌鼠(泳道4-6)的DNA和三隻宿主雌鼠(泳道7-9)的DNA比較。對照DNA來自C57BL/6(泳道16)、C3H(泳道17)、DBA/2(泳道18)、B6C3F1(泳道19)和B6D2F1(泳道20)。圖4A和4B的左側顯示了100鹼基對(bp)DNA大小標記的序列梯。圖4A描述了用株系特異性標記D1 Mit46進行的PCR分型。圖4B描述了用株系特異性標記D2Mitl02的PCR分型。F1代雜交小鼠的PCR擴增的DNA(圖4A和圖4B)顯示出在近交親代株系的DNA(泳道16-20)中未見的額外的凝膠條帶。該額外的條帶對應於從兩個親代產物衍生獲得的異源雙鏈體，它的構型導致了反常的凝膠遷移。圖4C描述了株系特異性Emv基因座(Emv1,Emv2和Emv3)的Southern印跡分型。
圖5是本發明的克隆程序的示意圖。
發明詳述有絲分裂細胞周期確保分裂的每個細胞將相等的遺傳物質給予兩個子細胞。DNA合成並非貫穿整個細胞分裂周期，而是局限於該周期的一部分，即在有絲分裂前的合成期(或「S」期)。在DNA合成後和細胞分裂前有一時間間期(G2)；另一間期(G1)發生於分裂後和下一個S期之前。這樣，細胞周期包括M(有絲分裂)期、G1期(間期1)、S期、G2期(間期2)，最後回到M期。組織中許多不分裂的細胞(例如所有的休眠的成纖維細胞)周期中止於有絲分裂後至S期前。在S期之前退出細胞周期的這種「休眠」細胞被稱為處於G0期。進入G0期的細胞可以暫時或長時間地停留於該狀態。例如，足細胞和神經元的特徵是在成年動物中不分裂、而保持處於G0期。新近排卵(小鼠)的卵母細胞周圍的卵丘細胞有90％以上處於G0或G1期。G0或G1期的細胞胞核具有二倍(2n)DNA含量，即，它們的形態上不同的染色體(n-1倍的常染色體)各具有兩個拷貝。處於G2期的細胞胞核具有4倍的DNA含量，即，在S期期間，每個不同染色體的兩個拷貝各自已經被複製。
本發明描述了產生脊椎動物克隆的方法。在該方法中，每個克隆從去核卵母細胞發育而成，該卵母細胞已經接受了成年體細胞的胞核(或其一部分，至少包括染色體)。在本發明的一個實施方案中，在用本發明方法將卵丘細胞(即排卵的卵泡細胞)胞核顯微注射到去核的卵母細胞中後生出了克隆小鼠。在本發明的另一實施方案中，在用本發明的方法將成年動物尾部成纖維細胞的胞核注射到去核卵母細胞中後生出了克隆小鼠。在採用成纖維細胞的本發明實施方案中，將一些成纖維細胞體外培養在不含血清的培養基中；因此，這些成纖維細胞是「飢餓」的，以便誘導它們處於細胞周期的G0或G1期(這是本領域所知道的)，並假定它們含有二倍染色體。其它成纖維細胞體外培養在含有血清的培養基中；因此，這些成纖維細胞通過分裂繼續著細胞周期，假定它們是2C至4C的。在本發明的另一個實施方案中，用胸腺細胞、脾細胞、巨噬細胞作為成年體細胞胞核供體。
其它的動物，例如但不局限於，靈長類動物、牛、豬、貓、狗、馬等也可用本發明的方法來克隆。本文顯示的本發明方法提供的胚胎成功發育至桑椹胚/胚泡階段的比例高，轉移的胚胎植入代孕接受動物的比例高，產生新生哺乳動物的成功率大於2％。這些效率的量值意味著本發明的方法容易再現。
圖5的例子中描述了本發明克隆動物方法之一個實施方案的步驟和分步驟。簡言之，(1)從卵母細胞供體動物收穫卵母細胞。(2)除去MetⅡ板，形成去核卵母細胞(無染色體的卵)。(3)從成年供體中收穫體細胞，(4)選出外表健康的細胞，(5)獲得它們的胞核(或包括染色體的胞核組成物)。(6)將單個胞核注射入去核卵母細胞的細胞質中。(7)使胞核在去核卵母細胞的細胞質中停留達6小時，在此期間可觀察到染色體凝聚。(8)然後在微管和/或微絲裝配的抑制劑存在下激活卵母細胞，(9)以抑制極體的形成。在該激活期間，可觀察到假前核的形成。(10)選出形成假前核的卵，置於胚胎培養物中。(11)然後將胚胎轉移到代孕母體中，(12)使活的後代出生。
因此，本發明克隆哺乳動物方法的一個實施方案包括下列步驟(a)從成年動物的體細胞收集體細胞胞核或至少含有染色體的部分胞核；(b)將至少部分體細胞胞核插入去核卵母細胞中形成核植入的卵母細胞；(c)使核植入的卵母細胞發育成胚胎；和(d)使胚胎發育成活的後代。下面將詳細描述這些步驟的每一個步驟。體細胞胞核(或含有染色體的胞核組成物)可從二倍以上染色體的體細胞(例如具有一倍或兩倍的正常二倍體基因組物質的細胞)收集得到。較佳的，從具有二倍染色體的體細胞收集得到體細胞胞核。較佳的是，將體細胞胞核插入去核卵母細胞的細胞質中。胞核的插入宜用顯微注射、更佳的是用壓電驅動的顯微注射來實現。
卵母細胞的激活可在插入體細胞胞核之前、期間或之後發生。在一個實施方案中，激活步驟在插入體細胞胞核後0至6小時時發生，以使胞核與卵母細胞的細胞質在卵母細胞激活前接觸一段時間。激活可用各種方式，包括但不局限於，電激活、或接觸乙醇、精子胞質因子、卵母細胞受體配體肽模擬物、Ca2+釋放的藥物刺激劑(如咖啡鹼)、Ca2+離子載體(例如A2318、離子黴素)、磷蛋白信號傳導調節物、蛋白合成抑制劑等，或它們的組合。在本發明的一個實施方案中，通過使細胞接觸鍶離子(Sr2+)來實現激活。
宜使注射了二倍染色體的激活的核植入的卵母細胞與微管和/或微絲裝配破壞劑(下文有描述)接觸，以防止形成極體，從而使供體胞核的所有染色體保留在核植入的宿主卵母細胞內。而注射了2C至4C胞核的激活的核植入的卵母細胞宜不接觸這種試劑，以便形成極體使染色體數目減少至2n。
使胚胎發育的步驟可包括將胚胎轉移至雌性哺乳動物代孕接受者中的分步驟，該胚胎在該接受者體內發育成活的胎。如本領域技術人員所知道的，任何階段(從兩細胞到桑椹胚/胚泡)的胚胎均可作轉移。
本發明的實施方案具有下列的一個或多個優點以及未列出的其它優點。首先，用顯微注射輸送胞核(或輸送包括染色體的胞核組成物)適用於各種細胞類型，無論細胞生長在體外還是體內，不考慮供體的大小、形態、發育階段等。第二，用顯微注射輸送胞核能在注射胞核時小心控制(例如最大程度地減少)導入去核卵母細胞的胞核供體細胞的細胞質和核質的體積，因為外來物質可能對發育潛力有毒性。第三，用顯微注射輸送胞核能在注射胞核時小心地控制額外試劑(與供體胞核)一同注射入卵母細胞。這些試劑在下文有例舉。第四，用顯微注射輸送胞核能使供體胞核在(去核卵母細胞)激活前與去核卵母細胞的細胞質接觸一段時間。這種接觸可能使得染色質重新塑造/重新編程，這有利於隨後的胚胎發育。第五，用顯微注射輸送胞核允許對隨後的激活方案作多種選擇(在一個實施方案中採用Sr2+)。不同的激活方案可能對發育潛力發揮不同的效果。第六，激活可以在微管和/或微絲破壞劑(在一個實施方案中是細胞鬆弛素B，以防止染色體擠壓)出去和細胞分化的修飾劑(在一個實施方案中是二甲基亞碸，以促進有利的發育結果)存在下進行。第七，在一個實施方案中，用壓電驅動的顯微注射來輸送胞核，這能迅速有效地處理樣品，從而減少受操作細胞的損傷。這部分是因為體細胞胞核的製備和導入去核卵母細胞可用同一注射針頭進行(與常規的顯微注射方法相反，常規的顯微注射方法在透明帶成粒和刺入卵母細胞質膜之間需要至少換一次注射針)。另外，一些種類動物(如小鼠)的卵母細胞不適合用常規針頭作顯微注射，而壓電驅動的顯微注射提供了高成功率。最後，不僅是本發明的個別步驟，而且這些步驟相互之間作為一個整體的關係也導致了高克隆效率。下面將更詳細地表述各個步驟，以顯示這些步驟在本發明中是怎樣相互排列的。
卵母細胞接受者已經報導說，去核時卵母細胞的體內成熟階段以及胞核輸送對於胞核輸送方法的成功是很重要的。通常，哺乳動物胞核輸送的報導描述了採用MetⅡ卵母細胞作為接受者。MetⅡ卵母細胞是通常被受精精子激活的細胞類型。已知卵母細胞細胞質的化學成分變化貫穿於整個成熟過程中。例如，與成熟中期促進因子(「MPF」)有關的胞質活性在未成熟卵母細胞處於第一次減數分裂(「MetⅠ」)中期時最高，隨著第一極體(「Pb1」)的形成和排出而下降，在MetⅡ時再次達到最高水平。MPF活性在停滯於MetⅡ的卵母細胞中保持高水平，在卵母細胞激活後迅速降低。當將體細胞胞核注射入MetⅡ卵母細胞(即MPF活性高的卵母細胞)的細胞質中後，其核膜破裂，染色質濃縮，導致形成中期染色體。
可用於本發明方法的卵母細胞包括未成熟(例如GV期)和成熟的(即MetⅡ期)卵母細胞。成熟的卵母細胞可以這樣獲得，例如，通過注射促性腺素或其它激素(例如依次給予馬和人絨毛膜促性腺激素)誘導動物超排卵，然後在排卵後(例如在家貓開始動情後80-84小時，奶牛開始動情後72-96小時，以及小鼠開始動情後13-15小時)用外科方法收穫卵細胞。在只能獲得未成熟卵母細胞時，將它們培養在促進成熟的培養基中，直至它們進展至MetⅡ；這稱為體外成熟(「IVM」)。未成熟牛卵母細胞的IVM方法在WO98/07841中有所描述，未成熟小鼠卵母細胞的IVM方法在Eppig＆Telfer(Methods in Enzymology 225,77-84,Academic Press,1993)中有所描述。
卵母細胞去核較佳的是，在去核前和去核時使卵母細胞接觸含有微管和/或微絲破壞劑的培養基。微絲和/或微管的破壞賦予了細胞膜以及其下的皮層細胞質相對流動性，從而使包封在膜內的卵母細胞部分易被吸入移液管，而對細胞結構的破壞最小。所選的一種微管破壞劑是細胞鬆弛素B(5微克/毫升)。其它合適的微管破壞劑，例如噻氨酯噠唑、6-二甲基氨基嘌呤和秋水仙鹼，也是本領域技術人員已知的。微絲破壞劑也是已知的，包括但不局限於，細胞鬆弛素D、甲斯普拉諾(jasplakinolide)、拉純庫林A(1atrunculin A)等。
在本發明的一個較佳的實施方案中，MetⅡ卵母細胞的去核是通過用壓電驅動的微量移液管抽吸來實現的。在整個去核顯微手術中，用常規的握持移液管固定MetⅡ卵母細胞，使壓電驅動的去核移液管(內徑約為7微米)的平嘴與透明帶接觸。合適的壓電驅動單元由Prime Tech Ltd.(Tsukuba,Ibaraki-ken,Japan)以壓電顯微操作儀/壓電衝擊驅動單元(Piezo Micromanipulator/Piezo Impact Drive Unite)的名稱出售。該單元利用壓電效應使(注射)移液管支架以受高度控制的快速方式向前推進非常小的距離(約0.5微米)。每次脈衝之間的強度和間隔可以變化，由一個控制單元調節。施加壓電脈衝(例如，強度=1-5，速度=4-16)，以推進(或鑽孔)移液管通過透明帶，同時維持移液管內的小負壓。這樣，移液管嘴迅速通過透明帶，從而推進至毗鄰MetⅡ板的位置(在幾種動物的MetⅡ卵母細胞的細胞質中可辨別的半透明區域，通常在第一極體附近)。然後將含有中期板的卵母細胞細胞質(它含有染色體-紡錘體複合物)以最少的量輕輕地吸入注射移液管中，輕微地抽出注射移液管(現在含有MetⅡ染色體)。該程序的效果是夾斷含有MetⅡ染色體的卵母細胞細胞質的那一部分。然後將注射移液管拉出透明帶，將染色體排入鄰近的培養基中，準備對下一個卵母細胞進行去除染色體的顯微手術操作。在適當的時候，可以對一批卵母細胞進行篩選，以確認完全去核。對於含有粒狀細胞質的卵母細胞(例如豬、羊、貓卵母細胞)，在確定去核效率時，用DAN特異性螢光物(例如Hoeschst 33342)進行染色並用低UV照射(用圖象強化視頻監測儀而加強)作簡單檢查是有好處的。
MetⅡ卵母細胞的去核可用其它的方法，如美國專利4,994,384中描述的方法來實現。例如，與壓電驅動的顯微移液管相反，可用常規的顯微移液管通過顯微手術來實現去核。這可通過用玻璃針沿透明帶靠近MetⅡ染色體位置的周圍10-20％將卵母細胞的透明帶撕開來實現(通過差分幹涉顯微鏡顯示紡錘體在卵母細胞的皮質中)。將該卵母細胞置於顯微操作室中一小滴含有細胞鬆弛素B的培養基中。用具有未削尖斜邊嘴部的去核移液管除去染色體。
去核後，卵母細胞容易用成年體細胞胞核來重建。較佳的是在插入供體胞核的約2小時內製備去核卵母細胞。
製備成年體細胞胞核從所含細胞帶有二倍染色體(即處於G0或G1期的細胞)或二倍以上染色體(例如處於G2期的細胞，通常為四倍)的體內或體外生長的細胞群衍生獲得的細胞可能是合適的胞核供體。在本發明的一個實施方案中，該細胞是從成年哺乳動物獲得的且經機械和/或酶方法(例如用透明質酸酶)分散的卵泡(卵丘細胞)細胞。可將所得的分散的細胞懸液置於微量操作室中，以有助於詳細地檢查、選擇並操縱個別細胞，以避免具有某些特徵(例如表現出凋亡、壞死或分裂的進展階段)的那些細胞。輕輕地重複抽吸以這種方式選出的細胞，以使質膜破裂，並收穫相應的胞核。然後將個別選出的胞核吸入下述的注射移液管中，用來插入去核卵母細胞內。
在本發明的另一個實施方案中，成年細胞胞核的供體是成纖維細胞。成纖維細胞可以用本領域技術人員熟知的方法從動物獲得。例如，成纖維細胞可這樣從成年小鼠尾獲得，將切碎的尾組織置於短期培養中(例如含5％CO2的空氣下37.5℃培育5-7天)，此期間培養物中的成纖維細胞變成佔主導地位的細胞類型。在本發明的還有一個實施方案中，採用胸腺細胞、脾細胞、巨噬細胞作為成年體細胞胞核的供體。獲得胸腺細胞或脾細胞懸液的方法是本領域技術人員所熟知的。巨噬細胞例如可通過用本領域技術人員已知的方法灌洗腹膜腔或肺來獲得。
可用作胞核來源的其它體細胞包括，但不局限於，上皮細胞、神經細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞、單核細胞、帶核紅細胞、足細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞和來自器官的其它細胞，這些器官包括但不局限於，皮膚、肺、胰、肝、腎、膀胱、胃、腸等(以及它們的合適的先祖細胞)，它們直接從體內來源獲得，或在體外培養後獲得。
將供體胞核插入去核卵母細胞用顯微注射技術可將胞核(或包括染色體的胞核組成物)直接注射入去核卵母細胞的細胞質中。在將體細胞胞核注射入去核卵母細胞的一個較佳的方法中，採用壓電驅動的微量移液管，其中可以採用基本上如上所述(關於卵母細胞的去核)的裝置和技術，這裡詳細描述改進之處。
例如，如上所述製備注射移液管，使其具有內徑約為5微米的平嘴。注射針在嘴部附近含有水銀，並根據生產商說明書安置在壓電驅動的單元中。注射移液管嘴附近水銀液滴的存在增加了動量，因此提高了刺入的能力。使含有單個選出胞核的注射移液管嘴與去核卵母細胞的透明帶緊密接觸，施加數個壓電脈衝(用控制器設定強度等級為1-5，速度為4-6)，以推進移液管，同時維持移液管內輕度負壓。當移液管嘴通過透明帶，就將所含的透明帶堵塞物擠入卵黃周隙，胞核被向前推至靠近移液管嘴。然後將移液管嘴與質膜並列，並向卵母細胞的相對面推進，直至夾持移液管幾乎到達卵母細胞皮質的對側。現在，卵母細胞質膜被深深地套在注射針嘴的周圍。在施加1至2次壓電脈衝(通常強度為1-2，速度為1)後，卵膜在移液管嘴處被刺破，表現為清晰可見的卵膜迅速鬆弛。然後，將胞核和伴隨的最少量(約6pL)培養基排入卵漿中。然後輕輕抽出移液管，使新導入的胞核留在卵母細胞的細胞質內。該方法的進行很迅速，通常一批10-15個去核卵母細胞，它們在其它時間是維持在培養狀態下。
其它顯微注射方案也可用來插入供體胞核，其中採用的是常規注射移液管。採用常規移液管將精子核插入倉鼠卵母細胞的合適顯微注射方法例子在Yanagida,K.,Yanagimachi,R.,Perreault,S.D.和R.G.Kleinfeld,Biology of Reproduction 44,440-447(1991)中有所描述，關於該方法的公開內容被納入本文作參考。
宿主卵母細胞的激活在本發明的一個實施方案中，在激活前，使核植入的卵母細胞回到培養條件下培育0-6小時。因此，在本發明的實施方案中，卵母細胞可在核植入後最長約6小時(潛伏期)內的任一時刻，通過電激活、注射入一種或多種激活卵母細胞的物質、或將卵母細胞轉移到含有一種或多種激活卵母細胞的物質的培養基中來激活。
能提供激活刺激(或組合的激活刺激)的試劑包括，但不局限於，精子細胞質激活因子以及某些藥物化合物(例如Ca2+和其它信號轉導調節劑)，這些試劑能在核植入之後或其同時通過顯微注射來導入。在將核植入的卵母細胞轉移(立即或在潛伏期後)至含有一種或多種激活性化合物亞組成員的培養基中後，就可提供某些激活刺激，這些激活化合物包括Ca2+釋放刺激劑(如咖啡鹼，Ca2+離子載體如A23187和離子黴素，以及乙醇)、磷蛋白信號傳導調節劑(例如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成抑制劑(例如A23187、環己醯胺)、6-二甲基氨基嘌呤或前述物質的組合(例如6-二甲基氨基嘌呤和離子黴素)。在本發明的一個實施方案中，通過在含有2-10毫摩爾Sr2+、不含Ca2+的CZB培養基中培育1-6小時來激活小鼠卵母細胞。
在核植入的同時或之後施加激活刺激的本發明實施方案中，將核植入的卵母細胞轉移至培養基中，該培養基含有一種或多種微管和/或微絲抑制劑(例如5微克/毫升細胞鬆弛素B)或如上所述的製劑，以抑制施加激活刺激時或其後不久的染色體擠出(通過「極體」)。
在本發明的一個實施方案中，在核植入前可以激活去核的卵母細胞。激活方法如上所述。在接觸激活刺激後，可以培育卵母細胞至多約6小時，然後如上所述注射入二倍體細胞胞核。在該實施方案中，體細胞衍生的染色體直接轉化入核植入的卵母細胞的前核樣結構中，通過與胞質分裂預防劑(如細胞鬆弛素B)一起培育，無需抑制「極體」擠出。
胚胎發育產生活的胎兒和後代在形成前核後，可通過培養在不含微管破壞劑的培養基中，使胚胎發育。培養可以持續到2-8細胞階段或桑椹胚/胚泡階段，此時可將胚胎轉移至代孕母親的輸卵管或子宮內。
另外，為了提高產量，胚胎可以分裂，細胞克隆擴增。或者另外，用本發明的方法可以提高活胚胎的產量，方法是對供體進行克隆擴增，和/或如果使用連續(胞核)轉移的方法，則可根據本發明上述方法將所得胚胎的核組成物轉移回到去核卵母細胞中，以產生新的胚胎。在本發明的另一個實施方案中，在直接轉移入合適接受者中後體內培養該前核胚胎。
細胞分裂或胚胎發育的調節在本發明的一個實施方案中，卵母細胞的核植入允許在胞核與去核卵母細胞結合之前、期間或之後導入一種或多種試劑，這些試劑具有改變胚胎發育結果的潛在作用。或者，試劑可在核植入之前或之後導入。例如，胞核可以和抗體一起共注射，這些抗體所針對的蛋白具有假想的調節作用，有影響本發明方法結果的可能。這些分子可包括，但不局限於，參與小泡運輸的蛋白(例如突觸結合蛋白)，能介導染色質-卵質通訊的分子(例如DNA損傷細胞周期關卡分子，如chk1)，在卵母細胞信號傳導中有推定作用的分子(如STAT3)或修飾DNA的分子(如DNA甲基轉移酶)。此類分子的成員還可以是通過顯微注射導入的調節性藥物製劑的(間接的)靶分子，它們具有與抗體類似的作用。抗體和藥物製劑均通過結合它們各自的靶分子來起作用。當靶標對發育結果有抑制作用時，這種結合減少了靶分子的功能，當靶分子對發育結果有正作用時，這種結合促進了該功能。另外，可通過注射蛋白(如上述類型的蛋白)而不是注射結合該蛋白的製劑來直接實現克隆過程中重要功能的調節。
在本發明的另一個實施方案中，可在核植入之前或之後通過顯微注射將外源核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)導入卵母細胞中。例如，注射入攜帶所需順式活性信號的重組DNA可導致重組DNA上的序列通過常駐的或共注射的轉錄因子來轉錄，隨後表達出對發育抑制因子有拮抗作用、或對胚胎發育有正作用的編碼蛋白質。另外，轉錄物可具有針對編碼發育抑制蛋白mRNA的反義活性。或者，可通過注射入核酸(或它們的衍生物)來實現反義調節，這些核酸能通過與沒有在卵母細胞中先行轉錄的它們的核酸靶標直接相互作用來發揮抑制作用。
通過本發明方法導入的重組DNA(線形或其它形狀)可含有一個功能性複製子，該複製子含有在啟動子控制下的一個或多個表達的功能性基因，該啟動子能表現出從窄到寬的發育表達分布圖。例如，當啟動子僅在早期合子中有活性時，該啟動子可能指導立即而簡短的表達。導入的DNA可能在胚胎發育期間的某一時刻喪失，或整合入一個或多個基因組基因座，在所得轉基因個體的整個生命中穩定地複製。在一個實施方案中，編碼推定「抗老化」蛋白(如端粒酶或超氧化物歧化酶)的DNA構建物可通過顯微注射導入卵母細胞。另外，可直接注射這些蛋白。
實施例下列實施例描述了本發明的方法以及從注射了成年體細胞胞核的卵母細胞發育成活的後代。具體地說，實施例描述了從注射了分離自成年小鼠卵丘細胞、足細胞、神經細胞、成纖維細胞、脾細胞、胸腺細胞和巨噬細胞的胞核的去核卵母細胞來克隆小鼠。本文描述的例子只是用來描述動物卵母細胞、成年體細胞、以及可用於本發明方法的介質的例子，並沒有限制性，如同本領域技術人員容易明白本發明其它試劑所有無機和有機化合物購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)，除非另有所述。
用來顯微手術後培養卵母細胞的介質是CZB培養基(Chatot，等人1989.J.Reprod.Fert.86,679-688)，其中添加了5.56mM D-葡萄糖。CZB培養基含有81.6毫摩爾NaCl、4.8毫摩爾KCl、1.7毫摩爾CaCl2、1.2毫摩爾MgSO4、1.8mM KH2PO4、25.1毫摩爾NaHCO3、0.1毫摩爾Na2EDTA、31毫摩爾乳酸鈉、0.3毫摩爾丙酮酸鈉、7單位/毫升青黴素G、5單位/毫升鏈黴素硫酸鹽和4毫克/毫升牛血清白蛋白。
從輸卵管收集卵母細胞、隨後進行處理和顯微操作的培養基是改進的CZB，它含有20毫摩爾Hepes、減少量的NaHCO3(5毫摩爾)和3毫克/毫升牛血清白蛋白。該培養基在本文中稱為Hepes-CZB。CZB和Hepes-CZB培養基的pH約為7.5。出於顯微注射的目的，較佳的是用0.1毫克/毫升聚乙烯醇(PVA，冷水可溶，平均分子量為10×103)代替Hepes-CZB中的BSA，因為PVA能比BSA在更長時間內保持注射移液管壁粘度較低，這在重複使用一個移液管進行多次胞核/卵母細胞轉移時是有益的。
用來激活重建的卵母細胞的培養基是不含Ca2+的CZB，它含有10毫摩爾SrCl2和5微克/毫升細胞鬆弛素B。將Sr2+的貯存液(蒸餾水中100毫摩爾)貯藏在室溫下。將細胞鬆弛素B的貯存液(二甲基亞碸DMSO中500微克/毫升)貯藏在-20℃下。在使用前，用不含Ca2+的CZB 1∶10稀釋Sr2+貯存液，從而使Sr2+的最終濃度為10毫摩爾。用不含Ca2+的CZB稀釋細胞鬆弛素B貯存液，從而使細胞鬆弛素在最終1％DMSO濃度中的最終濃度為5微克/毫升。
用來分離腦細胞的培養基是胞核分離培養基(NIM)，它由123.0mM KCl、2.6mMNaCl、7.8mM NaH2PO4、1.4mM KH2PO4、3mM Na2EDTA組成。通過加入少量1MHCl，將其pH值調節至7.2。在注射前，用添加了PVP(平均分子量為3×103,ICNBiochemicals,Costa Mesa,CA)的NIM懸浮腦細胞。
實施例中所用的其它培養基在適當的時候揭示。
動物用5-10周齡的B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)、B6C3F1(C57BL/6×C3H/He)和DBA/2雌鼠作為卵母細胞供體。用5-10周齡的C57BL/6、C3H/He、DBA/2、B6D2F1和B6C3F1雌鼠作為卵丘細胞胞核的供體。用10-12周齡的B6C3F1雄鼠作為成纖維細胞胞核的供體。用5-10周齡的B6D2F1雄鼠和雌鼠作為其它成年細胞胞核的供體。代孕母鼠是CD-1雌鼠，與同一株系的結紮輸精管的雄鼠交配。
這些實施例中所用的所有動物根據夏威夷大學實驗室動物服務部(LaboratoryAnimal Service at the University of Hawaii)以及實驗室來源國立研究委員會研究所的實驗室動物護理和使用委員會(Committee on Care and Use of Laboratory Animals of theInstitute of Laboratory Resources National Research Council)制定的指南(DHEW
發明者T·瓦卡雅瑪, R·楊吉麥希 申請人:夏威夷大學