益生菌乾酪乳桿菌菌株的製作方法

2023-05-26 02:09:56 2

專利名稱：：益生菌乾酪乳桿菌菌株的製作方法導言本發明涉及乾酪乳桿菌菌株(Lactobacilluscasei)菌株及其作為益生菌特別是作為免疫調節性生物治療劑的應用。保護人體胃腸道免於腸道細菌建群的防禦機制非常複雜，包括免疫學和非免疫學兩方面(1)。先天的防禦機制包括胃液的低pH，膽鹽，蠕動，粘液層和抗微生物化合物如溶菌酶(2)。免疫學機制包括在M細胞下面的特異的淋巴聚集，稱為淋巴集結，其遍布於小腸和結腸(3)。在這些部位存在的腔抗原(luminalantigen)刺激合適的T和B細胞亞群，導致細胞因子網絡建立及抗體分泌入胃腸道中(4)。另外，可以發生抗原呈遞經上皮細胞至上皮內淋巴細胞及至下面的固有層免疫細胞(5)。因此，宿主在胃腸道免疫學防禦作用中投入了許多。然而，由於胃腸道黏膜是宿主與外部環境相互作用的最大表面，必須存在特異的控制機制以調節對平均一生壽命中由胃腸道處理的100噸食物的免疫應答。另外，結腸腸道中定居有500個物種以上的1011-1012/g的細菌。因此，這些控制機制必須能將非病原性粘附細菌與對宿主造成明顯傷害的侵染病原體加以區分。事實上，通過與新吸收的潛在病原微生物競爭，腸內菌群有助於宿主的防禦作用。存在於人體胃腸道中的細菌可以促進炎症。對土著微生物區系的異常應答與一些疾病狀態相關，如炎症性腸病。與正常菌群相關的抗原通常產生免疫學耐受性，不能達到這種耐受性是黏膜炎症的主要機制(6)。在IBD患者中這種耐受性破壞的跡象包括針對腸道菌群的抗體水平提高。本發明涉及乾酪乳桿菌菌株，其示出通過調節細胞因子水平或者通過拮抗促炎微生物並將其從胃腸道中清除而具有免疫調節作用。發明概述根據本發明，提供了分離自切除並洗滌的人胃腸道的乾酪乳桿菌菌株或其突變體或變體。本發明還提供了乾酪乳桿菌菌株或其突變體或變體，其中所述乾酪乳桿菌菌株在經人體口服攝取後具有明顯的免疫調節作用。本發明提供了一種乾酪乳桿菌菌株，其選自AH101，AH104，AH111，AH112和AH113或其突變體或變體中任一個或多個。所述突變體可以是遺傳修飾的突變體。所述變體可以是天然發生的乾酪乳桿菌變體。在本發明的一個實施方案中，乾酪乳桿菌菌株是活細胞形式。或者乾酪乳桿菌菌株是非活細胞形式。在本發明的一個實施方案中，所述菌株是生物學純培養物形式。在本發明的一個實施方案中，所述乾酪乳桿菌菌株分離自切除並洗滌的人胃腸道。優選地，所述乾酪乳桿菌菌株在人口服後具有明顯免疫調節作用。本發明還提供了一種配方，其包含至少一種本發明的乾酪乳桿菌菌株。該配方可以包含兩或多種乾酪乳桿菌菌株。在本發明的一個實施方案中，所述配方包括另一種益生菌材料。在本發明的一個實施方案中，所述配方包括一種益生素材料。優選地，所述配方包括一種可攝食載體(ingestablecarrier)。所述可攝食載體可以是一種藥物學合適的載體如膠囊，片劑或粉末。優選地，所述可攝食載體是一種食品如酸奶(acidifiedmilk)，酸乳酪，冷凍酸乳酪，奶粉，濃縮奶，奶酪，調味品(dressings)或飲料。在本發明的一個實施方案中，本發明的配方進一步包含一種蛋白質和/或肽(特別是富含穀氨醯胺/穀氨酸的蛋白質和/或肽)、脂質、碳水化合物、維生素、礦物質和/或微量元素。在本發明的一個實施方案中，配方中存在的乾酪乳桿菌菌株超過106cfu/g輸送系統。優選地，所述配方包括佐劑、細菌成分、藥物本體(drugentity)或生物學化合物中的任一或多種。在本發明的一個實施方案中，所述配方用於免疫和接種方案。本發明還提供了本發明的Lactobacilluscasei菌株或配方作為食品、藥物的應用，及在預防和/或治療非所希望的炎性(undesirableinflammatoryactivity)中的應用，在預防和/或治療非所希望的胃腸道炎性如炎症性腸病如Crohns病或潰瘍性結腸炎、過敏性腸症候群、囊炎(pouchitis)或感染後結腸炎中的應用，在預防和/或治療胃腸道癌症中的應用，在預防和/或治療全身性疾病如類風溼性關節炎中的應用，在預防和/或治療由非所希望的炎性導致的自身免疫疾病中的應用，在預防和/或治療由非所希望的炎性導致的癌症中的應用，在預防癌症中的應用，在預防和/或治療由非所希望的炎性導致的腹瀉疾病如艱難梭菌(Clostridiumdifficile)相關的腹瀉、輪狀病毒相關的腹瀉或者感染後腹瀉中的應用，在預防和/或治療感染因子如大腸桿菌導致的腹瀉疾病中的應用。本發明還提供了乾酪乳桿菌菌株或配方在製備一種用於預防和/或治療非所希望的炎性的抗炎生物治療劑中的應用，或者在製備多種用於預防和/或治療非所希望的炎性的抗炎生物治療劑中的應用。在本發明的一個實施方案中，本發明的菌株通過拮抗促炎微生物並將其從胃腸道中清除而起作用。本發明還提供了本發明的乾酪乳桿菌菌株或配方在製備用於降低促炎細胞因子的水平的抗炎生物治療劑中的應用。本發明還提供了乾酪乳桿菌菌株AH111在製備用於降低IL-8水平的抗炎生物治療劑中的應用。本發明還提供了乾酪乳桿菌菌株在製備用於改變IL-8、IL-10、IL-12、TNFα或IFNγ水平的抗炎生物治療劑中的應用。本發明還提供了乾酪乳桿菌菌株在製備用於改變IFNγ水平的抗炎生物治療劑中的應用。優選地，在這種情況中，所述菌株選自AH101、AH104、AH112或AH113中的任一種。本發明還提供了乾酪乳桿菌菌株由於其拮抗病原體生長的能力而作為抗感染益生菌菌株的應用。我們已經發現特定的乾酪乳桿菌菌株在體外激發免疫調節作用。本發明因此在預防或治療免疫應答調節異常中具有重要的潛在治療價值，所述免疫應答調節異常如非所希望的炎症反應，例如炎症性腸病。所述菌株可以用作一組生物治療劑，從中可以加以選擇以改變IFNγ，TNFα，IL-8，IL-10和/或IL-12的水平。本發明的菌株或配方可以用於預防和/或治療炎症、免疫缺陷、炎症性腸病、過敏性腸症候群、癌症(特別是胃腸道和免疫系統癌症)、腹瀉、抗生素相關的腹瀉、兒童腹瀉、闌尾炎、自身免疫疾病、多發性硬化、Alzheimer’s病、類風溼性關節炎、腹腔疾病、糖尿病、器官移植、細菌感染、病毒感染、真菌感染、牙周病、泌尿生殖系疾病、性傳播疾病、HIV感染、HIV複製、HIV相關的腹瀉、外科手術相關的損傷、外科手術誘導的轉移性疾病、敗血症、體重減輕、厭食、發熱控制(fevercontrol)、惡病質、傷口癒合、潰瘍、gutbarrierfunction、過敏反應、哮喘、呼吸系病變、循環系病變、冠心病、貧血、凝血系統病變、腎病、中樞神經系統病變、肝病、局部缺血、營養失調、骨質疏鬆、內分泌失調、表皮病變、銀屑病和/或尋常痤瘡。乾酪乳桿菌菌株是共生微生物。它們已經從人胃腸道內的微生物菌群中分離。胃腸道內的免疫系統對這個菌群的成員不能具有明確的反應，因為所產生的炎性也會破壞宿主細胞和組織功能。因此，存在一些機制，藉此免疫系統可以識別與病原性生物體不同的胃腸道菌群的共生非病原性成員。這保證了對宿主組織破壞是有限的並且一種防禦屏障仍被保留。乾酪乳桿菌菌株AH101於2000年4月20日保藏在國家工業和海洋細菌保藏中心(NationalCollectionsofIndustrialandMarineBacteriaLimited，NCIMB)，保藏號NCIMB41043。乾酪乳桿菌菌株AH104於2000年4月20日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB41046。乾酪乳桿菌菌株AH111於2001年3月22日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB41095。乾酪乳桿菌菌株AH112於2001年3月22日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB41096。乾酪乳桿菌菌株AH113於2001年3月22日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB41097。乾酪乳桿菌菌株可以是遺傳修飾的突變體或者可以是其天然發生的變體。優選地，乾酪乳桿菌菌株是活細胞形式。或者，乾酪乳桿菌菌株可以是非活細胞形式。本發明的特異的乾酪乳桿菌菌株可以以在常規製品中的口服可攝入形式給予動物(包括人)，如膠囊，微膠囊，片劑，顆粒，粉末，錠劑，丸劑，栓劑，懸浮液及糖漿。合適的配方可以使用常規的有機和非有機添加劑通過常用方法製備。藥物組合物中活性成分的量可以呈實現希望的治療作用的水平。所述配方還包括一種細菌成分，一種藥物本體或一種生物學化合物。另外，包含本發明菌株的疫苗可以使用任何合適的已知方法製備，並可以包括一種藥物學可接受的載體或佐劑。在本說明書中，術語突變體，變體及遺傳修飾的突變體包括一種乾酪乳桿菌菌株，其遺傳和/或表型性質與親代菌株相比發生變化。乾酪乳桿菌菌株的天然發生的變體包括選擇性分離的目標性質自發變化，而親代菌株性質的預定變化可通過常規遺傳處理方法實現，如基因破壞，接合轉移等。附圖簡述圖1是示出乾酪乳桿菌菌株對人胃腸道上皮細胞CaCo-2和HT-29的粘著性質的條形圖。圖2是示出與乾酪乳桿菌菌株共同溫育後對PBMC產生IFNγ(pg/ml)的刺激作用的條形圖。圖3是示出乾酪乳桿菌菌株對PBMC產生IL-10(pg/ml)的免疫調節性質的條形圖。圖4是示出在與乾酪乳桿菌菌株溫育後IL-12產量(pg/ml)的條形圖。圖5是示出在與AH111和AH112溫育後IL-8產量(pg/ml)的條形圖。圖6是示出在與AH112溫育後TNFα產量(pg/ml)的條形圖。詳細描述我們已經發現乾酪乳桿菌菌株AH101，AH104，AH111，AH112和AH113不僅是酸和膽汁耐受的並附著於人小腸細胞系，而且令人驚訝地具有免疫調節作用，所述免疫調節作用通過調節細胞因子水平或通過拮抗及從胃腸道中排除促炎或免疫調節微生物而進行。益生菌一般是以活細胞形式應用。然而，其還可以擴展為非活細胞如滅活培養物或含有由益生菌表達的有益因子的組合物。這可以包括加熱滅活微生物或者通過改變pH或加壓而滅活的微生物。非活細胞產物的製備較簡便，細胞可以簡易地摻入藥物中，而且貯存要求比活細胞更不受限。乾酪乳桿菌YIT9018提供了有效應用熱滅活的細胞治療和/或預防腫瘤生長的方法實例，如美國專利No.US4347240所述。目前還未知是否需要完整細菌發揮免疫調節作用或者本發明的各個活性成分是否能單獨利用。已經鑑別了某些細菌菌株的促炎成分。革蘭氏陰性菌的促炎作用是通過脂多糖(LPS)介導的。LPS單獨能誘導一個促炎網絡，部分是由於LPS與單核細胞上的CD14受體結合所致。推測益生菌的成分具有免疫調節活性是由於整個細胞的作用所致。在分離這些成分時採取藥物級操作。白細胞介素-8(IL-8)是包含巨噬細胞炎性蛋白(MIP)家族的細胞因子的一種。MIP-1和MIP-2家族代表一組蛋白質，其是白細胞和成纖維細胞的趨化因子。這個家族的蛋白質也稱為intercrines，因為除了巨噬細胞之外的細胞也可合成它們。這些細胞包括T細胞和B細胞、成纖維細胞、內皮細胞、角質細胞、平滑肌細胞、滑膜細胞、嗜中性粒細胞、軟骨細胞、肝細胞、血小板和腫瘤細胞。MIP-1α、MIP-1β、結締組織激活蛋白(CTAP)、血小板因子4(PF4)和IL-8刺激嗜中性粒細胞趨化。單核細胞趨化蛋白(MCP-1)和RANTES是單核細胞趨化性的，IL-8是嗜中性粒細胞和淋巴細胞趨化性的，而PF4和CTAP是成纖維細胞趨化性的。針對這些家族成員中的一些已經描述了除了趨化性之外的作用。MCP-1刺激單核細胞細胞靜止活性及超氧化物陰離子釋放。CTAP和PF4提高成纖維細胞增殖，IL-8提高血管通透性，而MIP-1α和MIP-1β是熱原性的。IL-8直接參與胃腸道內的炎性應答。刺激IL-8(及其它促炎細胞因子)易引起胃腸道損害發展，因此重要的是益生菌應不刺激這種細胞因子產生。IL-10由T細胞，B細胞，單核細胞和巨噬細胞產生。這種細胞因子增加B細胞增殖及分化為分泌抗體的細胞。IL-10主要呈現抗炎活性。其通過正調節單核細胞表達IL-1RA，並抑制大多數單核細胞炎性。IL-10抑制單核細胞產生細胞因子、活性氧和氮中間體，MHCII類表達，殺滅寄生蟲及通過反饋機制產生IL-10(7)。這種細胞因子還示出通過幹擾PGE2-cAMP依賴性途徑而阻斷單核細胞產生腸膠原酶和IV型膠原酶，並因此可以是慢性炎症疾病中見到的結締組織破壞的重要調節因子。IL-12是一種70kD的異源二聚體蛋白，由兩個共價連接的35kD和40kD的鏈組成。其在炎症級聯早期主要由抗原呈遞細胞產生，如巨噬細胞。胞內細菌刺激IL-12高水平產生。其是IFNγ產生的強力誘導物及是天然殺傷細胞的激活物。IL-12是產生細胞介導的或者Th1免疫應答所必需的關鍵細胞因子之一，主要通過其引發細胞高產IFNγ的能力而起作用(8)。IL-12誘導IL-10產生，其反饋抑制IL-12產生，因此限制不受控制的細胞因子產生。TGF-β也負調節IL-12產生。IL-4和IL-13對IL-12的產生可具有刺激或抑制作用。IL-12的體內抑制在治療Th1相關的炎症如多發性硬化中可具有一些治療價值(9)。幹擾素γ(IFNγ)主要是激活的T淋巴細胞的產物，而且其大小由於可變糖基化而在20-25kD範圍內。這種細胞因子與其它細胞因子協同導致更強力刺激單核細胞，巨噬細胞，嗜中性粒細胞和內皮細胞。IFNγ還通過增加細胞因子產生而增強單核細胞和巨噬細胞誘導脂多糖(LPS)(10)，提高活性中間體釋放，吞噬作用和胞毒性。IFNγ誘導或增強主要組織相容性複合物II類(MHCII類)抗原在單核細胞及上皮，內皮和結締組織來源的細胞上的表達。這樣使炎症組織內細胞的抗原更高地呈遞給免疫系統。IFNγ也可以具有抗炎作用。這種細胞因子抑制磷脂酶A2，從而降低單核細胞產生PGE2和膠原酶(11)。IFNγ還可以調節TGFβ，TNFα和C5a的單核細胞和巨噬細胞受體表達(11)，從而有助於這種細胞因子的抗炎性質。益生菌對這種細胞因子的刺激根據宿主的當前炎症狀態、其它細胞因子的刺激及給藥途徑可在體內有不同作用。TNFα是一種促炎細胞因子，其介導在炎症應答期間見到的許多局部和全身作用。這種細胞因子主要是單核細胞或巨噬細胞衍生的產物，但其它類型細胞包括淋巴細胞，嗜中性粒細胞，NK細胞，肥大細胞，星形膠質細胞，上皮細胞，內皮細胞和平滑肌細胞也可以合成TNFα。TNFα作為激素原合成並在加工之後觀測到17.5kD的成熟產物。純化的TNFα已經觀測到呈二聚體，三聚體和五聚體形式，推測三聚體形式在體內是活性形式。已經鑑別了TNFα的三個受體，一個可溶受體似乎具有TNFα抑制劑功能(12)，而另兩個膜結合形式經鑑別分子大小分別為60和80kDa。在炎性部位局部產生TNFα可由內毒素誘導，而糖皮質激素地塞米松抑制細胞因子產生(13)。TNFα產生引起許多類型細胞的刺激。明顯的抗病毒作用可在TNFα處理的細胞系中觀測到(14)，IFN與TNFα協同增強這種作用。內皮細胞受刺激產生前凝血劑活性，粘附分子、IL-1、造血生長因子、血小板激活因子(PAF)和花生四烯酸代謝物表達。TNFα刺激嗜中性粒細胞粘附，吞噬，脫粒(15)，活性氧中間體產生，並可以影響細胞遷移。GM-CSF，TGFβ，IL-1，IL-6，PGE2及TNFα自身的白細胞合成均可在給予TNFα時被刺激(16，17)。編程性細胞死亡(細胞凋亡)在單核細胞中可被延遲(18)，同時對成纖維細胞的作用包括促進趨化及IL-6，PGE2和膠原酶合成。儘管局部TNFα產生促進傷口癒合和免疫應答，但TNFα的未調節的全身釋放可具有嚴重毒性作用如觀測到惡病質，發熱和急性期蛋白產生(19)。通過以下實施例可以更清晰理解本發明。實施例1鑑定從切除並洗滌的人胃腸道中分離的細菌，表明益生菌性狀分離益生菌對在重建手術期間獲得的人闌尾和胃腸道(G.I.T)的大腸和小腸切片進行篩選以獲得益生菌菌株。在手術後將所有樣品立即貯存在一80℃無菌容器中。將冷凍的組織解凍，稱重並置於半胱氨酸化(0.05％)的1/4強度的Ringer’s溶液中。輕輕搖動樣品以除去鬆散地粘附的微生物(稱為洗滌「W」)。在移至另一Ringer’s溶液之後，將樣品渦旋7分鐘以除去緊密粘附的細菌(稱為樣品「S」)。為分離組織包埋的細菌，將樣品356，176和A也在Braun攪拌機中均質(稱為勻漿「H」)。將該溶液系列稀釋並塗布(100μl)於以下瓊脂培養基上RCM(強化梭菌培養基)及用乙酸調節為pH5.5的RCM；TPY(類胰蛋白酶，蛋白腖和酵母膏)；MRS(deMann，Roogosa和Sharpe)；ROG(Rogosa的乙酸鹽培養基(SL))；LLA(Lapiere的肝乳糖瓊脂)；BHI(腦心浸液瓊脂)；LBS(乳桿菌選擇性瓊脂)及TSAYE(補加0.6％酵母膏的胰化蛋白腖大豆糖)。還使用了補加丙酸的TPY和MRS瓊脂(TPYP)。除了TPY瓊脂之外，所有瓊脂培養基均由OxoidChemicals提供。將平板在厭氧瓶(BBL，Oxoid)中，使用CO2產生試劑盒(AnaerocultA，Merck)，在37℃溫育2-5天。將革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的杆狀或二叉/多形細菌分離株在複合的非選擇性培養基(MRS和TPY)上劃線純化。將分離株在MRS或TPY培養基(除非特別指定)中在37℃在厭氧條件下常規培養。將預測的乳桿菌在40％甘油中貯存於-20℃和-80℃。對取自G.I.T.的7個組織切片篩選屬於乳桿菌屬的菌株的存在情況。在組織樣品之間有一些變化，如下表1所示。樣品A(迴腸)和316(闌尾)具有最低計數，大約為每克組織102個分離的細胞。相比之下，從其它樣品中回收103cfu/g組織以上細胞。在「洗滌」和「樣品」步驟期間分離相似數目的細菌，在433(迴腸—盲腸)的「樣品」溶液中計數略高。表1示出了組織樣品的細菌計數，以菌落形成單位/g(cfu/ml)組織表示。表1組織樣品編號分離A176356312316423433培養基「洗滌」溶液MRS57×102＞9.0×1033.3×103＞3.0×10403.2×1038.0×102TPYP0＞9.0×103＞6.0×103＞3.0×10401.9×1022.8×102RCM5.5003.1×1021.8×104ND3.0×1018.0×102ROG0＞9.0×103＞6.0×1037.7×1023.8×1029.7×1014.0×101TSAYE3.9×102＞9.0×103＞6.0×103NDNDNDNDLLA2.5×102＞9.0×103＞6.0×103ND5.3×102NDNDRCMNDNDND＞3.0×104ND4.8×1034.6×103「樣品」溶液MRS1.35×103＞9.0×103＞6.0×1031.66×1042.3×102＞1.0×1049.6×102TPYP0＞9.0×103＞6.0×103＞3.0×1044.6×10208.0×103RCM5.50＞9.0×103＞6.0×1031.7×103ND1.1×1031.5×103ROG1.37×102＞9.0×103＞6.0×1034.4×1024.5×1031.7×1036.1×103TSAYE1.4×103＞9.0×103NDNDNDNDNDLLA6.3×102＞9.0×103＞6.0×103ND3.0×102NDNDRCMNDNDND＞3.0×104ND＞1.0×104ND「勻漿」溶液MRS00＞6.0×103TPYP00＞6.0×103RCM5.5002.5×102ROG00＞6.0×103TSAYE3.9×1010＞6.0×103LLA1.9×1016.57×102＞6.0×103RCM00NDND未測定發酵及生長特性使用LKBBromma，AminexHPX-87H高效液相層析柱，檢測碳水化合物葡萄糖的代謝及隨後的有機酸終產物。將該柱保持在60℃，流速為0.6ml/分鐘(恆壓)。使用的HPLC緩衝液為0.01NH2SO4。在分析之前，將該柱用10mM檸檬酸鹽，10mM葡萄糖，20mM乳酸鹽和10mM乙酸鹽作為標準校準。將培養物在修飾的MRS肉湯中(乳桿菌菌株)，在37℃厭氧繁殖1-2天。在14000g離心10分鐘後，將上清用HPLC緩衝液1∶5稀釋，並取200μl在HPLC中分析。所有上清均以一式兩份進行分析。確定細菌分離株的生物化學和生理性狀以助於鑑別。分析硝酸鹽還原作用，吲哚形成及β-半乳糖苷酶活性表達情況。確定在15℃和45℃這兩個溫度下的生長狀況，在存在濃度增加直至5.0％的NaCl的情況下的生長狀況及在明膠上的蛋白酶活性。對菌株在石蕊牛奶中的生長特性也加以確定。從不同的樣品中選擇大約1500個過氧化氫酶陰性細菌分離株，根據其革蘭氏反應，細胞大小和形態，在15℃和45℃下的生長狀況及從葡萄糖發酵的終產物加以鑑定(數據未示出)。測試的分離株中有60％以上是革蘭氏陽性的以四個一組、鏈或分叉形式排列的同型發酵球菌(HOMO-)。18％的分離株是革蘭氏陰性桿菌和異型發酵球桿菌(HETERO-)。剩餘的分離株(22％)主要是同型發酵球桿菌。對38個菌株加以更詳盡鑑定，其中樣品433鑑定13株，樣品423鑑定4株，樣品312鑑定8株，樣品356鑑定9株，樣品176鑑定3株及樣品316鑑定1株。所有測試的38個分離株的硝酸鹽還原作用及從色氨酸中產生吲哚均是陰性的。記錄在不同溫度，NaCl濃度下的生長和明膠水解，如下表2所示。表2菌株來源發酵模式溫度曲線％NaCl*明膠水解石蕊牛奶中的反應15℃45℃pH**REDnAH101S1MRSHOMO-+-5.0-5.5RpCpAH104S0MRSHOMO-++(s)5.0-5.5RpCpAH111S1LBSHOMO-++(s)5.0-5.9RpAH112S0LBSHOMO-+(s)+(s)0.8-5.3RpCpAH113S0MRSHOMO-++5.0-5.6RpCp-，反應/生長陰性；+，反應/生長陽性；+(s)，緩慢生長；REDn，還原；Rp，部分還原；Cp，部分凝固；*所述菌株能生長的NaCl最大濃度**在37℃於石蕊牛奶中溫育24小時後的pH菌種鑑別使用API50CHL(BioMerieuxSA，法國)通過乳桿菌的碳水化合物發酵分布圖試驗性鑑別乳桿菌菌種。離心收穫過夜MRS培養物並再懸浮於所述試劑盒提供的懸浮培養基中。根據廠商指導接種API條帶並加以分析(在24和48小時後)。然後通過總細胞蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)檢測乳桿菌菌種(BrunoPot，Ghent大學，Belgium，私人交流)。最後，使用16sRNA分析及ribotyping證實菌株身份。API50CHL可以快速鑑別乳桿菌分離株。通過SDS-PAGE，16sRNA分析及ribotyping對乳桿菌菌種的總細胞蛋白進行的分析揭示了所述特異菌種的進一步信息(BrunoPot，個人信息)。下表3示出通過4種不同的方法對五個乳桿菌菌株的鑑別。表3菌株糖發酵分布圖總細胞蛋白16sRNA分析Ribotyping(SDS-PAGE)*AH101L.pentosusL.salivariusL.caseiL.paracaseisubsp.salivariussubsp.paracaseiAH104L.pentosusL.paracaseiL.caseiL.paracaseisubsp.paracaseisubsp.paracaseiAH111L.paracaseiL.paracaseiL.caseiL.paracaseisubsp.paracaseisubsp.paracaseisubsp.paracaseiAH112L.paracaseiL.paracaseiL.caseiL.plantarumsubsp.paracaseisubsp.paracaseiAH113L.paracaseiL.paracaseiL.caseiL.paracaseisubsp.paracaseisubsp.paracaseisubsp.paracasei酶活性譜使用APIZYM系統(BioMerieux，法國)半定量測定乳桿菌分離株產生的組成型酶。得自晚期對數生長期的細菌細胞通過在14000g離心10分鐘而收穫。洗滌沉澱的細胞並再懸浮於50mM磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中至相同的光密度。根據廠商指導接種該條帶，在37℃溫育4小時並記錄顏色產生情況。5個菌株AH101，AH104，AH111，AH112和AH113的酶活性譜示於下表4。無一菌株呈現脂酶，胰蛋白酶，α-葡糖醛酸糖苷酶或α-甘露糖苷酶活性。表4抗生素敏感性譜(profile)所述分離株的抗生素敏感性譜使用「圓盤敏感性」分析確定。將培養物在合適的肉湯培養基中生長24-48小時，塗布(100μl)於瓊脂培養基上，並將含有已知濃度抗生素的圓盤置於該瓊脂上。在厭氧條件下在37℃溫育1-2天後，檢測菌株的抗生素敏感性。如果觀測到1mm或更大的抑制圈，則認為菌株是敏感的。使用人體臨床重要的抗生素確定5個乾酪乳桿菌菌株的抗生素敏感性(μg/ml)譜，如下表5所示。測試的每種乳桿菌均對氨苄青黴素，阿莫西林(amoxacillin)和利福平敏感，5種菌株中有4種對頭孢曲松(ceftriaxone)，環丙沙星(ciprofloxacin)，頭孢拉定(cephradine)和氯黴素敏感。表5R，抗性；S，敏感的；ND，未測定乳桿菌在低pH情況下的生長通過經鼻飼胃管(Mercy醫院，Cork，Ireland)抽吸從健康人體中獲得胃液。將其在13000g立即離心30分鐘以除去所有固體顆粒，通過0.45μm和0.2μm濾膜過濾滅菌，分成40ml等份貯存在4℃和-20℃。在實驗應用之前，測定樣品的pH和胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性使用定量血紅蛋白分析測定。簡而言之，將等份胃液(1ml)加入5ml底物(0.7M脲，0.4％(w/v)牛血紅蛋白(SigmaChemicalCo.)，0.25MKCl-HCl緩衝液，pH2.0)中，在25℃溫育。以0，2，4，6，8，10，20和30分鐘間隔取出樣品。加入5％三氯乙酸(TCA)終止反應及不攪動靜止30分鐘。然後將分析混合物過濾(Whatman，no.113)，在14000g離心15分鐘，測定在280nm的吸光度。1單位的胃蛋白酶活性是指使用血紅蛋白作為底物，測定TCA可溶產物在pH2.0每分鐘提高A280nm0.001單位所需要的酶的量。為確定乳桿菌菌株在低pH值的生長狀況與在胃中發現的那些生長狀況是否相等，將過夜培養物接種於(1％)新鮮MRS肉湯中，並用1NHCl將pH調節為4.0，3.0，2.0和1.0。在定期間隔取等份(1.5ml)，測定在600nm的光密度(OD600)，並使用平板計數方法計算菌落形成單位/ml(cfu/ml)。在24-48小時期間監測生長。使用兩種分析研究菌株在體外在低pH下的存活力(a)從新鮮過夜培養物中收集細胞，在磷酸鹽緩衝液(pH6.5)中洗滌兩次並再懸浮於MRS肉湯中，用1NHCl將pH調節為3.5，3.0，2.5和2.0，至乳桿菌終濃度為大約108cfu/ml。在37℃溫育並在5，30，60和120分鐘間隔使用平板計數方法測定存活力。(b)將乳桿菌在緩衝的MRS肉湯(pH6.0)中繁殖5天。收穫細胞，洗滌並再懸浮於pH經調節的MRS肉湯中，使用平板計數方法在2小時的時間測定存活力。為確定乳桿菌菌株在經過胃後的存活力，使用人胃液進行源於體內的分析。從新鮮過夜培養物中收穫細胞，在緩衝液(pH6.5)中洗滌兩次並再懸浮於人胃液中，終濃度根據菌株為106-108cfu/ml。在37℃溫育30-60分鐘期間監測存活力。使用pH≈1.2(未調節的)和pH2.0和pH2.5(用1NNaOH調節)的胃液進行試驗。每種乳桿菌菌株在pH6.8和pH4.5均正常生長，在8小時後達到穩定期，倍增時間為80-100分鐘。在pH3.5生長受限，倍增時間提高至6-8小時。在pH2.5或更低值觀測無生長，因此檢測該菌株在低pH的存活力。每種乳桿菌菌株AH101，AH104，AH111，AH112和AH113對pH3.5，3.0，2.5和2.0均有抗性(數據未示出)。為確定乳桿菌菌株在人胃中遇到的條件下的存活力，在pH1.2和pH2.5的人胃液中測試5個菌株的存活能力，如表6所示。存活力以log10cfu/ml表示(nd，未確定)。表6時間(分鐘)菌株pH053060乳桿菌AH1011.29.169.004.85nd2.59.329.318.126.63AH1041.2ndndndnd2.57.247.264.274.71AH1111.29.076.692.82nd2.59.229.139.188.98AH1121.28.925.692.92nd2.58.698.725.554.79AH1131.29.259.002.88nd2.59.599.595.484.48ND，未測定培養物存存存膽汁的條件下的生長將新鮮培養物在補加牛膽汁(B-8381，SigmaChemical有限公司，Poole)和豬膽汁(B-8631，SigmaChemical有限公司，Poole)的MRS瓊脂平板上劃線，所述牛膽汁的濃度為0.3，1.0，1.5，5.0和7.5％(w/v)，所述豬膽汁濃度為0.3，0.5，1.0，1.5，5.0和7.5％(w/v)。將平板在37℃在厭氧條件下溫育，並記錄24-48小時後生長狀況。將從一些人膽囊中分離的膽汁樣品在使用之前貯存在-80℃。為進行實驗研究，將樣品解凍，集合併在80℃滅菌10分鐘。人膽汁的膽汁酸組分使用反相高效液相層析(HPLC)組合Dekker等所述方法(20)的脈衝電流檢測儀確定。將人膽汁以0.3％(w/v)濃度加入MRS/TPY瓊脂培養基中。在24和48小時後檢測新鮮劃線培養物的生長。人膽囊膽汁的膽汁酸濃度為50-100mM，在小腸中稀釋後濃度降低至5-10mM。另外，在生理條件下，膽汁酸以鈉鹽形式存在。因此，篩選培養物在含有以下每種膽汁酸的鈉鹽(SigmaChemical有限公司，Poole)的MRS瓊脂平板上的生長(a)綴合形式牛磺膽酸(TCA)；甘氨膽酸(GCA)；牛磺脫氧膽酸(TDCA)；甘氨脫氧膽酸(GDCA)；牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)和甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)；(b)早期解離(deconjugated)形式石膽酸(LCA)；鵝脫氧膽酸(CDCA)；脫氧膽酸(DCA)和膽酸(CA)。針對每種膽汁酸，使用濃度為1，3和5mM。在厭氧溫育24和48小時後，記錄生長狀況。使用定性(瓊脂平板)和定量(HPLC)這兩種分析確定每個菌株的早期解離活性。平板分析將所有培養物在補加(a)0.3％(w/v)豬膽汁，(b)3mMTDCA或者(c)3mMGDCA的MRS瓊脂平板上劃線培養。在集落周圍出現不透明的沉澱物作為觀測到早期解離的標示。高效液相層析(HPLC)使用HPLC進行人膽汁早期解離的體外分析。簡而言之，將過夜培養物接種於(5％)補加0.3％(w/v)人膽汁的MRS肉湯中，在37℃厭氧溫育。在24小時溫育期間以不同間隔取樣品(1ml)，在14000rpm離心10分鐘。然後將未稀釋的無細胞上清(30μl)通過HPLC進行分析。乾酪乳桿菌AH101，AH104，AH111，AH112和AH113能在所使用的三種來源的膽汁中生長(膽汁酸抗性)。觀測到對牛膽汁的抗性大大高於對豬膽汁的抗性。乾酪乳桿菌菌株對濃度直至並包括5.0％的牛膽汁有抗性(數據未示出)。豬膽汁更具抑制性，如下表7所示。表7不管在存在牛和豬這兩種膽汁的情況下膽汁抗性譜如何，每個乳桿菌菌株在0.3％(v/v)生理濃度的人膽汁中均生長至鋪滿(數據未示出)。當特異性分析對各種膽汁酸的抗性時，每個乾酪乳桿菌菌株在存在牛磺酸綴合的膽汁酸的情況下均生長良好，在含有直至並包括5mM牛磺酸綴合物TCA，TDCA和TCDCA的瓊脂培養基上，分離株生長至鋪滿。測試的甘氨酸綴合物中，GCDCA一般是最具抑制性的。在三種甘氨酸綴合物中GDCA抑制性略低，GCA抑制性最低，如下表8所示。令人感興趣地，甘氨酸綴合物無一抑制AH101生長。每個菌株在補加5mMGCA的瓊脂培養基上均生長。表8-無生長；+鋪滿生長對在存在早期解離的膽汁酸的情況下的生長狀況也進行測試。每個菌株均對5mMLCA抗性。對在存在CA的情況下的生長狀況也進行測試。如下表9所示，5個菌株中有4個在存在5mMCA的情況下生長。在存在1mMCDCA的情況下未觀測到生長(數據未示出)。表9菌株膽酸0135乳桿菌AH101++++AH104++++AH111++--AH112++++AH113++++檢測抗微生物活性使用指定方法檢測抗微生物活性(21)。在初始篩選中使用的指示微生物是L.innocua，L.fermentumKLD，P.flourescens和大腸桿菌V157。簡而言之，將乳桿菌(MRS)分別溫育12-16小時和36-48小時。將10倍系列稀釋液塗布於(100μl)MRS/TRY瓊脂培養基上。在過夜溫育後，將具有獨特菌落的平板用指示菌覆蓋。指示菌菌苔通過用2％(v/v)過夜指示菌培養物接種一層熔融覆蓋物而製備，所述接種的熔融覆蓋物傾注於接種的MRS平板表面上。將該平板在適於指示菌生長的條件下再溫育過夜。觀測到半徑大於1mm的抑制帶的指示菌培養物被認為對測試細菌敏感。由於噬菌體活性所致的抑制通過上下翻轉接種的MRS/TPY瓊脂平板及用指示菌覆蓋而除去。噬菌體不通過瓊脂擴散。篩選乾酪乳桿菌AH101，AH104，AH111，AH112和AH113菌株的抑制活性，使用Ls.innocua，L.fermentumKLD，P.flourescens和大腸桿菌作為指示微生物。當測試菌株接種於未緩衝的MRS上時，觀測四個指示菌的抑制情況。測定大小為1mm-5mm的條帶。每個乳桿菌對Ls.innocua的抑制均產生最大的條帶。實施例2益生菌與胃腸道上皮細胞的粘附使用對前述方法加以修改的形式進行益生菌菌株粘附(22)。在無菌22m2玻璃蓋片上製備單層的HT-29和Caco-2細胞，濃度為4×104個細胞/ml，將玻璃蓋片置於Corning組織培養皿中。將細胞每兩天補充一次新鮮培養基。在大約10天及發生單層分化後，將該單層用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次。在每個培養皿中加入無抗生素的DMEM(2ml)及2ml含有109cfu/ml的約18小時乳桿菌懸浮液，並將細胞在含有5％CO2的潮溼大氣下在37℃溫育2小時。在溫育之後，將該單層用PBS洗滌5次，在甲醇(BDH實驗室提供，Poole，UK)中固定3分鐘，進行革蘭氏染色(GramStainSet，Merck)並在油浸下經顯微鏡檢測。針對每個玻璃蓋片單層，在10個顯微鏡視野計數每20個上皮細胞粘附的細菌數目。計算每20個上皮細胞粘附的細菌的平均值和標準誤差。一式兩份進行每個粘附分析。在另一種方法中，在PBS中洗滌5次後，通過將細胞單層在冷卻的無菌水中劇烈渦旋以除去粘附的細菌。將細菌細胞通過在1/4強度的Ringer’s溶液(Oxoid)中系列稀釋及在MRS(乳桿菌)上溫育而計數。五個乳桿菌AH101，AH104，AH111，AH112和AH113均粘附於胃腸道上皮細胞(圖1)。這些益生菌菌株適用作疫苗/藥物輸送載體，因為它們粘附於胃腸道上皮並因此與相關的宿主組織相互作用。實施例3確定乾酪乳桿菌菌株對PBMC產生細胞因子的作用通過密度梯度離心從健康供體(19名)中分離周圍血單核細胞。在37℃將PBMC用益生菌菌株刺激72小時。在此時收集培養上清，離心，等份並貯存於-70℃直至使用ELISA(BoehringerMannheim)確定IL-8和IFNγ水平。AH101，AH104，AH112和AH113刺激培養的PBMC產生IFNγ(圖2)。AH113刺激PBMC產生IL-10，而AH101，AH104，AH111及AH112不改變這種細胞因子的水平(圖3)。AH101，AH104，AH111，AH112和AH113誘導PBMC分泌IL-12(圖4)。AH111或AH112均不刺激分離自健康供體的PBMC在體外產生IL-8。在與AH111共同溫育後，IL-8的水平實際上明顯降低(圖5)。實施例4確定在與AH112溫育後在上皮/PBMC共培養模型中細胞因子水平與腸道生理學相關的合適的體外模型是一個摻入上皮細胞，T細胞，B細胞，單核細胞和細菌菌株的培養系統。為此，將人Caco-2上皮細胞以5×105個細胞/ml種植於孔大小為3μm的25mmtranswell插入物(Costar)頂端表面上。將這些細胞在補加10％胎牛血清，穀氨醯胺，青黴素和鏈黴素的RPMI-1640中，在37℃在5％CO2環境中培養4周。每三天更換一次培養基。當上皮細胞完全分化時，通過密度梯度離心分離人周圍血單核細胞(PBMC)。將1×106個洗滌的PBMC在上皮細胞基底外側溫育，並與1×107個益生菌一起培養。對照組只含有培養基。在這個模型系統中PBMC和上皮細胞之間無直接細胞—細胞接觸是可能的，而且細胞通訊只由可溶因子介導。在與相關的細菌菌株溫育72小時後，取細胞培養上清，等份並貯存在-70℃。使用標準ELISA試劑盒(RD系統)測定TNFα胞外細胞因子水平。使用來自3個健康志願者的PBMC一式兩份測定TNFα水平。在用益生菌溫育上皮細胞-PBMC共培養物之後，通過ELISA檢測TNFα細胞因子水平(圖6)。在這個模型中與AH112共溫育不刺激TNFα產生。免疫調節人免疫系統在許多人疾病的病原學和病理學方面發揮明顯作用。超免疫和低免疫應答導致或者是大多數疾病狀態的一個成分。一個生物學實體家族，稱為細胞因子，對控制免疫過程特別重要。這些精密的細胞因子網的紊亂與許多疾病越來越多地相關聯。這些疾病包括但非限於炎症，免疫缺陷，炎症性腸病，過敏性腸症候群，癌症(特別是胃腸道和免疫系統癌症)，腹瀉，抗生素相關的腹瀉，兒童腹瀉，闌尾炎，自身免疫疾病，多發性硬化，Alzheimer’s病，類風溼性關節炎，腹腔疾病，糖尿病，器官移植，細菌感染，病毒感染，真菌感染，牙周病，泌尿生殖系疾病，性傳播疾病，HIV感染，HIV複製，HIV相關的腹瀉，外科手術相關的損傷，外科手術誘導的轉移性疾病，敗血症，體重減輕，厭食，發熱控制，惡病質，傷口癒合，潰瘍，gutbarrierfunction，過敏反應，哮喘，呼吸系病變，循環系病變，冠心病，貧血，凝血系統病變，腎病，中樞神經系統病變，肝病，局部缺血，營養失調，骨質疏鬆，內分泌失調，表皮病變，銀屑病和尋常痤瘡。每個測試的益生菌菌株對細胞因子產生的作用是特異性的。因此，可選擇特異性益生菌以特別針對特異類型疾病而校正單純的細胞因子不均衡。疾病特異治療可使用選擇上述益生菌菌株而實現。免疫訓練腸道菌群對腸道免疫系統的發育和正確發揮功能很重要。在沒有腸道菌群的情況下，如在無微生物的動物模型中表明的那樣，腸道免疫系統發育不全，而且一些功能參數降低，如巨噬細胞吞噬及免疫球蛋白產生的能力降低(23)。腸道菌群在刺激非損害性免疫應答中的重要性變得更明顯。在西方世界中過敏反應的影響範圍和嚴重程度的增加與衛生學和衛生設施的增加相關聯，伴隨宿主遭遇的感染性攻擊的數量和範圍降低。這種免疫刺激的缺乏使宿主與非病原性但抗原性因子反應而產生過敏或自身免疫性。慎重應用一系列非病原性免疫調節細菌可為宿主提供必需的及合適的訓練刺激，以正確發育及控制免疫功能。炎症炎症是一個術語，用於描述液體，血漿蛋白和白細胞在一個部位的局部積聚，所述部位具有持續的物理損害，感染或者在此有正在進行的免疫應答。炎症應答的控制在各種水平上發揮(24)。控制因子包括細胞因子，激素(例如氫化可的松)，前列腺素，活性中間體及白三烯。細胞因子是低分子量的生物活性蛋白，其參與免疫應答和炎性應答的產生和控制，而且還調節發育，組織修復和血細胞生成。它們提供了白細胞自身及與其它類型細胞之間通訊的一種方式。大多數細胞因子是多效的並表達多種生物學重疊活性。細胞因子級聯和網絡控制炎性應答而不是特定細胞因子針對特定類型細胞起作用(25)。炎症應答的衰退產生較低濃度的合適的激活信號及其它炎症介質，引起炎性應答停止。TNFα是一種關鍵的促炎細胞因子，因為其發起導致炎性狀態的細胞因子級聯及生物作用。因此，抑制TNFα的因子，例如infliximab，通常用於治療炎性疾病。現在認為促炎細胞因子在許多炎症疾病包括炎症性腸病(IBD)的發病機理中起主要作用。目前治療IBD的方法是針對降低這些促炎細胞因子包括IL-8和TNFα的水平而進行。這種治療方法在治療全身性炎症疾病如類風溼性關節炎中也發揮明顯作用。過敏性腸症候群(IBS)是一種常見的胃腸道病變，在人的一生當中的一些階段影響將近15-20％的人群。最常見的症狀包括腹痛，腸道習性紊亂，出現腹瀉或便秘，腸胃脹氣及腹脹。沒有簡便的試驗證實診斷，如果出現這些症狀而未發現其它器官病變，則通常診斷為IBS。胃腸病學家見到的患者中有多如25-50％的患者患有IBS。認為許多因子參與症狀的發作，例如胃腸炎，腹部或盆部手術，也許由抗生素攝取所致的腸道細菌菌群失調，及情緒壓力所引起的症狀。與一般人群相對比，IBS患者的生命質量明顯下降，更可能失去工作並使用更多的健康關懷資源。目前沒有有效的醫學處理方法，推薦的治療方法包括鎮痙劑，止瀉劑，膳食纖維補充劑，改變結腸內臟感覺閾值的藥物，止痛劑及抗抑鬱劑。本發明的每種菌株均具有關於細胞因子調節和抗微生物的獨特性質，預期可以選擇特異性菌株基於這些性質用於特異疾病狀態中。例如AH113對IL-10的刺激提示這個菌株適於治療fi炎症狀態如IBD或IBS。還預期將具有合適的細胞因子調節性質和抗微生物性質的這組菌株組合將會增強治療效力。本發明的菌株可潛在應用於治療一系列炎症疾病，特別是如果與其它抗炎治療如非類固醇抗炎藥物(NSAID)或Infliximab組合使用則更有效。細胞因子與癌症廣譜類型腫瘤產生多功能的細胞因子提示在患有癌症的患者中存在明顯的炎症應答。目前還不清楚為什麼這種應答的保護性作用在體內對抗腫瘤細胞的生長和發育。然而，這些炎症應答能逆轉地影響具有腫瘤的宿主。複雜的細胞因子相互作用在腫瘤和正常組織內參與調節細胞因子的產生和細胞增殖(26，27)。長期以來意識到體重喪失(惡病質)是癌症患者最常見的單一致死因素，而且最初的營養不良表明不良預後。就腫瘤的生長和擴散而言，其必須誘導新血管形成及降解胞外基質。炎症應答在上述機制中可具有明顯作用，因此促進宿主的衰退和腫瘤的進展。由於Lactobacillusparacasei的抗炎性質，這些細菌菌株可降低惡性細胞轉化的速度。另外，腸道細菌從飲食化合物中產生具有基因毒性，致癌性及腫瘤促進活性的物質，而且消化道細菌可將前致癌劑激活為DNA活性劑(28)。通常地，乳桿菌菌種與消化道內其它菌群如類菌體，真細菌和梭菌相比具有低生物異源代謝酶活性。因此，增加消化道內乳桿菌數量可有益於改變這些酶的活性。疫苗/藥物輸送大多數病原微生物通過黏膜表面得以進入體內。在這些部位有效接種可對抗特殊的感染因素入侵。目前口服疫苗策略集中使用減毒的活病原生物體或者純化的莢膜抗原(29)。工程化為在體內產生來自感染因子抗原的益生菌，可提供有吸引力的另一種選擇，因為這些細菌對人體服用是安全的(GRAS狀態)。對鼠進行的研究表明服用表達外源抗原的益生菌可激發保護性免疫應答。將編碼破傷風毒素片段C(TTFC)的基因在Lactococcuslactis中表達，並將小鼠通過口服途徑免疫。這個系統能誘導抗體滴度足夠高以保護小鼠免於致命毒素攻擊。除了抗原呈遞之外，活細菌載體在體內可產生生物活性化合物，如免疫刺激性細胞因子。分泌生物活性人IL-2或IL-6和TTFC的L.lactis在經鼻內免疫的小鼠中誘導提高10-15倍的血清IgG滴度(30)。然而，就這個特殊的細菌菌株而言，通過與這些細胞因子共表達，總IgA水平未提高。對其它細菌菌株如Streptococcusgordonii也進行測試其作為黏膜疫苗的有效性。在小鼠口腔和陰道內建群的重組S.gordonii誘導對這個細菌表達的抗原的黏膜和全身性抗體應答(31)。因此使用益生菌作為載體口服免疫不僅保護宿主免於感染，而且可代替病原體正常激發的免疫學刺激，因此有助於宿主的免疫學訓練。益生素(prebiotics)導入益生生物體通過攝取在合適載體內的微生物而實現。在大腸中提供促進這些益生菌生長的介質是有益的。加入一或多種寡糖，多糖或其它益生素增強胃腸道中乳酸菌的生長。益生菌素指任何非存活的食物成分，其在結腸中通過土著細菌特異性發酵，所述土著細菌認為是有陽性價值的，例如雙歧桿菌，乳桿菌。益生素的類型可包括含有果糖，木糖，大豆，半乳糖，葡萄糖和甘露糖的那些益生素。益生菌菌株與一或多種益生化合物組合施用可增強施用的益生菌在體內生長，產生更顯著的健康獲益，因此稱為共生的。其它活性成分應意識到益生菌可預防性施用或者其自身或與上述其它益生菌和/或益生素組合用於治療方法。另外，所述細菌可用作預防或治療方案的一部分，所述方案還使用如用於治療炎症或其它病變特別是具有免疫學參與的那些病變的其它活性物質。這種組合可以單一配方形式施用，或者以單獨配方同時或不同時間及使用相同或不同途徑施用。本發明非限於前述實施方案，可以加以變化。參考文獻1.McCrackenV.J.andGaskinsH.R.Probioticsandtheimmunesystem.InProbioticsacriticalreview，Tannock，GW(ed)，HorizonScientificPress，UK.1999，p.85-113.2.SavageD.C.Interactionbetweenthehostanditsmicrobes.InMicrobialEcologyoftheGut，ClarkandBauchop(eds)，AcademicPress，London.1977，p.277-310.3.KagnoffM.F.Immunologyoftheintestinaltract.Gastroenterol.1993；105(5)1275-80.4.LammM.E.Interactionofantigensandantibodiesatmucosalsurfaces.Ann.Rev.Microbiol.1997；51311-40.5.RaychaudhuriS.，RockKL.Fullymobilizinghostdefensebuildingbettervaccines.Natbiotechnol，1998；161025-31.6.StallmachA.，StroberW，MacDonaldTT，LochsH，ZeitzM.Inductionandmodulationofgastrointestinalinflammation.Immunol.Today，1998；19(10)438-41.7.deWaalMalefytR，HaanenJ，SpitsH，RoncaroloMG，teVeldeA，FigdorC，JohnsonK，KasteleinR，YsselH，deVriesJE.Interleukin10(IL-10)andviralIL-10stronglyreduceantigen-specifichumanTcellproliferationbydiminishingtheantigen-presentingcapacityofmonocytesviadownregulationofclassIImajorhistocompatibilitycomplexexpression.JExpMed1991Oct1；174(4)915-24.8.SchmittE，RudeE，GermannT.TheimmunostimulatoryfunctionofIL-12inT-helpercelldevelopmentanditsregulationbyTGF-beta，IFN-gammaandIL4.ChemImmunol1997；6870-85.9.LeonardJP，WaldburgerKE，SchaubRG，SmithT，HewsonAK，CuznerML，GoldmanSJ.Regulationoftheinflammatoryresponseinanimalmodelsofmultiplesclerosisbyinterleukin-12.CritRevImmunol1997；17(5-6)545-53.10.DonnellyRP，FentonMJ，FinbloomDS，GerrardTL.DifferentialregulationofIL-productioninhumanmonocytesbyIFN-gammaandIL-4.JImmunol1990Jul15；145(2)569-7511.WahlSM，AllenJB，OhuraK，ChenowethDE，HandAR，IFN-gammainhibitsinflammatorycellrecruitmentandtheevolutionofbacterial；cellwall-inducedarthritis.JImmunol1991Jan1；146(1)95-100.12.GatanagaT，HwangCD，KohrW，CappucciniF，LucciJA3d，JeffesEW，LentzR，TomichJ，YamamotoRS，GrangerGA.Purificationandcharacterizationofaninhibitor(solubletumornecrosisfactorreceptor)fortumornecrosisfactorandIymphotoxinobtainedfromtheserumultrafiltratesofhumancancerpatients.ProcNatlAcadSciUSA1990Nov；87(22)8781-4.13.KawakamiM，Iharal，IharaS，SuzukiA，FukuiK.Agroupofbactericidalfactorsconservedbyvertebratesformorethan300millionyears.JImmunol1984May；132(5)2578-81.14.MestanJ，DigelW，MittnachtS，HillenH，BlohmD，MoilerA，JacobsenH，KirchnerH.Antiviraleffectsofrecombinanttumournecrosisfactorinvitro.Nature1986Oct30-Nov5；323(6091)816-9.15.FerranteA，NandoskarM，WalzA，GohDH，KowankoIC.Effectsoftumournecrosisfactoralphaandinterleukin-1alphaandbetaonhumanneutrophilmigration，respiratoryburstanddegranulation.IntArchAllergyApplImmunol1988；86(1)82-91.16.BachwichPR，ChensueSW，LarrickJW，KunkelSL.Tumornecrosisfactorstimulatesinterleukin-1andprostaglandinE2productioninrestingmacrophages.BiochemBiophysResCommun1986Apr14；136(1)94-101.17.CiccoNA，LindemannA，ContentJ，VandenbusscheP，LubbertM，GaussJ，MertelsmannR，HerrmannF.Inducibleproductionofinterleukin-6byhumanpolymorphonuclearneutrophilsroleofgranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorandtumornecrosisfactor-alpha.Blood1990May15；75(10)2049-52.18.ManganDF，WelchGR，WahlSM.Lipopolysaccharide，tumornecrosisfactoralpha，andIL-1betapreventprogrammedcelldeath(apoptosis)inhumanperipheralbloodmonocytes.JImmunol1991Mar1；146(5)1541-6.19.DinarelloCA，CannonJG，WolffSM.Newconceptsonthepathogenesisoffever.RevInfectDis1988Jan-Feb；10(1)168-89.20.Dekker，R，vanderMeer，R，Olieman，C.Sensitivepulsedamperometricdetectionoffreeandconjugatedbileacids.incombinationwithgradientreversed-phaseHPLC.Chromatographia1991；31(11/12)549-553.21.Tagg，JR，Dajani，AS，Wannamaker，LW.BacteriocinsofGrampositivebacteria.BacteriolRev.1976；40722-756.22.Chauviere，G.，M.H.Cocconier，S.Kerneis，J.FourniatandA.L.Servin.AdherenceofhumanLactobacillusacidophilusstrainsLBtohumanenterocyte-likeCaco-2cells.RGen.Microbiol.1992；1381689-169623.CrabbeP.A.，H.Bazin，H.Eyssen，andJ.F.Heremans.ThenormalmicrobialfloraasamajorstimulusforproliferationofplasmacellssynthesizingIgAinthegut.Thegermfreeintestinaltract.Into.Arch.AllergyApplImmunol，1968；34362-75.24.HendersonB.，Poole，SandWilsonM.1998.In″Bacteria-Cytokineinteractionsinhealthanddisease.PortlandPress，79-130.25.AraiKI，LeeF，MiyajimaA，MiyatakeS，AraiN，YokotaT.Cytokinescoordinatorsofimmuneandinflammatoryresponses.AnnuRevBiochem1990；59783-836.26.McGeeDW，BambergT，VitkusSJ，McGheeJR.AsynergisticrelationshipbetweenTNF-alpha，IL-1beta，andTGF-beta1onIL-6secretionbytheIEC-6intestinalepithelialcellline.Immunology1995Sep；86(1)6-11.27.WuS，MeekerWA，WienerJR，BerchuckA，BastRCJr，BoyerCM.Transfectionofovariancancercellswithtumournecrosisfactoralpha(TNFalpha)antisensemRNAabolishestheproliferativeresponsetointerleukin-1(IL-1)butnotTNF-alpha.GynecolOncol1994Apr；53(1)59-63.28.RowlandI.R.Toxicologyofthecolonroleoftheintestinalmicroflora.InGibsonG.R.(ed).Humancolonicbacteriaroleinnutrition，physiologyandpathology，1995，pp155-174.BocaRatonCRCPress.29.Walker，R.I.Newstrategiesforusingmucosalvaccinationtoachievemoreeffectiveimmunization.Vaccine，1994；12387-400.30.SteidlerL.，K.Robinson，L.Chamberlain，K.MScholfield，E.Remaut，R.W.F.LePageandJ.M.Wells.Mucosaldeliveryofmurineinterleukin-2(IL-2)andIL-6byrecombinantstrainsofLactococcuslactiscoexpressingantigenandcytokine.Infect.Immun.，1998；663183-9.31.MedagliniD.，G.Pozzi，T.P.KingandV.A.Fischetti.MucosalandsystemicimmuneresponsestoarecombinantproteinexpressedonthesurfaceoftheoralcommensalbacteriumStreptococcusgordoniiafteroralcolonization.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995；926868-72.權利要求1.一種分離自切除並洗滌的人胃腸道的乾酪乳桿菌菌株(Lactobacilluscasei)菌株或其突變體或變體。2.一種乾酪乳桿菌菌株或其突變體或菌株，其中乾酪乳桿菌菌株在由人體口服攝取後具有明顯的免疫調節作用。3.一種乾酪乳桿菌菌株，其選自AH101，AH104，AH111，AH112或AH113或其突變體或變體。4.乾酪乳桿菌菌株AH101或其突變體或變體。5.乾酪乳桿菌菌株AH104或其突變體或變體。6.乾酪乳桿菌菌株AH111或其突變體或變體。7.乾酪乳桿菌菌株AH112或其突變體或變體。8.乾酪乳桿菌菌株AH113或其突變體或變體。9.前述任一權利要求的乾酪乳桿菌菌株，其中所述突變體是遺傳修飾的突變體。10.前述任何權利要求的乾酪乳桿菌菌株，其中所述變體是乾酪乳桿菌的天然發生的變體。11.選自AH101，AH104，AH111，AH112或AH113任一菌株的一種乾酪乳桿菌菌株的生物學純培養物。12.權利要求1-11任一項的乾酪乳桿菌菌株，其是活細胞形式。13.權利要求1-11任一項的乾酪乳桿菌菌株，其是非活細胞形式。14.權利要求2-13任一項的乾酪乳桿菌菌株，其中所述乾酪乳桿菌分離自切除並洗滌的人胃腸道。15.權利要求1-14任一項的乾酪乳桿菌菌株，其中所述菌株能刺激PBMC產生IL-10。16.權利要求15的乾酪乳桿菌菌株，其是AH113。17.一種配方，其包含至少一種權利要求1-16任一項所述的乾酪乳桿菌菌株。18.權利要求17的配方，其包括另一種益生材料。19.權利要求17或18任一項的配方，其包括一種益生素。20.權利要求17-19任一項的配方，其包括一種可攝食載體。21.權利要求20的配方，其中可攝食的載體是一種藥物可接受的載體如膠囊，片劑或粉末。22.權利要求20或21的配方，其中可攝食的載體是一種食品如酸奶，酸乳酪，冷凍酸乳酪，奶粉，濃縮奶，奶酪，調味品或飲料。23.權利要求17-22任一項的配方，其還包括一種蛋白質和/或肽，特別是含有豐富穀氨醯胺/穀氨酸的蛋白質和/或肽，一種脂質，一種碳水化合物，一種維生素，礦物質和/或微量元素。24.權利要求17-23的配方，其中所述乾酪乳桿菌菌株在配方中的量大於106cfu/g輸送系統。25.權利要求17-24的配方，其包括一種佐劑。26.權利要求17-25的配方，其包括一種細菌成分。27.權利要求17-26的配方，其包括一種藥物本體。28.權利要求17-27的配方，其包括一種生物學化合物。29.權利要求17-28的配方，其用於免疫和接種方案中。30.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方在食品中的應用。31.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用作藥物。32.權利要求1-16的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療非所希望的炎性。33.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療非所希望的胃腸道炎性，如炎症性腸病如Crohns疾病或潰瘍性結腸炎；過敏性腸症候群；囊炎；或者感染後結腸炎。34.權利要求33的乾酪乳桿菌菌株，其中所述炎性是過敏性腸症候群。35.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療胃腸道癌症。36.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療全身性疾病如類風溼性關節炎。37.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療由於非所希望的炎性所致的自身免疫系統疾病。38.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療由於非所希望的炎性所致的癌症。39.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防癌症。40.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於預防和/或治療由於非所希望的炎性所致的腹瀉，如艱難梭菌相關的腹瀉，輪狀病毒相關的腹瀉或者感染後腹瀉或者由於感染因子如大腸桿菌導致的腹瀉疾病。41.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於製備用以預防和/或治療非希望的炎性的抗炎生物治療劑。42.權利要求41的乾酪乳桿菌菌株，其中所述菌株通過拮抗胃腸道中促炎微生物並將其清除而起作用。43.權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方用於製備降低促炎細胞因子的水平的抗炎生物治療劑。44.選自AH101，AH104，AH112或AH113的任一乾酪乳桿菌菌株用於製備改變IFNγ的水平的抗炎生物治療劑。45.乾酪乳桿菌菌株AH111，用於製備降低IL-8水平的抗炎生物治療劑。46.乾酪乳桿菌菌株作為抗感染益生菌菌株的應用。47.選自AH101，AH104，AH111，AH112或AH113任一的乾酪乳桿菌菌株作為抗感染益生菌菌株的應用。48.一種治療或預防治療對象非所希望的炎性或炎症疾病的方法，包括為所述對象施用權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方。49.權利要求48的方法，其中所述非所希望的炎性是胃腸道炎性。50.權利要求48所述方法，其中所述非所希望的炎性是炎症性腸病如Crohns疾病或潰瘍性結腸炎；過敏性腸症候群；囊炎s；或感染後結腸炎。51.權利要求48的方法，其中所述非所希望的炎性是過敏性腸症候群。52.一種治療或預防癌症的方法，包括為治療對象施用權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方。53.權利要求52的方法，其中所述癌症是胃腸道癌症或由於炎症所致癌症。54.一種治療或預防與炎症相關的全身性疾病的方法，包括為治療對象施用權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方。55.權利要求54的方法，其中所述全身性疾病是類風溼性關節炎。56.一種治療或預防由炎症所致自身免疫失調的方法，包括為治療對象施用權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方。57.一種治療或預防腹瀉疾病的方法，包括為治療對象施用權利要求1-16任一項的乾酪乳桿菌菌株或者權利要求17-29任一項的配方。58.權利要求57的方法，其中所述腹瀉疾病是艱難梭菌相關的腹瀉，輪狀病毒相關的腹瀉，感染後腹瀉或者由於感染因子如大腸桿菌導致的腹瀉疾病。全文摘要一種分離自切除並洗滌的人胃腸道的乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)菌株或其突變體或變體，其在由人體口服攝取後具有明顯的免疫調節作用。特別是乾酪乳桿菌菌株AH101，AH104，AH111，AH112或AH113或其突變體或變體因此可用於預防和/或治療炎性，尤其非所希望的胃腸道炎性，如炎症性腸病或過敏性腸症候群。文檔編號A61P19/02GK1556853SQ02818579公開日2004年12月22日申請日期2002年7月26日優先權日2001年7月26日發明者約翰·凱文·柯林斯,約翰凱文柯林斯,德克里斯多福奧沙利文,傑拉爾德·克里斯多福·奧沙利文,奧馬霍尼,利亞姆·奧馬霍尼,沙納漢,弗格斯·沙納漢,基利,巴裡·基利申請人:營養健康有限公司