與PD‑1和LAG‑3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法與流程

2023-05-26 03:38:26

本申請要求美國專利申請號62/017,467(提交於2014年6月26日；在審)的優先權，所述申請通過引用以其整體併入本文。參考序列表根據37C.F.R.1.821以及下面的條款，本申請包括一個或多個序列表，所述序列表以計算機可讀介質(1301_0115PCT_序列_序列表_ST25.txt，2015年6月2日創建，並且大小為50,015位元組)的形式公開，並且通過引用將所述文件以其整體併入本文文件。本發明的背景
技術領域：
：本發明涉及包括兩條或更多條多肽鏈的雙特異性雙抗體，其具有對PD-1的表位為免疫特異性的至少一個表位結合位點和對LAG-3的表位為免疫特異性的至少一個表位結合位點(即，「PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體」)。更優選地，本發明涉及包括四條多肽鏈的雙特異性雙抗體，其具有對PD-1的一個(或兩個)表位為免疫特異性的兩個表位結合位點和對LAG-3的一個(或兩個)表位為免疫特異性的兩個表位結合位點(即，「PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體」)。本發明還涉及另外包括免疫球蛋白Fc結構域的這樣的雙抗體(「雙特異性Fc雙抗體」和「雙特異性、四價Fc雙抗體」)。本發明的雙抗體能夠同時結合PD-1和LAG-3，尤其是在這樣的分子排列在人細胞的表面上時。本發明涉及包含這樣的雙抗體的藥學組合物，並且涉及使用這樣的雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。現有技術描述細胞介導的免疫應答人和其他哺乳動物的免疫系統負責提供針對感染和疾病的保護。這種保護通過體液免疫應答和細胞介導的免疫應答二者被提供。體液應答導致能夠識別和中和外源靶(抗原)的抗體和其他生物分子的產生。相比之下，細胞介導的免疫應答涉及巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)和抗原特異性細胞毒T-淋巴細胞通過T-細胞的激活，和響應抗原的識別的各種細胞因子的釋放(Dong,C.等(2003)「ImmuneRegulationbyNovelCostimulatoryMolecules,Immunolog.Res.28(1):39-48)。T-細胞最佳地介導針對抗原的免疫應答的能力需要兩種不同的信號傳導相互作用(Viglietta,V.等(2007)「ModulatingCo-Stimulation,Neurotherapeutics4:666-675；Korman,A.J.等(2007)「CheckpointBlockadeinCancerImmunotherapy,Adv.Immunol.90:297-339)。第一，排列在抗原呈遞細胞(APC)的表面上的抗原必須被呈遞至抗原特異性原初(naive)CD4+T-細胞。這樣的呈遞經T-細胞受體(TCR)遞送信號，所述信號引導T-細胞啟動對呈遞的抗原為特異性的免疫應答。第二，通過在APC和不同的T-細胞表面分子之間的相互作用介導的一系列共刺激和抑制信號首先觸發T-細胞的激活和增殖，並最終導致它們的抑制。因此，第一信號賦予免疫應答特異性，而第二信號用於確定應答的性質、量級(magnitude)和持續時間。免疫系統通過共刺激和共抑制配體和受體被嚴格地控制。這些分子提供用於T-細胞激活的第二信號，並且提供正信號和副信號的平衡網絡以最大化針對感染的免疫應答，同時限制對自身的免疫(Wang,L.等(2011年3月7日)「VISTA,ANovelMouseIgSuperfamilyLigandThatNegativelyRegulatesT-CellResponses,」J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:1-16；Lepenies,B.等(2008)「TheRoleOfNegativeCostimulatorsDuringParasiticInfections,」Endocrine,Metabolic&ImmuneDisorders-DrugTargets8:279-288)。尤其重要的是抗原呈遞細胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配體和CD4+T-淋巴細胞的CD28和CTLA-4受體之間的結合(Sharpe,A.H.等(2002)「TheB7-CD28Superfamily」,NatureRev.Immunol.2:116-126；Dong,C.等(2003)「ImmuneRegulationbyNovelCostimulatoryMolecules」,Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)「TheClinicalUtilityOfInhibitingCD28-MediatedCostimulation」,Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2與CD28的結合刺激T-細胞激活；B7.1或B7.2與CTLA-4的結合抑制這種激活(Dong,C.等(2003)「ImmuneRegulationbyNovelCostimulatoryMolecules」,Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)「TheClinicalUtilityOfInhibitingCD28-MediatedCostimulation」,Immunol.Rev.229:307-321；Greenwald,R.J.等(2005)「TheB7FamilyRevisited」,Ann.Rev.Immunol.23:515-548)。CD28在T-細胞的表面上組成型表達(Gross,J.,等(1992)「IdentificationAndDistributionOfTheCostimulatoryReceptorCD28InTheMouse」,J.Immunol.149:380–388)，而CTLA4表達在T細胞激活之後被快速上調(Linsley,P.等(1996)「IntracellularTraffickingOfCTLA4AndFocalLocalizationTowardsSitesOfTCREngagement,」Immunity4:535–543)。因為CTLA4是更高的親和性受體(Sharpe,A.H.等(2002)「TheB7-CD28Superfamily」,NatureRev.Immunol.2:116-126)，所以結合首先啟動T-細胞增殖(經CD28)，然後抑制它(經CTLA4的初期表達)，從而在不再需要增殖時阻遏所述效果。CD28受體的配體的進一步研究導致一組相關的B7分子(「B7超家族」)的鑑定和表徵(Coyle,A.J.等(2001)「TheExpandingB7Superfamily:IncreasingComplexityInCostimulatorySignalsRegulatingT-CellFunction」,NatureImmunol.2(3):203-209；Sharpe,A.H.等(2002)「TheB7-CD28Superfamily」,NatureRev.Immunol.2:116-126；Greenwald,R.J.等(2005)「TheB7FamilyRevisited」,Ann.Rev.Immunol.23:515-548；Collins,M.等(2005)「TheB7FamilyOfImmune-RegulatoryLigands」,GenomeBiol.6:223.1-223.7；Loke,P.等(2004)「EmergingMechanismsOfImmuneRegulation:TheExtendedB7FamilyAndRegulatoryT-Cells.」ArthritisRes.Ther.6:208-214；Korman,A.J.等(2007)「CheckpointBlockadeinCancerImmunotherapy,」Adv.Immunol.90:297-339；Flies,D.B.等(2007)「TheNewB7s:PlayingaPivotalRoleinCancerImmunotherapy,」J.Immunother.30(3):251-260；Agarwal,A.等(2008)「TheRoleOfPositiveCostimulatoryMoleculesInTransplantationAndTolerance,」Curr.Opin.OrganTransplant.13:366-372；Lenschow,D.J.等(1996)「CD28/B7SystemofT-CellCostimulation,」Ann.Rev.Immunol.14:233-258；Wang,S.等(2004)「Co-SignalingMoleculesOfTheB7-CD28FamilyInPositiveAndNegativeRegulationOfTLymphocyteResponses,」MicrobesInfect.6:759-766)。該家族當前具有若干個已知成員：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可誘導的共刺激配體(ICOS-L)、程序性死亡-1配體(PD-L1；B7-H1)、程序性死亡-2配體(PD-L2；B7-DC)、B7-H3、B7-H4和B7-H6(Collins,M.等(2005)「TheB7FamilyOfImmune-RegulatoryLigands,」GenomeBiol.6:223.1-223.7；Flajnik,M.F.等(2012)「EvolutionOfTheB7Family:Co-EvolutionOfB7H6AndNkp30,IdentificationOfANewB7FamilyMember,B7H7,AndOfB7'sHistoricalRelationshipWithTheMHC,」Immunogeneticsepubdoi.org/10.1007/s00251-012-0616-2)。PD-1程序性死亡-1(「PD-1」)是廣義地負調節免疫應答的T-細胞調節劑的擴展的CD28/CTLA4家族的約31kDI型膜蛋白成員(Ishida,Y.等(1992)「InducedExpressionOfPD-1,ANovelMemberOfTheImmunoglobulinGeneSuperfamily,UponProgrammedCellDeath」,EMBOJ.11:3887-3895；美國專利申請公開號2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667；美國專利號6,808,710；7,101,550；7,488,802；7,635,757；7,722,868；PCT公開號WO01/14557)。與CTLA4相比，PD-1更多。PD-1表達在激活的T-細胞、B細胞和單核細胞上(Agata,Y.等(1996)「ExpressionOfThePD-1AntigenOnTheSurfaceOfStimulatedMouseTAndBLymphocytes,」Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等(2002)「ExpressionOfProgrammedDeath1LigandsByMurineT-CellsAndAPC,」J.Immunol.169:5538-5545)並在天然殺傷(NK)T細胞中以低水平表達(Nishimura,H.等(2000)「FacilitationOfBetaSelectionAndModificationOfPositiveSelectionInTheThymusOfPD-1-DeficientMice,」J.Exp.Med.191:891-898；Martin-Orozco,N.等(2007)「InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,」Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。PD-1的細胞外區域由與CTLA4中的相當的(equivalent)結構域具有23％同一性的單一免疫球蛋白(Ig)V結構域組成(Martin-Orozco,N.等(2007)「InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,」Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。細胞外IgV結構域之後是跨膜區和細胞內尾區。細胞內尾區包含位於基於免疫受體酪氨酸的抑制基序和基於免疫受體酪氨酸的轉換基序中的兩個磷酸化位點，這表明PD-1負調節TCR信號(Ishida,Y.等(1992)「InducedExpressionOfPD-1,ANovelMemberOfTheImmunoglobulinGeneSuperfamily,UponProgrammedCellDeath,」EMBOJ.11:3887-3895；Blank,C.等(Epub2006Dec29)「ContributionOfThePD-L1/PD-1PathwayToT-CellExhaustion:AnUpdateOnImplicationsForChronicInfectionsAndTumorEvasionCancer,」Immunol.Immunother.56(5):739-745)。通過結合B7-H1和B7-DC，PD-1介導其對免疫系統的抑制(Flies，D.B.等(2007)「TheNewB7s:PlayingaPivotalRoleinTumorImmunity,」J.Immunother.30(3):251-260；美國專利號6,803,192；7,794,710；美國專利申請公開號2005/0059051；2009/0055944；2009/0274666；2009/0313687；PCT公開號WO01/39722；WO02/086083)。B7-H1和B7-DC是廣泛表達在人和鼠科動物組織表面上的結合配體，所述組織比如心、胎盤、肌肉、胎肝(fetalliver)、脾、淋巴結和胸腺以及鼠科動物肝、肺、腎、胰腺和小腸的胰島細胞(Martin-Orozco,N.等(2007)「InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,」Semin.CancerBiol.17(4):288-298)。在人中，在人內皮細胞(Chen,Y.等(2005)「ExpressionofB7-H1inInflammatoryRenalTubularEpithelialCells,」Nephron.Exp.Nephrol.102:e81-e92；deHaij,S.等(2005)「RenalTubularEpithelialCellsModulateT-CellResponsesViaICOS-LAndB7-H1」KidneyInt.68:2091-2102；Mazanet,M.M.等(2002)「B7-H1IsExpressedByHumanEndothelialCellsAndSuppressesT-CellCytokineSynthesis,」J.Immunol.169:3581-3588)、心肌(Brown,J.A.等(2003)「BlockadeOfProgrammedDeath-1LigandsOnDendriticCellsEnhancesT-CellActivationAndCytokineProduction,」J.Immunol.170:1257-1266)、合體滋養層細胞(syncyciotrophoblasts)(Petroff,M.G.等(2002)「B7FamilyMolecules:NovelImmunomodulatorsAtTheMaternal-FetalInterface,」Placenta23:S95-S101)中已經發現了B7-H1蛋白質表達。分子也由一些組織的駐留型(resident)巨噬細胞表達、由已經用幹擾素(IFN)-γ或腫瘤壞死因子(TNF)-α激活的巨噬細胞表達(Latchman,Y.等(2001)「PD-L2IsASecondLigandForPD-1AndInhibitsT-CellActivation,」Nat.Immunol2:261-268)，並在腫瘤中表達(Dong,H.(2003)「B7-H1PathwayAndItsRoleInTheEvasionOfTumorImmunity,」J.Mol.Med.81:281-287)。已經發現B7-H1和PD-1之間的相互作用為T和B細胞提供了重要的負共刺激信號(Martin-Orozco,N.等(2007)「InhibitoryCostimulationAndAnti-TumorImmunity,」Semin.CancerBiol.17(4):288-298)，並且用作細胞死亡誘導者(Ishida,Y.等(1992)「InducedExpressionOfPD-1,ANovelMemberOfTheImmunoglobulinGeneSuperfamily,UponProgrammedCellDeath,」EMBOJ.11:3887-3895；Subudhi,S.K.等(2005)「TheBalanceOfImmuneResponses:CostimulationVerseCoinhibition,」J.Molec.Med.83:193-202)。更具體而言，已經發現低濃度的PD-1受體和B7-H1配體之間的相互作用導致強烈抑制抗原特異性CD8+T-細胞增殖的抑制信號的傳輸；在更高的濃度下，與PD-1的相互作用不抑制T細胞增殖但是顯著減少多種細胞因子的產生(Sharpe,A.H.等(2002)「TheB7-CD28Superfamily,」NatureRev.Immunol.2:116-126)。已經發現可溶性B7-H1-Fc融合蛋白抑制靜息和先前激活的CD4和CD8T-細胞，以及甚至來自臍帶血的原初T-細胞的T細胞增殖和細胞因子產生(Freeman,G.J.等(2000)「EngagementOfThePD-1ImmunoinhibitoryReceptorByANovelB7FamilyMemberLeadsToNegativeRegulationOfLymphocyteActivation,」J.Exp.Med.192:1-9；Latchman,Y.等(2001)「PD-L2IsASecondLigandForPD-1AndInhibitsT-CellActivation,」NatureImmunol.2:261-268；Carter,L.等(2002)「PD-1:PD-LinhibitorypathwayaffectsbothCD4(+)andCD8(+)T-cellsandisovercomebyIL-2,」Eur.J.Immunol.32(3):634-643；Sharpe,A.H.等(2002)「TheB7-CD28Superfamily,」NatureRev.Immunol.2:116-126)。B7-H1和PD-1在抑制T-細胞激活和增殖中的作用已經提示這些生物分子可能用作用於治療炎症和癌症的治療性靶。因此，已經建議了抗PD-1抗體治療感染和腫瘤以及上調適應性免疫應答的用途(見美國專利申請公開號2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401；美國專利號7,521,051、7,563,869、7,595,048；PCT公開號WO2004/056875、WO2008/083174)。Agata,T.等(1996)「ExpressionOfThePD-1AntigenOnTheSurfaceOfStimulatedMouseTAndBLymphocytes,」Int.Immunol.8(5):765-772和Berger,R.等(2008)「PhaseISafetyAndPharmacokineticStudyOfCT-011,AHumanizedAntibodyInteractingWithPD-1,InPatientsWithAdvancedHematologicMalignancies,」Clin.CancerRes.14(10):3044-3051已經報導了能夠免疫特異性結合PD-1的抗體(也見美國專利號8,008,449和8,552,154；美國專利公開號2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT專利公開WO2003/099196、WO2004/004771、WO2004/056875、WO2004/072286、WO2006/121168、WO2007/005874、WO2008/083174、WO2009/014708、WO2009/073533、WO2012/135408、WO2012/145549和WO2013/014668)。LAG-3淋巴細胞激活基因3(LAG-3，CD223)是由激活的CD4+和CD8+T-細胞和NK細胞表達的細胞-表面受體蛋白質，並且由漿細胞樣樹突細胞組成型表達；LAG-3不被B細胞、單核細胞或任何其他測試的細胞類型表達(Workman,C.J.等(2009)「LAG-3RegulatesPlasmacytoidDendriticCellHomeostasis,」J.Immunol.182(4):1885-1891)。已經發現，LAG-3與T-細胞共受體CD4密切相關(Grosso,J.F.等(2009)「FunctionallyDistinctLAG-3andPD-1SubsetsonActivatedandChronicallyStimulatedCD8T-Cells,」J.Immunol.182(11):6659-6669；Huang,C.T.等(2004)「RoleOfLAG-3InRegulatoryT-Cells,」Immunity21:503-513；Workman,C.J.等(2009)「LAG-3RegulatesPlasmacytoidDendriticCellHomeostasis,」J.Immunol.182(4):1885-1891)。如CD4，LAG-3也結合II類MHC分子，但是以顯著更高的親和力結合II類MHC分子(Workman,C.J.等(2002)「PhenotypicAnalysisOfTheMurineCD4-RelatedGlycoprotein,CD223(LAG-3),」Eur.J.Immunol.32:2255-2263；Huard,B.等(1995)「CD4/MajorHistocompatibilityComplexClassIIInteractionAnalyzedWithCD4-AndLymphocyteActivationGene-3(LAG-3)-IgFusionProteins,」Eur.J.Immunol.25:2718-2721；Huard,B.等(1994)「CellularExpressionAndTissueDistributionOfTheHumanLAG-3-EncodedProtein,AnMHCClassIILigand,」Immunogenetics39:213-217)。研究已經顯示LAG-3在負調節T-細胞增殖、功能和穩態中起重要的作用(Workman,C.J.等(2009)「LAG-3RegulatesPlasmacytoidDendriticCellHomeostasis,」J.Immunol.182(4):1885-1891；Workman,C.J.等(2002)「CuttingEdge：MolecularAnalysisOfTheNegativeRegulatoryFunctionOfLymphocyteActivationGene-3,」J.Immunol.169:5392-5395；Workman,C.J.等(2003)「TheCD4-RelatedMolecule,LAG-3(CD223),RegulatesTheExpansionOfActivatedT-Cells,」Eur.J.Immunol.33:970-979；Workman,C.J.(2005)「NegativeRegulationOfT-CellHomeostasisByLymphocyteActivationGene-3(CD223),」J.Immunol.174:688-695；Hannier,S.等(1998)「CD3/TCRComplex-AssociatedLymphocyteActivationGene-3MoleculesInhibitCD3/TCRSignaling,」J.Immunol.161:4058-4065；Huard,B.等(1994)「Lymphocyte-ActivationGene3/MajorHistocompatibilityComplexClassIIInteractionModulatesTheAntigenicResponseOfCD4+TLymphocytes,」Eur.J.Immunol.24:3216-3221)。研究已經提示，通過抗體封鎖抑制LAG-3功能可逆轉LAG-3介導的免疫系統抑制和部分恢復效應子功能((Grosso,J.F.等(2009)「FunctionallyDistinctLAG-3andPD-1SubsetsonActivatedandChronicallyStimulatedCD8T-Cells,」J.Immunol.182(11):6659-6669；Grosso,J.F.等(2007)「LAG-3RegulatesCD8+T-CellAccumulationAndEffectorFunctionDuringSelfAndTumorTolerance,」J.Clin.Invest.117:3383-3392)。已經發現，LAG-3經T細胞受體(TCR)-誘導的鈣流量(calciumflux)的抑制來負調節T細胞擴展，並控制記憶T細胞庫的尺寸(Matsuzaki,J.等(2010)「Tumor-InfiltratingNY-ESO-1-SpecificCD8+T-CellsAreNegativelyRegulatedByLAG-3AndPD-1InHumanOvarianCancer,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)107(17):7875-7880；WorkmanC.J.,etal.(2004)「LymphocyteActivationGene-3(CD223)RegulatesTheSizeOfTheExpandingT-CellPopulationFollowingAntigenActivationinvivo,」J.Immunol.172:5450-5455)。儘管之前的進步，但是仍需要這樣的改善的組合物：其能夠更有力引導身體的免疫系統攻擊癌症細胞或感染病原體的細胞，尤其以更低的治療性濃度。儘管適應性免疫系統可以是抵抗癌症和疾病的有效防禦機制，但是其通常受腫瘤微環境中免疫抑制機制，比如PD-1和LAG-3的表達，的阻礙。腫瘤細胞、免疫細胞和腫瘤環境(tumormilieu)中的基質細胞表達的共抑制分子可顯著減弱針對癌症細胞的T-細胞應答。如下面詳細描述的，本發明通過提供PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體解決了該需要。這樣的雙抗體能夠結合耗竭性和耐受性腫瘤-浸潤淋巴細胞表面上存在的PD-1和LAG-3細胞-表面分子，從而能夠消弱這樣的細胞-表面分子結合它們的受體配體的能力。這樣，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體用於阻斷PD-1和LAG-3介導的免疫系統抑制，從而促進免疫系統的持續激活。該性質允許這樣的雙特異性雙抗體用於治療癌症和病原體相關的疾病和病況。本發明涉及這樣的雙抗體和它們應用的方法。附圖說明圖1顯示基本的結構域的圖示。圖2顯示攜帶Fc的的結構域的圖示。圖3顯示的結構域的圖示。圖4顯示本發明優選的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體的結構域的圖示。四條多肽鏈——其中兩條具有多肽鏈1和3的結構域並且其中兩條具有多肽鏈2和4的結構域——複合在一起以形成雙抗體。二硫鍵(顯示為條紋線(stripedline))共價連接多肽鏈1和2、多肽鏈1和3以及多肽鏈3和4。相同多肽鏈的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域針對不同的表位(PD-1或LAG-3)，使得所得雙抗體具有對PD-1免疫特異性的兩個表位結合結構域和對LAG-3免疫特異性的兩個表位結合結構域。圖5顯示評估抗PD-1和抗LAG-3抗體增強T-細胞增殖的能力的方案的圖。圖6顯示在allo-MLR試驗開始時添加PD-1mAb1(5C4；BMS-936558)、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)和PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)相比IgG1同種型對照抗體誘導強的T-細胞增殖應答。也顯示的是用PD-1mAb4(CT-011；CureTech，BAT-1)，抗CTLAmAb和LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)獲得的增殖性應答。應答(R)細胞是全(pan)T細胞；刺激(S)細胞是成熟的樹突細胞(mDC)。圖7顯示對LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)單獨或組合PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)的T-細胞增殖性潛能的評估的結果。應答(R)細胞是全T細胞；刺激(S)細胞是成熟的樹突細胞(mDC)。圖8顯示可溶性人LAG-3(shLAG-3)——其結合在APC和CD4T-細胞上表達的人HLA-II類分子——相比IgG同種型或應答細胞(R)(全T細胞)加刺激細胞(S)(成熟的樹突細胞(mDC)對照孔誘導強的增殖性應答。圖9A-9B顯示本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體，相比抗PD-1mAb(5C4)或抗LAG-3mAb(25F7)，誘導有效的T-細胞增殖性應答。圖9A顯示使用本發明優選的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體(PD-1x和PD-1x)、PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)、可溶性人LAG-3(ShLAG-3)、對照IgG、應答+刺激細胞(全T細胞和成熟的樹突細胞；R+S)和刺激細胞(成熟的樹突細胞；S)獲得的T-細胞增殖性應答。圖9B顯示使用不同y軸刻度，對於PD-1x和PD-1xPD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)，和PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))+LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)的相同數據。技術實現要素：本發明涉及包括兩條或更多條多肽鏈的雙特異性雙抗體，其具有對PD-1的表位為免疫特異性的至少一個表位結合位點和對LAG-3的表位為免疫特異性的至少一個表位結合位點(即，「PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體」)。更優選地，本發明涉及包括四條多肽鏈的雙特異性雙抗體，其具有對PD-1的一個(或兩個)表位為免疫特異性的兩個表位結合位點和對LAG-3的一個(或兩個)表位為免疫特異性的兩個表位結合位點(即，「PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體」)。本發明還涉及另外包括免疫球蛋白Fc結構域的這樣的雙抗體(「雙特異性Fc雙抗體」和「雙特異性、四價Fc雙抗體」)。本發明的雙抗體能夠同時結合PD-1和LAG-3，尤其是在這樣的分子排列在人細胞的表面上時。本發明涉及包含這樣的雙抗體的藥學組合物，並且涉及使用這樣的雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。詳細地，本發明提供能夠免疫特異性結合PD-1的表位和結合LAG-3的表位的雙特異性Fc雙抗體，其中雙抗體包括四條多肽鏈，每條多肽鏈均具有氨基末端和羧基末端，並且其中：(A)第一和第二多肽鏈彼此共價結合，第二和第三多肽鏈彼此共價結合，和第三和第四多肽鏈彼此共價結合；(B)雙抗體的第一和第三多肽鏈各在N-末端至C-末端方向上包括對PD-1或LAG-3為免疫特異性的抗體的輕鏈可變結構域、對LAG-3或PD-1為免疫特異性的抗體的重鏈可變結構域、異源二聚體-促進結構域和CH2-CH3結構域，其中輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域不能締合形成能夠結合PD-1的表位或LAG-3的表位的表位結合位點；和(C)雙抗體的第二和第四多肽鏈各在N-末端至C-末端方向上包括對PD-1或LAG-3為免疫特異性的抗體的輕鏈可變結構域、對LAG-3或PD-1為免疫特異性的抗體的重鏈可變結構域和異源二聚體-促進結構域，其中輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域不能締合形成能夠結合PD-1的表位或LAG-3的表位的表位結合位點；和其中：(I)(1)第一多肽鏈的輕鏈可變結構域和第二多肽鏈的重鏈可變結構域締合以形成第一表位結合位點，和第一多肽鏈的重鏈可變結構域和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域締合以形成第二表位結合位點；和(2)第三多肽鏈的輕鏈可變結構域和第四多肽鏈的重鏈可變結構域締合以形成第三表位結合位點，和第三多肽鏈的重鏈可變結構域和第四多肽鏈的輕鏈可變結構域締合以形成第四表位結合位點；其中形成的表位結合位點中的兩個能夠免疫特異性結合PD-1的表位和形成的表位結合位點中的兩個能夠免疫特異性結合LAG-3的表位；II.第一和第三多肽鏈的異源二聚體-促進結構域不同並且具有選自下述的胺基酸序列：SEQIDNO:16和SEQIDNO:17；和III.第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域締合形成Fc結構域。本發明還涉及這樣的雙特異性Fc雙抗體的實施方式，其中第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域每個具有SEQIDNO:24的胺基酸序列。本發明還涉及這樣的雙特異性Fc雙抗體的實施方式，其中對LAG-3為免疫特異性的抗體的重鏈可變結構域具有SEQIDNO:11的胺基酸序列，並且其中對LAG-3為免疫特異性的抗體的輕鏈可變結構域具有SEQIDNO:12的胺基酸序列。本發明還涉及這樣的雙特異性Fc雙抗體的實施方式，其中對PD-1為免疫特異性的抗體的重鏈可變結構域具有SEQIDNO:2的胺基酸序列，並且其中對PD-1為免疫特異性的抗體的輕鏈可變結構域具有SEQIDNO:3的胺基酸序列。本發明也涉及藥學組合物，其包括有效量的任何上述Fc雙抗體，和藥學上可接受的載體。本發明還涉及這樣的藥學組合物的實施方式，其中有效量的雙特異性Fc雙抗體是在需要這種治療的接受者個體中治療癌症的有效量。本發明還涉及這樣的藥學組合物的實施方式，其中癌症是腎上腺癌、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外粘液樣軟骨瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、末梢神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤(posteriousuvealmelanoma)、罕見血液疾病、腎轉移性癌、杆狀腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症或子宮癌。本發明還涉及這樣的藥學組合物的實施方式，其中有效量的雙特異性Fc雙抗體是在需要這種治療的接受者個體中治療與病原體的存在相關的疾病的有效量。本發明還涉及這樣的藥學組合物的實施方式，其中病原體是細菌、真菌或病毒。本發明也涉及治療癌症的方法，其包括向需要其的個體施用有效量的這樣的藥學組合物。本發明也涉及治療與病原體的存在相關的疾病的方法，其包括施用有效量的權利要求8-9任一項所述的藥學組合物至需要其的個體。發明詳述本發明涉及包括兩條或更多條多肽鏈的雙特異性雙抗體，其具有對PD-1的表位為免疫特異性的至少一個表位結合位點和對LAG-3的表位為免疫特異性的至少一個表位結合位點(即，「PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體」)。更優選地，本發明涉及包括四條多肽鏈的雙特異性雙抗體，其具有對PD-1的一個(或兩個)表位為免疫特異性的兩個表位結合位點和對LAG-3的一個(或兩個)表位為免疫特異性的兩個表位結合位點(即，「PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體」)。本發明還涉及另外包括免疫球蛋白Fc結構域的這樣的雙抗體(「雙特異性Fc雙抗體」和「雙特異性、四價Fc雙抗體」)。本發明的雙抗體能夠同時結合PD-1和結合LAG-3，尤其在這樣的分子排列在人細胞的表面上時。本發明涉及包含這樣的雙抗體的藥學組合物，並且涉及使用這樣的雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。本發明的雙特異性雙抗體能夠同時結合PD-1和結合LAG-3，尤其在這樣的分子排列在人細胞的表面上時。本發明涉及包含這樣的雙抗體的藥學組合物，並且涉及使用這樣的雙抗體治療癌症和其他疾病和病況的方法。尤其地，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體包括共價複合在一起的多肽鏈。如上所討論，T-細胞激活需要兩種不同的信號。通過在抗原呈遞細胞(APC)上表達的人白細胞抗原(HLA)背景下已經識別肽抗原的T-細胞表面上表達的T-細胞受體(TCR)提供第一信號。通過在APC上表達的共刺激配體：B7-1和B7-2和在T-細胞上表達的它們相應的受體：CD28和CTLA-4的相關(cognate)對的相互作用提供第二信號。在該受體-配體軸(axis)內，B7-共刺激分子與CD28受體的結合可刺激T-細胞增殖，並隨後誘導CD28的負調節子和抗衡受體(抗衡受體)CTLA-4的表達，其強烈競爭B7-1和B7-2配體從而「減慢(winddown)」T-細胞激活和增殖性應答。已經顯示結合CD28的激動劑抗體誘導T-細胞效應子功能和增強腫瘤根除免疫的產生，並且在本質上是共刺激性的。相反地，阻斷CTLA-4結合的拮抗劑可防止T-細胞擺脫(disengage)它們的效應子功能同時保持可導致自身免疫的持續增殖。與CTLA-4:B7-1/B7-2軸——其用於在正常穩態下和在針對抗原的免疫應答的啟動期中激活免疫系統——平行，第二受體-配體軸用於抑制免疫系統，從而在免疫應答的效應期用作CTLA-4的抗衡點(counter-point)。該第二軸涉及在T-細胞的表面上表達的程序性細胞死亡-1蛋白質(PD-1)受體與其分別在抗原呈遞細胞(APC)和上皮細胞上表達的相應的配體：PD-L1和PD-L2的結合(ChenL.等(2013)「MolecularMechanismsOfT-CellCo-StimulationAndCo-Inhibition,」NatureReviewsImmunology13(4):227-242)。與結合CD28以刺激T-細胞應答的激動劑抗體相反，結合PD-1或PD-L1對抗或阻斷PD-1/PD-L1結合的抗體能夠通過防止朝著T-細胞遞送負信號而維持T-細胞應答。這增強或維持持T-細胞增殖、細胞毒性和細胞因子分泌。一併考慮，激動劑抗體，比如抗CD28，靶向正信號途徑，因此是共刺激物，而拮抗抗體，比如抗PD-1，靶向負信號途徑，因此被稱為檢查點抑制劑。儘管CTLA-4和PD-1代表標準的檢查點抑制劑，但存在免疫調節受體-配體對的不斷增長的家族。上述淋巴細胞激活基因-3(LAG-3)是在T-細胞上表達的另外的檢查點抑制劑靶，其結合在APC上表達的HLA-II類分子。LAG-3與PD-1在耗竭性和耐受性腫瘤浸潤淋巴細胞(「TILs」)上共表達(Matsuzaki,J.等(2010)「Tumor-InfiltratingNY-ESO-1-SpecificCD8+T-CellsAreNegativelyRegulatedbyLAG-3andPD-1inHumanOvarianCancer,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)107(17):7875-7880；Okazaki,T.等(2011)「PD-1andLAG-3inhibitorCoreceptorsActSynergisticallyToPreventAutoimmunityInMice,」J.Exp.Med.208(2):395-407)，並且關於T-調節細胞已經報導了LAG-3表達，暗示在腫瘤免疫學和自身免疫中的作用。動物模型已經表明了抗LAG-3誘導有效的腫瘤根除免疫，其足以減緩腫瘤生長，並且當組合抗PD-1mAb給予時，可甚至觸發完全的腫瘤消退(Woo,S.R.等(2012)「ImmuneInhibitoryMoleculesLAG-3AndPD-1SynergisticallyRegulateT-CellFunctionToPromoteTumoralImmuneEscape,」CancerRes.72(4):917-927)。涉及抗LAG-3mAbBMS-986016的組合療法目前處在單獨或組合抗PD-1mAb(nivolumab/BMS-936558)的早期臨床研究中(見Creelan,B.C.(2014)「UpdateonImmuneCheckpointInhibitorsinLungCancer,」CancerControl21(1):80-89)。本發明的雙特異性雙抗體能夠結合耗竭性和耐受性腫瘤浸潤淋巴細胞的表面上存在的PD-1和LAG-3細胞-表面分子，從而能夠損傷這樣的細胞-表面分子結合它們的受體配體的能力。這樣，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體能夠減弱PD-1和LAG-3介導的免疫系統抑制，並且促進持續的免疫系統激活。一般技術和一般定義本發明的實踐，除非另外指出，採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規的技術，其在本領域的技術範圍內。在下述文獻中充分闡釋了這樣的技術，比如，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第三版(Sambrook等.Eds.,2001)ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS:METHODSANDAPPLICATIONS(MethodsinMolecularBiology),Herdewijn,P.,Ed.,HumanaPress,Totowa,NJ；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(Gait,M.J.,Ed.,1984)；METHODSINMOLECULARBIOLOGY,HumanaPress,Totowa,NJ；CELLBIOLOGY:ALABORATORYNOTEBOOK(Cellis,J.E.,Ed.,1998)AcademicPress,NewYork,NY；ANIMALCELLCULTURE(Freshney,R.I.,Ed.,1987)；INTRODUCTIONTOCELLANDTISSUECULTURE(Mather,J.P.andRoberts,P.E.,Eds.,1998)PlenumPress,NewYork,NY；CELLANDTISSUECULTURE:LABORATORYPROCEDURES(Doyle,A.等.,Eds.,1993-8)JohnWileyandSons,Hoboken,NJ；METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.)NewYork,NY；WEIR』SHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY(Herzenberg,L.A.等.Eds.1997)Wiley-BlackwellPublishers,NewYork,NY；GENETRANSFERVECTORSFORMAMMALIANCELLS(Miller,J.M.等.Eds.,1987)ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,F.M.等.,Eds.,1987)GreenePub.Associates,NewYork,NY；PCR:THEPOLYMERASECHAINREACTION,(Mullis,K.等.,Eds.,1994)BostonMA；CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(Coligan,J.E.等.,eds.,1991)JohnWileyandSons,Hoboken,NJ；SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(JohnWileyandSons,1999)Hoboken,NJ；IMMUNOBIOLOGY7(Janeway,C.A.等.2007)GarlandScience,London,UK；Antibodies(P.Finch,1997)StridePublications,Devoran,UK；ANTIBODIES:APRACTICALAPPROACH(D.Catty.,ed.,1989)OxfordUniversityPress,USA,NewYorkNY)；MONOCLONALANTIBODIES:APRACTICALAPPROACH(Shepherd,P.等.Eds.,2000)OxfordUniversityPress,USA,NewYorkNY；USINGANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL(Harlow,E.等.Eds.,1998)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY；THEANTIBODIES(Zanetti,M.等.Eds.1995)HarwoodAcademicPublishers,London,UK)；和DEVITA,HELLMAN,ANDROSENBERG'SCANCER:PRINCIPLES&PRACTICEOFONCOLOGY,EIGHTHEDITION,DeVita,V.等.Eds.2008,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA。如本文所使用，「抗體」是免疫球蛋白分子，其通過位於免疫球蛋白分子可變區中的至少一個抗原識別位點，能夠特異性結合靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文所使用，該術語不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且也包括其突變體、天然存在的變體、包括具有必要的特異性的抗原識別位點的抗體部分的融合蛋白、人源化的抗體和嵌合抗體以及包括具有必要的特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的結構(configuration)。天然存在的抗體通常包括兩個拷貝的「重」(「H」)多肽鏈和兩個拷貝的「輕」(「L」)多肽鏈。每條輕鏈由輕鏈可變區(「VL」)和輕鏈恆定區(「CL」)組成，每條重鏈由重鏈可變區(「VH」)和重鏈恆定區組成，所述重鏈恆定區通常由三個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。重鏈多肽的CH2和CH3結構域彼此相互作用，以形成能夠結合免疫系統細胞表面上存在的Fc受體的Fc區域。完整的、未修飾的抗體(例如，IgG)結合抗原的表位的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上可變結構域(即，分別為VL和VH結構域)的存在。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL和VH結構域的相互作用形成抗體的一個表位結合位點。相比之下，抗體的「scFv」片段包括包含在單一多肽鏈中的抗體的VL和VH結構域，其中結構域通過足夠長的靈活性接頭分開，使得兩個結構域自組裝成功能性表位結合位點。在VL和VH結構域的自組裝由於不足長度的接頭(小於約12個胺基酸殘基)而不可能的情況下，兩個scFv構建物彼此相互作用形成「雙抗體」，其是二價分子，其中一條鏈的VL締合另一條鏈的VH(在以下文獻中被綜述：Marvin等(2005)「RecombinantApproachesToIgG-LikeBispecificAntibodies,ActaPharmacol.Sin.26:649-658)。除了它們在診斷中的已知用途，已經顯示抗體可用作治療劑。過去數十年已經看到對抗體治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一類重要的源自生物技術的藥物(Chan,C.E.等(2009)「TheUseOfAntibodiesInTheTreatmentOfInfectiousDiseases,」SingaporeMed.J.50(7):663-666)。接近200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。術語「單克隆抗體」指同質性(homogenous)抗體群體，其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結合的胺基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異性的，針對單抗原位點。術語「單克隆抗體」不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab』、F(ab』)2Fv)、單鏈(scFv)，其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有必要特異性和結合抗原能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。就抗體來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言不期望受到限制。該術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據定義「抗體」描述的片段。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler,G.等的方法(1975)「ContinuousCulturesOfFusedCellsSecretingAntibodyOfPredefinedSpecificity,」Nature256:495-497或其改良方法。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用包含期望的表位的免疫原量的細胞、細胞提取物或蛋白製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是，但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可培養一段時間(例如，至少24小時)，然後它們用作免疫原。細胞可通過它們本身或組合非變性佐劑比如Ribi用作免疫原。一般而言，當用作免疫原時，細胞應保持完整和優選地能存活。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以周期性間隔被多次施用，諸如兩周一次或一周一次，或者可以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴展開和冷凍宿主細胞用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用於基因操作，以產生本發明的雙特異性分子以及嵌合抗體、人源化的抗體或犬源化(caninized)的抗體，改善抗體的親和性，或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的表位結合的部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化大體上有四個步驟。這些是：(1)測定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的胺基酸序列(2)設計人源化的抗體或犬源化的抗體，即，確定在人源化或犬源化過程期間使用哪個抗體框架區(3)實際人源化或犬源化方法/技術和(4)轉染和表達人源化的抗體。見，例如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。天然抗體僅僅能夠結合一個表位種類(即，它們是單特異性的)，但是它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(見，例如，PCT公開號WO2008/003116、WO2009/132876、WO2008/003103，WO2007/146968)，其大部分使用接頭肽，以將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至另外的結合蛋白(例如scFv)或將例如兩個Fab片段或scFv融合。典型地，這樣的方法涉及折中和權衡。例如，PCT公開號WO2013/174873、WO2011/133886和WO2010/136172公開了接頭的使用可在治療情形中引起問題，並且教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由它們各自的天然位置被交換以及VL和VH結構域已經被多樣化(WO2008/027236、WO2010/108127)，以使得它們結合多於一個抗原。因此，這些文件中公開的分子用結合特異性換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO2013/163427和WO2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。文件指出了CH2結構域可能在介導效應子功能中僅起到最小的作用。PCT公開號WO2010/028797、WO2010028796和WO2010/028795公開了重組抗體，其Fc結構域已經用另外的VL和VH結構域取代，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單條鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO2013/006544公開多價Fab分子，其作為單條多肽鏈被合成並且然後進行蛋白酶解以產生異源二聚結構。因此，這些文件中公開的分子用所有或一些介導效應子功能的能力換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO2014/022540、WO2013/003652、WO2012/162583、WO2012/156430、WO2011/086091、WO2007/075270、WO1998/002463、WO1992/022583和WO1991/003493公開了添加另外的結合結構域或官能團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈，或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或彼此連接的多個Fab結構域)。因此，這些文件中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。現有技術已經另外指出了產生雙抗體的能力，所述雙抗體與天然抗體的不同之處在於能夠結合兩個或更多個不同表位種類(即，除了二價或多價之外還展示雙特異性或多特異性)(見，例如，Holliger等(1993)「Diabodies』:SmallBivalentAndBispecificAntibodyFragments,Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)90:6444-6448；US2004/0058400(Hollinger等)；US2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBSLett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)「AFullyHumanRecombinantIgG-LikeBispecificAntibodyToBothTheEpidermalGrowthFactorReceptorAndTheInsulin-LikeGrowthFactorReceptorForEnhancedAntitumorActivity,J.Biol.Chem.280(20):19665-19672、WO02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)「CovalentDisulfide-LinkedAnti-CEADiabodyAllowsSite-SpecificConjugationAndRadiolabelingForTumorTargetingApplications,」ProteinEngDesSel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)「MultimerizationOfAChimericAnti-CD20Single-chainFv-FvFusionProteinIsMediatedThroughVariableDomainExchange,ProteinEngineering14(2):1025-1033；Asano等(2004)「ADiabodyForCancerImmunotherapyAndItsFunctionalEnhancementByFusionOfHumanFcDomain,摘要3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)「ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)「BispecificT-CellEngagingAntibodiesForCancerTherapy,CancerRes.69(12):4941-4944)。雙抗體的設計是基於單鏈可變區片段(scFv)。這樣的分子通過利用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變區而製備。Bird等(1988)(「Single-ChainAntigen-BindingProteins,」Science242:423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變區的羧基末端和另一可變區的氨基末端之間橋跨約3.5nm。已經設計和使用了其他序列的接頭(Bird等(1988)「Single-ChainAntigen-BindingProteins,」Science242:423-426)。接頭可進而被修飾用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可經重組或經合成產生單鏈變體。對於合成產生scFv，可使用自動合成儀。對於重組產生scFv，包含編碼scFv的多核苷酸的適當質粒可被引入適當的宿主細胞——真核細胞比如酵母細胞，植物細胞，昆蟲細胞或哺乳細胞，或原核細胞比如大腸埃希氏菌(E.coli)。編碼感興趣scFv的多核苷酸可通過常規的操作比如多核苷酸的連接而製備。所得scFv可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離。美國專利號7,585,952和美國專利公開號2010-0173978涉及對ErbB2免疫特異性的scFv分子。已經描述了雙特異性T細胞連接子(engager)(「BiTEs」)，其是一類scFv分子(WO05/061547；Baeuerle,P等(2008)「BiTE:ANewClassOfAntibodiesThatRecruitTCells,」DrugsoftheFuture33:137-147；Bargou,等2008)「TumorRegressioninCancerPatientsbyVeryLowDosesofaTCell-EngagingAntibody,」Science321:974-977)。這樣的分子由具有兩個抗原結合結構域的單個多肽鏈分子組成，其中一個抗原結合結構域免疫特異性結合CD3表位和其第二個免疫特異性結合靶細胞表面上存在的抗原。非單特異性雙抗體的供應提供了明顯的優勢：共連接和共定位不同表位的能力。二價雙抗體因此具有寬的應用範圍，包括治療和免疫診斷。二價允許在各種應用中在設計和工程化雙抗體時更大的靈活性，提供對多聚體抗原的增強的抗體親抗原性，交聯不同的抗原，和依賴於兩個靶抗原的存在引導靶向特定的細胞類型。由於它們增加的價，低解離速率和從循環的快速清除(對於～50kDa或更低的小尺寸雙抗體)，本領域已知的雙抗體分子也已經顯示在腫瘤成像領域的特定用途(Fitzgerald等(1997)「ImprovedTumourTargetingByDisulphideStabilizedDiabodiesExpressedInPichiapastoris,」ProteinEng.10:1221)。雙抗體的二價已經使得它們用於共連接不同的細胞，例如，將細胞毒性T-細胞交聯至腫瘤細胞(Staerz等(1985)「HybridAntibodiesCanTargetSitesForAttackByTCells,Nature314:628-631；和Holliger等(1996)「SpecificKillingOfLymphomaCellsByCytotoxicT-CellsMediatedByABispecificDiabody,ProteinEng.9:299-305)。因此，例如，雙抗體表位結合結構域可被引導至任何免疫效應細胞比如CD3、CD16、CD32或CD64的表面決定子，所述免疫效應細胞在T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞或其他單核細胞上表達。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定子，例如Fcγ受體(FcγR)，的雙抗體激活效應細胞(Holliger等(1996)「SpecificKillingOfLymphomaCellsByCytotoxicT-CellsMediatedByABispecificDiabody,ProteinEng.9:299-305；Holliger等(1999)「CarcinoembryonicAntigen(CEA)-SpecificT-cellActivationInColonCarcinomaInducedByAnti-CD3xAnti-CEABispecificDiabodiesAndB7xAnti-CEABispecificFusionProteins,CancerRes.59:2909-2916；WO2006/113665、WO2008/157379、WO2010/080538、WO2012/018687、WO2012/162068)。通常，通過經Fc-FcγR相互作用使結合抗原的抗體結合效應細胞觸發效應細胞激活；因此，在這方面，雙抗體分子可展示Ig樣功能，不依賴於它們是否包括Fc結構域(例如，如在本領域已知的或本文列舉的任何效應子功能試驗(例如，ADCC試驗)中所檢驗的)。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞，而且使得有效的腫瘤殺傷(見例如，Cao等(2003)「BispecificAntibodyConjugatesInTherapeutics,Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。但是，上述優勢需要顯著的成本。形成這樣的非單特異性的雙抗體需要成功組裝兩個或更多個有區別的和不同的多肽(即，這樣的形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化形成雙抗體)。該事實與單特異性的雙抗體相反，其通過相同多肽鏈的同源二聚化形成。因為必須提供至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)，以便形成非單特異性的雙抗體，並且，因為這類多肽的同源二聚化導致無活性分子(Takemura,S.等(2000)「ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588)，因此，產生這樣的多肽必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(Takemura,S.等(2000)「ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588)。因此，現有技術教導了這類多肽的非共價締合(見，例如，Olafsen等(2004)「CovalentDisulfide-LinkedAnti-CEADiabodyAllowsSite-SpecificConjugationAndRadiolabelingForTumorTargetingApplications,Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)「ADiabodyForCancerImmunotherapyAndItsFunctionalEnhancementByFusionOfHumanFcDomain,摘要3P-683；J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)「ConstructionOfADiabody(SmallRecombinantBispecificAntibody)UsingARefoldingSystem,ProteinEng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)「AFullyHumanRecombinantIgG-LikeBispecificAntibodyToBothTheEpidermalGrowthFactorReceptorAndTheInsulin-LikeGrowthFactorReceptorForEnhancedAntitumorActivity,J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。但是，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽組成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單體(見，例如，Lu,D.等(2005)「AFullyHumanRecombinantIgG-LikeBispecificAntibodyToBothTheEpidermalGrowthFactorReceptorAndTheInsulin-LikeGrowthFactorReceptorForEnhancedAntitumorActivity,J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。面對該挑戰，現有技術已經成功開發了穩定、共價結合的異源二聚非單特異性的雙抗體，稱為(見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP2714079、EP2601216、EP2376109、EP2158221；和PCT公開號WO2012/162068、WO2012/018687、WO2010/080538；和Moore,P.A.等(2011)「ApplicationOfDualAffinityRetargetingMoleculesToAchieveOptimalRedirectedT-CellKillingOfB-CellLymphoma,Blood117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)「TherapeuticControlOfBCellActivationViaRecruitmentOfFcgammaReceptorIIb(CD32B)InhibitoryFunctionWithANovelBispecificAntibodyScaffold,」ArthritisRheum.62(7):1933-1943；Johnson,S.等(2010)「EffectorCellRecruitmentWithNovelFv-BasedDual-AffinityRe-TargetingProteinLeadsToPotentTumorCytolysisAndinvivoB-CellDepletion,J.Mol.Biol.399(3):436-449)。這類雙抗體包括兩個或更多個共價複合的多肽，並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化至每個採用的多肽種類中。例如，添加半胱氨酸殘基至這類構建物的c-末端已經顯示允許多肽鏈之間的二硫鍵合，穩定所得異源二聚體而不幹擾二價分子的結合特徵。最簡單的兩個多肽的每一個均包括三個結構域(圖1)。第一多肽包括：(i)結構域，其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL1)的結合區域，(ii)第二結構域，其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH2)的結合區域，和(iii)第三結構域，其用於促進與第二多肽的異源二聚化以及用於共價結合雙抗體的第一多肽與第二多肽。第二多肽包含互補的第一結構域(VL2結構域)、互補的第二結構域(VH1結構域)和第三結構域，所述第三結構域與第一多肽鏈的第三結構域複合，以便促進與第一多肽鏈的異源二聚化和共價鍵合。這類分子是穩定、有效的並且能夠同時結合兩個或更多個抗原。在一個實施方式中，第一和第二多肽的第三結構域每個包含半胱氨酸殘基，其用於將多肽經二硫鍵結合在一起。多肽之一或兩者的第三結構域可另外具有CH2-CH3結構域的序列，以便雙抗體多肽的複合形成Fc結構域，其能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體(圖2)。已經描述了這類分子的許多變型(見，例如，美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP2714079、EP2601216、EP2376109、EP2158221；和PCT公開號WO2012/162068、WO2012/018687、WO2010/080538)。這些具有Fc的可包括三條多肽鏈。這類雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域，(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。這類的第二多肽包含：(i)包含VL2的結構域，(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與雙抗體的第一多肽鏈的異源二聚化以及共價鍵合的結構域。這類的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，這類的第一和第二多肽鏈複合在一起以形成能夠結合表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽通過涉及它們各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。注意，第一和第三多肽鏈彼此複合，形成經二硫鍵穩定的Fc結構域。這類雙抗體具有增強的效力。這類具有Fc的可具有兩個取向之一(表1)：也已經描述了甚至更複雜的稱為(圖3)(WO2012/018687)。具有四條多肽鏈。這類雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域，(ii)包含VH2的結構域和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。的第二和第四多肽包含：(i)包含VL2的結構域，(ii)包含VH1的結構域和(iii)促進與Fc-DARTTM的第一多肽鏈的異源二聚化和共價鍵合的結構域。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域，和第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同，以便允許是特異性的、雙特異性的或四特異性的四價結合(表2)。遍及本申請，抗體輕鏈和重鏈的胺基酸殘基的編號是根據如在Kabat等(1992)SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,NationalInstitutesofHealthPublication(國立衛生研究院)No.91-3242中的EU索引。術語「多肽」和「肽」在本文可互換使用，指任何長度，尤其是長度大於3、5、10、15、20或25個胺基酸殘基，的胺基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或支鏈的，其可包括修飾的胺基酸，並且其可被非胺基酸中斷。該術語也包括天然修飾的或通過幹預修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，比如綴合標籤組分。還包括在該定義中的是，例如，包含一個或多個胺基酸的類似物(包括，例如，非天然胺基酸等)以及本領域已知的其他修飾的多肽。本發明的多肽可作為單鏈或複合的鏈存在。上面已經描述了術語「雙抗體」和「DARTTM」。是一類雙抗體，其包括至少兩條多肽鏈，所述多肽鏈優選地通過共價相互作用彼此複合，以形成至少兩個表位結合位點，其可識別相同的或不同的表位。雙抗體或DARTTM的多肽鏈中的兩條各包括免疫球蛋白輕鏈可變區和免疫球蛋白重鏈可變區，但是這些區域不相互作用形成表位結合位點(即，它們不是相互「互補的」)。相反，雙抗體或DARTTM多肽鏈中的一條(例如，第一)多肽鏈的免疫球蛋白重鏈可變區與不同的(例如，第二)雙抗體或DARTTM多肽鏈的免疫球蛋白輕鏈可變區相互作用，以形成表位結合位點。類似地，雙抗體或DARTTM多肽鏈中的一條(例如，第一)多肽鏈的免疫球蛋白輕鏈可變區與不同的(例如，第二)雙抗體或DARTTM多肽鏈的免疫球蛋白重鏈可變區相互作用，以形成表位結合位點。DARTTM分子公開在以下文獻中：美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP2714079、EP2601216、EP2376109、EP2158221；和PCT公開號WO2012/162068、WO2012/018687、WO2010/080538、WO2006/113665、WO2008/157379；和Moore,P.A.等(2011)「ApplicationOfDualAffinityRetargetingMoleculesToAchieveOptimalRedirectedT-CellKillingOfB-CellLymphoma,Blood117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)「TherapeuticControlOfBCellActivationViaRecruitmentOfFcgammaReceptorIIb(CD32B)InhibitoryFunctionWithANovelBispecificAntibodyScaffold,」ArthritisRheum.62(7):1933-1943；和Johnson,S.等(2010)「EffectorCellRecruitmentWithNovelFv-BasedDual-AffinityRe-TargetingProteinLeadsToPotentTumorCytolysisAndinvivoB-CellDepletion,J.Mol.Biol.399(3):436-449。如本文所使用，術語「締合(association)」或「締合(associating)」，就多肽(例如，一個雙抗體多肽締合至另一雙抗體多肽、免疫球蛋白輕鏈締合至免疫球蛋白重鏈、一個CH2-CH3結構域締合至另一CH2-CH3結構域等)而言，旨在表示多肽的非共價結合。術語」複合(complexes)」或「複合(complexing)」旨在表示多肽的共價結合。如本文所使用，如果它們的表位結合結構域能夠同時結合它們各自識別的表位，則本發明的雙抗體被視為介導「協同結合(coordinatedbinding)」。這樣的結合可以是同時的。本發明的雙抗體的表位結合結構域以「免疫特異性」方式結合它們識別的表位。如本文所使用，如果其相對於可選的表位，與該表位更頻繁、更快速地以更久的持續時間和/或以更大的親和力反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其他表位結合分子「免疫特異性」結合另一分子的區域(即，表位)。例如，免疫特異性結合病毒表位的抗體是這樣的抗體：與其免疫特異性結合其他病毒表位或非病毒表位相比，所述抗體以更大的親和力、抗體親抗原性、更容易和/或以更持久的時間結合該病毒表位。通過閱讀該定義，還應理解，例如，免疫特異性結合第一靶的抗體(或部分或表位)可能或可能不特異性或優先結合第二靶。因此，「特異性結合」不一定要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言，但是不一定，提及結合則意味著」特異性」結合。這類分子的各種免疫球蛋白結構域可源自任何同種型或同種異型的免疫球蛋白，包括但不限於IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在優選的實施方式中，如下面所討論，這類免疫球蛋白源自IgG免疫球蛋白。在具體的實施方式中，使用的IgG同種型是IgG1，但是可採用其他同種型的IgG(例如，IgG2、IgG3或IgG4或其同種異型)。II.本發明優選的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體本發明涉及PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體。本發明優選的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體具有抗體的表位結合片段，使得它們能夠協同結合兩個不同表位：PD-1的表位和LAG-3的表位，以便減弱這類分子的抑制活性。如本文所使用，這類減弱指可檢測的PD-1和或LAG-3抑制活性降低至少20％、降低至少50％、降低至少80％或降低至少90％，或可檢測的PD-1和或LAG-3抑制活性全部消除。A.抗PD-1結合能力對於PD-1免疫特異性的抗體是已知的(見，例如，美國專利號8,008,449、8,552,154；PCT專利公開WO2012/135408、WO2012/145549和WO2013/014668)。可通過分離使用PD-1或其肽片段產生的分泌抗體的雜交瘤製備另外期望的抗體。人PD-1(包括20個胺基酸殘基信號序列(以下劃線顯示)和268個胺基酸殘基的成熟蛋白質)具有胺基酸序列(SEQIDNO:1)：優選的抗PD-1抗體包括：PD-1mAb1(5C4；BMS-936558))、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)、PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)和PD-1mAb4(CT-011；CureTech，BAT-1)。PD-1mAb1的重鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:2)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb1的輕鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:3)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb2的重鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:4)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb2的輕鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:5)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb3的重鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:6)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb3的輕鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:7)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb4的重鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:8)(CDR加下劃線顯示)：PD-1mAb4的輕鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:9)(CDR加下劃線顯示)：B.抗LAG-3結合能力對LAG-3免疫特異性的抗體也是已知的(見，例如，WO2014/008218)。可通過分離使用LAG-3或其肽片段產生的分泌抗體的雜交瘤製備另外期望的抗體。人LAG-3(包括28個胺基酸殘基信號序列(加下劃線顯示)和497個胺基酸殘基的成熟蛋白質)具有胺基酸序列(SEQIDNO:10)：優選的抗LAG-3抗體是LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)。LAG-3mAb1的重鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:11)(CDR加下劃線顯示)：LAG-3mAb1的輕鏈可變結構域的胺基酸序列具有胺基酸序列(SEQIDNO:12)(CDR加下劃線顯示)：如本文所使用，術語「抗體的表位結合片段」意思是能夠免疫特異性結合表位的抗體片段。表位結合片段可包含這樣的抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR結構域，並且儘管能夠免疫特異性結合這樣的表位，但可展示針對與這樣的抗體的表位不同的這樣的表位的免疫特異性、親和性或選擇性。但是，優選地，表位結合片段包含這樣的抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單多肽鏈(例如，scFv)，或可包括兩條或更多條多肽鏈，每條具有氨基末端和羧基末端(例如，雙抗體、Fab片段、Fab2片段等)。C.本發明優選的雙抗體1.一般考慮本發明優選的雙抗體是雙特異性、四價、雙抗體(圖3)，其由總共四條多肽鏈組成。四條多肽鏈包括兩個包含CH2-CH3-的多肽(即，雙抗體的「第一」和「第三」多肽鏈)，其複合在一起，以形成Fc結構域，和兩個相同的非包含CH3-的多肽(即，雙抗體的「第二」和「第四」多肽鏈)，其每個與雙抗體的包含CH2-CH3-的多肽複合，以形成對PD-1或LAG-3是免疫特異性的表位結合結構域。因此，例如，第一多肽鏈包含抗PD-1(或抗LAG-3)可變輕鏈(VL)結構域和抗LAG-3(或抗PD-1)可變重鏈(VH)結構域，並且與具有互補的抗PD-1(或抗LAG-3)VH結構域和互補的抗LAG-3(或抗PD-1)VL結構域的第二多肽鏈複合，以便形成第一對的PD-1和LAG-3表位結合結構域。同樣地，第三多肽鏈包含抗PD-1(或抗LAG-3)可變輕鏈(VL)結構域和抗LAG-3(或抗PD-1)可變重鏈(VH)結構域，並且與具有互補的抗PD-1(或抗LAG-3)VH結構域和互補的抗LAG-3(或抗PD-1)VL結構域的第四多肽鏈複合，以便形成第二對的PD-1和LAG-3表位結合結構域。因為相同多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域涉及不同的表位，它們不能複合在一起以形成能夠結合PD-1或LAG-3的表位結合結構域。第一多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域優選地通過足夠短的間插接頭肽被彼此分開，以基本上防止這些結構域的複合。示例性接頭具有序列(SEQIDNO:13：GGGSGGGG。可選地可採用具有類似長度的其他接頭(以便防止相同多肽鏈的VL和VH結構域彼此相互作用)。如圖4中所顯示，本發明最優選的雙特異性、四價、雙抗體是已經被修飾以包含異源二聚體-促進結構域的雙抗體。包括這樣的結構域促進雙抗體的多肽鏈之間的異源二聚體形成。包括這樣的結構域不是必要的，並且本發明包括不具有這樣的結構域的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體。優選的異源二聚體-促進結構域包括「E-螺旋」結構域(SEQIDNO:14)：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK，和「K-螺旋」結構域(SEQIDNO:15)：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE。更具體而言，期望複合在一起的一對多肽鏈均被工程化，以包含一個(或多個)這樣的異源二聚體-促進結構域，其中採用的一條多肽鏈的結構域(一個或多個)與採用的另一多肽鏈的結構域(一個或多個)互補(例如，一條多肽鏈包含E-螺旋結構域而另一條包含K-螺旋結構域)。當兩條多肽鏈被工程化以包含大於一個這樣的異源二聚體-促進結構域時，它們可帶相同的電荷，或更優選地帶相反的電荷。尤其優選的是這樣的異源二聚體-促進結構域：其包括上述E-螺旋和K-螺旋序列的修飾，以便包括一個或多個半胱氨酸殘基。這樣的半胱氨酸殘基的存在允許一條多肽鏈上存在的螺旋共價結合另一多肽鏈上存在的互補螺旋，從而使多肽鏈彼此共價結合併且增加雙抗體的穩定性。這樣的尤其優選的例子是這樣的異源二聚體-促進結構域：其包括具有胺基酸序列(SEQIDNO:16)：EVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK的修飾的E-螺旋，其中SEQIDNO:14的亮氨酸殘基已經被半胱氨酸殘基(加下劃線顯示)替換，和具有胺基酸序列(SEQIDNO:17)：KVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE的修飾的K-螺旋，其中SEQIDNO:15的亮氨酸殘基已經被半胱氨酸殘基(加下劃線顯示)替換。第一多肽的可變重鏈結構域和該多肽的異源二聚體-促進結構域優選地通過包含1、2、3或更多個半胱氨酸殘基的間插接頭肽彼此分開。優選的包含半胱氨酸的間隔肽具有序列SEQIDNO:18：GGCGGG。可採用具有類似長度的其他接頭(以便包括可共價結合另一多肽鏈的半胱氨酸殘基的半胱氨酸殘基)。優選地，採用的異源二聚體-促進結構域和第一多肽鏈的CH2-CH3結構域通過為異源二聚體-促進結構域提供改善的穩定性的包含半胱氨酸的間插接頭肽彼此分開。合適的包含半胱氨酸的接頭肽具有胺基酸序列(SEQIDNO:19)：DKTHTCPPCP，但是，更優選的接頭具有胺基酸序列(SEQIDNO:20):LEPKSADKTHTCPPC。可選地，可以採用具有類似長度的其他接頭(以便包括可共價結合另一多肽鏈的半胱氨酸殘基的半胱氨酸殘基)。野生型CH2-CH3結構域的胺基酸序列如下(如在Kabat等(1992)SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,NationalInstitutesofHealthPublicationNo.91-3242的EU索引中定位)(SEQIDNO:21)：對於三特異性或四特異性的雙抗體(即，對於第一和第三多肽鏈不同的雙抗體)，期望減少或防止兩個第一多肽鏈的CH2-CH3結構域之間或兩個第三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間發生同源二聚化。為了促進第一和第三多肽鏈之間的異源二聚化，優選地修飾這些鏈的CH2-CH3結構域，以便促進這樣的異源二聚化。例如，胺基酸取代(優選用包括形成「杵(knob)」的大側基的胺基酸例如色氨酸進行取代)可被引入第一多肽鏈的CH2或CH3結構域，以便空間幹擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即，「臼(hole)」——配對(例如，用甘氨酸取代)。這樣的突變組可被工程化到任何多肽對中，包括雙抗體分子，並且進一步地，可被工程化到所述多肽鏈鏈對的任何部分中。相對於同源二聚化偏愛異源二聚化的蛋白質工程化的方法在本領域中是悉知的，尤其是關於工程化免疫球蛋白樣分子，這些都包括在本文中(見例如，美國專利號7,695,936和專利公開2007/0196363；Ridgway等(1996)「』Knobs-Into-Holes』EngineeringOfAntibodyCH3DomainsForHeavyChainHeterodimerization,」ProteinEngr.9:617-621；Atwell等(1997)「StableHeterodimersFromRemodelingTheDomainInterfaceOfAHomodimerUsingAPhageDisplayLibrary,」J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)「ANewFormatOfBispecificAntibody:HighlyEfficientHeterodimerization，ExpressionAndTumorCellLysis,」J.Immunol.Methods296:95-101，其每一篇通過引用以其整體併入本文。通過修飾天然的IgGFc結構域以包含修飾T366W產生優選的杵。通過修飾天然的IgGFc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V產生優選的臼。為了幫助純化本發明的雙抗體，包含臼突變的多肽鏈另外包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A結合位點。因此，包含臼突變的多肽的同源二聚體不結合蛋白A，而由於包含異源二聚體的杵和臼形成的雙抗體經包含杵突變的多肽鏈上的蛋白A結合位點保持其結合蛋白A的能力。本發明也包括包含變異的Fc結構域的分子，所述變異的Fc結構域相對於可比較的野生型Fc結構域包括一個或多個胺基酸取代、插入或缺失。包括變異的Fc結構域的分子相對於包括野生型Fc結構域的分子通常具有改變的表型。變異的表型可表現為改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能，如在NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中分析的。鑑定為改變效應子功能的Fc結構域修飾是本領域已知的，包括增加對激活受體的結合(例如，FcγRIIA(CD16A)和減少對抑制受體的結合(例如，FcγRIIB(CD32B)的修飾(見，例如，Stavenhagen,J.B.等(2007)「FcOptimizationOfTherapeuticAntibodiesEnhancesTheirAbilityToKillTumorCellsInVitroAndControlsTumorExpansionInVivoViaLow-AffinityActivatingFcgammaReceptors,」CancerRes.57(18):8882-8890)。具有對CD32B降低的結合和/或對CD16A增加的結合的人IgG1Fc結構域的示例性變體包含F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。這些胺基酸取代可以任何組合存在於人IgG1Fc結構域。在一個實施方式中，人IgG1Fc結構域變體包含F243L、R929P和Y300L取代。在另一實施方式中，人IgG1Fc結構域變體包含F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一實施方式中，人IgG1Fc結構域變體包含N297Q取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除了FcR結合。這樣的分子的第一多肽鏈的CH2-CH3結構域具有「攜帶杵的」序列(SEQIDNO:22)：或具有H435R取代的「攜帶臼的」序列，以消除蛋白A結合(SEQIDNO:23)：如所認識到，「攜帶臼的」CH2-CH3結構域(例如，SEQIDNO:22)可在第一多肽鏈中採用，在該情況下，「攜帶杵的」CH2-CH3結構域(例如，SEQIDNO:22)將用在第三多肽鏈中。對於本發明的第一和第三多肽鏈並非不同的雙特異性、四價雙抗體，優選的CH2-CH3結構域是修飾的CH2-CH3結構域，其具有胺基酸序列(SEQIDNO:24)：因此，總之，本發明優選的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體雙抗體優選的第一和第三多肽鏈具有一致的序列，並且這樣優選的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體的第二和第四多肽鏈具有一致的序列，如表3中顯示：2.第一示例性PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體(PD-1xLAG-3)本發明的第一尤其優選的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體(「PD-1xLAG-3」)的第一和第三多肽鏈具有一致的序列。這樣的第一/第三多肽鏈具有胺基酸序列(SEQIDNO:25)：其中，胺基酸殘基1-107是LAG-3mAb1的輕鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:12)，胺基酸殘基108-115是接頭GGGSGGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:13)，胺基酸殘基116-228是PD-1mAb1的重鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:2)，胺基酸殘基229-234是包含半胱氨酸的間隔肽GGCGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:18)，胺基酸殘基235-262是修飾的E-螺旋的胺基酸殘基(SEQIDNO:16)，胺基酸殘基263-277是包含半胱氨酸的接頭肽LEPKSADKTHTCPPC的胺基酸殘基(SEQIDNO:20)和胺基酸殘基278-494是修飾的CH2-CH3結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:24)。編碼這樣的第一/第三多肽鏈的核酸分子是(SEQIDNO:26)：這樣的PD-1xLAG-3的第二和第四多肽鏈具有一致的序列。這樣的第二/第四多肽鏈具有胺基酸序列(SEQIDNO:27)：其中，胺基酸殘基1-107是PD-1mAb1的輕鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:3)，胺基酸殘基108-115是接頭GGGSGGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:13)，胺基酸殘基116-235是LAG-3mAb1的重鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:11)，胺基酸殘基236-241是包含半胱氨酸的間隔肽GGCGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:18)，和胺基酸殘基242-269是修飾的K-螺旋的胺基酸殘基(SEQIDNO:17)。編碼這樣的第二/第四多肽鏈的核酸分子是(SEQIDNO:28)：3.第二示例性PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體(PD-1xLAG-3)本發明的第二尤其優選的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體(PD-1xLAG-3)的第一和第三多肽鏈具有一致的序列。這樣的第一/第三多肽鏈具有胺基酸序列(SEQIDNO:29)：其中，胺基酸殘基1-107是PD-1mAb1的輕鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:3)，胺基酸殘基108-115是接頭GGGSGGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:13)，胺基酸殘基116-235是LAG-3mAb1的重鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:11)，胺基酸殘基236-241是包含半胱氨酸的間隔肽GGCGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:18)，胺基酸殘基242-269是修飾的E-螺旋的胺基酸殘基(SEQIDNO:16)，胺基酸殘基270-284是包含半胱氨酸的接頭肽LEPKSADKTHTCPPC的胺基酸殘基(SEQIDNO:20)和胺基酸殘基285-501是修飾的CH2-CH3結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:24)。編碼這樣的第一/第三多肽鏈的核酸分子是(SEQIDNO:30)：PD-1xLAG-3的第二和第四多肽鏈具有一致的序列。這樣的第二/第四多肽鏈具有胺基酸序列(SEQIDNO:31)：其中，胺基酸殘基1-107是LAG-1mAb1的輕鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:12)，胺基酸殘基108-115是接頭GGGSGGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:13)，胺基酸殘基116-228是PD-1mAb1的重鏈可變結構域的胺基酸殘基(SEQIDNO:2)，胺基酸殘基229-234是包含半胱氨酸的間隔肽GGCGGG的胺基酸殘基(SEQIDNO:18)，和胺基酸殘基235-262是修飾的K-螺旋的胺基酸殘基(SEQIDNO:17)。編碼這樣的第二/第四多肽鏈的核酸分子是(SEQIDNO:32)：III.藥學組合物本發明包括治療癌症或與病原體的存在相關的疾病的藥學組合物。這樣的組合物包括用於製造藥學組合物的散裝藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)和藥學組合物(即，適於向受試者或患者施用組合物)，其可用於製備單位劑量形式。這樣的組合物包括本發明的預防或治療有效量的修飾的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體，(和尤其地，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性、四價雙抗體)和藥學上可接受的載體。優選地，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的一種或多種分子和藥學上可接受的載體。本發明也包括這樣的藥學組合物：其包括這樣的修飾的雙抗體和對具體的病原體相關的抗原特異的第二治療性抗體，以及藥學上可接受的載體。如本文所使用，術語「癌症」指特徵在於存在惡性腫瘤的疾病。這樣的癌症包括腎上腺癌、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦癌和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外粘液樣軟骨瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病，脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、末梢神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見血液疾病、腎轉移性癌、杆狀腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌症或子宮癌。如本文所使用，術語「與病原體的存在相關的疾病」指與由下述病原體導致的感染相關的疾病：細菌(例如，大腸埃希氏菌、艱難梭菌(C.difficile)、傷寒沙門氏菌(Salmonellathyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)、流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenzae)、痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和肺炎鏈球菌等(Streptococcuspneumonia))，真菌(例如，念珠菌屬(Candida)、麴黴菌屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、球孢子菌屬(Coccidioides)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、肺孢菌屬(Pneumocystis)、葡萄穗黴菌屬(Stachybotrys)等)、原生動物(變形蟲類(Amoebozoa)、古蟲類(Excavata)、囊泡藻類(Chromalveolata)、內變形蟲類(Entamoeba)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、賈第蟲(Giardia)、錐體蟲屬(Trypanosoma)、球蟲亞綱(Coccidia)、貝諾屬(Besnoitia)、岐腔屬(Dicrocoelium)、利什曼蟲屬(Leishmania)等)或病毒(尤其是腺病毒、腺伴隨病毒、B病毒(恆河猴皰疹病毒I型(macacineherpesvirusI))、BK病毒、布尼亞病毒、切昆貢亞(chikungunya)病毒、柯薩奇(cocksackie)病毒、冠狀病毒、巨細胞病毒、東部馬腦炎(easternequineencephalitis)病毒、伊波拉病毒、腸道病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、漢坦病毒(hantavirus)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，單純性皰疹病毒1型、單純性皰疹病毒2型、人泡沫病毒(humanfoamyvirus)、人皰疹病毒3型、人皰疹病毒5型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒7型、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、人β-嗜淋巴細胞病毒、人T細胞白血病病毒I型、人T細胞白血病病毒II型、流感病毒、JC病毒、JEV、卡波西氏肉瘤相關的皰疹病毒、拉沙病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、馬爾堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipahvirus)、諾如病毒(norovirus)、諾瓦克(Norwalk)病毒、正呼腸孤病毒(orthoreovirus)、副流感病毒、細小病毒、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、呼腸病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、裂谷熱病毒、輪狀病毒、風疹病毒、天花病毒、聖路易腦炎病毒、重型天花病毒(variolamajorvirus)、卡菲爾痘病毒(variolaminorvirus)、水痘-皰疹病毒(vericella-zostervirus)、西尼羅病毒、西部馬腦炎病毒或黃熱病病毒)。如本文所使用，術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」表示獲得有益的或期望的結果的途徑，所述有益的或期望的結果包括並且優選地是有益的或期望的臨床結果。這樣的有益的或期望的臨床結果包括但不限於下述的一個或多個：減少(或破壞)受感染細胞或其他患病的細胞的增殖、減輕由於疾病產生的症狀，提高遭受疾病的那些的生活質量、減少治療疾病需要的其他藥物的劑量、延遲疾病的進展，和/或延長陪伴(companion)動物接受者的生存。在具體的實施方式中，術語「藥學上可接受的」表示被聯邦或國家政府的管理機構批准，或列舉在美國藥典中或其他通常認可的用於動物，尤其是人的藥典中。術語「載體」指稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全的和不完全的)、賦形劑或利用其施用治療劑的媒介。這樣的藥學載體可以是無菌液體，比如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成起源的那些，比如花生油、大豆油、礦物質油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和丙三醇溶液可也可用作液體載體，尤其用於可注射的溶液。適當的藥學賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，組合物也可包含少量的溼潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可為下述形式：溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋製劑等。一般而言，分別或以單位劑型混合在一起來提供本發明組合物的成分，例如，在密封容器比如指示活性劑的量的安瓿或袋(sachette)中作為乾燥凍乾粉末或無水濃縮物。在組合物通過輸注施用的情況下，其可用包含無菌藥學級的水或鹽水的輸注瓶進行分配。在通過注射施用組合物的情況下，可提供一安瓿的注射用無菌水或鹽水，從而可混合成分然後施用。本發明的組合物可配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的那些，比如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和用陽離子形成的那些，比如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些。本發明也提供了藥學包裝或試劑盒，其包括一個或多個包含本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體——單獨的或與這樣的藥學上可接受的載體一起——的容器。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑可也包括在藥學包裝或試劑盒中。本發明也提供了藥學包裝或試劑盒，其包括填充本發明的藥學組合物的一種或多種成分的一個或多個容器。任選地與這樣的容器(一個或多個)結合的可以是監管藥物製劑或生物製品的製造、使用或售賣的政府管理局規定的形式的公告(notice)，該公告反映管理局對用於人施用的製造、使用或售賣的批准。本發明提供了可用於上述方法的試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包括本發明的一種或多種分子。在另一實施方式中，試劑盒進一步在一個或多個容器中包括一種或多種其他預防劑或治療劑，所述劑可用於治療特徵在於存在病原體相關的抗原的癌症或疾病。在另一實施方式中，試劑盒進一步包括結合一個或多個病原體相關的抗原的一種或多種抗體或雙抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。IV.產生本發明PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的方法最優選地通過重組表達編碼這樣的多肽的核酸分子產生本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體，這是本領域熟知的。本發明的多肽可方便地使用固相肽合成製備(Merrifield,B.(1986)「SolidPhaseSynthesis,Science232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)「GeneralMethodForTheRapidSolid-PhaseSynthesisOfLargeNumbersOfPeptides:SpecificityOfAntigen-AntibodyInteractionAtTheLevelOfIndividualAminoAcids,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135；Ganesan,A.(2006)「Solid-PhaseSynthesisInTheTwenty-FirstCentury，MiniRev.Med.Chem.6(1):3-10)。可選地，可使用本領域已知的任何方法重組製備和表達抗體。可如下重組製備抗體：首先分離從宿主動物製備的抗體、獲得基因序列和使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如，菸草)或轉基因奶中表達抗體序列。已經公開了在植物或奶中重組表達抗體的合適的方法(見，例如，Peeters等(2001)「ProductionOfAntibodiesAndAntibodyFragmentsInPlants,Vaccine19:2756；Lonberg,N.等(1995)「HumanAntibodiesFromTransgenicMice,Int.Rev.Immunol13:65-93；和Pollock等(1999)「TransgenicMilkAsAMethodForTheProductionOfRecombinantAntibodies,J.ImmunolMethods231:147-157)。製備抗體衍生物，例如，嵌合的、人源化的，單鏈的等的適當的方法是本領域已知的。在另一可選方案中，抗體可通過噬菌體展示技術重組製備(見，例如，美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter,G.等(1994)「MakingAntibodiesByPhageDisplayTechnology,Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。可通過Edman降解法對感興趣的抗體或蛋白質測序，所述Edman降解法對於本領域技術人員是熟知的。由質譜或Edman降解法產生的肽信息可用於設計探針或引物，其被用於克隆感興趣的蛋白質。克隆感興趣的蛋白質的可選的方法是通過使用純化蛋白質或其部分「淘洗」表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。「淘洗」程序可如下進行：從在第二細胞類型中表達或過表達期望的cDNA的組織或細胞獲得cDNA文庫，和篩選特異性結合期望蛋白質的第二細胞類型的轉染的細胞。用於通過「淘洗」克隆編碼細胞-表面蛋白質的哺乳動物基因的方法的詳細描述可見於現有技術(見，例如，Aruffo,A.等(1987)「MolecularCloningOfACD28cDNAByAHigh-EfficiencyCOSCellExpressionSystem,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:8573-8577；和Stephan,J.等(1999)「SelectiveCloningOfCellSurfaceProteinsInvolvedInOrganDevelopment:EpithelialGlycoproteinIsInvolvedInNormalEpithelialDifferentiation,Endocrinol.140:5841-5854)。可根據現有技術的標準方法通過從具體的細胞類型逆轉錄mRNA獲得編碼抗體和其他肽激動劑、拮抗劑和調諧劑的cDNA。具體而言，可使用各種裂解酶或化學溶液根據上文Sambrook等闡釋的程序分離mRNA，或通過商業上可得的核酸-結合樹脂根據製造商提供的伴隨說明書提取mRNA(例如，Qiagen,Invitrogen,Promega)。然後將合成的cDNA引入表達載體，以在第二類型細胞中產生感興趣的抗體或蛋白質。暗示表達載體在宿主細胞中必須是可複製的——作為游離體(episome)或作為染色體DNA的不可缺少的部分。適當的表達載體包括但不限於質粒、病毒載體，包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒和黏粒。包含感興趣的多核苷酸的載體可通過許多適當的方式中的任意方式被引入宿主細胞，所述適當方式包括電穿孔，採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質進行轉染；微彈轟擊(microprojectilebombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑比如牛痘病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇通常取決於宿主細胞的特徵。任何能夠過表達異源DNA的宿主細胞均可用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。適當的哺乳動物宿主細胞的非限制性例子包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質(如果存在)，宿主細胞以高約5倍，更優選地高10倍，更優選地高20倍、更優選地高50倍或更優選地高100倍的水平表達cDNA。優選地通過免疫試驗或FACS實現對特異性結合期望的蛋白質的宿主細胞的篩選。由此可鑑定過表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。各種技術也是可用的，其現在可用以產生突變肽激動劑、拮抗劑和調諧劑，其相對於親代肽激動劑、拮抗劑或調諧劑分子編碼所得蛋白質的胺基酸序列中的添加、缺失或改變。本發明包括對本發明PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的修飾和具有增強的或降低的活性的變體，所述修飾不顯著影響它們的特性。多肽的修飾是現有技術的常規實踐。修飾的多肽的例子包括具有胺基酸殘基的保守取代的多肽，不顯著不利改變功能活性的胺基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的胺基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/穀氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻譯後修飾的多肽，比如例如用不同糖的糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，胺基酸取代是保守的，即，取代的胺基酸應具備與原始胺基酸類似的化學特性。這樣的保守取代是本領域已知的，並且上面已經提供了例子。胺基酸修飾的範圍可從改變或修飾一個或多個胺基酸到區域，比如可變區的完全重新設計(redesign)。可變區的改變可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其他方法包括使用本領域已知的偶聯技術，包括但不限於酶促方式、氧化取代和螯合作用。修飾可用於，例如，連接用於免疫試驗的標籤，比如連接用於放射免疫分析的放射性部分。使用現有技術確立的程序製備修飾的多肽並且可使用本領域已知的標準試驗篩選。本發明也包括融合蛋白，其包括來自本發明多肽和抗體的一個或多個片段或區域。在一個實施方式中，提供融合多肽，其包括可變輕鏈區的至少10個連續胺基酸和可變重鏈區的至少10個胺基酸。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白恆定區。在另一實施方式中，融合多肽包含由公共保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含一個或多個多肽結構域和在天然分子中未連接的另一胺基酸序列，例如，來自另一區域的異源序列或同源的序列，所述多肽結構域特異性結合期望的病毒表位或期望的免疫效應細胞的激活受體或表達這樣的激活受體的免疫效應細胞表面上存在的蛋白質。本發明包括多肽，其包括本發明抗體的胺基酸序列。本發明的多肽可通過本領域已知的程序製備。可如下產生多肽：抗體的蛋白酶解或其他降解、如上述的重組方法(即，單個或融合多肽)或化學合成。抗體的多肽，尤其多達約50個胺基酸的短多肽，便利地通過化學合成製備。化學合成的方法是本領域已知的並且是商業上可得的。例如，這樣的多肽可通過採用固相方法的自動多肽合成儀產生。V.本發明的組合物的用途本發明包括組合物，包括藥學組合物，所述藥學組合物包括本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體、源自這樣的分子的多肽、包括編碼這樣的分子或多肽的多核苷酸序列，和如本文所描述的其他試劑。因為本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體具有減弱由PD-1和LAG-3介導的免疫系統的抑制的能力，所以本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體可用於治療與非期望的受抑制的免疫系統相關的任何疾病或病況，包括與病原體(例如，細菌、真菌、病毒或原生動物感染)的存在相關的癌症和疾病。VI.施用方法通過向受試者施用有效量的本發明的藥學組合物，本發明的組合物可被提供用於治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一個或多個症狀。在優選的方面中，這樣的組合物基本上是純化的(即，基本上不含限制其作用或產生非期望的副作用的物質)。在具體的實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物比如非靈長類(例如，牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴比如，食蟹猴(cynomolgusmonkey)、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。各種各種遞送系統是已知的並且可用於施用本發明的組合物，例如，封裝在脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(見，例如，Wu等(1987)「Receptor-MediatedInVitroGeneTransformationByASolubleDNACarrierSystem,」J.Biol.Chem.262:4429-4432)，作為逆轉錄病毒或其他載體一部分的核酸的構建物等。施用本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的方法包括但不限於腸胃外施用(例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)、硬膜外和黏膜(例如，鼻內和口服途徑)。在具體的實施方式中，肌內、靜脈內或皮下施用本發明的分子。可通過任何方便的途徑施用組合物，例如，通過輸注或丸劑注射，通過經上皮或黏膜皮膚被覆(lining)(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可也採用肺部施用，例如，通過使用吸入器或噴霧器，和具有氣霧化試劑的製劑。見，例如，美國專利號6,019,968、5,985，320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公開號WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903，其每一篇通過引用以其整體併入本文。本發明也使得本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體可包裝在密封容器比如指示這樣的分子的量的安瓿或袋中。在一個實施方式中，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體被供應作為密封容器中的乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物並且可，例如，用水或鹽水重構至適當的濃度用於施用至受試者。優選地，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體被供應作為密封容器中的乾燥無菌凍乾粉末，單位劑量為至少5μg，更優選地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg或至少200μg。本發明的凍幹PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體應在它們的原始容器中在2和8℃之間儲存並且分子應在重構之後的12小時內，優選地6小時內，5小時內，3小時內，或1小時內施用。在可選的實施方式中，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體以液體形式供應在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，液體形式的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體被供應在密封容器中，其中分子存在的濃度為至少1μg/ml，更優選地至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。如本文所使用，在一個實施方式中，「有效量」的藥學組合物是足夠實現有益的或期望的結果的量，包括但不限於臨床結果比如減輕由於疾病造成的症狀、減輕感染的症狀(例如，病毒量、發燒、疼痛，膿毒症等)或癌症的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾病的那些的生活質量、減少治療疾病需要的其他藥物的劑量、加強另一藥物的作用——比如經靶向和/或內化、延遲疾病的進展和/或延長個體的生存。有效量可在一次或多次施用中施用。為了本發明的目的，有效量的藥物、化合物或藥學組合物是這樣的量：所述量足夠直接或間接減少病毒存在的增殖(或作用)和減輕和/或延遲病毒疾病的發展。在一些實施方式中，有效量的藥物、化合物或藥學組合物可能或不能實現結合另一藥物、化合物或藥學組合物。因此，「有效量」可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如果結合一種或多種其他試劑，期望的結果可以或得以實現，則單個試劑可視為以有效量給予。儘管個體需要不同，測定每種組分的有效量的最佳範圍仍在現有技術的範圍內。對於抗體施用，典型的劑量包括在0.1-至100mg/kg/體重之間的一個或多個單位劑量。有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的量可通過標準臨床技術來測定。製劑中採用的精確劑量也取決於施用的途徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量響應曲線外推。對於本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體，施用至患者的劑量通常為按受試者的體重計至少約0.01μg/kg、至少約0.05μg/kg、至少約0.1μg/kg、至少約0.2μg/kg、至少約0.5μg/kg、至少約1μg/kg、至少約2μg/kg、至少約5μg/kg、至少約10μg/kg、至少約20μg/kg、至少約50μg/kg、至少約0.1mg/kg、至少約1mg/kg、至少約5mg/kg、至少約10mg/kg、至少約30mg/kg、至少約50mg/kg、至少約75mg/kg、至少約100mg/kg、至少約125mg/kg、至少約150mg/kg或更多。在另一實施方式中，患者施用的治療方案包括一個或多個劑量的這樣的預防或治療有效量的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體，其中治療方案在2天內、3天內、4天內、5天內、6天內或7天內施用。在某些實施方式中，治療方案包括間歇地施用預防或治療有效量的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的劑量(例如，在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量並且在相同周的第5天、第6天和第7天不施用預防或治療有效量的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的劑量)。典型地，有1、2、3、4、5或更多個治療療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。在另一實施方式中，施用的劑量在方案(一個或多個)的前四分之一、前二分之一或前三分之二或四分之三(例如，在4個治療療程的第一、第二、或第三方案內)內逐漸上升直到實現每日預防或治療有效量的本發明包括的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體。在一個實施方式中，可計算施用至患者的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的劑量，用作單一試劑療法。在另一實施方式中，本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體結合其他治療性組合物使用，並且施用至患者的劑量比這樣的雙抗體用作單一試劑療法時更低。在具體的實施方式中，可期望局部施用本發明的藥學組合物至需要治療的區域；這可通過，但不限於例如如下方式實現：局部輸注、通過注射、或通過植入體，所述植入體是多孔的、非多孔的、或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜(sialastic)或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須注意使用不吸收該分子的材料。在另一實施方式中，組合物可在小泡，尤其是脂質體中遞送(見Langer(1990)「NewMethodsOfDrugDelivery,」Science249:1527-1533)；Treat等，在LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer(傳染病和癌症療法中的脂質體)中，Lopez-Berestein和Fidler(eds.),Liss,NewYork,353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327頁；一般見上)。在又另一實施方式中，組合物可在控釋或緩釋系統中遞送。本領域技術人員已知的任何技術均可用於產生包括本發明的一個或多個分子的緩釋製劑。見，例如，美國專利號4,526,938；PCT公開WO91/05548、PCT公開WO96/20698；Ning等(1996)「IntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustained-ReleaseGel,」Radiotherapy&Oncology39:179-189；Song等(1995)「AntibodyMediatedLungTargetingOfLong-CirculatingEmulsions,」PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等(1997)「BiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplication,」Pro.Int』l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)「MicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDelivery,」Proc.Int』l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，其各通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中，泵可用於控釋系統中(見Langer，同上；Sefton,(1987)「ImplantablePumps,」CRCCrit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)「Long-Term,ContinuousIntravenousHeparinAdministrationByAnImplantableInfusionPumpInAmbulatoryPatientsWithRecurrentVenousThrombosis,」Surgery88:507-516；和Saudek等(1989)「APreliminaryTrialOfTheProgrammableImplantableMedicationSystemForInsulinDelivery,」N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一實施方式中，聚合物材料可用於實現抗體的控釋(見例如，MedicalApplicationsofControlledRelease,LangerandWise(eds.),CRCPres.,BocaRaton,Florida(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,SmolenandBall(eds.),WileyNewYork(1984)；Levy等(1985)「InhibitionOfCalcificationOfBioprostheticHeartValvesByLocalControlled-ReleaseDiphosphonate,」Science228:190-192；During等(1989)「ControlledReleaseOfDopamineFromAPolymericBrainImplant:InVivoCharacterization,」Ann.Neurol.25:351-356；Howard等(1989)「IntracerebralDrugDeliveryInRatsWithLesion-InducedMemoryDeficits,」J.Neurosurg.7(1):105-112)；美國專利號5,679,377、美國專利號5,916,597、美國專利號5,912,015、美國專利號5,989,463、美國專利號5,128,326；PCT公開號WO99/15154；和PCT公開號WO99/20253)。在緩釋製劑中使用的聚合物的例子包括但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinylacetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯基醇)、聚丙烯醯胺，聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯(polyorthoeste)。在又另一實施方式中，控釋系統可放置在治療性靶(例如，肺)附近，因此僅僅需要全身劑量的一部分(見，例如，Goodson,在MedicalApplicationsofControlledRelease中，同上，vol.2,pp.115-138(1984))。在另一實施方式中，根據Dunn等使用用作控釋移植物的聚合組合物(見美國5,945,155)。該具體的方法基於來自聚合物系統的生物活性材料的原位-控釋的療效。植入可一般發生在患者需要治療性治療的身體內的任何地方。在另一實施方式中，使用非聚合物持續遞送系統，由此受試者身體中的非聚合物植入物被用作藥物遞送系統。當植入身體時，植入物的有機溶劑將從組合物消散，分散或滲漏到周圍組織流體中，並且非聚合材料逐漸凝聚或沉澱形成固體、多微孔基質(見美國5,888,533)。Langer的綜述(1990,「NewMethodsOfDrugDelivery,」Science249:1527-1533)討論了控釋系統。本領域技術人員已知的任何技術均可用於產生包括本發明的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見，例如，美國專利號4,526,938；國際公開號WO91/05548和WO96/20698；Ning等(1996)「「IntratumoralRadioimmunotheraphyOfAHumanColonCancerXenograftUsingASustained-ReleaseGel,」Radiotherapy&Oncology39:179-189；Song等(1995)「AntibodyMediatedLungTargetingOfLong-CirculatingEmulsions,」PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等(1997)「BiodegradablePolymericCarriersForAbFGFAntibodyForCardiovascularApplication,」Pro.Int』l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)「MicroencapsulationOfRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyForLocalDelivery,」Proc.Int』l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一篇通過引用以其整體併入本文。在其中本發明的組合物是編碼本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的一條或多條多肽鏈的核酸的具體實施方式中，通過將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其變成是細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic)，Dupont)，或用脂質或細胞-表面受體或轉染試劑塗覆，或通過將其連接至已知進入核的同源框樣肽施用(見例如，Joliot等(1991)「AntennapediaHomeoboxPeptideRegulatesNeuralMorphogenesis,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等，核酸可被體內施用以促進其編碼的雙抗體的表達。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。用治療或預防有效量的本發明的PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體治療受試者可包括單一治療或，優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，受試者用本發明的分子每周治療一次，持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，甚至更優選地持續約4、5或6周。在其他實施方式中，每天一次、每天兩次或每天三次施用本發明的藥學組合物。在其他實施方式中，每周一次、每周兩次、每兩周一次、每月一次、每六周一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次施用藥學組合物。也認識到用於治療的分子的有效劑量可在具體的治療療程內增加或降低。現已經大體上描述了本發明，通過參考下述實施例其更容易理解。這樣的實施例通過示例的方式提供，並且不旨在限制本發明，除非另外指出。實施例1PD-1xLAG-3雙特異性雙抗體的產生和特性在allo-MLR試驗的背景下，響應HLA-錯配(Latchman,Y.E.等(2004)「PD-L1-DeficientMiceShowThatPD-L1OnT-Cells,Antigen-PresentingCells,AndHostTissuesNegativelyRegulatesT-Cells.」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)101(29):10691-10696；Wang,W.等(2008)「PD-L1/PD-1SignalDeficiencyPromotesAllogeneicImmuneResponsesAndAcceleratesHeartAllograftRejection,」Transplantation86(6):836-44)或促有絲分裂/藥理學刺激，誘導T-細胞增殖。已知靶向共刺激分子的激動劑抗體通過加強T-細胞信號傳導和穩定促進或驅使T-細胞效應子功能的轉錄因子，誘導增殖性應答(Melero,I.等(2013)「AgonistAntibodiestoTNFRMoleculesThatCostimulateTandNKCells,」Clin.CancerRes.19(5):1044-1053)。類似地，靶向負調節T-細胞應答的關鍵檢查點分子的拮抗劑抗體可通過保持T-細胞信號傳導和效應子功能誘導增殖性應答，從而提高抗腫瘤免疫(Capece,D.等(2012)「TargetingCostimulatoryMoleculestoImproveAntitumorImmunity,」J.Biomed.Biotech.2012:926321)。在摻入3H-胸苷之後，可在短期混合淋巴細胞(allo-MLR)反應中容易地測量針對共刺激或檢查點靶的單克隆抗體響應同種異體抗原對增殖的作用。為了解決針對檢查點抑制劑的抗體增強增殖的能力，產生基準抗PD-1或抗LAG-3mAbs，將其純化，並且在allo-MLR試驗開始時，以20、10、5、2.5和1.25μg/ml外源添加(圖5)。在5-6天結束時，用3H-胸苷脈衝平鋪的96孔並且培養18hrs，以測量增殖。評估評估針對人PD-1、LAG-3和CTLA-4的數個基準抗體響應同種異體抗原刺激而增強T-細胞增殖的能力。如圖6中顯示，在allo-MLR試驗開始時添加PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)或PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)，相比IgG1同種型對照抗體或包含響應物和刺激物的對照孔誘導強的T-細胞增殖。單獨包含輻射的刺激細胞的孔表明沒有增殖。儘管觀察到劑量依賴性增殖性應答，但PD-1mAb4(CT-011；CureTech，BAT-1)相比PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)、PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab)或PD-1mAb3(EH12.2H7；DanaFarber)顯示最小增殖。也用LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)觀察到輕微的劑量依賴性增殖性應答，其與伊匹單抗(ipilimumab)——一種抗CTLA-4mAb(BristolMyers-Squib)——類似地相當。PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)與LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)同時被給予與任一抗體被單獨給予相比在動物模型中引起有效的抗腫瘤免疫的顯著效力(Woo,S.R.等(2012)「ImmuneInhibitoryMoleculesLAG-3AndPD-1SynergisticallyRegulateT-CellFunctionToPromoteTumoralImmuneEscape,」CancerRes.72(4):917-927)表明以組合給予的基準mAb可比任一單獨的抗體更大地加強同種(allo)-誘導的T-細胞增殖。如圖7中顯示，評估抗LAG-3mAb(25F7)單獨或組合抗PD-1mAbs(PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)或PD-1mAb2(MK-3475；Merck，lambrolizumab))的增生性潛能。如先前觀察到的，兩種抗PD-1mAbs均以劑量依賴性方式誘導有效的增殖。相反，與任一抗PD-1mAb一起提供抗LAG-3mAb不誘導超過單獨用抗PD-1mAbs觀察到的增強的增殖。單獨的抗LAG-3mAb相比同種型IgG1對照或應答物加刺激物對照孔僅僅展示輕微的T-細胞增殖。抗LAG-3mAb——單獨或以組合——不能誘導超過用抗PD-1mAb觀察到的增殖表明在allo-MLR試驗期間T-細胞上不存在LAG-3表達或抗LAG-3mAb不結合LAG-3以阻斷負信號級聯。為了分析誘導LAG-3信號轉導的潛能，將可溶性人LAG-3蛋白質(「shLAG-3」)添加至allo-MLR，並且與抗LAG-3mAb和/或抗PD-1mAb比較。如圖8中顯示，結合APC和CD4T-細胞上表達的人HLA-II類分子的可溶性人LAG-3相比IgG同種型或應答物加刺激物對照孔誘導有力的增殖性應答。LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)的加入似乎不阻礙可溶性人LAG-3蛋白質的增生性作用並且可具有輕微的增強的T-細胞增殖，因為觀察到輕微的劑量依賴性增殖性應答。與之前的觀察一致，抗PD-1mAb誘導有效的T-細胞增殖，其通過添加可溶性人LAG-3蛋白質和/或LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)被進一步增強。添加同種型IgG1對照至抗PD-1抗體不使T-細胞增殖增強超過單獨用PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)觀察到的。可溶性LAG-3甚至在存在抗LAG-3mAbs的情況下誘導有效T-細胞增殖的能力不清楚。一種可能性是抗LAG-3mAb簡單地不能阻斷可溶性LAG-3mAb誘導的強的增殖性號。一種可選方式——但不一定是非互相排斥的可能性—是可溶性人LAG-3蛋白質與抗LAG-3一起形成免疫交聯複合物，其可進一步加強增殖性應答。可溶性LAG-3加強T-細胞增殖的能力提示在allo-MLR試驗中將抗PD-1和抗LAG-3mAb接近引入可能增強T-細胞增殖性應答。為了解決該可能性，以兩個取向在雙親和性重靶向-雙特異性形式中構建基準抗PD-1和抗LAG-3mAb：LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)–PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)雙特異性、四價雙抗體(PD-1xLAG-3)和PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)–LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)雙特異性、四價雙抗體(PD-1xLAG-3)。在allo-MLR開始時外源添加兩種形式(以上述劑量-依賴性方式)，並且評估它們的T-細胞增殖性潛能。如圖9A-9B中所顯示，兩種-雙抗體均誘導比用PD-1mAb1(5C4(BMS-936558)和/或LAG-3mAb1(25F7；BMS-986016，Medarex/BMS)獲得T-細胞增殖性應答的令人吃驚地更有效的T-細胞增殖性應答。可溶性人LAG-3(「shLAG-3」)在allo-MLR試驗中再次顯示強的T-細胞增殖。通過和可溶性人LAG-3蛋白質誘導的強的增殖性信號使單獨的抗PD-1mAb或抗LAG-3mAb的貢獻最小化。儘管抗PD-1和LAG-3mAb都以劑量依賴性方式誘導超過用IgG1同種型對照或應答物加刺激物孔單獨觀察到的T-細胞增殖，但抗PD-1與抗LAG-3的組合顯示比任一單獨抗體增強的增殖，表明——如之前在文獻中報導的——已經表明功能協同作用(Wang,W.等(2008)「PD-L1/PD-1SignalDeficiencyPromotesAllogeneicImmuneResponsesAndAcceleratesHeartAllograftRejection,」Transplantation86(6):836-44；Melero,I.等(2013)「AgonistAntibodiestoTNFRMoleculesThatCostimulateTandNKCells,」Clin.CancerRes.19(5):1044-1053；Capece,D.等(2012)「TargetingCostimulatoryMoleculestoImproveAntitumorImmunity,」J.Biomed.Biotech.2012:926321)。本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，如同好像具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步更改，並且本申請旨在覆蓋大體上遵循本發明原理的本發明的任何變型、用途或改變，所述變型、用途或改變包括與本公開的這種偏離，只要其在本發明所屬領域的已知或常規實施範圍內和只要其可應用於上文闡釋的本質特徵。序列表宏觀基因股份有限公司E·波維尼L·S·詹森P·A·摩爾K·沙哈R·拉莫特-莫斯與PD-1和LAG-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法1301.0115PCT62/017,4672014-06-2632PatentIn3.5版本1288PRT智人misc(1)..(288)人PD-1，包括信號序列1MetGlnIleProGlnAlaProTrpProValValTrpAlaValLeuGln151015LeuGlyTrpArgProGlyTrpPheLeuAspSerProAspArgProTrp202530AsnProProThrPheSerProAlaLeuLeuValValThrGluGlyAsp354045AsnAlaThrPheThrCysSerPheSerAsnThrSerGluSerPheVal505560LeuAsnTrpTyrArgMetSerProSerAsnGlnThrAspLysLeuAla65707580AlaPheProGluAspArgSerGlnProGlyGlnAspCysArgPheArg859095ValThrGlnLeuProAsnGlyArgAspPheHisMetSerValValArg100105110AlaArgArgAsnAspSerGlyThrTyrLeuCysGlyAlaIleSerLeu115120125AlaProLysAlaGlnIleLysGluSerLeuArgAlaGluLeuArgVal130135140ThrGluArgArgAlaGluValProThrAlaHisProSerProSerPro145150155160ArgProAlaGlyGlnPheGlnThrLeuValValGlyValValGlyGly165170175LeuLeuGlySerLeuValLeuLeuValTrpValLeuAlaValIleCys180185190SerArgAlaAlaArgGlyThrIleGlyAlaArgArgThrGlyGlnPro195200205LeuLysGluAspProSerAlaValProValPheSerValAspTyrGly210215220GluLeuAspPheGlnTrpArgGluLysThrProGluProProValPro225230235240CysValProGluGlnThrGluTyrAlaThrIleValPheProSerGly245250255MetGlyThrSerSerProAlaArgArgGlySerAlaAspGlyProArg260265270SerAlaGlnProLeuArgProGluAspGlyHisCysSerTrpProLeu2752802852113PRT智人MISC_FEATURE(1)..(113)抗-PD-1抗體mAb1重鏈可變區2GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuAspCysLysAlaSerGlyIleThrPheSerAsnSer202530GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleTrpTyrAspGlySerLysArgTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuPhe65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrAsnAspAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSer100105110Ser3107PRT智人MISC_FEATURE(1)..(107)抗-PD-1抗體mAb1輕鏈可變區3GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnSerSerAsnTrpProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys1001054120PRT人工序列人源化的抗-PD-1抗體mAb2重鏈可變區4GlnValGlnLeuValGlnSerGlyValGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530TyrMetTyrTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleAsnProSerAsnGlyGlyThrAsnPheAsnGluLysPhe505560LysAsnArgValThrLeuThrThrAspSerSerThrThrThrAlaTyr65707580MetGluLeuLysSerLeuGlnPheAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgArgAspTyrArgPheAspMetGlyPheAspTyrTrpGlyGln100105110GlyThrThrValThrValSerSer1151205111PRT人工序列人源化的抗-PD-1抗體mAb2輕鏈可變區5GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerLysGlyValSerThrSer202530GlyTyrSerTyrLeuHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaPro354045ArgLeuLeuIleTyrLeuAlaSerTyrLeuGluSerGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580SerLeuGluProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnHisSerArg859095AspLeuProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys1001051106121PRT小家鼠6GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaLysProGlyAla151015SerValGlnMetSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheThrSerSer202530TrpIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTyrIleTyrProSerThrGlyPheThrGluTyrAsnGlnLysPhe505560LysAspLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTrpArgAspSerSerGlyTyrHisAlaMetAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrSerValThrValSerSer1151207111PRT小家鼠MISC_FEATURE(1)..(111)抗-PD-1抗體mAb3輕鏈可變區7AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuThrValSerLeuGly151015GlnArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGlnSerValSerThrSer202530GlyTyrSerTyrMetHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleLysPheGlySerAsnLeuGluSerGlyIleProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuAsnIleHis65707580ProValGluGluGluAspThrAlaThrTyrTyrCysGlnHisSerTrp859095GluIleProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys1001051108117PRT人工序列人源化的抗-PD-1抗體mAb4重鏈可變區8GlnValGlnLeuValGlnSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015SerValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGlnTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrAspSerGlyGluSerThrTyrAlaGluGluPhe505560LysGlyArgPheValPheSerLeuAspThrSerValAsnThrAlaTyr65707580LeuGlnIleThrSerLeuThrAlaGluAspThrGlyMetTyrPheCys859095ValArgValGlyTyrAspAlaLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSer1159106PRT人工序列人源化的抗-PD-1抗體mAb4輕鏈可變區9GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysSerAlaArgSerSerValSerTyrMet202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuTrpIleTyr354045ArgThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrSerTyrCysLeuThrIleAsnSerLeuGlnProGlu65707580AspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgSerSerPheProLeuThr859095PheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys10010510525PRT智人MISC_FEATURE(1)..(525)人LAG3(CD223)蛋白質，包括信號序列10MetTrpGluAlaGlnPheLeuGlyLeuLeuPheLeuGlnProLeuTrp151015ValAlaProValLysProLeuGlnProGlyAlaGluValProValVal202530TrpAlaGlnGluGlyAlaProAlaGlnLeuProCysSerProThrIle354045ProLeuGlnAspLeuSerLeuLeuArgArgAlaGlyValThrTrpGln505560HisGlnProAspSerGlyProProAlaAlaAlaProGlyHisProLeu65707580AlaProGlyProHisProAlaAlaProSerSerTrpGlyProArgPro859095ArgArgTyrThrValLeuSerValGlyProGlyGlyLeuArgSerGly100105110ArgLeuProLeuGlnProArgValGlnLeuAspGluArgGlyArgGln115120125ArgGlyAspPheSerLeuTrpLeuArgProAlaArgArgAlaAspAla130135140GlyGluTyrArgAlaAlaValHisLeuArgAspArgAlaLeuSerCys145150155160ArgLeuArgLeuArgLeuGlyGlnAlaSerMetThrAlaSerProPro165170175GlySerLeuArgAlaSerAspTrpValIleLeuAsnCysSerPheSer180185190ArgProAspArgProAlaSerValHisTrpPheArgAsnArgGlyGln195200205GlyArgValProValArgGluSerProHisHisHisLeuAlaGluSer210215220PheLeuPheLeuProGlnValSerProMetAspSerGlyProTrpGly225230235240CysIleLeuThrTyrArgAspGlyPheAsnValSerIleMetTyrAsn245250255LeuThrValLeuGlyLeuGluProProThrProLeuThrValTyrAla260265270GlyAlaGlySerArgValGlyLeuProCysArgLeuProAlaGlyVal275280285GlyThrArgSerPheLeuThrAlaLysTrpThrProProGlyGlyGly290295300ProAspLeuLeuValThrGlyAspAsnGlyAspPheThrLeuArgLeu305310315320GluAspValSerGlnAlaGlnAlaGlyThrTyrThrCysHisIleHis325330335LeuGlnGluGlnGlnLeuAsnAlaThrValThrLeuAlaIleIleThr340345350ValThrProLysSerPheGlySerProGlySerLeuGlyLysLeuLeu355360365CysGluValThrProValSerGlyGlnGluArgPheValTrpSerSer370375380LeuAspThrProSerGlnArgSerPheSerGlyProTrpLeuGluAla385390395400GlnGluAlaGlnLeuLeuSerGlnProTrpGlnCysGlnLeuTyrGln405410415GlyGluArgLeuLeuGlyAlaAlaValTyrPheThrGluLeuSerSer420425430ProGlyAlaGlnArgSerGlyArgAlaProGlyAlaLeuProAlaGly435440445HisLeuLeuLeuPheLeuIleLeuGlyValLeuSerLeuLeuLeuLeu450455460ValThrGlyAlaPheGlyPheHisLeuTrpArgArgGlnTrpArgPro465470475480ArgArgPheSerAlaLeuGluGlnGlyIleHisProProGlnAlaGln485490495SerLysIleGluGluLeuGluGlnGluProGluProGluProGluPro500505510GluProGluProGluProGluProGluProGluGlnLeu51552052511120PRT智人MISC_FEATURE(1)..(120)抗-LAG-3抗體mAb1重鏈可變區11GlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLysProSerGlu151015ThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPheSerAspTyr202530TyrTrpAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAsnHisAsnGlyAsnThrAsnSerAsnProSerLeuLys505560SerArgValThrLeuSerLeuAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeu65707580LysLeuArgSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095PheGlyTyrSerAspTyrGluTyrAsnTrpPheAspProTrpGlyGln100105110GlyThrLeuValThrValSerSer11512012107PRT智人MOD_RES(1)..(107)抗-LAG-3抗體mAb1輕鏈可變區12GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnArgSerAsnTrpProLeu859095ThrPheGlyGlnGlyThrAsnLeuGluIleLys100105138PRT人工序列接頭113GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly151428PRT人工序列E-螺旋異源二聚體促進結構域14GluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGluVal151015AlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys20251528PRT人工序列K-螺旋異源二聚體促進結構域15LysValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLysVal151015AlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu20251628PRT人工序列包含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體促進結構域16GluValAlaAlaCysGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGluVal151015AlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys20251728PRT人工序列包含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體促進結構域17LysValAlaAlaCysLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLysVal151015AlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu2025186PRT人工序列包含半胱氨酸的間隔肽18GlyGlyCysGlyGlyGly151910PRT人工序列包含半胱氨酸的接頭肽19AspLysThrHisThrCysProProCysPro15102015PRT人工序列可選的包含半胱氨酸的接頭肽20LeuGluProLysSerAlaAspLysThrHisThrCysProProCys15101521218PRT智人MISC_FEATURE(1)..(218)IgG1Fc區21ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys21021522218PRT人工序列"攜帶杵的"IgG1CH2-CH3結構域22ProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys21021523218PRT人工序列"攜帶臼的"IgG1CH2-CH3結構域23ProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuValSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnArgTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys21021524217PRT人工序列IgG1Fc區L234A/L235A變體24ProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro151015LysProLysAspThrLeuTyrIleThrArgGluProGluValThrCys202530ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp354045TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu505560GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu65707580HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn859095LysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGly100105110GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu115120125MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr130135140ProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn145150155160AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe165170175LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn180185190ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr195200205GlnLysSerLeuSerLeuSerProGly21021525494PRT人工序列示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1雙抗體的第一和第三多肽鏈25GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnArgSerAsnTrpProLeu859095ThrPheGlyGlnGlyThrAsnLeuGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGln115120125ProGlyArgSerLeuArgLeuAspCysLysAlaSerGlyIleThrPhe130135140SerAsnSerGlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpValAlaValIleTrpTyrAspGlySerLysArgTyrTyrAla165170175AspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsn180185190ThrLeuPheLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal195200205TyrTyrCysAlaThrAsnAspAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuVal210215220ThrValSerSerGlyGlyCysGlyGlyGlyGluValAlaAlaCysGlu225230235240LysGluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGlu245250255ValAlaAlaLeuGluLysLeuGluProLysSerAlaAspLysThrHis260265270ThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerVal275280285PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuTyrIleThrArgGlu290295300ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu305310315320ValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys325330335ThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer340345350ValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys355360365CysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIle370375380SerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro385390395400ProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu405410415ValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn420425430GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer435440445AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg450455460TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu465470475480HisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGly485490261482DNA人工序列編碼示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1雙抗體的第一和第三多肽鏈的多核苷酸26gaaattgtcctgacacagtctcccgcaaccctgagtttgagtcctggggagcgagcaact60ctctcctgccgagcctcccagagtatctcctcctacctcgcctggtaccaacagaagcca120gggcaggctccaaggctgcttatctatgacgcctctaaccgcgcaactgggattcccgca180cgcttctccggctctggttccggcacagactttacacttactatctctagcctggagcca240gaagactttgccgtgtactattgtcagcaacgttccaattggccccttacctttgggcag300ggcactaacttggaaatcaaaggtggcggatccggcggcggaggccaggttcagctggtc360gagagtggtggcggcgttgtgcaacctgggcgttccctccgattggactgtaaagcttcc420ggcattactttctcaaattccggcatgcattgggtgaggcaagcccctggaaaagggctc480gaatgggtggctgtgatttggtacgatggcagcaaacggtactacgccgattctgttaag540ggccgctttaccatctcccgcgataactcaaagaacacactgtttctgcaaatgaatagt600cttagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgccacaaatgacgattattgggggcag660ggcacattggtcacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcatgtgag720aaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctg780gagaaactggagcccaaatctgctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacct840gaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctctat900atcacccgggagcctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag960gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgg1020gaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggac1080tggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatc1140gagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc1200ccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc1260tatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaag1320accacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg1380gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg1440cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt148227269PRT人工序列示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1雙抗體的第二和第四多肽鏈27GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnSerSerAsnTrpProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLys115120125ProSerGluThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPhe130135140SerAspTyrTyrTrpAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpIleGlyGluIleAsnHisAsnGlyAsnThrAsnSerAsnPro165170175SerLeuLysSerArgValThrLeuSerLeuAspThrSerLysAsnGln180185190PheSerLeuLysLeuArgSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyr195200205TyrCysAlaPheGlyTyrSerAspTyrGluTyrAsnTrpPheAspPro210215220TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyCysGlyGly225230235240GlyLysValAlaAlaCysLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLys245250255ValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu26026528807DNA人工序列編碼示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-1雙抗體的第二和第四多肽鏈的多核苷酸28gagatcgtacttacccagtctcccgccaccctttccctgagtcctggtgagcgggccact60ctttcctgtcgcgcaagccaatcagtttctagctacctcgcatggtatcagcagaagcca120gggcaggcacccaggcttctcatctatgacgccagtaaccgcgcaaccgggatacctgct180agattttccggcagtggatctgggaccgatttcacactgacaatttcatccttggaacca240gaagatttcgcagtctactactgccagcaatcttccaactggccaagaactttcggacag300gggaccaaagtggaaattaaaggtggcggatccggcggcggaggccaggtccagctccag360caatggggagccgggctgctgaaaccctctgaaacactgagtctcacatgtgccgtttat420ggaggttccttctccgattattactggaactggattcgtcagcctcccggcaagggcctg480gagtggatcggtgagattaaccacaatggcaataccaatagcaatcctagtttgaaatct540cgcgtcactctttccctcgatacaagcaaaaaccagttttctttgaaattgcgatctgta600actgctgctgatactgccgtgtattactgcgcattcggctactccgactatgaatataat660tggttcgatccttggggacagggaacattggtaaccgtgtcatccggaggatgtggcggt720ggaaaagtggccgcatgtaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcactt780aaggaaaaggtcgcagccctgaaagag80729501PRT人工序列示例性PD-1xLAG-3Fc-DART-2雙抗體的第一和第三多肽鏈29GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnSerSerAsnTrpProArg859095ThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlyGlnValGlnLeuGlnGlnTrpGlyAlaGlyLeuLeuLys115120125ProSerGluThrLeuSerLeuThrCysAlaValTyrGlyGlySerPhe130135140SerAspTyrTyrTrpAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeu145150155160GluTrpIleGlyGluIleAsnHisAsnGlyAsnThrAsnSerAsnPro165170175SerLeuLysSerArgValThrLeuSerLeuAspThrSerLysAsnGln180185190PheSerLeuLysLeuArgSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyr195200205TyrCysAlaPheGlyTyrSerAspTyrGluTyrAsnTrpPheAspPro210215220TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyCysGlyGly225230235240GlyGluValAlaAlaCysGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGlu245250255ValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysLeuGluPro260265270LysSerAlaAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGlu275280285AlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp290295300ThrLeuTyrIleThrArgGluProGluValThrCysValValValAsp305310315320ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly325330335ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn340345350SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp355360365LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuPro370375380AlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu385390395400ProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn405410415GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle420425430AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr435440445ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys450455460LeuThrValAspLysSerArgTrpG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