一種治療耳聾耳鳴的中藥組合物及其製備方法

2023-05-26 08:02:21 1

專利名稱：一種治療耳聾耳鳴的中藥組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物及其製備方法和質量控制方法，特別涉及一種治療耳聾耳鳴的藥物組合物及其製備方法和質量控制方法。
背景技術：
感音神經性耳聾是一類較為常見的疾病，其基本臨床特徵為氣導、骨導聽力同時下降，病變位於耳蝸、聽神經或中樞。據病因可分為先天性耳聾、遺傳性耳聾、老年性聾、感染性耳聾、中毒性耳聾、突發性耳聾、噪聲性耳聾等多種類型。其中以藥物中毒性耳聾、突發性耳聾、老年性聾發病率最高。該病發病率逐年有所增加，1萬人中約有10.7人發病，佔耳鼻咽喉科初診病例的2％，兩耳發病率約佔4％，其中一半兩耳同時發病。也有報告感音神經性耳聾發病率高達17％者，且性別、左右側發病率無明顯差異，有隨年齡增加發病率增加的趨勢，患病年齡在40歲或40歲以上者約佔3/4。
老年性聾一般是雙耳對稱性漸進性的聽力下降，精神倦怠，勞累時聽力更差，同時常伴有雙耳高調耳鳴等，對高聲吵鬧十分煩躁。該病患者與周圍環境交往困難，由此引起的思想壓力和不良的精神狀態往往使其感到自卑和孤獨。所以研發針對老年性聾的無毒副作用、能改善臨床症狀、價格低廉的治療藥物有較大市場價值，且在保障老年身體健康、提高老人生活質量、解決日益增長的老年問題等方面有著較大的社會意義。

發明內容
本發明目的在於提供一種治療耳聾耳鳴的藥物組合物及其製備方法，本發明另一目的在於提供該藥物組合物製劑的質量控制方法。
本發明目的是通過如下技術方案實現本發明是通過如下原料組成丹參1450-1550重量份骨碎補950-1050重量份石菖蒲450-550重量份人工麝香1-2重量份上述原料藥的最佳配比如下
丹參1450重量份 骨碎補1050重量份石菖蒲450重量份 人工麝香2重量份上述原料藥的最佳配比如下丹參1550重量份 骨碎補950重量份石菖蒲550重量份 人工麝香1重量份上述原料藥的最佳配比如下丹參1500重量份 骨碎補1000重量份石菖蒲500重量份 人工麝香1.5重量份上述藥物組合物能夠製成片劑、軟膠囊劑、膠囊劑、緩釋劑、顆粒劑、滴丸劑、口服液體製劑或凍乾粉針劑等各種劑型。
本發明具體製備工藝如下以上四味，取丹參、骨碎補加50-80％乙醇加熱回流提取三次，第一次加6-9倍藥材量，提取1-2小時；第二次加4-7倍藥材量，提取0.5-1.5小時；第三次加3-5倍藥材量，提取20-50分鐘，合併藥液，濾過，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度約60℃時為1.10的清膏，備用；石菖蒲加8-12倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮髮油5-8小時，收集揮髮油，藥液濾過，濾液備用；所得揮髮油用7-9倍量β-環糊精，加入13-17倍量於β-環糊精的水，室溫超聲包合30-50分鐘，抽濾，40℃乾燥3-5小時，研磨，過100目篩，備用；石菖蒲藥渣合併丹參、骨碎補醇提後藥渣，加水煎煮1-3次，每次加6-10倍藥材量，提取0.5-1.5小時，合併煎液，濾過，濾液以4000r/min速度離心，取上清液減壓濃縮至相對密度60℃時為1.10-1.15的清膏；合併以上兩種清膏，在進風溫度170～180℃，出風溫度90～100℃的條件下噴霧乾燥；收集幹浸膏粉末，再加入原料人工麝香、及輔料糊精50-60重量份、β-環糊精包合物和蛋白糖15-25重量份，混勻，加常規輔料製成各種劑型。
本發明的質量控制方法包括鑑別方法和/或含量測定方法，其中鑑別方法包括如下方法中一種或幾種A.取本藥物組合物製劑日服用劑量的3/10，研細，加30～60℃的石油醚45-55ml，超聲提取20-40分鐘，濾過，濾液揮幹，殘渣加乙醚1ml使溶解，作為供試品溶液；另取丹參對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液；再取丹參酮IIA對照品，加乙醚製成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以17-19:1-3的苯-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾乾；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點；B.取本藥物組合物製劑日服用劑量的1/2，研細，加60～90℃石油醚45-55ml，振蕩數分鐘後超聲20-40分鐘，濾過，濾液揮幹石油醚，殘渣加60～90℃的石油醚2ml溶解，作為供試品溶液；另取石菖蒲對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以6-9:1-4的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾乾，置365nm的紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點；C.取本藥物組合物製劑日服用劑量的2倍，研細，加乙醚45-55ml，浸泡過夜，超聲處理10-20分鐘，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液；另取麝香酮對照品加乙醚製成每ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液；照氣相色譜法試驗，柱長為2m，以50％苯基甲基矽酮為固定相，塗布濃度為2％，柱溫為210℃；分別取對照品溶液和供試品溶液適量，注入氣相色譜儀；供試品應呈現與對照品保留時間相同的色譜峰。
質量控制方法中的含量測定方法如下色譜條件與系統適用性用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，4-5:160:1-2的乙腈-水-醋酸為流動相；檢測波長為200-400nm；理論板數按丹參素鈉峰計算應不低於3000；對照品溶液的製備取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，即得；供試品溶液的製備取本藥物組合物製劑日服用劑量的3％，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60％甲醇25ml，稱定重量，密塞，超聲或回流提取10-40分鐘，放置至室溫後補足重量，搖勻，濾過，收集續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入色譜儀，測定，即得；
本藥物組合物製劑按每日服用劑量計，含丹參素以丹參素鈉C9H9O5Na不得少於60.0mg。
本發明每日服用製劑相當於原生藥量28.5-31.52g。
方中丹參為君藥，其性苦、寒，《本草經疏》謂之入手足少陰、足厥陰，是心、脾、肝、腎、血分之藥。具活血調血、祛瘀止痛、涼血消腫、養血安神益氣功效。本方用丹參不僅取其活血化瘀之功，且因其性苦寒，還能抑制石菖蒲和麝香溫燥之性。骨碎補為臣藥，輔助丹參，發揮補腎功效。其性味苦溫，入肝腎經。功能活血、補腎、止血。《本草匯言》中載以骨碎補為主藥組方治「腎虛耳鳴耳聾，並牙齒浮動，疼痛難忍」。本方中應用骨碎補與丹參合用共奏活血祛瘀之功。綜上，四味藥相輔相成、緊扣病機，以現代劑型製成治療腎虛血瘀型老年性聾的藥物，不論從中醫傳統理論還是從現代藥理研究來講都具可行性。
本發明藥物組合物的製備方法經過分離與純化工藝研究、濃縮與乾燥工藝研究、輔料的篩選、製劑處方量的確定、製劑成型工藝研究等試驗，其中在β-環糊精包裹揮髮油工藝研究中，β-CD與油的比例、加水量、超聲時間為影響包合的主要因素，對每個因素，各取三個水平，進行正交試驗，最佳工藝為1ml揮髮油與8克β-環糊精，加200ml水，包合40分鐘。據此條件，驗證三次，包合率均值為85.40％，收得率均值為86.86％，與正交試驗結果基本符合，說明揮髮油的包合工藝條件穩定，具有重現性。
在質量控制方法的鑑別方法中鑑別A為丹參的薄層鑑別，選用苯-乙酸乙酯(19∶1)或石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8∶3)為展開劑；試驗結果前一種展開系統所得色譜圖中的特徵斑點更明顯，Rf值更為適中，且供試品色譜中，均檢出丹參的主要特徵斑點，且陰性無幹擾；鑑別B為石菖蒲的薄層鑑別，選用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)或正己烷-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視。試驗結果前一種展開系統所得色譜圖中的特徵斑點更明顯，Rf值更為適中，且供試品色譜中，均檢出石菖蒲的主要特徵斑點，且陰性無幹擾；鑑別C為人工麝香的氣相色譜鑑別。麝香酮是人工麝香中的主要有效成分。資料顯示麝香酮的檢測方法有薄層色譜法和氣相色譜法，根據實驗結果制定了本法。根據麝香酮的溶解性及極性，同時為消除其它組分幹擾，該方法中供試品溶液的製備選用乙醚為溶劑。實驗結果顯示，供試品呈現與對照品保留時間相同的色譜峰，且陰性無幹擾，經多次驗證，表明切實可行。
本藥物組合物具補腎化瘀，通竅聰耳功效，主要用於治療老年性耳聾、耳鳴或對抗藥物性耳聾、耳鳴引起的聽力下降、耳鳴，或伴有腰痛乏力等症。用正常動物和疾病動物模型進行了補腎、化瘀及治療耳聾的作用研究，結果證明1.實驗性衰老豚鼠經本藥物組合物14.56g原藥/kg/日、7.28g原藥/kg/日、3.647g原藥/kg/日治療後，衰老豚鼠的聽力有所提高，其ABR值明顯下降。與D-半乳糖衰老模型組相比有顯著差異(P＜0.01，P＜0.05)，顯示本藥物組合物有治療因D-半乳糖造成豚鼠衰老和聽力下降的作用。同時本藥物組合物大、中劑量可使豚鼠的SOD活力明顯升高，與D-半乳糖衰老模型組相比有顯著差異(P＜0.05)，並使MDA明顯降低，與D-半乳糖衰老模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。說明本藥物組合物有一定對抗D-半乳糖造成豚鼠衰老的作用。2.本藥物組合物大劑量組豚鼠在連續40天肌注硫酸慶大黴素的同時，以14.56g原藥/kg/日劑量進行預防治療，結果其ABR值升高受到抑制，與模型組豚鼠的ABR值相比顯著降低(P＜0.05)。表明本藥物組合物對慶大黴素引起的動物聽力下降有明顯預防作用。3.本藥物組合物大、中劑量能使實驗性「血瘀」大鼠的全血粘度、血漿粘度和纖維蛋白原顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。本藥物組合物的小劑量能使「血瘀」型大鼠的全血粘度(高切、中切)明顯降低、並能明顯降低大鼠的紅細胞壓積(P＜0.05)。同時本藥物組合物大、中劑量14.56克原藥/公斤、7.28克原藥/公斤可明顯減輕大鼠體外循環聚乙烯管中手術線血栓溼重。表明有一定的活血化瘀作用。4.本藥物組合物大劑量組能顯著增加腎陽虛大鼠的體重及包皮腺臟器指數、睪丸指數、前列腺+精液囊指數，與模型組相比(P＜0.05)，中劑量也能顯著增加前列腺+精液囊指數(P＜0.05)；本藥物組合物大，中劑量與模型組相比，可顯著縮短去勢大鼠的陰莖受刺激勃起潛伏期(P＜0.01)，證明本藥物組合物有一定補腎作用。實驗證明，本藥物組合物製劑具有對抗衰老造成的耳聾、耳鳴或對抗藥物性耳聾、耳鳴的作用。同時有活血化瘀、補腎的作用。
下面實驗例用於進一步說明但不限於本發明。
實驗例1石菖蒲揮髮油提取工藝的研究試驗在揮髮油提取過程中，加水量和提取時間是影響提油量的主要因素。故採用單因素考察法，對石菖蒲揮髮油提取中水量和提取時間進行考察。
稱取三份石菖蒲藥材，每份均為100g，加水量分別為藥材量的8倍，10倍，12倍，在相同條件下提取揮髮油，測定1至8小時提取的揮髮油量，結果見表1。
表1 加水量對揮髮油收得量的影響

注揮髮油收得量單位為ml。
從上表可見，在相同條件下，加10倍量水所提揮髮油的量比8倍及12倍均大。故選擇加水量為藥材的10倍。同時，提取6小時後，其揮髮油基本提取完全。因此選擇提取時間為6小時。
由以上試驗結果可知，石菖蒲100g加水10倍量，水蒸氣蒸餾法提取6小時，揮髮油收油量約1.20ml。
實驗例2丹參與骨碎補醇提工藝的考察試驗乙醇回流提取的主要影響因素有乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數，對每個因素，各取三個水平，按L9(34)正交表安排試驗。表頭設計見表2。稱取丹參120g，骨碎補80g，按所設正交試驗條件提取。藥液用400目濾布過濾，分別定容至相應量。
指標及測定方法本藥物組合物製劑的提取工藝中，丹參酮IIA含量是衡量醇提工藝效果的重要指標，丹參酮IIA含量越高，提取效果越好，可作為醇提工藝篩選的主要指標，權重係數定為0.6；但幹膏收率作為選擇劑型的參考指標，影響除雜方法的選擇，是顆粒劑日服量、單服量及包裝規格確定的重要參數。因此，必須以幹膏收率作為評價指標之一，但其與療效強度不成量效關係，故綜合評價時權重係數應較小，以0.4為宜。照高效液相色譜法測定丹參酮IIA和幹膏收率。
表2 醇提工藝的因素水平表

表3 醇提工藝條件的正交試驗表

表4 水煎工藝因素水平表

經方差分析可見，影響提取效果的順序為提取次數＞提取時間＞醇濃度＞加醇量，最佳醇提工藝條件為A3B1C3D3，提取次數對醇提工藝有顯著影響，醇濃度及提取時間無顯著影響。從節約生產成本考慮，故調整工藝條件為A2B1C2D3，即加6倍量的65％乙醇，提取3次，每次1.0小時，其中第一次加8倍量，提取1.5小時；第二次加6倍量，提取1小時；第三次加4倍量，提取0.5小時。
以此條件，驗證三次，幹膏收率均值為24.15％，丹參酮IIA含量均值為1.480mg/g，說明提取工藝條件基本穩定，具重現性。根據丹參藥材中丹參酮IIA含量為2.027mg/g，可以計算出丹參藥材乙醇提取轉移率為73.01％。實驗例3醇提後藥渣與石菖蒲藥渣共水煎煮工藝考察試驗水煎煮提取的主要影響因素有加水量、煎煮時間、煎煮次數三個因素，對每個因素各選三個水平，按L9(34)正交表安排試驗。稱取120g丹參與80g骨碎補，醇提後藥渣加入石菖蒲40g(提油後)藥渣，按正交試驗條件進行水煎煮提取，藥液以400目濾布濾過，收集濾液，濃縮並定容至相應量。
指標及測定方法照高效液相色譜法測定丹參素和幹膏收率結果經方差分析，影響提取效果的因素順序為煎煮時間＞加水量＞煎煮次數。煎煮時間對提取效果有顯著影響，煎煮次數與加水量無顯著影響，考慮節約時間和能源，便於生產操作，較佳提取工藝為A1B2C2，即煎煮2次，每次加10倍量的水，提取1.0小時。
以此條件，驗證三次，結果乾膏收率均值為10.71％，丹參素含量均值為5.1810mg/g，與正交試驗結果基本符合，說明提取工藝條件基本穩定，具重現性。根據丹參藥材中丹參素含量為7.5237mg/g，可以計算出丹參藥材的水提轉移率為68.68％。
實驗例4丹參含量測定的研究試驗本藥物組合物的君藥為丹參，丹參素為丹參的主要有效成分。為了控制實施例1顆粒劑內容物質量，選擇丹參素作為控制實施例1顆粒劑內容物質量的指標成分。
測定波長的選擇精密稱取丹參素鈉對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，即得對照品溶液。以甲醇為空白，對照品溶液在200～400nm波長掃描，在280nm處有最大吸收。故選擇280nm作為測定波長；流動相的選擇研究中選擇了流動相①甲醇-0.5％冰醋酸(20∶80)②乙腈-水-冰醋酸(5∶160∶1)，③甲醇-0.5％冰醋酸(12∶88)。在①、③條件下，丹參素鈉保留時間均太短，分離不好；在②條件下，丹參素鈉分離較好，大於1.5，理論塔板數按丹參素鈉峰計算不低於3000，出峰時間(t＝11.998min)合適，陰性無幹擾，故選用乙腈-水-冰醋酸(5∶160∶1)為流動相。
線性範圍的考察，試驗結果表明，在0.28～1.40μg範圍內，丹參素峰面積與進樣量有良好的線性關係。
實驗例5質量控制方法中含量測定的提取溶劑考察試驗取本藥物組合物製劑(顆粒劑)數袋，研細，取3份，每份約0.3克，分別加入70％乙醇，甲醇，60％甲醇25ml，稱定重量，超聲提取30分鐘，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，離心，上清液作為供試品溶液。按上述色譜條件，精密吸取對照品溶液(0.084mg/ml)及供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積值。計算每克樣品中丹參素的含量，結果見表6表6 不同提取溶劑中丹參素的含量

試驗結果表明，60％甲醇作提取溶劑比70％乙醇作溶劑分離效果好，比甲醇提取完全，因此選擇60％甲醇作提取溶劑。
實驗例6質量控制中含量測定供試品溶液的提取方法的考察取本藥物組合物製劑(顆粒劑)約0.35克，2份，精密稱定，加入60％甲醇25ml，稱定重量，分別回流，超聲提取30分鐘，放冷，稱定重量，以60％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，為供試品溶液。按上述色譜條件，精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀記錄峰面積值。計算每克樣品中丹參素的含量，結果如表7
表7 不同提取方法中丹參素含量

結果表明，回流與超聲提取對丹參素含量影響不大，故選擇操作簡便易行的超聲提取法。
實驗例7質量控制中含量測定供試品溶液的提取時間的考察取本藥物組合物製劑(顆粒劑)約0.33克，4份，精密稱定，加入60％甲醇25ml，稱定重量，分別超聲提取10，20，30，40分鐘，放冷，稱定重量，以60％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，離心，上清液作為供試品溶液。按上述色譜條件，精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀記錄峰面積值。計算每克樣品丹參素的含量，結果見表8表8 不同提取時間的丹參素含量

結果表明，丹參素含量隨提取時間而增加，當提取30分鐘時已近提取完全。故確定超聲提取時間為30分鐘。
實驗例8本藥物組合物顆粒劑對實驗性衰老豚鼠聽力的作用D-半乳糖模型組豚鼠在連續40天皮下注射D-半乳糖50mg/kg/日後，造成其ABR值明顯升高，說明對豚鼠聽力造成了一定影響。而分別用本藥物組合物顆粒劑10.4g原藥/kg/日、5.2g原藥/kg/日、2.6g原藥/kg/日治療後，本藥物組合物顆粒劑大、中、小劑量組豚鼠的聽力有所提高，其ABR值也明顯下降。與D-半乳糖組相比有顯著差異(P＜0.01，P＜0.05)，顯示本藥物組合物顆粒劑有治療因D-半乳糖造成豚鼠衰老和聽力下降的作用。
表9 本藥物組合物顆粒劑對實驗性衰老豚鼠ABR閾值的影響(x±S)

注與模型組相比「*」P＜0.05；「**」P＜0.01；「***」P＜0.001；模型組豚鼠SOD活力有所下降，MDA升高，說明D-半乳糖造成了豚鼠的衰老，而本藥物組合物顆粒劑能升高SOD活力，降低MDA，尤其本藥物組合物顆粒劑大、中劑量組豚鼠的SOD活力明顯升高，與D-半乳糖衰老模型組相比有顯著差異(P＜0.05)；本藥物組合物顆粒劑大、中、小劑量可使MDA明顯降低，與D-半乳糖衰老模型組相比有顯著性差異(P＜0.001)。說明本藥物組合物顆粒劑有一定對抗D-半乳糖造成豚鼠衰老的作用。
表10 對實驗性老年性耳聾豚鼠SOD和MDA含量的影響(x±S)

注與模型組相比「*」P＜0.05；「**」P＜0.01；「***」P＜0.001；實驗例9本藥物組合物顆粒劑對「血瘀」大鼠血液流變學的影響取健康老年大鼠，雌雄各半，體重(440～480)g，隨機分為6組，隨機分為正常對照組、血瘀模型組、複方丹參對照組和本藥物組合物顆粒劑高、中、低劑量組，每組10隻。本藥物組合物顆粒劑高、中、低劑量組每日灌服本藥物組合物顆粒劑混懸液1ml/100gBW。其高、中、低劑量分別為12.48g原藥/kg/日、6.24g原藥/kg/日、3.12g原藥/kg/日。複方丹參陽性藥物對照組豚鼠灌服同體積的複方丹參7.28g原藥/kg/日。正常對照組、血瘀模型組灌服同體積的自來水。ig每天1次，連續給藥7d。除正常對照組外，各組大鼠於末次給藥1h後sc 0.8mg/kg/日腎上腺素注射液，間隔6h後再注射1次，其間將大鼠放入冰水刺激5min，禁食。於次日晨所有各組大鼠用10％烏拉坦ip麻醉，頸動脈採血4mL，加入肝素抗凝管中，測定全血比粘度(高切)、全血比粘度(中切)、全血比粘度(低切)、血漿粘度、紅細胞壓積、纖維蛋白原等流變學指標。結果見表11。
表11 對「血瘀」大鼠血液流變學指標的影響(x±S)

與對照組相比「△」P＜0.05，「△△」P＜0.01；與模型組相比「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
表11 本藥物組合物顆粒劑對「血瘀」大鼠血液流變學指標的影響(x±S)

與對照組相比「△」P＜0.05，「△△」P＜0.01；與模型組相比「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
可以看出本藥物組合物顆粒劑大、中劑量能使實驗性「血瘀」型大鼠的全血粘度、血漿粘度、纖維蛋白原顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。本藥物組合物顆粒劑大劑量能使「血瘀」型大鼠的全血粘度(高切、中切)明顯降低、並使能明顯降低大鼠的紅細胞壓積(P＜0.05)。表明有一定的活血化瘀作用。
實驗例10本藥物組合物顆粒劑抗大鼠血栓實驗取健康老年大鼠，雌雄各半，體重(440～480)g，隨機分為正常對照組、複方丹參對照組和本藥物組合物顆粒劑高、中、低劑量組，每組10隻。本藥物組合物顆粒劑高、中、低劑量組每日灌服本藥物組合物顆粒劑混懸液1ml/100gBW。其高、中、低劑量分別為12.48g原藥/kg/日、6.24g原藥/kg/日、3.12g原藥/kg/日。複方丹參陽性藥物對照組豚鼠灌服同體積的複方丹參7.28g原藥/kg/日。正常對照組、血瘀模型組灌服同體積的自來水。ig每天1次，連續給藥7d。各組大鼠均每日灌胃給藥1次，連續7天，末次藥後30min，以10％烏拉坦1ml/100g腹腔麻醉，仰位固定於大鼠手術臺上，實施手術。彎剪剪去頸部位毛，正中切開頸部皮膚，鈍剝離分離右頸總動脈及左頸外靜脈，將事先充滿肝素生理鹽水(50U/ml)的聚乙烯管(分三段連結，在中段放人長6cm的4號手術線)的一端插入左頸外靜脈後，從聚乙烯管注入肝素50U/kg，夾住管壁，將右頸總動脈近心端以止血夾阻斷血流，眼科剪剪一「△」口，將聚乙烯管另一端插入右頸總動脈，結紮，5min後打開止血夾開放血流，血液從右頸總動脈經聚乙烯管返回左頸外靜脈，開放血流15min後，中斷血流，迅速取下聚乙烯管，取出手術線，分析天平稱重，以總重量減去線重即血栓溼重N。實驗結果表12。
表12 對大鼠體外血栓形成的影響(x±S)

與對照組相比「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
結果可以看出，老年大鼠在連續七天灌服本藥物組合物顆粒劑12.48克原藥/公斤、6.24克原藥/公斤後，可明顯減輕大鼠體外循環聚乙烯管中手術線血栓溼重。與生理鹽水正常對照組相比，本藥物組合物顆粒劑大、中劑量組大鼠血栓溼重明顯低於正常對照組大鼠，具有顯著性差異(P＜0.01、P＜0.05)。說明本藥物組合物顆粒劑大、中劑量有一定對抗老年大鼠血栓形成的作用。
實驗例11對腎陽虛大鼠的作用試驗雄性老年大鼠60隻，體重440～480克，隨機分為6組，分為空白對照組，腎陽虛模型組、本藥物組合物顆粒劑大、中、小劑量組，生力雄丸組，各給藥組按劑量灌胃給予藥物，空白對照組及腎陽虛模型組，給予同體積的蒸餾水，連續10日，第11日起除空白對照組外，皮下注射氫化可的松25毫克/公斤一日一次。在皮下注射氫化可的松的同時照常灌胃給藥，如此再連續10日，第21日處死大鼠，取包皮腺、睪丸、前列腺+精液囊、稱重、計算臟器指數。
表13 本藥物組合物顆粒劑對腎陽虛大鼠稱重的影響(x±S)

與對照組相比「△」P＜0.05，「△△」P＜0.01；與模型組相比「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
表14 對腎陽虛大鼠生殖系統臟器指數的影響(x±S)

與對照組相比「△」P＜0.05，「△△」P＜0.01；與模型組相比「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
本藥物組合物顆粒劑大、中劑量組與模型組相比能顯著增加腎陽虛大鼠的體重及包皮腺臟器指數、睪丸指數、前列腺+精液囊指數(P＜0.001，P＜0.01)，證明本藥物組合物顆粒劑有一定補腎作用。
實驗例12對去勢大鼠陰莖勃起功能作用試驗雄性大鼠經戊巴比妥鈉(0.6％，75毫克)麻醉後局部消毒，摘除雙側睪丸。術後三日，將50隻去勢大鼠分為5組。去勢大鼠模型組，每日灌餵蒸餾水0.5毫升/100克，本藥物組合物顆粒劑大、中、小劑量組按劑量經灌胃給藥的劑量為12.48克原藥/公斤，6.24克原藥/公斤，3.12克原藥/公斤，生力雄丸組的劑量為0.48克/公斤，給藥容積均為0.5毫升/100克，每日一次，連續給藥20日。此外，同期另設正常對照組，將10隻未去勢大鼠同期飼養並灌餵蒸餾水0.5毫升/100克。給藥後第21日將電刺激儀的電極放置於大鼠陰莖部位，施於局部電刺激，電流強度為5mA，記錄從刺激開始至陰莖勃起時間(勃起潛伏期)，結果進行統計學處理。
表15 對去勢大鼠陰莖勃起功能的影響(x±S)

與對照組相比「△」P＜0.05，「△△」P＜0.01；與模型組相比「*」P＜0.05，「**」P＜0.01。
可見本藥物組合物顆粒劑大，中劑量與模型組相比，可顯著縮短去勢大鼠的陰莖受刺激勃起潛伏期(P＜0.01，P＜0.05)，顯示該藥有一定壯陽作用。
具體實施例如下實施例1顆粒劑的製備丹參1500g骨碎補1000g 石菖蒲500g 人工麝香1.5g以上四味，取丹參，骨碎補加65％乙醇加熱回流提取三次，第一次加8倍藥材量，提取1.5小時；第二次加6倍藥材量，提取1小時；第三次加4倍藥材量，提取0.5小時，合併藥液，濾過，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度約為1.10(60℃)的清膏，備用；石菖蒲加10倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮髮油6小時，收集揮髮油，藥液濾過，濾液備用；所得揮髮油用8倍量β-環糊精(即48g)，加入15倍量於β-環糊精的水，室溫超聲包合40分鐘，抽濾，40℃乾燥4小時，研磨，過100目篩，備用；石菖蒲藥渣合併丹參、骨碎補醇提後藥渣，加水煎煮兩次，每次加10倍藥材量，提取1小時，合併煎液，濾過，濾液以4000r/min速度離心，取上清液減壓濃縮至相對密度約為1.10(60℃)的清膏；合併以上兩種清膏，在進風溫度170～180℃，出風溫度90～100℃的條件下噴霧乾燥；收集幹浸膏粉末，加入人工麝香、糊精53g、β-環糊精包合物和蛋白糖20g，混勻，在主壓力4.5～5.5MPa，側壓力0.25MPa的條件下幹法制粒，得乾燥顆粒，整粒，分裝，即得。
實施例2膠囊的製備取丹參1450g骨碎補1050g 石菖蒲450g 人工麝香2g製得的膠囊劑。每粒含內容物0.5g。口服，一次4粒，一日3次，耳聾、耳鳴患者服用，以8周為一療程。
實施例3片劑的製備取丹參1550g 骨碎補950g 石菖蒲550g 人工麝香1g製得的片劑，每片含內容物0.5g。口服，一次4片，一日3次。
實施例4口服溶液的製備取丹參1500g 骨碎補1000g 石菖蒲500g 人工麝香1.5g加入溶劑、矯味劑、乳化劑等輔料，製成口服溶液，每支10ml。耳聾、耳鳴患者服用，一次10ml，一日2次。
實施例5緩釋片的製備取丹參1550g骨碎補950g 石菖蒲550g 人工麝香1g加入輔料，製成緩釋片，每片0.4g。耳聾、耳鳴患者服用，一次1片，一日1次。
實施例6滴丸的製備取丹參1450g骨碎補1050g 石菖蒲450g人工麝香2g加入輔料，製成滴丸，每粒0.05g。耳聾、耳鳴患者服用，一次20粒，一日2次。
實施例7質量控制中的鑑別方法(1)取實施例1顆粒劑內容物3g，研細，加石油醚(30～60℃)50ml，超聲提取30分鐘，濾過，濾液揮幹，殘渣加乙醚1ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液。再取丹參酮IIA對照品，加乙醚製成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIB)試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點。
(2)取實施例1顆粒劑內容物5克，研細，加石油醚(60～90℃)50ml，振蕩數分鐘後超聲30分鐘，濾過，濾液揮幹石油醚，殘渣加石油醚(60～90℃)2ml溶解，作為供試品溶液。另取石菖蒲對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIB)試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
(3)取實施例1顆粒劑內容物20g，研細，加乙醚50ml，浸泡12小時，超聲處理15分鐘，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液。另取麝香酮對照品加乙醚製成每ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIE)試驗，柱長為2m，以50％苯基甲基矽酮(OV-17)為固定相，塗布濃度為2％，柱溫為210℃。分別取對照品溶液和供試品溶液適量，注入氣相色譜儀。供試品應呈現與對照品保留時間相同的色譜峰。
實施例8質量控制中的含量測定方法色譜條件與系統適用性用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，乙腈-水-醋酸(5∶160∶1)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數按丹參素鈉峰計算應不低於3000。
對照品溶液的製備取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供試品溶液的製備取實施例2膠囊劑內容物約0.3g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60％甲醇25ml，稱定重量，密塞，超聲提取30分鐘，放置至室溫後補足重量，搖勻，濾過，收集續濾液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入色譜儀，測定，即得。
本膠囊劑每克含丹參素以丹參素鈉(C9H9O5Na)計，不得少於12.0mg。
實施例9質量控制方法(1)取實施例3片劑2g，研細，加石油醚(30～60℃)50ml，超聲提取30分鐘，濾過，濾液揮幹，殘渣加乙醚1ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液。再取丹參酮IIA對照品，加乙醚製成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIB)試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點。
(2)取實施例3片劑3克，研細，加石油醚(60～90℃)50ml，振蕩數分鐘後超聲30分鐘，濾過，濾液揮幹石油醚，殘渣加石油醚(60～90℃)2ml溶解，作為供試品溶液。另取石菖蒲對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIB)試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
(3)取實施例3片劑12克，研細，加乙醚50ml，浸泡過夜，超聲處理15分鐘，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液。另取麝香酮對照品加乙醚製成每ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIE)試驗，柱長為2m，以50％苯基甲基矽酮(OV-17)為固定相，塗布濃度為2％，柱溫為210℃。分別取對照品溶液和供試品溶液適量，注入氣相色譜儀。供試品應呈現與對照品保留時間相同的色譜峰。
色譜條件與系統適用性用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，乙腈-水-醋酸(5∶160∶1)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數按丹參素鈉峰計算應不低於3000。
對照品溶液的製備取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供試品溶液的製備取實施例4口服溶液1ml，置具塞錐形瓶中，加入60％甲醇25ml，稱定重量，密塞，超聲提取30分鐘，放置至室溫後補足重量，搖勻，濾過，收集續濾液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入色譜儀，測定，即得。
實施例10口服溶液每1ml含丹參素以丹參素鈉(C9H9O5Na)計，不得少於3.8mg。
權利要求
1.一種治療耳聾耳鳴的藥物組合物，其特徵在於該藥物組合物是由如下原料藥按重量份製成丹 參1450-1550重量份骨碎補950-1050重量份石菖蒲450-550重量份 人工麝香1-2重量份。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於該藥物組合物是由如下原料藥按重量份製成丹 參1450重量份 骨碎補1050重量份石菖蒲450重量份 人工麝香2重量份。
3.如權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於該藥物組合物是由如下原料藥按重量份製成丹 參1550重量份 骨碎補950重量份石菖蒲550重量份 人工麝香1重量份。
4.如權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於該藥物組合物是由如下原料藥按重量份製成丹 參1500重量份 骨碎補1000重量份石菖蒲500重量份 人工麝香1.5重量份。
5.如權利要求1、2、3或4所述的藥物組合物，其特徵在於該組合物製成片劑、軟膠囊劑、膠囊劑、緩釋劑、顆粒劑、滴丸劑、口服液體製劑或凍乾粉針劑。
6.如權利要求5所述的藥物組合物製劑的製備方法，其特徵在於該方法包括以下步驟以上四味，取丹參、骨碎補加50-80％乙醇加熱回流提取三次，第一次加6-9倍藥材量，提取1-2小時；第二次加4-7倍藥材量，提取0.5-1.5小時；第三次加3-5倍藥材量，提取20-50分鐘，合併藥液，濾過，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度約60℃時為1.10的清膏，備用；石菖蒲加8-12倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮髮油5-8小時，收集揮髮油，藥液濾過，濾液備用；所得揮髮油用7-9倍量β-環糊精，加入13-17倍量於β-環糊精的水，室溫超聲包合30-50分鐘，抽濾，40℃乾燥3-5小時，研磨，過100目篩，備用；石菖蒲藥渣合併丹參、骨碎補醇提後藥渣，加水煎煮1-3次，每次加6-10倍藥材量，提取0.5-1.5小時，合併煎液，濾過，濾液以4000r/min速度離心，取上清液減壓濃縮至相對密度60℃時為1.10-1.15的清膏；合併以上兩種清膏，在進風溫度170～180℃，出風溫度90～100℃的條件下噴霧乾燥；收集幹浸膏粉末，加入人工麝香、糊精50-60重量份、β-環糊精包合物和蛋白糖15-25重量份，混勻，加常規輔料製成各種劑型。
7.如權利要求6所述的藥物組合物製劑的製備方法，其特徵在於該方法包括以下步驟以上四味，取丹參、骨碎補加65％乙醇加熱回流提取三次，第一次加8倍藥材量，提取1.5小時；第二次加6倍藥材量，提取1小時；第三次加4倍藥材量，提取0.5小時，合併藥液，濾過，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度約60℃時為1.10的清膏，備用；石菖蒲加10倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮髮油6小時，收集揮髮油，藥液濾過，濾液備用；所得揮髮油用8倍量β-環糊精，加入15倍量於β-環糊精的水，室溫超聲包合40分鐘，抽濾，40℃乾燥4小時，研磨，過100目篩，備用；石菖蒲藥渣合併丹參、骨碎補醇提後藥渣，加水煎煮2次，每次加10倍藥材量，提取1小時，合併煎液，濾過，濾液以4000r/min速度離心，取上清液減壓濃縮至相對密度60℃時為1.10-1.15的清膏；合併以上兩種清膏，在進風溫度170～180℃，出風溫度90～100℃的條件下噴霧乾燥；收集幹浸膏粉末，加入人工麝香、糊精53重量份、β-環糊精包合物和蛋白糖20重量份，混勻，在主壓力4.5～5.5MPa，側壓力0.25MPa的條件下幹法制粒，得乾燥顆粒，整粒，分裝，即得。
8.如權利要求5所述的藥物組合物的質量控制方法，其特徵在於該方法中的鑑別方法包括如下鑑別中的一種或幾種A.取本藥物組合物製劑日服用劑量的3/10，研細，加30～60℃的石油醚45-55ml，超聲提取20-40分鐘，濾過，濾液揮幹，殘渣加乙醚1ml使溶解，作為供試品溶液；另取丹參對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液；再取丹參酮IIA對照品，加乙醚製成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以17-19∶1-3的苯-醋酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾乾；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點；B.取本藥物組合物製劑日服用劑量的1/2，研細，加60～90℃石油醚45-55ml，振蕩數分鐘後超聲20-40分鐘，濾過，濾液揮幹石油醚，殘渣加60～90℃的石油醚2ml溶解，作為供試品溶液；另取石菖蒲對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以6-9∶1-4的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾乾，置365nm的紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點；C.取本藥物組合物製劑日服用劑量的2倍，研細，加乙醚45-55ml，浸泡12小時，超聲處理10-20分鐘，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液；另取麝香酮對照品加乙醚製成每ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液；照氣相色譜法試驗，柱長為2m，以50％苯基甲基矽酮為固定相，塗布濃度為2％，柱溫為210℃；分別取對照品溶液和供試品溶液適量，注入氣相色譜儀；供試品應呈現與對照品保留時間相同的色譜峰。
9.如權利要求8所述的藥物組合物的質量控制方法，其特徵在於該方法中的鑑別方法包括如下鑑別中的一種或幾種A.取本藥物組合物製劑日服用劑量的3/10，研細，加30～60℃的石油醚50ml，超聲提取30分鐘，濾過，濾液揮幹，殘渣加乙醚1ml使溶解，作為供試品溶液；另取丹參對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液；再取丹參酮IIA對照品，加乙醚製成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以19∶1的苯-醋酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾乾；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；與對照品色譜相應的位置上，顯相同的暗紅色斑點；B.取本藥物組合物製劑日服用劑量的1/2，研細，加60～90℃石油醚50ml，振蕩數分鐘後超聲30分鐘，濾過，濾液揮幹石油醚，殘渣加60～90℃的石油醚2ml溶解，作為供試品溶液；另取石菖蒲對照藥材1g，同法製成對照藥材溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各10ul，分別點於同一矽膠G薄層板上，以7∶3的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾乾，置365nm的紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點；C.取本藥物組合物製劑日服用劑量的2倍，研細，加乙醚50ml，浸泡12小時，超聲處理15分鐘，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液；另取麝香酮對照品加乙醚製成每ml含0.2mg的溶液，作為對照品溶液；照氣相色譜法試驗，柱長為2m，以50％苯基甲基矽酮為固定相，塗布濃度為2％，柱溫為210℃；分別取對照品溶液和供試品溶液適量，注入氣相色譜儀；供試品應呈現與對照品保留時間相同的色譜峰。
10.如權利要求8所述的藥物組合物的質量控制方法，其特徵在於該方法中還包括的含量測定為如下測定方法色譜條件與系統適用性用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，4-5∶160∶1-2的乙腈-水-醋酸為流動相；檢測波長為200-400nm；理論板數按丹參素鈉峰計算應不低於3000；對照品溶液的製備取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，即得；供試品溶液的製備取本藥物組合物製劑日服用劑量的3％，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60％甲醇25ml，稱定重量，密塞，超聲或回流提取10-40分鐘，放置至室溫後補足重量，搖勻，濾過，收集續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入色譜儀，測定，即得；本藥物組合物製劑按每日服用劑量計，含丹參素以丹參素鈉C9H9O5Na不得少於60.0mg。
11.如權利要求10所述的藥物組合物的質量控制方法，其特徵在於該方法中的含量測定為如下測定方法色譜條件與系統適用性用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，5∶160∶1的乙腈-水-醋酸為流動相；檢測波長為280nm；理論板數按丹參素鈉峰計算應不低於3000；對照品溶液的製備取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，即得；供試品溶液的製備取本藥物組合物製劑日服用劑量的3％，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60％甲醇25ml，稱定重量，密塞，超聲提取30分鐘，放置至室溫後補足重量，搖勻，濾過，收集續濾液，即得；測定法；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入色譜儀，測定，即得；本藥物組合物製劑按日服用劑量計，含丹參素以丹參素鈉C9H9O5Na不得少於60.0mg。
12.如權利要求1、2、3或4所述的藥物組合物在製備治療耳聾、耳鳴藥物中的應用。
13.如權利要求12所述的藥物組合物的應用，其特徵在於所述耳聾、耳鳴是指老年性耳聾、耳鳴或藥物性耳聾、耳鳴。
14.如權利要求13所述的藥物組合物的應用，其特徵在於所述的治療耳聾、耳鳴是指具有抗衰老性耳聾耳鳴、預防藥物性聽力下降、活血化瘀或補腎作用。
全文摘要
本發明公開了一種治療耳聾耳鳴的藥物組合物及其製備方法和質量控制方法。該藥物組合物由丹參、骨碎補、石菖蒲和人工麝香組成，該藥物組合物能夠製成片劑、軟膠囊劑、膠囊劑、緩釋劑、顆粒劑、滴丸劑、口服液體製劑或凍乾粉針劑等臨床或藥學上可接受的劑型。同時本發明公開了該藥物組合物的一種製備方法、丹參、石菖蒲的薄層鑑別、人工麝香的氣相色譜鑑別及丹參的含量測定方法。
文檔編號A61K9/08GK1726982SQ20051008555
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月28日 優先權日2005年7月28日
發明者黃文峰 申請人:北京荔博園醫藥研究所