作為補體激活的抑制劑的masp同種型的製作方法

2023-05-26 08:17:41

專利名稱：作為補體激活的抑制劑的masp同種型的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型ficolin-相關多肽，和衍生於這些ficolin-相關多肽的多肽，其用於治療與炎症、凋亡、自體免疫性、凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的病症的治療，以及用作生物標記。本發明還涉及識別所述新型ficolin-相關多肽和衍生於其的多肽的抗體、編碼所述多肽的核酸分子、用於生產所述多肽的載體和宿主細胞。
背景技術：
補體系統(C)的激活通過三種不同的起始途徑完成旁路途徑(AP)，經典途徑(CP)，或凝集素途徑(LCP)。AP激活發生在外源表面上，並且由C3的緩慢自發性水解和因子備解素、因子B和因子D形成功能性C3轉換酶C3bBb的活性引起。AP還作為另外兩種途徑的放大途徑(amplification pathway)(放大環)起作用。最近，已經表明，備用的轉換酶組裝還可以通過將備解素非共價連接到一些靶標表面上而起始。另一方面，當Clq結合與 抗原複合的免疫球蛋白時起始CP激活，Clq同與抗原複合的免疫球蛋白的結合引發Clq-締合的絲氨酸蛋白酶Clr和Cls的激活。Cls分裂並且激活C4和C2，從而形成CP C3轉換酶C4b2a。當甘露糖-結合凝集素(MBL)或ficolins結合限制性模式的糖類(carbohydrate)或乙醯化的化合物時，例如，在微生物體表面上，或當暴露在瀕死宿主細胞上時，激活LCP。當與配體結合時，締合的絲氨酸蛋白酶MASP-2激活並且分裂C4和C2，從而形成LCP C3轉換酶C4b2a。已經提議MASP-I的功能涉及C2的MASP-2分裂的穩定，並且還指導C3的低級分裂。然而，其它研究將MASP-I和MASP-2的功能和活性與涉及凝血酶原、纖維蛋白原和因子XIII的凝結系統交叉通訊(coagulation system cross-talk)相關。使用MASPI/3敲除小鼠，最近證明MASP-I事實上有助於補體活性。最近發現的MBL締合的絲氨酸蛋白酶MASP-3的準確功能尚未得到闡明。已經報導了一些研究，其表明MASP-3與有限範圍的MBL寡聚體締合，並且MASP-3和小的MBL-締合的蛋白(sMAP)參與MBL依賴性LCP補體激活的調節或抑制。MASP-I和-3通過不同的剪接來源於同一 MASP1/3基因(存在於染色體3q27_q28上)。它們包含相同的A鏈，不同的是15個C端殘基。A鏈包括由EGF(表皮生長因子)結構域隔開的兩個CUB (Clr/Cls，Urchin-EGF,骨形態生成蛋白)結構域，接著是兩個CCP結構域(補體控制蛋白)。包括絲氨酸蛋白酶結構域的B鏈不同於MASP-I和MASP-3。MASP-2和sMAP也來源於相同的基因(存在於染色體Ip36-p36. 2上)，其中sMAP是缺少絲氨酸蛋白酶結構域和A鏈主要部分的截短形式。已經表明MASP1/3基因是多態性的，但是其功能重要性仍然所知甚少。然而，存在一些證據表明MASP2/sMAP基因中的多態性與增加的感染風險有關。MASPs的表達定位在肝臟的肝細胞，但是最近的研究記載人MASP-3 mRNA (唯一的MASP-mRNA)在寬泛範圍的組織中表達。發明目的本發明實施方案的目的是提供適於治療與炎症、凋亡、自體免疫性、凝結、和/或血栓形成或凝血病相關的疾病有關的病症的多肽。本發明的多肽可以進一步適於作為生物標記，用於診斷和/或預測這些適應證以及用於惡性病，如癌症。
發明概述本發明人已經發現與凝集素補體途徑的識別分子相關的新型多肽以及諸如衍生於其的片段的多肽可以用於治療與炎症、凋亡、自體免疫性、凝結、和/或血栓形成或凝血病相關的疾病有關的特定醫學病症的治療。因此，在第一方面，本發明涉及分離的ficolin-相關多肽。在第二方面，本發明涉及包括胺基酸序列SEQ ID NO :4的多肽或其變體或免疫學片段。在第三方面，本發明涉及特異性結合本發明的多肽的抗體。在第四方面，本發明涉及編碼本發明的多肽的分離的核酸分子。在另一個方面，本發明涉及包含與SEQ NO :2的序列至少70%相同的核苷酸序列的分尚的核酸分子。在另一個方面，本發明涉及包含編碼本發明的多肽的分離的核酸分子的載體。在另一個方面，本發明涉及包含含有編碼本發明的多肽的分離的核酸分子的載體的宿主細胞。在另一個方面，本發明涉及產生本發明的多肽的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構建體表達的條件下，在適合的生長培養基中培養本發明的細胞，並且從培養基中回收得到的多肽。在另一個方面中，本發明涉及包含本發明的多肽的組合物。在另一個方面中，本發明涉及包含本發明的多肽的藥物組合物。在另一個方面中，本發明涉及檢測生物樣品中的本發明的多肽的方法，所述方法包括a)獲得生物學樣品；b)使所述生物學樣品與本發明的抗體接觸；並且c)如果有的話，檢測所述抗體與多肽的複合物；作為所述樣品中存在所述多肽的指示。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽，其用作藥物。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽用於製備藥物的用途。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽，其用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽，其用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的任意適應證。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽，其用於預防在鑑定的高危患者中發生血栓栓塞併發症，所述鑑定的高危患者如經歷手術的那些或患有充血性心力衰竭(congestive heart failure)的那些。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽，其用於治療與心臟相關的醫學病症。 在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽，其用於治療與ficolin-相關多肽缺乏有關的醫學病症。在另一個方面中，本發明涉及用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的本發明的多肽。在另一個方面中，本發明涉及用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的任意適應證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的本發明的多肽。在另一個方面中，本發明涉及用於預防在鑑定的高危患者中發生血栓栓塞併發症的方法，所述鑑定的高危患者如經歷手術的那些或患有充血性心力衰竭的那些，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的本發明的多肽。在另一個方面中，本發明涉及用於治療與心臟相關的醫學病症的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的本發明的多肽。在另一個方面中，本發明涉及用於治療與ficolin-相關多肽缺乏有關的醫學病症的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的本發明的多肽。
在另一個方面中，本發明涉及能夠在嚴格條件下與編碼本發明的多肽的核酸序列雜交的核酸探針。在另一個方面中，本發明涉及檢測生物學樣品中存在編碼本發明的多肽的核酸的方法，所述方法包括a)獲得生物學樣品；b)使所述生物學樣品與本發明的核酸探針接觸；並且c)如果有的話，檢測所述核酸探針與編碼多肽的核酸的複合物；作為在所述樣品中存在所述編碼多肽的核酸的指示。在另一個方面中，本發明涉及診斷與ficolin-相關多肽異常表達有關的病症的方法，所述方法包括獲得來自患者的生物學樣品，並且測量所述生物學樣品中ficolin-相關多肽的表達，其中，與對照相比，ficolin-相關多肽增加或減少的表達表示患者患有與ficolin-相關多肽異常表達有關的病症。在另一個方面中，本發明涉及一種分離的組合物，其包括本發明的多肽以及選自Ficolin-l、2、3，甘露糖結合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和細胞內膠原樣防禦分子，諸如CLL-Il的一種或多種蛋白的組合。在另一個方面中，本發明涉及包含本發明的多肽的組合物，其是一種藥物組合物。在另一個方面中，本發明涉及本發明所述的藥物組合物，其用作藥物。在另一個方面中，本發明涉及本發明的組合物用於製備藥物的用途。在另一個方面中，本發明涉及本發明的藥物組合物，其用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證。在另一個方面中，本發明涉及本發明的藥物組合物，其用於治療本文定義的任意適應證。在另一個方面中，本發明涉及用於治療本文定義的任意適應證的方法，所述方法包括同時或先後施用治療或預防有效量的本發明的多肽和一種或多種選自Ficolin-l、2、3，和甘露糖結合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP_D，和細胞內膠原樣防禦分子，諸如CLL-Il的蛋白。在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽作為血液和組織中的生物標記的用途，用於診斷和/或預測惡性疾病，諸如癌症疾病，諸如腦瘤、肝腫瘤和生殖道腫瘤。
在另一個方面中，本發明涉及本發明的多肽作為血液和組織中的生物標記的用途，用於診斷和/或預測本文定義的自體免疫、代謝和/或炎性病症。附例圖I :MASP_1基因的可變轉錄。在肝臟cDNA中檢測到MASP-1基因的可變轉錄。使用位於外顯子6的通用正向引物和位於外顯子12 (MASPl)、外顯子11(MASP3)、和外顯子8a(FAP)的特異性反向引物擴增MASP1，MASP3，和FAP轉錄物。MASPl產生500bp的片段，MASP3產生506bp的片段，FAP產生309bp的片段。圖2 :MASP1基因的可變剪接。MASPl通過剪截掉8a和外顯子11產生，二者均包含終止密碼子序列(用黑框標記)。MASPl序列在外顯子17中包含終止密碼子。MASP3通過剪截掉外顯子8a而產生，如果沒有剪截掉外顯子8a，則產生FAP。FAP蛋白包含兩個CUB結構域，EFG結構域和第一 CCPl結構域。
圖3 =FAP片段的組織表達。在來自Clontech的cDNA組中研究MASP_1、MASP3、和FAP基因的組織分布。使用通用正向引物和特異性反向弓I物擴增MASP-I、MASP-3、和FAP轉錄物。GADPH用作參照基因。所有三種基因在肝臟中高度表達，另外，FAP在心臟組織中強表達(用黑色箭頭表示)。在腦、結腸、前列腺、骨骼肌、和小腸中檢測到FAP基因的較少表達(用白色箭頭表示)。圖4 :MASP-1，MASPUP FAP 的比對。利用 BioEdit 軟體比對 MASP-1，MASP-3，和FAP的蛋白序列。MASP-I和MASP-3包含不同的C端絲氨酸蛋白酶結構域，而FAP不包含任何絲氨酸蛋白酶結構域。相反，該蛋白在C端區域包含17個新的胺基酸。圖5 =FAP的cDNA序列和相對應的蛋白序列。cDNA序列顯示在上一行，相對應的蛋白序列顯示在下。外顯子區域被黑色豎直線分開。認為參與MBL/ficolins結合的胺基酸用淺黃色方框標記。圖6 =MASP-I補體激活。將人MBL用增加量的MASP-1溫育。MASP-1能夠激活C3和C4兩種補體蛋白。圖7 MASP-2補體激活。將人MBL用增加量的MASP-2溫育。MASP-2能夠強烈激活C3和C4兩種補體蛋白。圖8 :補體的MASP-3抑制。將人MBL用增加量的MASP-3溫育。MASP-3能夠抑制C3和C4兩種補體蛋白的激活。圖9 :免疫沉澱。用 mAb 抗-MBL 131-11，抗-Ficolin-2 克隆 219，和抗-Ficolin-3克隆334免疫沉澱血清Ficolin/MBL。接著進行Dynal磁珠分離，SDS-PAGE，蛋白質印跡和生物素標記的抗-MASP-1/MASP-3克隆8B3作為信號抗體。

圖10 =Ficolin與乙醯化的人血清白蛋白(AcHSA)結合時，FAP與Ficolin相互作用。洗脫的與AcHSA結合的血清Ficolin。蛋白質印跡使用生物素標記的抗-MASP-I/MASP-3克隆8B3作為信號抗體進行。圖11 =MASP-I和MASP-3與rFicolin-2之間相互作用的動力學和解離常數Hummelshaj T 等，Mol. Immunol.(分子免疫學),2007)。圖12 KULF和FAP的17個特有胺基酸的比對。圖13 :在甘露聚糖/MBL ELISA測定中，C4的補體激活。將甘露聚糖包被的孔用或不用重組人MBL溫育，然後用連續稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖14 :在乙醯化的BSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補體激活。將AcBSA包被的孔用或不用重組人Ficolin-3溫育，然後用連續稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖15 :在甘露聚糖/MBL ELISA測定中，C4的補體激活。將甘露聚糖包被的孔用重組人MBL溫育，然後在一個維度用rMASP-Ι連續稀釋液作為不含血清的培養基培養物上清進行溫育。隨後在第二維度用連續稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖16 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補體激活。將AcBSA包被的孔用重組人Ficolin-3溫育，然後在一個維度用rMASP-Ι連續稀釋液作為不含血清的培養基培養物上清進行溫育。隨後在第二維度用連續稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖17 :在甘露聚糖/MBL ELISA中，C4的補體激活。將甘露聚糖包被的孔用重組人MBL溫育，然後在一個維度用rMASP-2連續稀釋液作為不含血清的培養基培養物上清進行溫育。隨後在第二維度用連續稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖18 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補體激活。將AcBSA包被的孔用重組人Ficolin-3溫育，然後在一個維度用rMASP-2連續稀釋液作為不含血清的培養基培養物上清進行溫育。隨後在第二維度用連續稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖19 :在甘露聚糖/MBL ELISA測定中，C4的補體激活。將甘露聚糖包被的孔用重組人MBL溫育，然後在一個維度用rMASP-3連續稀釋液作為不含血清的培養基培養物上清進行溫育。隨後在第二維度用連續稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖20 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補體激活。將AcBSA包被的孔用重組人Ficolin-3溫育，然後在一個維度用rMASP-3連續稀釋液作為不含血清的培養基培養物上清進行溫育。隨後在第二維度用連續稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點雙重確定的標準誤差的兩倍。圖21 FAP,MASPl和MASP3的組織分布。在心臟組織中，FAP表達較MASPI和MASP3高得多。與在肝臟中的FAP表達相比，FAP在心臟組織中的表達高三倍。此外，與在肝臟中的MASPl和MASP3表達相比，在肝臟中觀察到更高的FAP表達。在腦、骨骼肌和前列腺組織中也檢測到相當多的FAP表達。實驗一式兩份進行三次。顯示平均值的標準誤差。圖22 :使用針對蛋白的17個FAP特異性C端殘基的多克隆小鼠抗血清進行MAP-I的免疫組織化學肝臟定位。對照染色是陰性的。幾種不同的針對FAP的多克隆抗體(兔和小鼠)表現出相同模式的染色。圖23 =MAP-I組織定位的免疫組織化學分析(0M X10)。左圖顯示用針對MAP-I的 mAb(12Bll)染色。右圖顯示用不相關的IgGlk mAb的同種型對照染色。(A-B):心肌，(C-D)骨骼肌，(E-F):肝臟樣品，(G-H):主動脈組織。所有載玻片上右下角刻度條表示50 μ m。
圖24 =MAP-I和MASP-1/3血清複合物的免疫沉澱。(A)用mAb 20C4(抗MAP-1)和mAb 8B3 (抗MASP-1/3，具有在通用重鏈上的表位)從血清中免疫沉澱MAP-1和MASP-1/3。將還原的樣品電印跡並且用針對MAP-I的PAb或針對Ficolin-3 (FCN334)和MBL (Hyb131-1)的生物素醯化的 mAbs 顯色。(B)用針對 MBL(Hyb 131-11)，Ficolin-2 (FCN219)和Ficolin-3 (FCN334)的mAbs分別從1ml，300 μ I和100 μ I血清進行免疫沉澱(左側)。對照為使用抗MAP-I mAb 20C4從血清沉澱的MAP-I (sMAP-Ι)和從培養物上清沉澱的rMAP-1 (rMAP-1)(右側)。樣品通過使用針對MAP-I的pAb探測的蛋白質印跡進行分析。圖25 MASP-2和MAP-1對MBL和Ficolin-3介導的補體C4沉積的影響。C4沉積使用針對C4的多克隆抗體測量，並且作為0D490-650nm值給出。誤差條表示雙重確定的標準誤差的兩倍。在附圖標記中給出rMBL，rFicolin-3，rMAP-1和rMASP-2的近似濃度。(A)使用MBL缺陷型血清，用400ng/ml的rMBL，重建在甘露聚糖包被的表面上的C4沉積。對照不加入rMBL。(B) rMASP-2對rMBL介導的C4沉積的劑量依賴性影響。(C) rMAP-Ι對rMBL介導的C4沉積的劑量依賴性影響。(D)使用Ficolin-3缺陷型血清，用400ng/ml的rFicolin-3,重建在AcBSA包被的表面上的C4沉積。(E)rMASP_2對rFicolin-3介導的C4
圖26 :MASP-2和MAP-I對純系統中補體C4沉積的影響。甘露聚糖表面上的rMBL在第一維度上用連續稀釋的rMASP-2預先溫育。然後在第二維度上應用連續修飾的rMAP-1，然後應用I μ g/ml的純化的C4。使用針對C4的pAb測量C4沉積，並且作為0D490_650nm值給出。誤差條表示雙重確定的標準誤差的兩倍。在附圖標記中給出rMAP-Ι和rMASP-2的近似濃度。圖27 rMAP-Ι的SDS-PAGE分析。左手側表示免疫印跡分析+/-N-糖苷酶F處理(ENDO-F)。右側表示相對應的考馬斯染色。Fig. 28A，B :校正曲線。A)通過mAb 20C4/mAb_8B3雙側ELISA產生的校正曲線，其使用應用到MAP-I耗盡的正常人血清庫(PNHS)的兩倍連續稀釋的rMAP-Ι或稀釋在PBS/0. 05%吐溫/IOmM EDTA中的連續稀釋的rMAP-Ι進行。誤差條表示8次確定的標準誤差的兩倍。B)MAP-I耗盡的血清、正常人血清和摻加rMAP-Ι的MAP-I耗盡的血清的免疫印跡。圖29A-C =MAP-I血清濃度。A)在100名丹麥獻血者中的MAP-I血清濃度和分布。平均血清水平240ng/ml。範圍115_466ng/ml· ;B)MASP_3和MAP-1血清水平之間的相關性；C)對血清冷凍和解凍的影響。將血清冷凍和解凍8輪，測量每輪的MAP-I水平。誤差條表示雙重確定的標準誤差的兩倍。圖30 A)在100名丹麥獻血者中，MAP-I與MBL，Ficolin-2和Ficolin-3之間各自的締合水平(以相對O. D. 490-650nm單位表示)。P值通過非參數雙尾t檢驗獲得。B)在MAP-I血清水平和與MBL，Ficolin-2和Ficolin-3的相對締合之間的相關性(左手側)。MBL, Ficolin-2和Ficolin-3血清水平與同MAP-I的相對締合之間的相關性(右手側)。相關性P-和r-值使用非參數斯皮爾曼等級相關性檢驗計算。圖31A-C :蔗糖梯度超離心。A)由進行10_30%蔗糖密度梯度的血清收集的級分(1-27)。級分通過針對MAP-1，MASP-3, MBL, Ficolin-2和-3的特異性ELISA進行分析。血清IgM(19S)和IgG(7S)的峰值表示在圖的頂部。B)通過針對MAP-1，MASP-I, MASP-3,sMAP, MASP-2, MBL, Ficolin-2和Ficolin-3的免疫印跡分析編號8-23的級分。C)通過激活外源應用在固定的乙醯化BSA(—種Ficolin-3配體)或甘露聚糖(一種MBL配體)上的人C4的能力而分析級分1-27。發明的詳細公開內容本發明已經發現一種與凝集素補體途徑的識別分子相關的40kDa新型血漿蛋白，並且將其鑑定為MASP-1/MASP-3的新的可變轉錄變體，其又對應於該新發現的血漿蛋白。本發明人已經表明該新型蛋白(本發明人命名為FAP(Ficolin相關蛋白，FicolinAssociated Protein)或 MAP-1(MBL/Ficolin 相關蛋白-I, MBL/Ficolin associatedprotein-1))缺少酶結構域但是包含ficolin/MBL結合結構域,並且因此預測其通過MASPs的競爭和置換或備選地，但不相互排斥地，作為參與清除或信號傳導功能的蛋白而參與補體和凝結功能的調控和抑制。補體系統和/或凝結級聯的不可控激活強烈地與在系統性炎症和膿毒症、心肌梗 死和自體免疫性的範圍內的各種疾病的致死性嚴重後果相關。已經表明，凝結和補體激活的抑制是一種有希望的治療工具。本發明描述一種補體和凝結功能的可能的新型抑制劑。然而，本發明的多肽可以具有其它的功能，諸如清除和/或信號傳導功能。此外，其可以在一些疾病情形中用作新的生物標記，所述疾病情形包括惡性疾病、自體免疫性、代謝和/或炎性病症。本發明的發明人已經發現一種稱為Ficolin相關蛋白(FAP)的體內血存在的漿蛋白，並且表明，其主要與ficolins相締合(圖9)，但是其可能還與甘露糖結合凝集素相締合。通過搜索NCBI核苷酸資料庫，本發明的發明人發現一種對應於截短的MASP-I的可能的轉錄變體。基於這一序列，設計引物，從而擴增推定的新基因轉錄物。隨後，使用人肝臟cDNA，鑑定了 MASP-I基因的新可變轉錄變體(圖I)。對這一 mRNA鏈進行測序，並且確定胺基酸序列，其對應於分子量為40kDa的在血漿/血清中觀察到的蛋白(圖5)。該新型蛋白部分與MASP-I和MASP-3相同，但是缺少絲氨酸蛋白酶結構域，卻包含在終止密碼子前的編碼17個胺基酸的新外顯子。該外顯子在MASPl和MASP3轉錄物中被剪截掉(圖2)。通過使用一組mRNA表達文庫，本發明人已經發現該蛋白在心臟和在肝臟中、其次在骨骼肌中強烈表達的證據(圖3)。在腦、消化道、前列腺和在脾中觀察到弱表達(圖3)。Taqman分析證實在心臟和肝臟細胞中的表達。FAP較MASPl和MASP3在心臟組織中的表達高得多。與在肝臟中的FAP表達相比，FAP在心臟組織中的表達高三倍。並且，與在肝臟中的MASPl和MASP3表達相比，在肝臟中觀察到更高的FAP表達。在腦、骨骼肌和前列腺組織中也檢測到相當多的FAP表達。實驗一式兩份進行三次。在心臟中的高表達非常顯著，並且使本發明人提議本發明的多肽作為自體免疫性、代謝和/或炎性病症(諸如與心臟相關的醫學病症)中抗組織損傷的非常有用的保護劑的應用。本發明人已經建立評估由ficolins和甘露糖結合凝集素引發的補體活性的測定法，並且發明人因此已經能夠表明FAP可能的功能性補體抑制作用。本發明人已經建立實時定量測定法來測量不同組織中準確的相對表達水平。本發明的多肽可以通過重組技術產生。可以用特有的17個胺基酸長的肽免疫兔或小鼠，從而分別獲得FAP多克隆和單克隆特異性抗體。
特異性FAP抗體可以用於定量測量FAP和不同組織中的免疫組織化學檢測。可以在ELISA中並且通過使用表面等離子體共振技術(Biacore)確定FAP和本文所述的不同結合配偶體之間的結合常數。FAP特異性接納體蛋白，如特異性細胞表面結合的受體，可以通過本領域技術人員已知的標準測定法鑑定，所述測定法諸如其中蛋白直接結合到細胞上的測定法。新型蛋白Ficolin相關蛋白(FAP)是MASPl的可變剪接變體。該蛋白缺少絲氨酸蛋白酶結構域，但是仍然保留參與與補體系統的凝集素途徑的起始劑結合的結構域。因此，本發明人預測該蛋白通過MASPs的競爭和置換參與MASP-I和MASP-3 (補體，凝結功能和其它酶底物)功能的調節和抑制。備選地，但是不相互排斥地，FAP可以作用為清除分子，促進去除與內源性廢物物質或病原體結合的FAP/MBL/ficolin複合物。補體系統和凝結級聯的不可控激活與不利的後果相關，並且功能性抑制劑，諸如本發明的多肽，可以非常有效地控制補體系統和凝結級聯。另外，本發明的多肽可以用在其它情形中。另一個角度是可以將該蛋白用作不同疾病情形中的生物標記。所述蛋白是獨特的，並且可以提供用於新藥物和/或新診斷工具的基礎。包含胺基酸序列SEQ ID NO :4或其免疫學片段或變體的本發明的多肽可以具有與該胺基酸序列相關的特定功能。本發明人提議，所述多肽可以具有與選自下列的一種或多種蛋白的活性相對應的功能或活性=DNMTl DNA (細胞因子_5_)-甲基轉移酶I (DNMTl)，高爾基蛋白亞家族B成員I (GOLGBl) ,A-激酶錨定蛋白9 (AKAP9)，B_和T-淋巴細胞-相關蛋白)(⑶272抗原)，包含PTB結構域的吞沒銜接蛋白I (⑶LP)，和包含MACRO結構域的蛋白2。在一些特別有意思的實施方案中，本發明的多肽具有與包含PTB結構域的吞沒銜接蛋白I(GULP)的活性相對應的功能或活性。定義術語「ficolin相關多肽」用在本文中意指包含天然人ficolin相關多肽(FAP)(SEQ ID NO 1)的胺基酸序列20-380或SEQ ID NO 9的胺基酸序列16-363的任意蛋白或多肽，其功能性變體、功能性截短版本以及功能性衍生物或綴合物，所述多肽不具有補體活性，但是具有與MASP-1，MASP-2，或MASP-3競爭與f icolin-3，MBL，Clq,肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D和/或CL-Ll (和其它膠原凝集素家族成員)結合的能力。這包括但不限於具有SEQ ID NO :I的人ficolin相關多肽(FAP)及其變體。術語「ficolin相關蛋白(FAP) 」用在本文中意指具有天然人FAP (SEQID NO I)的胺基酸序列1-380(有或無信號肽，諸如胺基酸序列20-380)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。其還包括具有略微修飾的胺基酸序列的蛋白，例如，包括N或C端胺基酸缺失或添加的修飾的N或C末端，只要這些蛋白基本上保留FAP活性。術語「ficolin相關蛋白(FAP) 」在本文中與術語「MAP-1」或「MBL/Ficolin相關蛋白-I」互換使用。在上述定義中的「FAP」還包括可能在一個個體到另一個個體之間存在並發生的天然等位基因變體。該術語還包括具有同源序列和相似功能的來源於除人外其它物種(諸如牛、豬、狗、馬、大鼠、和小鼠)的蛋白。此外，取決於所選的宿主細胞和宿主細胞環境的性質，糖基化或其它翻譯後修飾的程度和位置可能不同。
術語「MBL-相關的絲氨酸蛋白酶-I」或「MASP-1」用在本文中意指具有天然人MASP-1 (SEQ ID NO :5)的胺基酸序列1-699 (有或無信號肽，諸如胺基酸序列20-699)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。應該理解，所述序列可以存在於一條或多條肽鏈中，諸如存在於兩條鏈中，即，存在於天然人蛋白的重鏈和輕鏈中。術語「MBL-相關的絲氨酸蛋白酶-3」或「MASP-3」用在本文中意指具有天然人MASP-3 (SEQ ID NO 7)的胺基酸序列1-728 (有或無信號肽，諸如胺基酸序列20-728)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。應該理解，所述序列可以存在於一條或多條肽鏈中，諸如存在於兩條鏈中，即，存在於天然人蛋白的重鏈和輕鏈中。術語「MBL-相關的絲氨酸蛋白酶-2」或「MASP-2」用在本文中意指具有天然人MASP-2 (SEQ ID NO 9)的胺基酸序列1-686 (有或無信號肽，諸如胺基酸序列16-686)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。應該理解，所述序列可以存在於一條或多條肽鏈中，諸如存在於兩條鏈中，即，存在於天然人蛋白的重鏈和輕鏈中。術語「小的MBL相關蛋白」、「sMAP」、「19kD的MBL相關的血漿蛋白」或「MApl9」用 作本文中意指具有天然人sMAP (SEQ ID NO 11)的胺基酸序列1_185 (有或無信號肽，諸如胺基酸序列16-185)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。術語「變體」(「variant」或「variants」)用在本文中意欲指定具有序列SEQ IDNO :1的ficolin相關多肽或包含胺基酸序列SEQ ID NO 4的多肽，其中一個或多個胺基酸已被另一個胺基酸置換和/或其中一個或多個胺基酸已被刪除和/或其中已經在多肽中插入一個或多個胺基酸和/或其中已向多肽添加一個或多個胺基酸。所述添加可以發生在N末端或在C末端或在兩端。在該定義中的「變體」仍然具有功能性活性。在一些實施方案中，變體與序列SEQ ID NO :1具有70%的序列同一性。在一些實施方案中，變體與序列SEQ IDNO :1具有80%的序列同一性。在另一些實施方案中，變體與序列SEQ ID N0:1具有90%的序列同一性。在另一個實施方案中，變體與序列SEQ ID NO: I具有95%的序列同一性。在一些實施方案中，變體與序列SEQ ID NO: 4具有70%的序列同一性。在一些實施方案中，變體與序列SEQ ID NO :4具有80%的序列同一性。在另一些實施方案中，變體與序列SEQ ID NO :4具有90%的序列同一性。在另一個實施方案中，變體與序列SEQ ID NO:4具有95%的序列同一性。短語「功能性變體」、「功能性截短版本」和「功能性衍生物」用在本文中是指SEQ IDNO :1的變體、截短的版本以及衍生物，所述多肽包含SEQ ID NO: I的基本序列部分，並且至少具有與MASP-I或MASP-3競爭結合ficolins或MBL的能力而不具有補體活性和/或絲氨酸蛋白酶活性。應該理解，ficolin相關多肽可以具有選自作為變體、和/或截短體和/或衍生物的兩個或三個特徵。已經在相同細胞類型中產生了 ficolin相關多肽的功能性變體，包括在本文所述的測定法中檢測時，表現出野生型FAP的至少約25%，諸如至少約50%，諸如至少約75%，諸如至少約90%的特異性活性的那些。術語「免疫學片段」用在本文中是指具有基本上相同的功能性活性和被抗體識別的相同空間方向的胺基酸序列的片段。相應地，特異性抗體結合多肽和其免疫學片段二者。術語「另一個胺基酸」用作本文中意指不同於在該位置天然存在的胺基酸的一個胺基酸。這包括但不限於可以由多核苷酸編碼的胺基酸。在一些實施方案中，不同的胺基酸採用天然L形式，並且可以由多核苷酸編碼。
術語「衍生物」用在本文中意欲指相對於野生型人FAP表現出基本上相同或提高的生物學活性的ficolin相關多肽，其中母本多肽的一個或多個胺基酸已被化學修飾，例如，通過烷基化、PEG化、醯化、酯形成或醯胺形成等進行化學修飾。術語「補體活性」用在本文中意指激活補體系統的活性。補體活性可以用本文標題為「測定法」部分中所述的測定法進行測量。術語「甘露糖結合凝集素(MBL) 」用作本文中還意指甘露糖結合凝集素，甘露糖結合蛋白(MBPl)，和甘露糖結合蛋白，該術語可以互換使用。術語「能夠締合」用在本文中是指本發明的蛋白在溶液中特異性結合補體系統的凝集素途徑的一個或多個起始劑或可能參與該多肽作用的其它蛋白的能力。術語「構建體」意欲指可能基於編碼目的多肽的完整的或部分的天然存在的核苷酸序列的多核苷酸片段。構建體可以任選地包含其它多核苷酸片段。以相似的方式，術語「可以由多核苷酸構建體編碼的胺基酸」包括可以由上文定義的多核苷酸構建體編碼的胺基酸，即，諸如 Ala, Val, Leu, He, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 和 Gln 的胺基酸。術語「載體」用在本文中意指在宿主細胞中能夠擴增的任意核酸實體。因此，載體可以是自發複製的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如質粒。備選地,載體可以是這樣一種載體,即，當引入到宿主細胞中時,其整合到宿主細胞基因組中並且與其已經整合到其中的染色體一起複製。載體的選擇通常取決於載體要被引入的宿主細胞。載體包括，但不限於，質粒載體、噬菌體載體、病毒或黏端質粒載體。載體通常包含複製起點和至少一個可選擇基因，即，編碼易於檢測的產物的基因或該基因的存在對細胞生長是必需的基因。在另一個方面中，本發明提供包含所述多核苷酸構建體或載體的重組宿主細胞。在一個實施方案中，重組宿主細胞是真核細胞。在其它實施方案中，重組宿主細胞是哺乳動物來源的。在另一個實施方案中，重組宿主細胞選自由CHO細胞、HEK細胞和BHK細胞組成的組。術語「宿主細胞」用在本文中表示任意細胞，包括雜交細胞，其中可以表達異源DNA0典型的宿主細胞包括，但不限於昆蟲細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞，包括人細胞，諸如BHK，CH0，HEKJP COS細胞。當實施本發明時，培育的宿主細胞優選是哺乳動物細胞，更優選是建立的哺乳動物細胞系，包括但不限於，CH0(例如，ATCC CCL 61)，C0S-1(例如，ATCC CRL1650)，幼倉鼠腎(BHK)和 HEK293(例如，ATCC CRL1573 ;Graham 等，J. Gen. Virol.(基因病毒學雜誌)36 :59-72,1977)細胞系。優選的BHK細胞系是tk- tsl3 BHK細胞系(Waechter和 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)79 :1106-1110,1982)，以下稱為BHK 570細胞。BHK 570細胞系可從美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Dr. , Rockville, MD20852)獲得，ATCC 保藏號為 CRL 10314。 tk- tsl3 BHK細胞系也可從ATCC獲得，其保藏號為CRL 1632。其它適當的細胞系包括，但不限於，大鼠H印I (大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印II (大鼠肝細胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC1469 (ATCC CCL 9. I)和 DUKX細胞(Urlaub 和 Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)77 =4216-4220,
1980)。也可以使用3T3細胞、Namalwa細胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其它細胞的融合。
在另一個方面中，本發明提供包含並且表達所述多核苷酸構建體的轉基因動物。在另一個方面中，本發明提供包含並且表達所述多核苷酸構建體的轉基因植物。在另一個方面中，本發明涉及用於生產本發明的ficolin相關多肽的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構建體表達的條件下在適合的生長培養基中培育包含所述多核苷酸構建體的細胞，並且從培養基中回收得到的多肽。當用於本文中時，術語「適合的生長培養基」意指包含細胞生長和編碼本發明的ficolin相關多肽的核酸序列表達所需要的營養物和其它成分的培養基。在另一個方面中，本發明涉及用於生產ficolin相關多肽的方法，所述方法包括從由轉基因動物產生的奶中回收所述多肽。在另一個方面中，本發明涉及用於生產ficolin相關多肽的方法，所述方法包括培育包含多核苷酸構建體的轉基因植物的細胞，並且從得到的植物中回收所述多肽。 在本發明的上下文中，術語「治療」意欲包括對預期涉及不適當的補體激活的病症(諸如炎症和再灌注損傷)的預防和對已經存在的病症(諸如心肌梗死和中風)的調節，目的是抑制或將組織損傷減至最少。因此，術語「治療」包括預防性施用本發明的ficolin相關多肽。術語「受試者」用在本文中意欲指任何動物，特別是哺乳動物，諸如人，並且在適當時候可以與術語「患者」互換使用。術語「序列同一性」，如本領域已知的，是指兩種或多種多肽分子或兩種或多種核酸分子之間通過比較序列確定的關係。在本領域中，「同一性」還意指核酸分子之間或多肽之間的序列相關性的程度，根據具體情況而定，通過兩個或多個核苷酸殘基或兩個或多個胺基酸殘基的鏈之間的匹配數目而確定。「同一性」測量在兩個或多個序列的較小者之間相同性匹配的百分數，其中通過特定的數學模型或電腦程式(即，「算法」)闡釋缺口比對(如果存在的話)。術語「相似性」是相關的概念，但是與「同一性」相反，是指包括相同的匹配和保守置換匹配二者的序列關係。例如，如果兩種多肽序列具有(分數(10/20))相同的胺基酸，並且其餘的全部是非保守置換，則同一性和相似性百分數均為50%。如果，在同一實例中，存在另外5個具有保守置換的位置，則同一性百分數仍為50%，但是相似性百分數為75%(分數(15/20))。因此，在存在保守置換的情形中，兩種多肽之間的相似性程度高於這兩種多肽之間的同一性百分數。胺基酸序列SEQ ID NO 1的保守修飾(和對編碼核苷酸的相對應修飾)將產生具有與天然存在的FAP的那些相似的功能性和化學特徵的ficolin相關多肽。相反，在ficolin相關多肽的功能性和/或化學特徵中的實質性修飾可以通過選擇胺基酸序列SEQID N01中的置換實現，所述置換在它們保持(a)置換區域中的分子主鏈的結構，例如，作為摺疊或螺旋構象，(b)分子在靶位點的電荷或疏水性，或(C)側鏈的體積的作用方面顯著不同。例如，「保守胺基酸置換」可以包括用非天然殘基置換天然胺基酸殘基，以使對該位置胺基酸殘基的極性或電荷影響很小或沒有影響。此外，多肽中任何天然的殘基還可以用丙氨酸置換，如以前關於「丙氨酸掃描誘變」所述(參見，例如，MacLennan等，1998，ActaPhysiol. Scand. Suppl. 643 :55-67 ；Sasaki 等，1998, Adv. Biophys.(生物物理進展)35 1-24，其討論了丙氨酸掃描誘變)。理想的胺基酸置換(不管是保守的還是不保守的)可以由本領域技術人員在需要所述置換時確定。例如，胺基酸置換可以用來鑑定ficolin相關多肽的重要殘基，或增加或降低本文所述的ficolin相關多肽的親和性。基於常見的側鏈特性，天然存在的殘基可以分成下述幾類I)疏水性正亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；2)中性親水性Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；3)酸性Asp，Glu ;4)鹼性His, Lys, Arg ；5)影響鏈方向的殘基Gly, Pro ;和6)芳香的Trp, Tyr, Phe0例如，不保守置換可以包括這些種類中一類的一個成員與另一種類的一個成員交換。這樣置換的殘基可以引入到人ficolin相關多肽與非人ficolin相關多肽同源的區域 中，或引入到該分子的非同源區域中。在進行這樣的變化時,可以考慮胺基酸的水性指數(hydropathic index)。基於胺基酸的疏水性和電荷特徵，每個胺基酸已被指定一個水性指數，其為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1. 9);丙氨酸(+1. 8);甘氨酸(-0. 4);蘇氨酸(-0. 7);絲氨酸(-0. 8);色氨酸(-0. 9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);穀氨酸(-3.5);穀氨醯胺(-3.5);天冬氨酸(-3. 5);天冬醯胺(-3. 5);賴氨酸(-3. 9);和精氨酸(-4. 5)。本領域中知曉水性胺基酸指數對賦予蛋白相互作用生物學功能的重要性。Kyte等，J. Mol. Biol.(分子生物學雜誌)，157 =105-131 (1982)。已知某些胺基酸可以被具有相似水性指數或得分的另一些胺基酸置換並且仍然保留相似的生物學活性。在基於水性指數進行變化時，優選水性指數在±2之內的胺基酸置換，特別優選在±1之內的那些，並且甚至更特別優選在±0. 5之內的那些。本領域中還知曉可以基於親水性有效進行相似胺基酸的置換，特別在意欲將由此產生的生物學功能等價蛋白或肽用於免疫學實施方案的情形中，如在本情形中一樣。蛋白的最大局部平均親水性，由其相鄰的胺基酸的親水性所控制，與其免疫原性和抗原性相關，即，與蛋白的生物學特性相關。下述親水性值已經分配給胺基酸殘基精氨酸(+3. 0);賴氨酸('3. 0);天冬氨酸(+3.0±1);穀氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬醯胺(+0.2);穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2. 3);苯丙氨酸(-2. 5);色氨酸(-3. 4)。在其餘相似的親水性值進行變化時，優選親水性值在±2之內的胺基酸的置換，特別優選在±1之內的那些，甚至更特別優選在±0.5之內的那些。人們還可以基於親水性從一級胺基酸序列鑑定表位。這些表位還稱為「表位核心區」。專業技術人員將能夠利用公知的技術確定SEQ ID NO :I所示的多肽的適當的變體。為了鑑定該分子在不破壞活性的前提下可以被改變的適當區域，本領域技術人員可以靶向認為對活性不重要的區域。例如，當已知來自相同物種或來自其它物種具有相似活性的相似多肽時，本領域技術人員可以將ficolin相關多肽的胺基酸序列與所述相似多肽進行比較。利用這樣的比較，人們可以鑑定在相似多肽之間保守的該分子的殘基和部分。應該理解，在相對於所述相似多肽不保守的ficolin相關多肽的區域中的變化較不可能不利地影響ficolin相關多肽的生物學活性和/或結構。本領域技術人員還將知曉，甚至在相對保守的區域中，人們也可以用化學相似的胺基酸置換天然存在的殘基，同時保留活性(保守胺基酸殘基置換)。因此，甚至可能對生物學活性或對結構是重要的區域也可以進行保守胺基酸置換而不破壞生物學活性或不會不利地影響多肽結構。另外，本領域技術人員可以參閱鑑定相似多肽中對活性或結構重要的殘基的結構-功能研究。關於這樣的比較，人們可以預測ficolin相關多肽中與相似多肽中對活性或結構重要的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基的重要性。本領域技術人員可以為ficolin相關多肽和本發明的其它多肽所述預測的重要胺基酸殘基選擇化學相似的胺基酸置換。本領域技術人員還可以相對於相似多肽的結構分析三維結構和胺基酸序列。參考所述信息，本領域技術人員可以關於ficolin相關多肽的三維結構預測ficolin相關多肽 的胺基酸殘基的比對。本領域技術人員可以選擇不對預測在蛋白表面上的胺基酸殘基帶來根本變化，因為所述殘基可以參與與其它分子的重要的相互作用。此外，本領域技術人員可以產生在每個需要的胺基酸殘基包含單個胺基酸置換的檢測變體。然後，可以使用本文所述的活性測定法篩選所述變體。所述變體可以用來收集關於適當的變體的信息。例如，如果人們發現對特定胺基酸殘基的改變導致破壞的、不理想地減少的、或不適當的活性，將避免具有這樣的變化的變體。換言之，基於由這樣的常規實驗收集的信息，本領域技術人員可以容易地確定應該避免單獨的或與其它突變組合的其它置換的胺基酸。許多科學出版物致力於二級結構的預測。參見Moult J. , Curr. Op. in Biotech.(現代生物技術觀點雜誌)，7(4) :422-427 (1996)，Chou等，Biochemistry (生物化學)，13(2) :222-245(1974) ;Chou 等，Biochemistry (生物化學)，113 (2) :211-222(1974) ；Chou等，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47 :45-148 (1978) ；Chou 等，Ann. Rev. Biochem.(生物化學年度綜述)，47 =251-276和Chou等，Biophys. J.(生物物理學雜誌)，26 :367-384(1979)。此外，目前可以用電腦程式來輔助預測二級結構。一種預測二級結構的方法是基於同源性建模。例如，兩種具有大於30%的序列同一性或大於40%的相似性的多肽或蛋白通常具有相似的結構拓撲學。最近的蛋白質結構資料庫(TOB)的增長已經提供了提高的二級結構預測性，包括在多肽或蛋白結構中摺疊的潛在數目。參見Holm等，Nucl.Acid. Res.(核酸研究)，27 (I) :244-247 (1999)。已經提議(Brenner 等，Curr. Op. Struct.Biol.(現代結構生物學觀點)，7(3) =369-376(1997))在給定的多肽或蛋白中存在有限數目的摺疊，並且一旦已經解析了關鍵數目的結構，結構預測將獲得顯著的準確性。預測二級結構的其它方法包括"threading"(Jones, D. , Curr. Opin. Struct.Biol.(現代結構生物學觀點)，7(3) :377-87(1997) ;Sippl 等，Structure (結構)，4 (I)15-9(1996))，"模式分析"(Bowie 等，Science (科學)，253 :164-170(1991) ；Gribskov等，Meth. Enzymol.(酶學方法)，183 146-159 (1990) ；Gribskov 等，Proc. Nat. Acad. Sci.(國家科學院學報)，84(13) :4355-4358(1987)),和"進化聯繫"(參見Home，同上，和Brenner,同上)。
相關多肽的同一性和相似性可以容易地通過已知的方法計算。所述方法包括，但不限於，Computational Molecular Biology (計算分子生物學)，Lesk, A. M.編，OxfordUniversity Press (牛津大學出版社)，紐約，1988 ；Biocomputing Informatics andGenome Pro jects (生物計算信息學和基因組工程)，Smith, D. W.編，Academic Press(學院出版社)，紐約，1993 ；Computer Analysis of Sequence Data(序列數據的計算機分析)，第 I 部分，Griffin, A. Μ.，和 Griffin, H. G.編，Humana Press,新澤西，1994 ；SequenceAnalysis in Molecular Biology (分子生物學中的序列分析)，von Heinje, G. , AcademicPress (學院出版社)，1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov,M.和Devereux, J.編，M. Stockton Press,紐約，1991 ;和 Carillo 等,SIAM J. Applied Math.，48 :1073(1988)中所述的那些。確定同一性和/或相似性的優選方法設計為給出檢測序列之間的最大匹配。在公眾可用的電腦程式中記述了確定同一性和相似性的方法。確定兩種序列之間的同一性和相似性的優選的電腦程式方法包括，但不限於，GCG程序包，包括GAP (Devereux等，Nucl. Acid. Res.(核酸研究)，12 :387 (1984) ；Genetics Computer Group(遺傳計算機 組)，University of Wisconsin (威斯康辛大學)，Madison, ffis.), BLASTP, BLASTN,和FASTA (Altschul 等，J. Mol. Biol.(分子生物學雜誌)，215 :403-410 (1990))。BLASTX 程序是從 National Center for Biotechnology Information (NCBI,國立生物技術信息中心)和其它來源(BLAST Manual, Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda,Md. 20894 ；Altschul 等，同上)公眾可用的。公知的Smith Waterman算法也可以用來確定同一'丨生。用於比對兩種胺基酸序列的特定的比對方案可能導致僅兩條序列的較短區域匹配，並且該小的比對區域可能具有非常高的序列同一性，儘管在這兩條全長序列之間沒有顯著的關係。因此，在優選的實施方案中，所選的比對方法(GAP程序)將導致跨越靶多肽至少50個連續的胺基酸的比對。例如,使用計算機算法GAP(Genetics Computer Group (遺傳計算組)，Universityof Wisconsin (威斯康辛大學)，Madison, Wis.),比對要確定序列同一1丨生百分數的兩種多肽，以最佳匹配它們各自的胺基酸(「匹配的跨度」，如由該算法確定的)。缺口開口罰分(其計算為平均對角線的3倍；「平均對角線(average diagonal) 」是使用的比較矩陣的對角線的平均數；「對角線」是通過特定的比較矩陣分配給每個最佳胺基酸匹配的得分或數字)和缺口延伸罰分(其通常是缺口開口罰分的{分數(1/10)}倍)，以及比較矩陣，如PAM 250或BLOSUM 62與該算法聯合使用。該算法也使用標準的比較矩陣(關於PAM 250比較矩陣，參見 Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure,卷 5, supp. 3 (1978);關於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等，Proc. NatI. Acad. Sci USA (美國國家科學院學報)，89 :10915-10919(1992)) ο用於多肽序列比較的優選參數包括下述 算法Needleman等，J. Mol. Biol (分子生物學雜誌)，48 :443-453 (1970)；比較矩陣來自Henikoff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)，89 :10915-10919(1992)的BLOSUM 62 ;缺口罰分12，缺口長度罰分4，相似性閾值0。GAP程序使用上述參數。前述參數是使用GAP算法進行多肽比較的默認參數(與其一起對末端缺口沒有罰分)。
用於核酸分子序列比較的優選參數包括下述算法Needleman等，J. Mol Biol.(分子生物學雜誌)，48 :443_453 (1970);比較矩陣匹配=+10，不匹配=0，缺口罰分50，缺口長度罰分3。GAP程序也使用上述參數。前述參數是用於核酸分子比較的默認參數。可以使用其它示例性的算法，缺口開口罰分，缺口延伸罰分，比較矩陣，相似性閾值等，包括在Program Manual (程序手冊),WisconsinPackage,第9版，1997年9月中所述的那些。要進行的特定選擇對於本領域技術人員是顯而易見的，並且將取決於要進行的具體比較，諸如DNA與DNA比較，蛋白與蛋白比較，蛋白與DNA比較；另外，不管比較是在給定的序列對之間(在該情形中，通常優選GAP或BestFit)還是在一個序列和大的序列資料庫之間(在該情形中，優選FASTA或BLASTA)。製備本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽
本發明還涉及製備上述本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的方法。本文所述的本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽可以通過重組核酸技術產生。通常，修飾克隆的野生型FAP核酸序列來編碼需要的蛋白。然後，將該修飾的序列插入到表達載體中，其又轉化或轉染到宿主細胞中。高等真核細胞，特別是培養的哺乳動物細胞，優選作為宿主細胞。關於人FAP的完整的胺基酸和核苷酸序列通過SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2給出。胺基酸序列變化可以通過多種技術實現。核酸序列的修飾可以通過位點特異性誘變進行。關於位點特異性誘變的技術在本領域中是公知的，並且例如，記述在Zoller和Smith (DNA 3:479-488,1984)或"Splicing by extension overlap (通過延長重疊剪接)"，Horton等，Gene (基因)77，1989，第61-68頁。因此，利用FAP的核苷酸和胺基酸序列，人們可以引入選擇的變化。同樣地，關於使用特異性引物利用聚合酶鏈式反應製備DNA構建體的方法是本領域技術人員公知的(參見PCR Protocols (PCR流程),1990, AcademicPress (學院出版社),San Diego, California,美國)。本發明的多肽還可以包括非天然存在的胺基酸殘基。非天然存在的胺基酸包括，但不限於，丙氨酸，去氨基組氨酸，反式-3-甲基脯氨酸，2，4_甲醇基脯氨酸，順式-4-羥基脯氨酸，反式-4-羥基脯氨酸，N-甲基甘氨酸，別-蘇氨酸，甲基蘇氨酸，羥基乙基半胱氨酸，羥基乙基高半胱氨酸，硝基穀氨醯胺，高穀氨醯胺，哌可酸，噻唑烷羧酸，脫氫脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，3，3- 二甲基脯氨酸，叔-亮氨酸，正-纈氨酸，2-氮雜苯丙氨酸，3-氮雜苯丙氨酸，4-氮雜苯丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。本領域已知一些用於將非天然存在的胺基酸殘基結合到多肽中的方法。例如，可以使用體外系統，其中使用化學氨基醯化的阻抑物tRNAs抑制無義突變。用於合成胺基酸和氨基醯化tRNA的方法在本領域中是已知的。在不含細胞的系統中進行包含無義突變的質粒的轉錄和翻譯，所述不含細胞的系統包括大腸桿菌(E. coli) S30提取物和商購的酶和其它試劑。通過層析純化多肽。參見，例如，Robertson 等，J. Am. Chem. Soc.(美國化學學會雜誌)113 :2722,1991 ；Ellman 等，MethodsEnzymol.(酶學方法)202 301,1991 ;Chung 等，Science (科學)259 :806-9,1993 JPChung等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)90 :10145-9，1993)。在第二種方法中，通過顯微注射突變的mRNA和化學氨基醯化的阻抑物tRNAs在爪蟾卵母細胞中進行翻譯(Turcatti等，J. Biol. Chem.(生物化學雜誌)271 :19991-8，1996)。在第三種方法中，將大腸桿菌細胞在缺乏要被替代的天然胺基酸(例如苯丙氨酸)和存在需要的非天然存在的胺基酸(例如，2-氮雜苯丙氨酸，3-氮雜苯丙氨酸，4-氮雜苯丙氨酸，或4-氟苯丙氨酸)的條件下培養。所述非天然存在的胺基酸結合到多肽中替換其天然負體。參見，Koide等，Biochem.(生物化學)33 :7470-6,1994。天然存在的胺基酸殘基可以通過體外化學修飾轉化為非天然存在的種類。化學修飾可以與定點誘變組合，以進一步擴大置換的範圍(Wynn和 Richards，Protein Sci.(蛋白質科學)2 :395_403，1993)。編碼本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽的核酸構建體可以適當地是基因組或cDNA來源的，例如，通過製備基因組或cDNA文庫並且通過按照標準技術(參見Samtoook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第 2 版· ColdSpring Harbor Labora-tory (冷泉港實驗室)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989)使用合成的寡核苷酸探針雜交來篩選編碼該多肽的全部或部分的DNA序列而獲得。編碼Ficolin相關多肽的核酸構建體還可以通過建立的標準方法合成製備，所述建立的標準方法，例如，Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Letters (四面體通信)22(1981) ,1859-1869 所述的磷醯亞胺法，或 Matthes 等，EMBO Journal (ΕΜΒ0 雜誌)3 (1984)，801-805所述的方法。按照磷醯亞胺方法，合成寡核苷酸，例如，在自動化DNA合成儀中合成，純化，退火，連接並且克隆到適當的載體中。編碼本發明的人Fi Co I in相關多肽和其它多肽的DNA序列還可以通過使用特定引物的聚合酶鏈式反應製備，例如，如在下述中所述US 4,683,202，Saiki 等，Science (科學)239 (1988)，487-491，或 Sambrook等，同上。此外，核酸構建體可以是按照標準技術通過連接合成的、基因組或cDNA來源的片段(適當地)而製備的混合的合成的和基因組、混合的合成的和cDNA或混合的基因組和cDNA來源的，所述片段對應於完整核酸構建體的不同部分。核酸構建體優選地是DNA構建體。用於產生本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列典型地編碼在FAP氨基端的前-原多肽，從而獲得正確的翻譯後加工和從宿主細胞分泌。編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列通常插入到重組載體中，其可以是任何載體，其可以便利地進行重組DNA步驟，並且載體的選擇通常取決於要引入載體的宿主細胞。因此，載體可以是自發複製的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如質粒。備選地，載體可以是這樣一種載體，即，當引入到宿主細胞中時，其整合到宿主細胞基因組中並且與其已經整合到其中的染色體一起複製。載體優選是表達載體，其中編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列可操作地連接到該DNA轉錄所需要的另外的片段上。通常，表達載體來源於質粒或病毒DNA，或可以包含二者的組件。術語「可操作地連接」表示所述片段這樣排列，以使它們按照它們需要的目的行使功能，例如，轉錄由啟動子起始並且沿著編碼多肽的DNA序列進行。用於表達本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽的表達載體包含能夠指導克隆的基因或cDNA轉錄的啟動子。啟動子可以是任意DNA序列，其在選擇的宿主細胞中表現出轉錄活性，並且可以來源於對所述宿主細胞來說是同源或異源的編碼蛋白的基因。在哺乳動物細胞中指導編碼人Ficolin相關多肽的DNA的轉錄的適當的啟動子的 實例是 SV40 啟動子(Subramani 等，Mo I. Cell Biol.(分子細胞生物學)I (1981)，854-864)，MT-I (金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter 等，Science (科學)222 (1983)，809-814)，CMV啟動子(Boshart等，Cell (細胞)41 =521-530,1985)或腺病毒2主要晚期啟動子(Kaufman和 Sharp, Mol. Cell. Biol (分子細胞生物學)，2 :1304-1319，1982)。用於昆蟲細胞的適當的啟動子的實例是多角體蛋白啟動子(US4，745，051 ；Vasuvedan 等，FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), PlO 啟動子(J. M. Vlak 等，J. Gen. Virology (基因病毒學雜誌)69，1988，第765-776頁)，苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒基本蛋白啟動子(Autographa californica polyhedrosis virus basic protein promoter)(EP 397485)，杆狀病毒即時早期基因I啟動子(US 5, 155,037 ；US 5，162，222)，或杆狀病毒39K延遲早期基因啟動子(US 5，155，037 ；US 5，162，222)。用於酵母宿主細胞中的適當的啟動子的實例包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J. Biol. Chem.(生物化學雜誌)255 (1980)，12073-12080 ;Alber 和 Kawasaki, J. Mol.Appl. Gen.(分子應用遺傳學雜誌)I (1982)，419-434)或醇脫氫酶基因(Young等，在Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (關於化學的微生物遺傳學改造)(HoiIaender 等編)，Plenum Press,紐約，1982)的啟動子，或 TPIl (US 4, 599, 311)或ADH2-4c (Russell 等，Nature (自然)304 (1983)，652-654)啟動子。 用於絲狀真菌宿主細胞的適當的啟動子的實例為，例如，ADH3啟動子(McKnight等，The EMBO J. (ΕΜΒ0雜誌)4(1985) ,2093-2099)或tpiA啟動子。其它有用的啟動子的實例是來源於編碼米麴黴(A. oryzae)TAKA澱粉酶、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(A.niger)中性α -澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴(A. awamori)葡糖澱粉酶(gluA)、米赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶或構巢麴黴(A. nidulans)乙醯胺酶的基因。優選的是TAKA-澱粉酶和gluA啟動子。適當的啟動子例如在EP 238023和EP 383 779中提及。如果需要，編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列還可以可操作地連接到適當的終止子上,諸如人生長激素終止子(Palmiter等，Science (科學)222,1983，第 809-814 頁)或 TPIl (Alber 和 Kawasaki，J. Mol. Appl. Gen.(分子應用遺傳學雜誌)1，1982，第 419-434 頁)或 ADH3 (McKnight 等，The EMBO J. (ΕΜΒ0 雜誌)4，1985，第2093-2099頁)終止子。表達載體還可以包含位於啟動子下遊和FAP序列本身插入位點的上遊的一組RNA剪接位點。優選的RNA剪接位點可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因獲得。表達載體中還包含位於插入位點下遊的多腺苷化信號。特別優選的多腺苷化信號包括來自SV40的早期或晚期多腺苷化信號(Kaufman和Sharp，同前)，來自腺病毒5Elb區的多腺苷化信號，人生長激素基因終止子(DeNoto等Nucl. Acids Res.(核酸研究)9 :3719_3730，
1981)或來自人FAP基因或牛FAP基因的多腺苷化信號。表達載體還可以包括非編碼的病毒前導序列，諸如腺病毒2三聯前導序列，其位於啟動子和RNA剪接位點之間；和增強子序列，諸如SV40增強子。為了將本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽導向宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也已知為前導序列，前原序列或前序列)。將分泌信號序列與編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列在正確的閱讀框中連接。分泌信號序列通常位於編碼所述肽的DNA序列的5'。分泌信號序列可以通常與所述蛋白相關或可以來自於編碼另一種分泌的蛋白的基因。對於從酵母細胞中分泌，分泌信號序列可以編碼任意信號肽，其確保將所表達的本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽有效導向細胞的分泌途徑。信號肽可以是天然存在的信號肽，或其功能部分，或其可以是合成的肽。已經發現適當的信號肽為α因子信號肽(參見US 4，870，008)，小鼠唾液澱粉酶的信號肽(參見O. Hagenbuchle等，Nature (自然)289，1981，第643-646頁)，修飾的羧肽酶信號肽(參見L. A. Valls等，Cell (細胞)48，1987，第887-897頁)，酵母BARl信號肽(參見WO 87/02670)，或酵母天冬氨酸蛋白酶3 (YAP3)信號肽(參見 M. Egel-Mitani 等，Yeast 6，1990，第 127-137 頁)。對於在酵母中的有效分泌，還可以將編碼前導肽的序列插入在信號序列的下遊且在編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列的上遊。前導肽的功能是允許所表達的肽被從內質網導向高爾基體並且進一步至分泌小泡，從而分泌到培養基中(即，將本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽輸出到細胞壁外或至少通過細胞膜進入到酵母細胞的周質空間)。前導肽可以是酵母α因子前導(其應用記述在例如US 4，546，082，US 4,870，008，EP 16 201，EP 123 294，EP 123 544 和 EP 163 529 中)。備選地，前導肽可以是合成的前導肽，認為其不是天然存在的前導肽。合成的前導肽可以，例如，如WO89/02463 或 WO 92/11378 中所述構建。 對於在絲狀真菌中的應用，信號肽可以便利地來源於編碼麴黴屬澱粉酶或葡糖澱粉酶的基因、編碼米赫根毛黴脂肪酶或蛋白酶或柔毛腐質黴(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。信號肽優選地來源於編碼米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性澱粉酶或黑麴黴葡糖澱粉酶的基因。適當的信號肽公開在例如EP 238 023和EP215 594 中。對於在昆蟲細胞中的應用，信號肽可以便利地來源於昆蟲基因(參見WO90/05783)，諸如鱗翅類菸草天蛾(Manduca sexta)脂肪動員激素前體信號肽(參見US5，023，328)。用於分別連接編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列、啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列，並將它們插入到包含複製所必需的信息的適當的載體中的步驟，是本領域技術人員公知的(參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989)。轉染哺乳動物細胞並且表達引入到細胞中的DNA序列的方法記述在，例如Kaufman 和 Sharp, J. Mol. Biol.(分子生物學雜誌)159 (1982)，601-621 ；Southern 和Berg, J. Mol. Appl. Genet.(分子應用遺傳學雜誌)I (1982)，327-341 ； Loyter 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)79 (1982)，422-426 ；ffigler 等，Cell (細胞)14 (1978), 725 ;Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics (體細胞遺傳學)7 (1981),603, Graham和 van der Eb, Virology (病毒學)52 (1973), 456 ;和 Neumann 等，EMB0J. (ΕΜΒ0 雜誌)1(1982)，841-845 中。克隆的DNA序列通過例如，磷酸I丐介導的轉染(Wigler等，Cell (細胞)14 :725-732，1978 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (體細胞遺傳學)7 :603-616,1981 ;Graham 和 Van der Eb, Virology (病毒學)52d :456-467,1973)或電穿孔(Neumann等，EMBO J. (ΕΜΒ0雜誌)1 =841-845,1982)引入到培養的哺乳動物細胞中。為了鑑定並且選擇表達外源DNA的細胞，通常將賦予可選擇表型的基因(可選擇的標記)與目的基因或cDNA—起引入到細胞中。優選的可選擇標記包括賦予藥物(諸如新黴素、潮黴素和甲氨蝶呤)抗性的基因。可選擇的標記可以是可擴增的選擇標記。優選的可擴增的選擇標記是二氫葉酸還原酶(DHFR)序列。可選擇的標記由Thilly綜述(Mammalian Cell Technology (哺乳動物細胞技術)，Butterworth Publishers, Stoneham, MA,通過引用結合在本文中)。本領域技術人員將容易的能夠選擇適當的可選擇標記。可選擇的標記可以在分離的質粒上與目的基因同時引入到細胞中，或者它們可以在同一質粒上引入到細胞中。如果在同一質粒上，所述可選擇的標記和目的基因可以處在不同啟動子或相同啟動子的控制之下，後一種排列產生雙順反子信使。這種類型的構建體在本領域中是已知的(例如，，Levinson和Simonsen,U. S. 4, 713, 339)。也可以有利地將另外的DNA (已知為「載體DNA 」 )添加到引入到細胞中的混合物中。在細胞已經攝入該DNA後，它們在適當的培養基中生長，典型地生長1-2天，開始表達目的基因。當用在本文中時，術語「適當的生長培養基」意指包含細胞生長和目的人Ficolin相關多肽表達所需要的營養物和其它成分的培養基。培養基通常包括碳源、氮源、必需胺基酸、必需糖類、維生素、鹽、磷脂、蛋白和生長因子。然後，應用藥物選擇來選擇以穩 定方式表達所述可選擇標記的細胞的生長。對於已經轉染了可擴增的選擇標記的細胞，可以增加藥物濃度，以選擇增加拷貝數目的克隆序列，由此增加表達水平。然後篩選穩定轉染的細胞的克隆對目的人Ficolin相關多肽的表達。引入編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列的宿主細胞可以是任何細胞，其能夠產生翻譯後修飾的人多肽，並且包括酵母、真菌和高等真核細胞。用於本發明的哺乳動物細胞系的實例為COS-UATCC CRL 1650)，幼倉鼠腎(BHK)和 293 (ATCC CRL 1573 ；Graham 等，J. Gen. Virol.(遺傳病毒學雜誌)36 :59-72,1977)細胞系。優選的 BHK 細胞系是 tk_tsl3 BHK 細胞系(Waechter 和 Baserga,Proc. Natl. Acad.Sci. USA (美國國家科學院學報)79 :1106-1110，1982，其通過弓I用結合於此)，以下稱為BHK570細胞。BHK 570細胞系已經保藏在美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Dr.，Rockville，Md. 20852)，ATCC 保藏號為 CRL 10314。。tk-tsl3 BHK細胞系也可從ATCC獲得，其保藏號為CRL 1632。另外，多種其他細胞系可以用在本發明中，包括大鼠H印I (大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印11(大鼠肝細胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)，CHO (ATCC CCL 61)和 DUKX 細胞(Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)77 =4216-4220,1980)。適當的酵母細胞的實例包括酵母屬(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母屬(Schizosac-charomyces spp.)的細胞，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或Saccharomyces kluyveri的菌株。用異源DNA轉化酵母細胞並且由其生產異源多肽的方法記述在，例如，US 4, 599, 311,US 4, 931, 373,US 4，870，008，5，037，743，和 US 4, 845, 075中，所有這些通過引用結合於此。轉化的細胞通過可選擇的標記確定的表型進行選擇，所述表型通常是藥物抗性或在缺乏特定營養物(例如亮氨酸)的條件下生長的能力。用在酵母中的優選載體是US 4，931，373中公開的POTl載體。編碼本發明的人Ficolin相關多肽和其它多肽的DNA序列可以在信號序列之後，並且任選在前導序列之後，例如，如上述。適當的酵母細胞的其他實例為克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌株,諸如乳酸克魯維酵母(K. lactis),漢遜酵母屬(Hansenula),例如多形漢遜酵母(H. poIymorpha),或畢赤酵母屬(Pichia),例如巴斯德畢赤酵母(P. pastor is)(參見 Gleeson 等,J. Gen. Microbiol.(遺傳微生物學雜誌)132，1986，第 3459-3465 頁；US 4，882，279)。其他真菌細胞的實例是絲狀真菌的細胞,例如，麴黴屬(Aspergillus spp.),鏈孢黴屬(Neurospora spp·),鍵刀菌屬(Fusarium spp.)或木黴屬(Trichoderma spp·),特別是米麴黴、構巢麴黴或黑麴黴的菌株。應用麴黴屬進行蛋白表達記述在，例如EP 272 277，EP 238 023, EP 184 438 中。尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)的轉化,例如，如 Malardier 等，1989，Gene (基因)78 :147-156所述進行。例如，木黴屬的轉化可以如EP 244 234所述進行。當使用絲狀真菌作為宿主細胞時，其可以轉化本發明的DNA構建體，便利地通過將DNA構建體整合到宿主染色體中而獲得重組宿主細胞。該整合通常認為是有利的，因為DNA序列更可能穩定地保持在細胞中。將DNA構建體整合到宿主染色體中可以按照常規方法進行，例如，通過同源或異源重組進行。昆蟲細胞的轉化和其中異源多肽的產生可以如US 4，745，051 ；US4, 879，236 ；US
5,155,037 ；5, 162, 222 ；EP 397，485所述進行，所有這些通過引用結合於此。用作宿主的昆蟲細胞系可以適當地為鱗翅目(Lepidoptera)細胞系，諸如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞(參見US 5,077,214)。培養條件可以適當地如例如WO 89/01029或WO 89/01028中所述，或前文提及的任意參考文獻中所述。然後，在允許人Ficolin相關多肽表達的條件下，在適當的營養培養基中培養上述轉化的或轉染的宿主細胞，之後可以從培養物中回收全部或部分得到的肽。用於培養細胞的培養基可以是適於宿主細胞生長的任意常規培養基，諸如最小培養基或包含適當的補充物的複雜培養基。適當的培養基可從商業供應商獲得，或可以按照公布的配方製備(例如，在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)的目錄中)。然後，可以通過常規步驟從培養基中回收由所述細胞產生的人Ficolin相關多肽，包括通過離心或過濾從培養基中分離宿主細胞，通過鹽(例如硫酸銨)沉澱上清或濾過物的蛋白質樣成分，通過各種層析方法純化，例如離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析等，這取決於所討論的多肽的類型。可以利用轉基因動物技術來生產本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽。優選地在雌性哺乳動物宿主的乳腺中產生所述蛋白。在乳腺中表達隨後將目的蛋白分泌到乳中克服了從其它來源分離蛋白所遇到的許多困難。乳容易收集，可以大量獲得，並且生物化學充分表徵。此外，主要的乳蛋白以高濃度存在於乳中(典型地約I至15g/l)。從商業觀點來看，清楚地，優選使用具有高的乳產率的物種作為宿主。儘管可以使用較小的動物，如小鼠和大鼠(並且在驗證證據階段是優選的)，但是優選使用家畜哺乳動物，包括但不限於，豬、山羊、綿羊和牛。特別優選綿羊，原因在於諸如這一物種先前的轉基因史、乳產率、成本和用於收集綿羊奶的設備的容易獲得性的因素(參見，例如，W088/00239，關於影響宿主物種選擇的因素的比較)。通常理想地選擇已經關於乳業用途育種的宿主動物品種，諸如東弗裡斯蘭綿羊(East Friesland sheep),或近來通過轉基因品 系育種引入奶場中的牛羊。在任一種事件中，應該使用已知的、健康狀況良好的動物。
為了獲得在乳腺中的表達，使用來自乳蛋白基因的轉錄啟動子。乳蛋白基因包括編碼酪蛋白(參見U. S. 5，304，489)、β乳球蛋白、a乳清蛋白、和乳清酸性蛋白的那些基因。β乳球蛋白(BLG)啟動子是優選的，在綿羊β乳球蛋白基因的情形中，通常使用該基因5'側連序列至少最近的406bp的區域，儘管優選較大的5'側連序列部分，至多約5kbp，如包含5'側連啟動子和β乳球蛋白基因的非編碼部分的 4. 25kbp DNA片段(參見Whitelaw等，Biochem. J.(生物化學雜誌)286 :31 39(1992))。來自其他物種的相似的啟動子DNA片段也是合適的。β乳球蛋白基因的其他區域也可以結合到構建體中，待表達的基因的基因組區域也可以結合到構建體中。在本領域中通常接受的是，缺少內含子的構建體，例如，與包含所述DNA序列的那些相比,表達很差(參見，Brinster等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)85 :836 840(1988) ;Palmiter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)88:478 482(1991) ;Whitelaw 等，Transgenic Res.(轉基因研究)1:3 13(1991)；WO 89/01343 ;和冊91/02318，它們分別通過引用結合於此)。在這一點上，通常優選的是，在可能時，使用包含編碼目的蛋白或多肽的基因的全部或一些天然內含子，因此優選進一步包含至少一些來自例如β乳球蛋白基因的內含子。一個這樣的區域是來自綿羊β乳球 蛋白基因的3'非編碼區的提供內含子剪接和RNA多腺苷化的DNA序列。當置換基因的天然3'非編碼序列時，該綿羊β乳球蛋白片段可以提高並且穩定目的蛋白或多肽的表達水平。在其他實施方案中，在FAP序列的起始ATG周圍的區域用來自乳特異性蛋白基因的相對應序列替換。這樣的替換提供推定的組織特異性起始環境，從而增強表達。儘管可以替換較小的區域，但是便利地用例如BLG基因替換完整的FAP前原和5'非編碼序列。對於在轉基因動物中表達本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽，將編碼FAP的DNA片段可操作地連接到其表達所需要的另外的DNA片段上，從而產生表達單位。所述另外的片段包括上文提及的啟動子，以及為轉錄終止和mRNA多腺苷化提供的序列。表達單位另外包括編碼分泌信號序列的DNA片段，其可操作地與編碼修飾的FAP的片段連接。分泌信號序列可以是天然FAP分泌信號序列或可以是另一種蛋白(如乳蛋白)的分泌信號序列(參見，例如，von Heijne, Nucl. Acids Res.(核酸研究)14 :4683 4690 (1986);和 Meade等，U. S. 4，873，316，其通過引用結合於此)。儘管表達單位可以基本上通過任意序列連接而構建，但是用於轉基因單位的表達單位的構建便利地通過將FAP序列插入到包含另外的DNA片段的質粒或噬菌體載體中進行。特別便利地提供包含編碼乳蛋白的DNA片段的載體，並且用FAP變體的編碼區替換乳蛋白的編碼區；由此產生包括乳蛋白基因的表達控制序列的基因融合體。在任意情形中，表達單位克隆到質粒或其他載體中促進FAP序列的擴增。擴增便利地在細菌(例如大腸桿菌)宿主細胞中進行，由此該載體典型地包括在細菌宿主細胞中起作用的複製起點和可選擇的標記。然後，將表達單位引入到所選宿主物種的受精卵(包括早期階段的胚胎)中。異源DNA的引入可以通過數種途徑中的一種完成，所述途徑包括顯微注射(例如美國專利號 4，873，191)，反轉錄病毒感染(Jaenisch, Science (科學)240 1468 1474 (1988))或使用胚胎幹(ES)細胞的位點定向整合(由Bradley等，Bio/Technology (生物技術)10 534 539(1992)綜述)。然後，將卵植入到假孕雌性中的輸卵管或子宮中，並且允許發育成至足月。在其種系中攜帶引入的DNA的後代可以將該DNA以正常的、孟德爾方式傳遞給它們的後代，允許轉基因群體的發育。用於產生轉基因動物的通用方法在本領域中是已知的(參見，例如，General procedures for producing transgenic animals are known inthe art(see, for example, Hogan Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual (操作小鼠胚胎實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室),1986 ；Simons 等，Bio/Technology(生物技術)6 :179 183(1988) ；ffall 等，Biol.Reprod.(生物學繁殖)32 :645 651 (1985) ；BuhIer 等，Bio/Technology (生物技術)8 140143 (1990) ;Ebert 等,Bio/Technology (生物技術)9 :835 838(1991) ;Krimpenfort 等，Bio/Technology (生物技術)9 :844 847(1991) ;Wall 等，J. Cell. Biochem.(細胞生物化學雜誌)49:113 120(1992) ；U. S. 4, 873, 191 ；U. S. 4, 873, 316 ；W0 88/00239,WO 90/05188,WO92/11757 ;和GB87/00458)。用於將外源DNA序列引入到哺乳動物和它們的種系細胞中的技術最初在小鼠中開展(參見，例如，Gordon等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)77:7380 7384(1980) ;Gordon 和 Ruddle，Science (科學)214 :1244 1246(1981)；Palmiter 和 Brinster, Cell (細胞)41 :343345 (1985) ；Brinster 等,Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國國家科學院學報)82 :4438 4442(1985);和Hogan等(同前))。這些技術隨後適用於更大的動物，包括家畜物種(參見，例如，WO 88/00239，WO 90/05188，和W092/11757 ； 和Simons等,Bio/Technology (生物技術)6 :179 183(1988))。總結來說，目前用於產生轉基因小鼠或家畜的最有效的途徑中，按照建立的技術，將數百個線性目的DNA分子注射到受精卵的一個前核中。也可以使用將DNA注射到合子的細胞質中。還可以利用在轉基因植物中的生產。表達可以是普遍的或導向特定的器官，諸如塊莖(參見，Hiatt, Nature (自然)344 :469 479(1990) ;Edelbaum 等，J. Interferon Res.(幹擾素研究雜誌)12 :449 453(1992) ;Si jmons 等，Bio/Technology (生物技術)8 :217221(1990) JPEP O 255 378)FAP 純化本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽可以從細胞培養基或乳中回收。本發明的Ficolin相關多肽和其它多肽可以通過本領域已知的多種方法純化，包括但不限於，層析(例如，離子交換，親和性，疏水，層析聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，製備級等電聚焦(IEF),差別性溶解性(例如,硫酸銨沉澱)，或提取(參見,例如,Protein Purification (蛋白純化)，J.-C. Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers,紐約，1989)。優選地，它們可以通過在抗-FAP抗體柱上的親和層析進行純化。另外的純化可以通過常規化學純化手段實現，諸如高效液相色譜。其他純化方法，包括檸檬酸鋇沉澱，是本領域中已知的，並且可以應用於純化本文所述的新型Ficolin相關多肽和其他多肽(參見,例如，Scopes, R. , ProteinPurification (蛋白純化)，Springer-Verlag, N. Y.，1982)。為了治療目的，優選本發明的Ficolin相關多肽和其他多肽是基本上純的。因此，在本發明的優選實施方案中，本發明的(Ficolin相關多肽)和其他多肽純化至至少約90-95 %的均質性，優選至至少約98 %的均質性。純度可以通過例如凝膠電泳和氨基端胺基酸測序評估。術語「分離的多肽」是指本發明的多肽⑴已經與其天然相關的至少約50%的多核苷酸、脂質、糖類或其他物質(即汙染物)分離。優選地，所述分離的多肽基本上不含任意其他汙染多肽或其他在其天然環境中存在的汙染物，其將幹擾其治療、診斷、預防或研究應用。術語「微生物」用在本文中是指細菌、真菌、古細菌、原生生物；微型植物和動物(諸如綠藻或浮遊生物)，渦蟲和變形蟲。該定義包括病原體微生物。測定法關於SDS-PAGE和蛋白質印跡的通用步驟如供應商推薦，使用NuPAGE 系統(Invitrogen)，用不連續的緩衝液，在10%或4-12% (w/v)Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。蛋白質印跡使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, GE-healthcare，Hilleroed，丹麥，貨號 RPN303F)，2 μ g/ml 生物素標記的一級單克隆抗體和通過在PBS，0. 05%吐溫20中I : 1500稀釋的HRP綴合的鏈黴抗生物素蛋白(P0397，Dako, Glostrup，丹麥)進行二級顯現而進行。將膜用在丙酮和在50mM檸檬酸鈉緩衝液pH 5中的O. 015% H2O2中的O. 04% 3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma-aldrich,fcoenby，丹麥，貨號 A5754-100G)顯影。共免疫沉澱甘露糖結合凝集素(MBL)血清複合物的免疫沉澱將Iml正常人血清I : I稀釋在TBS (IOmM Tris,140mM NaCl，pH 7.5)中，並且在4°C用5yg MBL特異性小鼠單克隆抗體 Hyb 131-11 (Bioporto, Gentoffe,丹麥)顛倒溫育 I 小時。Ficolin-2血清複合物的免疫沉澱將O. 5ml正常人血清I : I稀釋在TBS(IOmMTris,140mM NaCl，pH 7.5)中，並且在4°C用5yg Ficolin-2特異性小鼠單克隆抗體Hyb219 (Munthe-Fog L,等)顛倒溫育I小時。
Ficolin-3血清複合物的免疫沉澱將O. 2ml正常人血清I : I稀釋在TBS(IOmMTris,140mM NaCl，pH 7.5)中，並且在4°C用5yg Ficolin-3特異性小鼠單克隆抗體Hyb334 (Munthe-Fog L,等)顛倒溫育I小時。免疫複合物沉澱用綿羊抗小鼠IgG綴合的磁dynal珠(Dynal-Invitrogen,貨號112. 02D)進行在用血清和一級抗體(如上文)溫育後，添加5xl07個綿羊抗小鼠綴合的磁dynal珠，並且在4°C溫育30分鐘。將珠子磁力分離並且用TBS-吐溫-Ca2+(10mM Tris,140mM NaCl，0. 05%吐溫，5mM CaCl2, pH 7.5)洗滌3次，最後在SDS-上樣緩衝液中煮沸，並且通過SDS-PAGE和蛋白質印跡進行分析，蛋白質印跡使用生物素標記的單克隆抗體mAb-8B3 (與MASP-I和-3共有的重鏈/A鏈上的表位反應)進行。FAP的免疫親和純化按供應商推薦，將IOmg mAb_8B3 (與FAP、MASP-I和-3共有的重鏈/A鏈上的表位反應)或IOmg兔多克隆抗FAP抗體綴合到CNBr活化的瓊脂糖(GE-healthcare，Hilleroed，丹麥，貨號17-0430-01)上並且填充到柱子上。從血清純化將150ml正常人血清的匯聚液用TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA(IOmMTris,640mM NaCl,10mM EDTA，pH 7.5)1 I稀釋，並且上樣到上述柱上。將該柱用11TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA洗滌，並且用IM甘氨酸-HCl，pH 2. 5洗脫Iml級分，並且通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析,蛋白質印跡使用生物素標記的單克隆抗體mAb-8B3進行。重組FAP的純化將來自表達重組FAP (rFAP)的中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)的
2-3 I培養物上清(來自CHO無血清培養基/Gibco-Invitrogen，貨號12651-014)上樣到上述抗體柱上。將該柱用I. 5 1TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA洗滌，並且用IM甘氨酸-HCl，pH 2. 5洗脫Iml級分。洗脫的級分通過SDS-PAGE和考馬斯染色進行分析。
FAP 的重組表達從Genscript (Genscript,New Jersey,美國)定購插入全長cDNA的 pcDNA5/FRT 載體(Invitrogen,貨號 V6010-20),並且與 pOG44 載體(Invitrogen,貨號V6005-20)共轉染到CHO Flp-In細胞系(Invitrogen，貨號R758-07)中，並且按供應商推薦(Invitrogen)進行選擇和克隆。將細胞生長在Freestyle CHO無血清培養基(Invitrogen,貨號12651-014)中，收集培養物上清並且進行分析。單克隆和多克隆抗體的產生按供應商推薦(Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois,美國),使用半胱氨酸偶聯方法,用間-馬來醯亞胺苯甲醯基_N_輕基琥拍醯亞胺酯，將FAP特異性17個C-端殘基的肽構建體(定購自Genscript, New Jersey,美國)偶聯到破傷風和白喉的類毒素形式上。6隻小鼠和2隻兔每隻用吸附到Al (OH) 3和弗氏不完全佐劑上的25 μ g抗原免疫3次(間隔14天)。利用ELISA，使用偶聯到蛋白載體上的不同FAP肽，評估多克隆抗體滴度。
在第一次、第二次和第三次免疫後14天收集多克隆兔抗血清( IOml)。兩隻小鼠用於生產單克隆抗體。在融合前4天，小鼠接受靜脈內注射25 μ g抗原。融合按他處所述進行(Kohler, G.和 C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fusedcells secreting antibody of predefined specificity(分泌預定特異性抗體的融合細胞的連續培養)· Nature (自然)256 =495-497)。克隆通過針對偶聯到不同蛋白載體上的肽的差別性ELISA篩選進行選擇。功能性補體測定法使用Ficolin-3和MBL純合子缺陷型血清來研究FAP功能。Ficolin-3 測定法將 Maxisorp 平板(NUNC，Roskilde，丹麥，貨號 439454)在 4°C在包被緩衝液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.5)中用5 μ g/ml乙醯化的牛血清白蛋白包被12小時。在巴比妥/吐溫緩衝液(4mM巴比妥，145mM NaCl, 2mM CaCl2, ImM MgCl2, pH
7.4+0. 05%吐溫)中封閉/洗滌4次後，加入在巴比妥/吐溫緩衝液中500ng/ml的重組人Ficolin-3，並且在20°C搖動溫育I. 5小時。在巴比妥/吐溫緩衝液中洗滌平板兩次後，在分離的平板的第一維度上，加入連續稀釋的作為無血清培養基培養物上清的重組FAP，人MASP-1,-2或-3，並且在20°C搖動溫育I小時。在巴比妥/吐溫緩衝液中洗滌平板兩次後，在平板的第二維度上，加入連續稀釋的Ficolin-3或MASP-2缺陷型血清，並且在37°C溫育30分鐘。在巴比妥/吐溫緩衝液中洗滌平板四次後，通過在20°C用I : 2000稀釋的針對人C4c的多克隆兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號Q0369)溫育I小時，然後4次洗滌步驟，並且在20°C用辣根過氧化物酶綴合的豬抗兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號P0399)溫育45分鐘而測量補體因子C4的沉積。通過將平板用100 μ I/孔溶解在具有0. 12%。(ν/V) H2O2的檸檬酸緩衝液(35mM檸檬酸，65mM Na2PO4, pH 5)中的鄰-苯二胺(OPD) (O. 4mg/ml)顯色而獲得信號。用IM H2SO4終止酶反應，並且使用V-max動力學-讀數儀(分子裝置(Molecular Devices))在 490nm-650nm 測量光學密度(OD)水平。甘露糖結合凝集素測定法將Maxisorp平板(NUNC，Roskilde,丹麥，貨號439454)在 4°C在包被緩衝液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.5)中用 10 μ g/ml 甘露聚糖(Sigma-aldrich,Broenby,丹麥,貨號M7504-1G)包被12小時。在巴比妥/吐溫緩衝液(4mM 巴比妥，145mMNaCl，2mM CaCl2, ImM MgCl2,pH 7.4+0. 05%吐溫)中封閉 /洗滌4次後，加入在巴比妥/吐溫緩衝液中0. 5 μ g/ml的重組人甘露糖結合凝集素，並且在20°C搖動溫育I. 5小時。在巴比妥/吐溫緩衝液中洗滌平板兩次後，在分離的平板的第一維度上，加入連續稀釋的作為無血清培養基培養物上清的重組FAP，人MASP-I，-2或-3，並且在20°C搖動培養I小時。在巴比妥/吐溫緩衝液中洗滌平板兩次後，在平板的第二維度上，加入連續稀釋的MBL或MASP-2缺陷型血清，並且在37°C溫育45分鐘。在巴比妥/吐溫緩衝液中洗滌平板四次後，通過在20°C用I : 2000稀釋的針對人C4c的多克隆兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號Q0369)溫育I小時，然後4次洗滌步驟，並且在20°C用辣根過氧化物酶綴合的豬抗兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號P0399)溫育45分鐘而測量補體因子C4的沉積。通過將平板用100 μ I/孔溶解在具有O. 12%。(ν/ν)Η202的檸檬酸緩衝液(35mM檸檬酸，65mMNa2PO4,pH 5)中的鄰-苯二胺(OPD) (O. 4mg/ml)顯色而獲得信號。用IM H2SO4終止酶反應，並且使用V-max動力學-讀數儀(分子裝置(Molecular Devices))在490nm-650nm測量光學密度(OD)水平。基因分型測定法可以進行不同的基因分型測定法，其中使用生物學測定法確定個體中的基因型。可以使用不同種類的測定法，諸如 基於雜交的方法O動態等位基因特異性雜交O分子指示標ο SNP 微陣列·基於酶的方法ο限制性片段長度多態性ο基於PCR的方法ο Flap內切核酸酶ο引物延伸。5』_ 核酸酶ο寡核苷酸連接酶測定法·基於DNA物理特性的其它擴增後方法ο單鏈驗證多態性ο溫度梯度凝膠電泳ο變性高效液相色譜O完整擴增子的高解析度解鏈ο SNPlex·測序施用和藥物組合物組合治療 本說明書中定義的ficolin相關多肽可以與選自Ficolin_l、2、3,和甘露糖結合凝集素(MBL)的一種或多種蛋白同時或先後施用。因子可以提供在單一劑型中，其中所述單一劑型包含兩種化合物，或以部件試劑盒的形式提供，所述部件試劑盒包括作為第一單位劑型的ficolin相關多肽製劑和作為第二單位劑型的所述一種或多種其它化合物的制齊U。不管在整個說明書中何時提及第一或第二或第三單位劑量等，這不表示施用的優選次序，而是僅為了便利的目的這樣提及。
ficolin相關多肽製劑和一種或多種其它化合物的製劑「同時」給藥意指施用處在單一劑型中的化合物，或施用第一藥劑，然後施用第二藥劑，時間間隔不超過15分鐘，優選10分鐘，更優選5分鐘，更優選2分鐘。任何一種因子可以最先施用。「先後」給藥意指施用第一藥劑，然後施用第二藥劑，時間間隔超過15分鐘。兩種單位劑型中的任一種可以最先施用。優選地，兩種產物通過相同的靜脈內途徑注射。本發明的另一個目的是提供一種藥物製劑，其包含以Omg/ml至lmg/ml的血清/血漿濃度存在的ficolin相關多肽，並且其中所述製劑具有2. 0-10. O的pH。所述製劑可以進一步包含緩衝劑系統、防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩定劑和表面活性劑。在本發明的一些實施方案中，所述藥物製劑是水性製劑，即包含水的製劑。所述製劑典型地是溶液或混懸液。在本發明的另一個實施方案中，所述藥物製劑是水溶液。術語「水性製劑」定義為包含至少50% w/w的水的製劑。同樣地，術語「水溶液」定義為包含至少50% w/w的水的溶液，術語「水性混懸液」定義為包含至少50% w/w的水的混懸液。在其它實施方案中，所述藥物製劑是冷凍乾燥的製劑，在使用前醫師或患者向其 中加入溶劑和/或稀釋劑。在其它實施方案中，所述藥物製劑是不需要預先溶解即時使用的乾燥的製劑(例如冷凍乾燥或噴霧乾燥)。在另一個方面中，本發明涉及包含ficolin相關多肽的水溶液、和緩衝劑的藥物製劑，其中ficolin相關多肽以Ο-lmg/ml或以上的血清/血漿濃度存在，並且其中所述製劑具有約2. O-約10. O的pH。在本發明的其它實施方案中，製劑的pH選自由下列組成的列表2. 0，2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. I,4. 2，4. 3，4. 4，4. 5，4. 6，4. 7，4. 8，4. 9，5. 0，5. I，5. 2，5. 3，5. 4，5. 5，5. 6，5. 7，5. 8，5. 9，6. 0，
6.I，6. 2，6. 3，6. 4，6. 5，6. 6，6. 7，6. 8，6. 9，7. 0，7. I，7. 2，7. 3，7. 4，7. 5，7. 6，7. 7，7. 8，7. 9，
8.O，8. I，8. 2，8. 3，8. 4，8. 5，8. 6，8. 7，8. 8，8. 9，9. O，9. I，9. 2，9. 3，9. 4，9. 5，9. 6，9. 7，9. 8，
9.9，和 10. O0在本發明的另一個實施方案中，緩衝劑選自由下列組成的組乙酸鈉，碳酸鈉，檸檬酸鹽，甘氨醯甘氨酸，組氨酸，甘氨酸，賴氨酸，精氨酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸鈉，和三羥甲基氨基甲烷，N-二(羥乙基)甘氨酸，三(羥甲基)甲基甘氨酸，蘋果酸，琥珀酸鹽，馬來酸，延胡索酸，酒石酸，天冬氨酸或它們的混合物。這些具體緩衝液中的每一種組成本發明的備選實施方案。在本發明的另一個實施方案中，所述製劑進一步包含藥用防腐劑。在本發明的另一個實施方案中，所述防腐劑選自由下列組成的組苯酚，鄰甲酚，間甲酚，對甲酚，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯，2-苯氧乙醇，對羥基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯代丁醇，和thiomeiOsal，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪脲，氯己定，脫氫乙酸鈉，氯甲酚，對羥苯甲酸乙酯，節索氯銨(benzethonium chloride),氯苯甘醚(chlorphenesine, 3p-(氯苯氧基丙烷)-1，2_ 二醇)或它們的混合物。在本發明的另一個實施方案中，防腐劑以0. lmg/ml至20mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，防腐劑以0. lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，防腐劑以5mg/ml至10mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，防腐劑以10mg/ml至20mg/ml的濃度存在。這些具體的防腐劑中的每一種組成本發明的一個備選實施方案。防腐劑在藥物組合物中的應用對於專業人員來說是公知的。為方便，參考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓製藥科學和實踐)，第19版，1995。在本發明的另一個實施方案中，所述製劑進一步包含等滲劑。在本發明的另一個實施方案中，所述等滲劑選自由下列組成的組鹽(例如氯化鈉)，糖或糖醇，胺基酸(例如L-甘氨酸，L-組氨酸，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸)，糖醇(例如甘油(丙三醇)，1，2_丙二醇(丙二醇)，1，3_丙二醇，1，3_ 丁二醇)，聚乙二醇(例如PEG400)，或它們的混合物。可以使用任意的糖，諸如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括，例如，果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，芽黴菌糖，糊精，環糊精，可溶澱粉，羥乙基澱粉和羧甲纖維素鈉。在一些實施方案中，糖添加物是鹿糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8碳水化合物(hydrocarbon),並且包括，例如，甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一些實施方案中，所述糖醇是甘露醇。上文提及的糖或糖醇可以單獨或組合使用。對所用的量沒有固定的限制，只要所述糖或糖醇在液體製劑中可溶並且沒有不利地影響使用本發明的方法所獲得的穩定作用。在一些實施方案中，糖或糖醇濃度為約lmg/ml至約150mg/ml。在本發明的另一個實施方案中，等滲劑以lmg/ml至50mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，等 滲劑以lmg/ml至7mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，等滲劑以8mg/ml至24mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，等滲劑以25mg/ml至50mg/ml的濃度存在。這些具體的等滲劑中的每一種組成本發明的備選實施方案。等滲劑在藥物組合物中的應用對於專業人員來說是公知的。為方便,參考Remington :The Science and Practiceof Pharmacy (雷明頓製藥科學和實踐)，第19版，1995。在本發明的另一個實施方案中，所述製劑進一步包含螯合劑。在本發明的另一個實施方案中，所述螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、和天冬氨酸的鹽，以及它們的混合物。在本發明的另一個實施方案中，螯合劑以O. lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，螯合劑以O. lmg/ml至2mg/ml的濃度存在。在本發明的另一個實施方案中，螯合劑以2mg/ml至5mg/ml的濃度存在。這些具體的螯合劑中的每一種組成本發明的備選實施方案。螯合劑在藥物組合物中的應用對於專業人員來說是公知的。為方便，參考Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓製藥科學和實踐)，第 19 版，1995。在本發明的另一個實施方案中，所述製劑進一步包含穩定劑。穩定劑在藥物組合物中的應用對於專業人員來說是公知的。為方便,參考Remington :The Science andPractice of Pharmacy (雷明頓製藥科學和實踐)，第19版，1995。更具體地，本發明的組合物是穩定的液體藥物組合物，其治療活性成分包括在以液體藥物製劑存儲過程中可能表現出聚集物形成的多肽。「聚集物形成」意指多肽分子之間的物理相互作用，其導致形成可能保持可溶的寡聚物，或形成從溶液中沉澱下來的大的可見的聚集物。「在存儲過程中」意指液體藥物組合物或製劑在製備後不立即施用給受試者。相反，在製備後，將其包裝進行存儲，以液體形式、以冷凍狀態、或以乾燥形式存儲，之後重構成液體形式或其它適於施用給受試者的形式。「乾燥形式」意指液體藥物組合物或製劑通過冷凍乾燥(即，凍幹；參見，例如，Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci.Technol.(腸胃外科學技術雜誌)38 48-59)、噴霧乾燥(參見Masters (1991) Spray-DryingHandbook (噴霧乾燥手冊)(第 5 版；Longman Scientific and Technical (朗曼科學技術)，Essez,英國)，第 491-676 頁；Broadhead 等(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;和 Mumenthaler 等(1994) Pharm. Res.(藥物研究)11 12-20)、或空氣乾燥(Carpenter 和Crowe (1988) Cryobiology (低溫生物學)25 :459-470 ;和 Roser (1991) Biopharm.(生物製藥)4 47-53)進行乾燥。在液體藥物組合物存儲過程中多肽形成聚集物可以不利地影響所述多肽的生物學活性，導致藥物組合物的治療功效損失。此外，聚集物形成可以引起其它問題，諸如當使用輸注系統施用含有多肽的藥物組合物時，引起輸液管、膜或泵的堵塞。本發明的藥物組合物可以進一步包含足以減少組合物存儲過程中多肽的聚集物形成的量的胺基酸鹼。「胺基酸鹼」意指胺基酸或胺基酸組合，其中任何給定的胺基酸以其游離鹼形式或以其鹽形式存在。當使用胺基酸組合時，所有的胺基酸可以以其游離鹼形式存在，所有可以以其鹽形式存在，或一些可以以其游離鹼形式存在而另一些以其鹽形式存在。在一些實施方案中，用於製備本發明的組合物的胺基酸是攜帶帶電荷側鏈的那些，諸如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、和穀氨酸。在本發明的藥物組合物中可以存在特定胺基酸(例如，甘氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，咪唑，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸以及它們的混合物)的任意立體異構體(即，L，D，或DL異構體)或這些立體異構體的組合， 只要所述特定的胺基酸以其游離鹼形式或其鹽形式存在。在一些實施方案中，使用L-立體異構體。本發明的組合物還可以用這些胺基酸的類似物配製。「胺基酸類似物」意指在本發明的液體藥物組合物存儲過程中導致減少多肽的聚集物形成的理想作用的天然存在胺基酸的衍生物。適當的精氨酸類似物包括，例如，氨基精氨酸、鳥氨酸和N-單以及L-精氨酸，適當的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，適當的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如使用其它胺基酸一樣，胺基酸類似物以其游離鹼形式或其鹽形式結合在組合物中。在本發明的另一個實施方案中，胺基酸或胺基酸類似物組合使用，其足以防止或延遲蛋白的聚集。在本發明的另一個實施方案中，為了抑制甲硫氨酸殘基氧化為甲硫氨酸亞碸，當作用為治療劑的多肽為包含至少一個易於發生這樣的氧化的甲硫氨酸殘基的多肽時，可以添加甲硫氨酸(或其它硫胺基酸或胺基酸類似物)。「抑制」意指甲硫氨酸氧化的種類隨時 間的積聚最少。抑制甲硫氨酸氧化導致多肽更多保持為其正確的分子形式。可以使用甲硫氨酸(L，D，或DL異構體)的任意立體異構體或它們的組合。加入的量應該是足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，從而使甲硫氨酸亞碸的量對於管理結構來說是可以接受的。典型地，這意指所述組合物包含不超過約10%至約30%的甲硫氨酸亞碸。通常，這可以通過添加甲硫氨酸實現，從而使添加的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比例在約I : I至約1000 I的範圍內，諸如10 I至約100 I的範圍內。在本發明的另一個實施方案中，所述製劑進一步包含穩定劑，所述穩定劑選自高分子量聚合物或低分子量化合物的組。在本發明的另一個實施方案中，穩定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基-/羥基纖維素或它們的衍生物(例如HPC，HPC-SL, HPC-L和HPMC)，環糊精，含硫物質，如單硫甘油，巰基乙酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體的穩定劑中的每一種組成本發明的備選實施方案。所述藥物組合物還可以包含另外的穩定試劑，其進一步增強其中的治療活性多肽的穩定性。本發明特別感興趣的穩定試劑包括，但不限於，甲硫氨酸和EDTA，其保護多肽抗甲硫氨酸氧化，和非離子表面活性劑，其保護多肽抗與凍融或機械剪切相關的聚集。在本發明的另一個實施方案中，所述製劑進一步包含表面活性劑。在本發明的另一個實施方案中，所述表面活性劑選自去汙劑，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙醯化甘油單酯，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆如Pluronic F68,泊洛沙姆188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物，如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫，例如吐溫-20，吐溫-40，吐溫-80和Bri j-35)，單甘油酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，凝集素和磷脂(例如，磷脂醯絲氨酸，磷酯醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯肌醇，雙磷脂醯甘油和鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如，二棕櫚醯磷脂酸)和溶血磷脂(例如，棕櫚醯溶血磷脂醯-L-絲氨酸和乙醇胺、膽鹼、絲氨酸或蘇氨酸的I-醯基-sn-甘油-3-磷酸酯)和溶血磷脂醯和磷脂醯膽鹼的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧(烷基醚)_衍生物，例如，溶血磷脂醯膽鹼的月桂醯和肉豆蘧醯衍生物，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼，和極性頭基團的修飾，其為膽鹼、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇、和帶正電荷的DODAC，DOTMA, DCP, BISHOP,溶血磷脂醯絲氨酸和溶血磷脂醯蘇氨酸，和甘油磷脂(例如，腦磷脂)，甘油糖脂(例如， galactopyransoide),神經鞘氨糖脂(例如，神經醯胺，神經節苷脂)，十二燒基磷酸膽鹼，母雞卵溶血卵磷脂，梭鏈孢酸衍生物-(例如牛磺-二氫梭鏈孢酸鈉等)，長鏈脂肪酸和它們的C6-C12鹽(例如，油酸和辛酸)，醯基肉毒鹼和衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N° -醯化衍生物，或賴氨酸或精氨酸的側鏈醯化衍生物，包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性胺基酸的的任意組合的二肽的N°-醯化衍生物，包含中性胺基酸和兩個帶電荷胺基酸的任意組合的三肽的N°-醯化衍生物，DSS(多庫酯鈉，CAS註冊號[577-11-7])，多庫酯鈣，CAS註冊號[128-49-4])，多庫酯鉀，CAS註冊號[7491-09-0])，SDS (十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)，辛酸鈉，膽酸或它們的衍生物，膽汁酸及其鹽和甘氨酸或牛磺酸綴合物，烏索脫氧膽酸，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，牛磺膽酸鈉，甘膽酸鈉，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-I-丙烷磺酸酯，陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽)單價表面活性劑，兩性離子表面活性劑(例如，N-燒基-N, N-二甲基銨基-I-丙燒橫酸酯(N-alkyl-N, N-dimethylammonio-1-propanesulfonates) ,3-膽胺酸-I-丙基二甲基銨基-I-丙燒橫酸酯(3-cholamido-l-propyIdimethylammonio-1-propanesulfonate),陽離子表面活性劑(季銨鹼)(例如，十六燒基-三甲基溴化銨，十六烷基氯化吡啶鐵)，非離子表面活性劑(例如，十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)，poloxamines (例如，Tetronic』 s),其是通過向乙二胺連續添加環氧丙燒和環氧乙烷衍生的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性劑可以選自咪唑衍生物或其混合物的組。這些具體的表面活性劑中的每一種組成本發明的備選實施方案。表面活性劑在藥物組合物中的應用對於專業人員來說是公知的。為方便，參考Remington The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓製藥科學和實踐)，第 19版，1995。可能的是，在本發明的肽藥物製劑中可以存在其它成分。所述另外的成分可以包括溼潤劑，乳化劑，抗氧化劑，填充劑，張力改性劑，螯合劑，金屬離子，油狀賦形劑，蛋白(例如，人血清白蛋白，明膠或蛋白)和兩性離子(例如，胺基酸，如甜菜鹼，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，賴氨酸和組氨酸)。當然，所述另外的成分，不應該不利地影響本發明的藥物製劑的整體穩定性。本發明的包含ficolin相關多肽的藥物組合物可以在數個位點施用給需要所述治療的患者，例如，在局部位點，例如，皮膚和黏膜位點，在旁路吸收的位點，例如，在動脈、靜脈、在心臟施用，和在涉及吸收的位點，例如，在皮膚中、在皮膚下、在肌肉中或在腹部施用。局部施用可以特別有利於治療與局部炎症相關的病症，諸如治療與燒傷相關的炎症或與皮膚相關的其它病症。因此，在一些實施方案中，施用通過局部施用進行。在一些具體的實施方案中，眼用滴劑可以用於與眼睛有關的病症，如角膜炎(keratitis)，如彌散性薄層狀角膜炎(diffuse lamellar keratitis, DLK)。
本發明的藥物組合物的施用可以通過數種施用途徑，例如，舌部，舌下，含服，口腔中，口服，在胃和腸中，鼻部，肺部，例如，通過細支氣管和肺泡或它們的組合，表皮，皮膚，經皮，陰道，直腸，眼睛，例如，通過結膜，輸尿管，和腸胃外施用給需要所述治療的患者。本發明的組合物可以以數種劑型施用，例如，作為溶液，混懸液，乳液，微乳液，多層乳液，泡沫劑，軟膏，糊劑，膏藥，油膏，片劑，包衣片劑，清洗劑(rinses),膠囊,例如,硬明膠膠囊和軟明膠膠囊，栓劑，直腸膠囊，滴劑，凝膠，噴霧劑，粉劑，氣霧劑，吸入劑，眼用滴齊U，眼用軟膏，眼用清洗劑，陰道子宮託，陰道環，陰道藥膏，注射液，原位轉化溶液，例如原位膠化，原位固定，原位沉澱，原位結晶，輸注溶液，和植入物。本發明的組合物可以進一步混合在、或附著到藥物載體、藥物遞送系統和高級藥物遞送系統上，例如，通過共價、疏水和靜電相互作用混合或附著，從而進一步增加ficolin相關多肽的穩定性，增加生物利用度，增加溶解性，減少副作用，實現本領域技術人員公知的擇時療法，並且增加患者的依從性或任意這些的組合。載體、藥物遞送系統和高級藥物遞送系統的實例包括，但不限於，聚合物，例如纖維素和衍生物，多糖，例如葡聚糖和衍生物，澱粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙烯酸和甲基丙烯酸聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和它們的嵌段共聚物，聚乙二醇，載體蛋白，例如白蛋白，凝膠，例如熱膠化系統，例如本領域技術人員公知的嵌段共聚合系統，膠束，脂質體，微球體，納米顆粒，液態晶體和其分散液，L2相和其分散液，其為本領域技術人員公知的脂質-水系統中的相變行為，聚合膠束，多層乳液，自乳化，自微乳化，環糊精及其衍生物，和樹狀聚體。本發明的組合物用在適於肺部施用ficolin相關多肽的固體、半固體、粉末和溶液製劑中，例如，使用測定的劑量吸入器、乾粉吸入器和噴霧器施用，所有這些都是本領域技術人員公知的裝置。本發明的組合物特別用在可控釋放、緩釋、延長釋放、延遲釋放和緩慢釋放藥物遞送系統的製劑中。更具體地，但是不限於，組合物用在腸胃外可控釋放和緩釋系統(兩個系統導致給藥次數的多倍減少)的製劑中，這是本領域技術人員公知的。甚至更優選的是皮下施用的可控釋放和緩釋系統。不限制本發明的範圍，有用的控制釋放系統和組合物的實例是水凝膠、油狀凝膠、液態晶體、聚合膠束、微球體、納米顆粒。產生用於本發明的組合物的可控釋放系統的方法包括，但不限於，結晶，縮合，共結晶，沉澱，共沉澱，乳化，分散，高壓均化，包封，噴霧乾燥，微型包封，凝聚，溶劑蒸發以產生微球體，擠出和超臨界流體工序。通用參考文獻參考Handbook of PharmaceuticalControlled Release (藥物控制釋放手冊)(Wise, D. L.編· Marcel Dekker,紐約，2000)和 Drug and the Pharmaceutical Sciences (藥物和製藥科學)第 99 卷ProteinFormulation and Delivery (蛋白配製和遞送)(MacNally,E. J.編· Marcel Dekker,紐約,2000)。藥物施用可以通過利用注射器、任選筆式注射器的皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射進行。備選地，腸胃外施用可以通過輸注泵進行。另一種選擇是可以是用於以鼻或肺部噴霧形式施用ficolin相關多肽的溶液或混懸液的組合物。還有另一個選擇，本發明含有ficolin相關多肽的藥物組合物還可以適於經皮施用，例如，通過無針注射或從貼片，任選離子電滲療法貼片施用，或經黏膜施用，例如口腔施用。術語「穩定的製劑」是指具有增加的物理穩定性、增加的化學穩定性或增加的物理和化學穩定性的製劑。術語蛋白製劑的「物理穩定性」用在本文中是指蛋白因所述蛋白暴露於熱-機械壓力和/或與不穩定界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成無生物學活性和/或不溶聚集物的傾向性。水性蛋白製劑的物理穩定性在將填裝在適當容器(例如，筒或小 瓶)中的製劑在不同溫度暴露於機械/物理壓力(例如，振蕩)不同時間期間後通過視覺檢驗和/或濁度測量評估。製劑的視覺檢驗以具有黑暗背景的清晰聚焦光進行。製劑的濁度通過排序渾濁程度的視覺得分表徵，例如，以0-3的等級進行(沒有表現出渾濁的製劑對應於視覺得分0，在日光下表現出可見渾濁的製劑對應於視覺得分3)。相對於蛋白聚集，當製劑在日光下表現出可見渾濁時，製劑分類為物理不穩定的。備選地，製劑的濁度可以通過本領域技術人員公知的簡單濁度測量進行評估。水性蛋白製劑的物理穩定性還可以使用分光鏡試劑或蛋白構象狀態的探針進行評估。探針優選是優先結合蛋白的非天然構象異構體的小分子。蛋白結構的小分子分光鏡探針的一個實例是Thioflavin T。Thioflavin T是一種螢光染料，其廣泛用於檢測澱粉樣蛋白原纖維。存在原纖維以及可能的其它蛋白構型時，Thioflavin T在與原纖維蛋白形式結合時產生在約450nm的新激發最大值和在約482nm的增強的發射。未結合的Thioflavin T在所述波長基本上沒有螢光。其它小分子可以用作蛋白結構從天然狀態到非天然狀態變化的探針。例如，「疏水片(hydrophobic patch) 」探針優先結合蛋白暴露的疏水片。疏水片通常包埋在天然狀態的蛋白的三級結構中，但是當蛋白開始解摺疊或變性時暴露出來。這些小分子、分光鏡探針的實例是芳香、疏水染料，諸如antrhacene，吖啶，菲咯啉等。其它分光鏡探針是金屬-胺基酸複合物，如疏水胺基酸(如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、和纈氨酸等)的鈷金屬複合物。術語蛋白製劑的「化學穩定性」用在本文中是指與天然蛋白結構相比，導致形成具有潛在較小的生物學功效和/或潛在增加的免疫原特性的化學降解產物的蛋白結構的化學共價變化。取決於天然蛋白的類型和性質以及所述蛋白暴露的環境，可以形成多種化學降解產物。化學降解的消除可能是最不可能完全避免的，並且本領域技術人員公知，在存儲和使用蛋白製劑的過程中，通常觀察到增加量的化學降解產物。大部分蛋白傾向於脫醯胺，其為穀氨醯基或天冬醯胺醯基殘基中的側鏈醯胺基團水解形成游離羧酸的過程。其它降解途徑涉及形成高分子量轉化產物，其中兩種或多種蛋白分子通過轉醯胺和/或二硫化物相互作用彼此共價結合，導致形成共價結合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產物(Stabilityof Protein Pharmaceuticals (蛋白質製藥的穩定性)，Ahern. T. J. & Manning M. C.，Plenum Press,紐約1992)。氧化(例如，甲硫氨酸殘基的氧化)可能是所提到的另一種蛋白降解變化。蛋白製劑的化學穩定性可以通過在暴露於不同環境條件(例如，通常通過升高溫度而加速降解產物形成)後測量不同時間點的化學降解產物的量而評估。每種個體降解產物的量通常通過分離該降解產物而確定，降解產物的分離依賴於分子大小和/或電荷利用各種層析技術(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)進行。因此，如上文所述，「穩定的製劑」是指具有增加的物理穩定性、增加的化學穩定性或增加的物理和化學穩定性的製劑。通常，製劑必須在使用和存儲過程中直至達到產品有效期時是穩定的(按照推薦使用和存儲條件)。在本發明的一些實施方案中，包含ficolin相關多肽的藥物製劑超過6周使用和超過3年存儲是穩定的。在本發明的其它實施方案中，包含ficolin相關多肽的藥物製劑超過4周使用和超過3年存儲是穩定的。在本發明的另一個實施方案中，包含ficolin相關多肽的藥物製劑超過4周使用和超過兩年存儲是穩定的。在本發明的另一個實施方案中，包含ficolin相關多肽的藥物製劑超過2周使用和超過兩年存儲是穩定的。
本發明的具體實施方案如上述，本發明涉及分離的ficolin相關多肽以及包含胺基酸序列SEQID N0:4的多肽或其變體或免疫學片段。在一些實施方案中，本發明的多肽是基本上純的。在一些實施方案中，本發明的多肽能夠與甘露糖結合凝集素(MBL)締合。在一些實施方案中，本發明的多肽能夠與ficolin-1, ficolin-2,或ficolin-3中的任一種相締合。 在一些實施方案中，本發明的多肽能夠與Clq，肺表面活性蛋白SP_A和/或SP_D，和細胞內膠原樣防禦分子，諸如CLL-Il中的任一種相締合。在一些實施方案中，本發明的多肽能夠與特異性接受體蛋白，諸如特異性受體相
鋪A
φ π O在一些實施方案中，本發明的多肽包含SEQ NO 3的胺基酸序列20-297、或其功能性變體。在一些實施方案中，本發明的多肽包含SEQ NO 1的胺基酸序列20-380、或其功能性變體。在一些實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO 9的胺基酸序列16-296或其功能性變體。在一些實施方案中，本發明的多肽在非還原條件下在SDS-PAGE上具有約40kDa的
分子量。在一些實施方案中，本發明的多肽在與選自SEQ NO :1的49和178的位置相對應的一個或兩個胺基酸處被N-連接糖基化。在一些實施方案中，本發明的多肽是重組蛋白。在一些實施方案中，本發明的多肽是同型二聚體形式的。在一些實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO I的胺基酸序列20-380組成。在一些實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO :4的胺基酸序列或其變體或免疫學片段。
在一些實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO :4、或其變體或免疫學片段組成。在一些實施方案中，本發明的多肽介導瀕死細胞或死亡細胞、和/或細胞碎片的吞噬，所述瀕死細胞或死亡細胞諸如凋亡細胞。在一些實施方案中，本發明的多肽介導微生物的吞噬。在一些實施方案中，特異性結合本發明的多肽的抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，特異性結合本發明的多肽的抗體是多克隆抗體。在一些實施方案中，本發明的多肽具有與具有序列同源性的其它蛋白相似的活性，所述具有序列同源性的其它蛋白如吞沒銜接蛋白(GULP)。在一些實施方案中，編碼本發明的多肽的分離的核酸分子包含與SEQ NO 2的序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列。 在一些實施方案中，本發明的宿主細胞是真核細胞。 在一些實施方案中，本發明的宿主細胞是哺乳動物來源的。在一些實施方案中，本發明的宿主細胞選自由CHO細胞、HEK細胞和BHK細胞組成的組。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療任意自體免疫性病症，諸如艾迪生病(Addison, s disease),自體免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia),自體免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis),局限性迴腸炎(Crohn' s disease),格雷夫斯病(Graves' disease),吉蘭-巴雷症候群(Guillain-Barre syndrome),系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE),狼瘡性腎炎(lupus nephritis),多發性硬化病(multiple sclerosis),重症肌無力(myasthenia gravis),銀屑病(psoriasis),原發性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis),類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis)和葡萄膜炎(uveitis),哮喘(asthma),動脈粥樣硬化(atherosclerosis), I型糖尿病(TypeI diabetes),銀屑病(psoriasis),各種過敏症(allergies)。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療選自由下列組成的組的任意炎性病症闌尾炎(appendicitis),消化性潰瘍(peptic ulcer),胃潰瘍(gastric ulcer),十二指腸潰瘍(duodenal ulcer)，腹膜炎(peritonitis)，胰腺炎(pancreatitis)，潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)，假膜性結腸炎(pseudomembranous colitis),急性結腸炎(acute colitis),缺血性結腸炎(ischemic colitis),憩室炎(diverticulitis),會厭炎(epiglottitis),失弛緩症(achalasia),膽管炎(cholangitis),膽囊炎(cholecystitis),月幹炎(hepatitis),局限性迴腸炎(Crohn 丨 s disease),腸炎(enteritis),惠普爾病(Whipple' sdisease),過敏症(allergy),免疫複合物病(immunecomplex disease)，器官缺血(organ ischemia)，再灌注損傷(reperfusion injury)，器官壞死(organ necrosis),花粉症(hay fever),膿毒症(sepsis),敗血病(septicemia),內毒素性休克(endotoxic shock),惡病質(cachexia),高燒(hyperpyrexia),嗜酸性肉芽腫(eosinophilic granuloma),肉芽腫病(granulomatosis),肉瘤樣病(sarcoidosis),感染性流產(septic abortion)，附睪炎(epididymitis)，陰道炎(vaginitis)，前列腺炎(prostatitis),尿道炎(urethritis),支氣管炎(bronchitis),肺氣腫(emphysema),鼻炎(rhinitis)，月市炎(pneumonitis)，月市塵病(pneumotransmicroscopicsiIicovolcanoconiosis)，肺泡炎(alvealitis)，毛細支氣管炎(bronchiolitis)，咽頭炎(pharyngitis)，胸膜炎(pleurisy)，竇炎(sinusitis)，流感(influenza)，呼吸道合胞病毒感染(respiratory syncytial virus infection)，HIV 感染，乙型月幹炎病毒感染(hepatitisB virus infection)，C型肝炎病毒感染(hepatitis C virus infection)，彌散性菌血症(disseminated bacteremia)，登革熱(Dengue fever)，念珠菌病(candidiasis)，症疾(malaria)，絲蟲病(filariasis)，阿米巴病(amebiasis)，包蟲囊腫(hydatidcysts)，燒傷，皮炎(dermatitis)，皮肌炎(dermatomyositis)，曬傷(sunburn)，蕁麻疫(urticaria)，撫(warts)，風疫塊(wheals)，血管炎(vasulitis)，脈管炎(angiitis)，心內膜炎(endocarditis)，動脈炎(arteritis)，動脈粥樣硬化(atherosclerosis)，血栓性靜脈炎(thrombophlebitis)，心包炎(pericarditis)，心肌炎(myocarditis),心肌缺血(myocardial ischemia)，結節性動脈周圍炎(periarteritis nodosa)，風溼熱(rheumatic fever)，阿爾茨海默病(Alzheimer ' s disease)，腹腔病(coeliacdisease)，充血性心力衰竭(congestive heart failure)，成人呼吸窘迫症候群(adultrespiratory distress syndrome)，腦膜炎(meningitis)，腦炎(encephalitis)，多發性 硬化病，腦梗死(cerebral infarction)，腦栓塞(cerebral embolism)，吉蘭-巴雷症候群(Guillame-Barre syndrome)，神經炎(neuritis)，神經痛(neuralgia)，脊髓損傷(spinal cord injury)，癱瘓(paralysis)，葡萄膜炎(uveitis)，關節炎(arthritides)，關節痛(arthralgias)，骨髓炎(osteomyelitis)，筋膜炎(fasciitis)，佩吉特病(Paget' sdisease)，痛風(gout)，牙周病(periodontal disease)，類風溼性關節炎，滑膜炎(synovitis)，重症肌無力(myasthenia gravis)，甲狀腺炎(thyroiditis)，系統性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosis)，肺出血腎炎症候群(Goodpasture' s syndrome),貝赫切特症候群(Behcet, s syndrome)，同種異體移植排斥(allograft rejection)，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，I型糖尿病，強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)，貝格爾病(Berger' s disease)，萊特爾症候群(Reiter' s syndrome)和霍奇金病(Hodgkin, s disease)，角膜炎(keratitis)，2型糖尿病，囊性纖維化(cysticfibrosis)，心肌梗死(myocardial infarction)，再灌注損傷，中風(stroke)，皮肌炎，代謝症候群(metabolic syndrome)，系統性炎症反應症候群(systemic inflammatoryresponse syndrome)，膿毒症，多器官功能衰竭(multiple organ failure)，瀰漫性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation)，過敏性休克(anaphylacticshock)，血管併發症(Vascular complication)和與I型和/或2型糖尿病相關的腎病(nephropathy associated with type I 和 / 或 type 2 diabetes)，腦膜炎，細菌性敗血病(bacterial septicaemia)，並發性症疾(complicated malaria)，非典型的溶血性尿毒症症候群(atypic haemolytic uremic syndrome)，溶血性尿毒症症候群(haemolyticuremic syndrome)，年齡相關的黃斑變性(age related macular degeneration)，陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)，蛇毒咬傷(snake venombite)，燒傷，和器官移植併發症。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療選自由下列組成的組的任意炎性病症器官缺血(organ ischemia)，再灌注損傷，器官壞死，血管炎，心內膜炎(endocarditis),動脈粥樣硬化,血栓性靜脈炎(thrombophlebitis),心包炎,心肌炎,心肌缺血，結節性動脈周圍炎，風溼熱，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫症候群，腦梗死，腦栓塞，血管併發症和與I型和/或2型糖尿病相關的腎病。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的任意適應證。在一些實施方案中，本發明的多肽治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病或病症有關的適應證，包括炎性反應和與纖維蛋白形成有關的慢性血栓栓塞疾病或病症，包括血管病症，如血栓形成(thrombosis)，諸如深靜脈血栓形成，動脈血栓形成，術後血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG),經皮透皮冠狀血管成形(percutaneous transdermalcoronary angioplastry, PTCA),血小板沉積中風，腫瘤生長，腫瘤轉移，血管發生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄(restenosis)，如動脈硬化和/或血管成形後的再狹窄，急性和慢性適應證，如炎症，膿毒症(sepsis),膿毒性休克(septic chock),敗血病(septicemia),低血壓，成人呼吸窘迫症候群(adult respiratory distress syndrome,ARDS),系統性炎症反應症候群(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),彌散 性血管內凝血病(disseminated intravascular coagulopathy, DIC),肺栓塞(pulmonaryembolism),病理性血小板沉積(pathological platelet deposition),心肌梗死，或用於預防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風險患有血栓形成，外周血祖細胞(PBPC)移植後的靜脈閉塞病，溶血性尿毒症症候群(hemolytic uremicsyndrome, HUS),和血栓性血小板減少性紫癒(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)，和風溼熱。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病或病症有關的適應證，包括炎性反應和與纖維蛋白形成有關的慢性血栓栓塞疾病或病症,包括血管病症,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術後血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG)，經皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風，腫瘤生長，腫瘤轉移，血管發生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形後的再狹窄，急性和慢性適應證如炎症，病理性血小板沉積，心肌梗死，或用於預防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風險患有血栓形成，外周血祖細胞(PBPC)移植後的靜脈閉塞病，溶血性尿毒症症候群(HUS)，和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和風溼熱。
在一些實施方案中，本發明的多肽用於預防在鑑定的高危患者中發生血栓栓塞併發症，所述鑑定的高危患者如經歷手術的那些或患有充血性心力衰竭的那些。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療與心臟相關的醫學病症。在一些實施方案中，本發明的多肽用於治療與ficolin-相關多肽缺乏有關的醫學病症。實施例I檢測MASPl基因的可變剪接轉錄物方法為了檢測MASPl的三種轉錄物MASP1，MASP3和FAP，設計用於每種變體的特異性引物。PCR使用在外顯子6中的通用正向引物(5' -gcacccagagccacagtg-3')和特異性反向引物MASP1在外顯子12中(5' -gccttccagtgtgtgggc-3' ) ,MASP3在外顯子11中(5_gccttccagagtgtggtca_3/ )和 FAP 在外顯子 8a 中(5' -cgatctggagagcgaactc-3')進行(圖I)。PCR擴增在20-μ I體積中進行，其包含:50ng肝臟cDNA (Clontech)，O. 25 μ M每種引物，2. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTP,50mM KCl, IOmM Tris · HCl，pH 8.4，和 0.4 單位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。PCR反應按照下述循環參數進行10min 94 °C,30 或 40 個循環(30sec 94°C，50sec 58°C，90sec72°C )，IOmin 72。。。樣品在 2%瓊脂糖凝膠上分析。結果在肝臟cDNA中檢測到MASPl基因的可變轉錄。使用位於外顯子6的通用正向引物和位於外顯子12 (MASPl)、外顯子11(MASP3)、和外顯子8a(FAP)的特異性反向引物擴增MASP1，MASP3，和FAP轉錄物。MASPl產生500bp的片段，MASP3產生506bp的片段，FAP產生309bp的片段。FAP片段的組織表達方法使用如上述相同的PCR測定法，研究商購人組織cDNA組(Clontech)的MASPI, MASP3，和FAP表達。樣品在2%瓊脂糖凝膠上分析。結果在來自Clontech的cDNA組中研究MASP1，MASP3,和FAP基因的組織分布(圖2)。使用通用正向引物和特異性反向引物擴增MASP1，MASP3，和FAP轉錄物。GADPH用作參照基因。所有三種基因在肝臟中高度表達，另外，FAP在心臟組織中強表達(用黑色箭頭表示)。在腦、結腸、前列腺、骨骼肌、和小腸中檢測到FAP基因的較少表達(用白色箭頭表不)。100個個體的FAP外顯子8a的DNA測序方法在來自100名健康白種人個體的基因組DNA模板上進行外顯子8a的直接測序，包括相對於翻譯ATG起點跨越位置+44，083至+44，431的MASP1/MASP3/FAP基因的內含子-外顯子邊界。通過使用單一引物組(正向5' -ctgttcttcacactggctg-3 ',反向5' -ctgctgagatcatgttgttc-3 ')擴增該片段，其中正向引物包含5 ' -T7序列(5' -ttatacgactcacta-3' )。PCR擴增在20-μ I體積中進行，其包含50ng基因組DNA，0.25「] 每種引物，2.5111^%(12，0.21111 dNTP,50mM KCl, IOmM Tris · HCl，pH 8· 4，和 O. 4單位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。PCR反應按照下述循環參數進行2min94°C，15 個循環(30sec 94°C，60sec 64°C，60sec 72°C)，15 個循環(30sec 94°C，60sec58°C,60sec 72°C ), 5min 72°C，並且使用ABIBigDye循環測序終止子試劑盒(AppliedBiosystems (應用生物系統)，Foster City, CA)按流程使用5'-生物素醯化的測序引物在正向方向上測序。測序反應使用鏈黴抗生物素蛋白珠(Geno Vision)在PyroMark VacuumPrep Workstation (Biotage)上純化。序列分析在 ABI Prism 3100 基因分析儀(AppliedBiosystems (應用生物系統))上進行。得到的DNA序列用BioEdit軟體比對,並且從序列電泳圖上視覺驗證DNA的多態性。結果所有序列使用BioEdit軟體比對。在100名健康個體中沒有觀察到外顯子8a或外顯子-內含子區域中的遺傳變異。實施例2免疫沉澱來自血清的MAP-I特異性免疫沉澱使用MAP-I特異性mAb 20C4(針對17 MAP-I 特異性C-端肽產生)或mAb 8B3進行，mAb 8B3是一種針對MASP-1/3的共有重鏈反應的單克隆抗體，其用作對照沉澱抗體。允許總共10 μ g抗MAP-I或MASP-1/3抗體與綿羊或小鼠或兔 IgG Dyna 珠(M-280，貨號 112. 02D/112. 04D, Dynal/Invitrogen)結合。在洗滌步驟後，將珠子用於正常人血清匯聚液(I I稀釋在TBS中)，並且在4°C顛倒溫育I小時。在最後的洗滌步驟和磁力分離後，將珠子在SDS上樣緩衝液中煮沸，並進行SDS-PAGE和蛋白質印跡，蛋白質印跡使用針對MAP-UMBLjP Ficolin-3的抗體進行探測。使用針對MBL(Hyb 131-11, Bioporto,丹麥)，Ficolin-2(FCN219)和Ficolin-3 (FCN334)的mAbs進行上述相同的沉澱步驟。為了補償MBL、Ficolin_2和-3血清濃度的差異，它們分別從lml、300 μ I和100 μ I血清中沉澱。通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析樣品，蛋白質印跡使用針對MAP-I的pAb進行。免疫組織化學在培養瓶中在RPMI+10%中生產表達rMAP-Ι的CHO細胞。在80_90%匯聚收集細胞，將細胞收集並且在4%甲醛-PBS中固定24小時，隨後包埋在石蠟中。還對六種不同的人肝臟組織和來自兩種不同的心肌組織、兩種骨骼肌組織的樣品和兩份獲自人主動脈的樣品進行上述固定和石蠟包埋。使用Leitz Wetzlar切片機獲得5 μ m薄片的切片，並且置於 玻璃載玻片上，並且在4°C保存直至測定。按前述進行預處理和分析。一級抗體是MAP-I特異性單克隆抗體mAb 12B11或親和純化的、單特異性兔抗所有均稀釋至5 μ g/ml。同種型抗體對照以相同的濃度應用到組織。二級抗體是EnVision 抗體(HRP-抗小鼠或HRP-抗兔，Dako, Glostrup,丹麥)。在Leica DMLB2顯微鏡下進行染色模式分析。SDS-PAGE和蛋白質印跡基本上按照供應商所述，使用NuPAGE 系統(Invitrogen),用不連續的緩衝液，在10%或4-12% (w/v)Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。蛋白質印跡使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), 2 μ g/ml 一級 mAbs 和通過在 PBS, 0· 05% 吐溫20中I : 1500稀釋的HRP綴合的鏈黴抗生物素蛋白(Ρ0397，Dako)或I : 1000稀釋的HRP-兔抗小鼠IgG (Ρ0260，Dako)進行二級顯影而進行。膜使用在50mM乙酸鈉緩衝液pH 5中的3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)(在丙酮中O. 04% )和O. 015% H2O2進行顯影。補體激活測定基本上如前述評估MAP-I對MBL和Ficolin_3介導的補體因子C4沉積的影響。簡言之，將甘露聚糖(MBL配體)(Sigma-Aldrich M7504)或乙醯化的牛血清白蛋白(Ficolin-3配體)以10 μ g/ml固定到Maxisorp ELISA平板(Nunc,丹麥)上。洗漆後，添加rMBL或rFicolin-3 (O. 4 μ g/ml)並且溫育I. 5小時。在第一維度上以兩倍的連續稀釋應用rMAP-Ι或rMASP-2 I小時，然後在第二維度上，在37°C用缺乏MBL或Ficolin-3的血清連續稀釋液溫育45分鐘。C4沉積使用針對C4c的pAb (Q0369, Dako, Glostrup/丹麥)進行測量。另外，我們使用純系統評估MAP-I對MASP-2的置換。如前述，在rMBL/甘露聚糖矩陣中，在第一維度上，將rMASP-2在連續稀釋液中在20°C預先溫育45分鐘，然後在第二維度上，在20°C用rMAP-Ι稀釋液溫育45分鐘。純化的C4(來自Quidel，CA，USA)以I μ g/ml的濃度加入，並且在37°C溫育45分鐘。檢測如上述進行。結果MAP-I 與 Ficolin-2、Ficolin-3 和 MBL 共沉澱為了研究MAP-I與MBL和Ficolin-3的可能的締合，我們使用抗MAP-1 mAb20C4與針對MASP-I和MASP-3共有重鏈的mAb (mAb8B3) 二者來沉澱血清複合物。隨後通過蛋白質印跡分析沉澱物，所述蛋白質印跡分別用針對MAP_1、MBL、和Ficolin-3的抗體探測。我們觀察到Ficolin-3共沉澱條帶，但是也觀察到具有MBL的較弱條帶(圖24A)。樣品不使用針對Ficolin-2的抗體探測，因為它們在蛋白質印跡中不作用。然後，我們使用針對MBL、Ficolin-2和Ficolin-3的mAbs來分別沉澱1ml、300 μ I和100 μ I血清(進行其來分別調^ MBL (2 μ g/ml) >Ficolin-2 (5 μ g/ml)和 Ficolin-3 (20 μ g/ml)血清濃度的差異)來倒轉免疫沉澱。隨後，通過用針對MAP-I的抗體探測的蛋白質印跡分析樣品。在來自Ficolin-2和_3的沉澱物中觀察到明顯的MAP-I條帶，在MBL沉澱物中顯現更弱得多的條帶，其中免疫沉澱的rMAP-Ι和血清MAP-I作為對照(圖24B)。MAP-I抑制凝集素途徑的補體活性使用缺乏MBL和Ficolin-3的血清與rMBL和rFicolin_3組合來重構MBL和Ficolin-3的補體C4激活活性。甘露聚糖和乙醯化的BSA分別作為MBL和Ficolin-3的配體。rMBL和rFicolin-3 二者都能夠分別起始MBL和Ficolin-3缺陷型血清中的C4沉積(圖25A和25D)。應用rMASP-2導致通過Ficolin-3和MBL兩種激活途徑的C4沉積的強 陽性劑量依賴性增加(圖25B和25E)，而應用rMAP-Ι導致通過兩種途徑的對C4沉積的明顯劑量依賴性抑制(圖25C和25F)。另外，我們使用僅包含rMBL，rMASP-2, rMAP-1和純化的C4的純組分系統來解決MAP-I對MASP-2的可能的置換。將rMASP-2用連續稀釋的甘露聚糖/rMBL複合物預先溫育。然後，加入變化濃度的rMAP-Ι，然後加入純化的C4。向該系統應用rMAP-Ι明顯導致C4沉積的劑量依賴性抑制(圖26)。實施例3確定新型MBL/Ficolin相關蛋白I(MAP-I)的血清濃度和締合特異性在CH0-DG44細胞中產生並且穩定表達MAP-I的全長無標記的重組構建體。產生針對MAP-I的特異性單克隆抗體。還建立關於MAP-I血清測量的定量ELISA，並且通過ELISA和密度梯度分級來檢驗血清MAP-I與Ficolin-2、-3和MBL之間的締合。重組蛋白如其它地方所述(Hummelshoj等，Mol Immunol (分子免疫學)44,401-11, 2007 ；Larsen等，J Biol Chem(生物化學雜誌)279，21302-11，2004 ;Ma等，2009 J Biol Chem(生物化學雜誌)，Oct 9 ;284(41))，改進之處在於使用PowerCHOl無血清培養基(Lonza，Vallensbaek/丹麥，www. lonza. com)作為表達培養基，在CH0-DG44細胞中表達無標記的人MAP-I的全長構建體。如前述，我們利用抗體親和純化來純化rMAP-1 (Skjoedt等，2009 ；Immunobiology (免疫生物學)，Nov 23)。簡言之,基本上按照Pfeiffer等所述(Pfeiffer等,J Immunol Methods (免疫學方法雜誌)97,1-9,1987),將 15mg抗MAP-1 抗體(mAb 20C4)共價偶聯到CNBr活化的瓊脂糖上，並且用作純化基質。還使用抗-MAP-I柱來耗盡血清中的 MAP-I。單克隆抗體的產生按前述進行(Skjoedt等，J Biol Chem(生物化學雜誌)285,8234-43,2010)。使用NuPAGE 系統(Invitrogen),按推薦,用不連續緩衝液,在10%或4-12%(w/ν) Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, GEHealthcare)進行蛋白質印跡。將膜用2 μ g/ml 一級抗體顯影,二級顯現通過用在50mM乙酸鈉緩衝液pH5中的O. 04% 3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma-Aldrich,Broendby/丹麥,www.sigmaaldrich. com) +0. 015% H202作為底物，用I : 1500稀釋的HRP綴合的鏈黴抗生物素蛋白或 HRP-兔抗小鼠 IgG(P0397/P0260, Dako, Glostrup/ 丹壽，www. dako. com)進行。按推薦和先前所述(Skjoedt等，2009)，將rMAP_l用N-糖苷酶-F/END0_F(N-糖苷酶-F去糖基化試劑倉，Roche,Mannheim/Germany,www. roche. com)處理。產物通過在還原條件下的SDS-PAGE然後考馬斯染色或蛋白質印跡進行分析。先前已經證實了抗-MAP-1 mAb 20C4的特異性(Skjoedt等，2010)。在定量MAP-1ELISA中，mAb 20C4用作捕獲抗體，其以6 μ g/ml固定在Maxisorb ELISA平板上(NUNC ，Roskilde/丹麥，www. nuncbrand. com)。校正劑(慘加在MAP-I耗盡血清中的rMAP-1或rMAP-Ι)的連續稀釋液或捐獻者血清樣品應用在PBS+0. 05 %吐溫20+0. 5 %牛血清和IOmMEDTA中。檢測抗體是以3 μ g/ml使用的生物素標記的mAb 8B3，其如前述與MASP_1、_3和 MAP-I 的共有鏈反應(Skjoedt 等，2010 ；Skjoedt 等，2009)。 Ficolin-2 和 _3 血清濃度如 Munthe-Fog 等和 Hummelshoj 等(Hummelshoj 等，Hum Mol Genet (人類分子遺傳學)14, 1651-8, 2005 ;Munthe_Fog 等，Scand J Tmmunol 65,383-92,2007 ;Munthe_Fog 等，MolImmunol (分子免疫學)45，2660-6，2008)所述確定，MBL和MASP-3血清濃度如前述確定(Skjoedt等，2009)。顯色使用鄰苯二胺(Dako,Glostrup/丹麥)獲得，並且按推薦，用1MH2S04終止酶反應。使用 V-max 動力學-讀數儀(分子裝置(Molecular Devices), Sunnyvale/CA/U. S)測量光學密度(0D490nm-650nm)水平。MAP-I與MBL、Ficolin-2和_3之間的相對締合基本上如前述測定(Skjoedt等，2009)，改進之處在於，使用MAP-I特異性mAb 20C4作為捕獲抗體(以6 μ g/ml包被)。檢測mAbs是生物素標記的FCN-219 (Ficolin-2特異性)或FCN-334 (Ficolin-3特異性)(24-25)、或Hyb 131-11，全部以2 μ g/ml應用。分析來自如上述相同的100名丹麥獻血者
的血清樣品。將正常人血清進行蔗糖梯度分離。將O. 75ml血清上樣到40ml離心柱上，該離心柱由緩衝在IOmM Tris,145mM NaCl, 3mM CaCl2和30 μ g/ml的人血清白蛋白中的10-30%蔗糖梯度組成。在L70 Beckmann超離心機中，使用SW28轉頭，將上樣的柱在4°C以150. OOOxg真空離心24小時。從底部收集I. 5ml級分，並且通過針對下述抗原的特異性ELISA或免疫印跡進行分析MAP-1，MASP-I，MASP-2，MASP-3, sMAP, MBL, Ficolin-2 和 Ficolin-3。也評估血清IgM(19S)和IgG(7S)的峰，表明分子表面與質量的比率。另外，分析級分激活外源應用的C4的能力。簡言之，如前述(Skjoedt等，2010)，將級分以連續稀釋液應用到用乙醯化BSA(Ficolin-3配體)或甘露聚糖(MBL配體)包被的ELISA平板上，然後在4°C搖動溫育I小時。然後，洗滌平板，並且在37°C用I μ g/ml純化的C4溫育I小時。隨後用針對C4c的多克隆抗體(Q 0369，Dako, Glostrup，丹麥)測量C4沉積。統計學分析使用Prism4 軟體(GraphPad Software, Inc. , La Jolla/CA/US, www. Rraphpad.com)，計算統計學(Spearman non-parametric correlation (Spearman 非參數相關性)，non-parametric two-tailed t-test (非參數雙尾 t 檢驗))和MAP-l,MBL,Ficolin_2 與 _3血清水平。結果rMAP-Ι的純化和表徵rMAP-Ι在CHO DG44中的表達導致在存在150nM甲氨蝶呤的條件下的高產率(在無血清培養基中的產率10-20 μ g/ml)。純化後，在SDS-PAGE中，然後考馬斯亮藍染色或免疫印跡，分析rMAP-Ι。SDS-PAGE/考馬斯染色分析顯現具有 45kDa的估算還原分子量的條帶(圖27)。用N-糖苷酶F對rMAP-Ι去糖基化導致分子量變化為 40kDa，這對應於沒有信號肽的理論質量。該模式也在使用針對MAP-I的特異性抗體的免疫印跡中觀察到。MAP-I血清水平我們開發了定量ELISA來確定MAP-I的血清水平。該測定法基於作為捕獲抗體的MAP-I特異性mAb 20C4和識別MASP-I、_3和MAP-I的共有重鏈的檢測抗體(mAb 8B3)。在純化的rMAP-Ι校正劑和以標準曲線的已知濃度摻加純化的MAP-I的MAP-I耗盡血清之間觀察到極好的平行性(圖28A)。我們分析100名丹麥獻血者中的MAP-I血清水平，並且發現平均值為240ng/ml，其範圍為115_466ng/ml (圖29A)。如前述，我們測量同一組中的MASP-3血清水平(Skjoedt等，2009)，並且繪製MAP-1和MASP-3濃度(圖29B)。我們發現在MAP-I和MASP-3血清濃度之間沒有相關性，儘管它們代表來自同一基因的可變轉錄物。我們評估了抗原和測定法在血清和在凍融循環中的穩定性(圖29C)。我們觀察到MAP-I的評估非常穩健，與凍融循環無關。MAP-I 與 Ficolin-2，_3 和 MBL 之間的締合為了測量MAP-I與MBL，Ficolin-2和_3之間的相互作用，我們開發了三種不同的ELISAs，使用mAb 20C4作為捕獲抗體，並用下列生物素標記的mAbs探測FCN-219 (Ficolin-2 特異性)，FCN-334 (Ficolin-3 特異性)或Hyb 131-11 (MBL特異性)。我們分析與用於MAP-I確定相同的100份捐獻者血清樣品，並且評估MAP-I與Ficolin-2，-3和MBL之間的血清締合水平，以相對O.D. 490-650nm給出(圖30A)。另外，我們按前述(Skjoedt 等，2009)測量了 MBL, Ficolin-2 和-3 的血清濃度。我們發現MAP-I以與MBL，Ficolin-2和-3複合存在。然而，似乎MAP-I的主要部分與ficolins、且特別是Ficolin-3 (P < O. 0001)締合，該模式先前關於MASP-3也已經觀察到過(Skjoedt 等，2009)。我們針對相對締合水平繪製MAP-1，MBL, Ficolin-2和_3的血清濃度，並且發現MAP-I與MBL之間的締合與MBL水平高度相關(Spearman r :0. 92，p < O. 0001)(圖30B,頂部右手側)。與這相反，與Ficolin-2和-3的相對MAP-I締合與MAP-I血清水平相關(Spearman r :分別為O. 45和O. 61，p < O. 0001，圖30B左手側)。儘管我們觀察到在MAP-1濃度和同MBL的相對締合以及Ficol in-3濃度之間的某種相關性，但是這種趨勢較不明顯。 密度梯度分級為了研究MAP-I關於締合的分子的分布和檢驗有多少表現為不締合的，我們將正常的人血清使用10-30%蔗糖梯度和超離心進行密度分級。隨後，通過ELISA分析收集的級分的MAP-1，MASP-3, MBL, Ficolin-2和_3 (圖31A)，通過蛋白質印跡分析收集的級分的獻？-1，嫩5 -1，-2和-3，8嫩卩，]\^1^卩化01111-2和-3(圖31B)。結果顯示，血清MAP-1僅存在於具有ficolins和MBL的級分中，這表明MAP-I不作為未締合的分子存在。對於sMAP，MASP-1, -2和-3觀察到相同的模式。另外，數據表明，MAP-1, sMAP和MASP-1，-2和-3的大部分共同定位在Ficolin-3的峰值級分中。這種分布還通過在sephadex_200柱上的大小排阻層析進行分析。觀察到分子的等價分布模式(數據未顯示)。最後，我們評估蔗糖梯度級分激活外源應用的C4的能力。使用固相甘露聚糖和乙醯化的BSA分別作為關於MBL和Ficolin-3的配體。我們觀察到兩條不同的C4沉積曲線，這反映通過蔗糖梯度分離的Ficolin-3和MBL複合物的峰(圖31C)。討論為了研究結構方面和確定新型MBL/Ficolin相關蛋白I(MAP-I)的血清水平，我們表達了無標記的重組MAP-I，並且產生針對其的特異性抗體。N-糖苷酶F處理和SDS-PAGE分析表明MAP-I被糖基化，這產生具有N-聚糖的 45kDa的分子量，並且在去糖基化後分子量為 40kDa，這等價於由不具有信號肽的推定胺基酸序列計算的分子量。
我們使用針對MAP-I特異性C末端產生的單克隆抗體來建立定量MAP-1 ELISA，並且確定100名健康丹麥獻血者中的血清濃度範圍。在捐獻者組中，我們發現較MASP-3濃度(平均6500ng/ml)相對低的血清濃度(平均240ng/ml,範圍115_466ng/ml)。另外,在兩種蛋白的血清濃度之間沒有相關性，這表明，儘管這兩種分子是同一基因的不同剪接變體，但是表達調控是不同的。近來，記述了 MASP-1，-3和MAP-I組織分布的顯著不同(Degn等，2009 ；Skjoedt等，2010)。在MASP-3和MAP-I之間血清濃度的主要差異的發現進一步支持來源於MASPl基因的轉錄變體的調控機制不同的觀點。我們開發了基於ELISA的測定法來分別評估血清MAP-1與MBL，Ficolin-2和_3之間的相對締合。另外，我們確定Ficolin-2，-3和MBL的血清濃度，從而使其與相對締合水平相關。結果表明，MAP-I主要與Ficolin-3和Ficolin-2締合，與MBL的相對締合表現得較不明顯。可以爭辯說這種分布反映MBL，Ficolin-2和-3平均血清濃度的差異。然而，儘管MBL-MAP-I締合與MBL濃度相關，對於Ficolin-2，其中MAP-I血清濃度與同Ficolin-2的締合水平相關，同樣不明顯。Ficolin-3和MAP-I之間的相對締合與MAP-I血清濃度高度相關，而與Ficolin-3血清水平的正相關性很弱。上述發現表明，MAP-I與Ficolin-2和-3之間的主要締合不僅僅是由於相對較高的Ficol in-2和-3濃度。通過分析進行密度梯度分 離的血清，進一步證實了這種分布模式。我們發現一種清楚的趨勢不僅MAP-1，而且sMAP，MASP-I，-2和-3與Ficol in-3峰值級分共同定位。這是我們先前對於MASP-3所觀察到的現象(Skjoedt等,2009)。Ficolin-3和MBL峰值級分的分離還通過在乙醯化BSA (Ficolin-3配體)和甘露聚糖(MBL配體)上激活外源加入的C4的能力進行評估。在這兩種不同的活化表面上的C4沉積清楚地表明包含MBL或Ficolin-3複合物的不同的峰值級分。蔗糖梯度密度分析的數據還表明，對於MBL的表面與質量比率高於Ficolin-2和Ficolin-3的，這支持最近的研究的觀察結果，其表明MBL在四級結構中具有非常鬆散和開放的構象(Jensenius等,2009)。然而，ficolins的較小的表面與質量比率也可能反映具有締合的分子如MAP-1、sMAP和MASPs的分子分布。在這一方面，與MAP-1/sMAP/MASPs締合越多可能導致更高的質量和通過密度梯度的進一步遷移。總之，我們已經表明，與MASP-3相比，MAP-I以低血清濃度存在，並且MAP-I主要以與ficolins的複合物進行循環，但是在某種程度上也與MBL的複合物進行循環。此外，我們可能證明，在LCP識別分子中，Ficolin-3似乎是主要的MAP-I締合分子。
SEQ ID NO :1.人FAP的完整的380個胺基酸的序列。(突出顯示了在胺基酸位置49和178鑑定的兩個潛在的糖基化位點)。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEV 240PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYF 320FKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE SEQ ID NO :2.人FAP的完整的cDNA核苷酸序列。atgaggtggctgcttctctattatgctctgtgcttctccctgtcaaaggcttcagcccacaccgtggagο βββοββ βtgtttggccagatccagtcgcctggttatccagactcctatcccagtgattcagaggtgacttggaatatcactgtcccagatgggtttcggatcaagctttacttcatgcacttcaacttggaatcctcctacctttgtgaatatgactatgtgaaggtagaaactgaggaccaggtgctggcaaccttctgtggcagggagaccacagacacagagcagactcccggccaggaggtggtcctctcccctggctccttcatgtccatcactttccggtcagatttctccaatgaggagcgtttcacaggctttgatgcccactacatggctgtggatgtggacgagtgcaaggagagggaggacgaggagctgtcctgtgaccactactgccacaactacattggcggctactactgctcctgccgcttcggctacatcctccacacagacaacaggacctgccgagtggagtgcagtgacaacctcttcactcaaaggactggggtgatcaccagccctgacttcccaaacccttaccccaagagctctgaatgcctgtataccatcgagctggaggagggtttcatggtcaacctgcagtttgaggacatatttgacattgaggaccatcctgaggtgccctgcccctatgactacatcaagatcaaagttggtccaaaagttttggggcctttctgtggagagaaagccccagaacccatcagcacccagagccacagtgtcctgatcctgttccatagtgacaactcgggagagaaccggggctggaggctctcatacagggctgcaggaaatgagtgcccagagctacagcctcctgtccatgggaaaatcgagccctcccaagccaagtatttcttcaaagaccaagtgctcgtcagctgtgacacaggctacaaagtgctgaaggataatgtggagatggacacattccagattgagtgtctgaaggatgggacgtggagtaacaagattcccacctgtaaaaaaaatgaaatcgatctggagagcgaactcaagtcagagcaagtgacagagtgaSEQ NO :3.包含CUB1-EGF-CUB2結構域的ficolin相關多肽的最小序列，其包含胺基酸1-19的信號肽。該序列對應於外顯子2至外顯子6。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFE DIFDIEDHPEV 240PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAASEQ ID NO :4. FAP特有的末端17個胺基酸KNEIDLESELKSEQVTESEQ ID NO :5 人 MASP-1 的蛋白質序列。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKM.NNNTGIYTCSAQGVWMNKVLGRSLPTCLPVCGLPKFSRKLMARIFNGRPAQKGTTPffIAM,Sffl,NGQPFCGGSLLGSSffIVTAAHCLHQSLDPEDPTLRDSDLLSPSDFKIILGKHffRLRSDENEQHLGVKHTTLHPQYDPNTFENDVALVELLESPVLNAFVMPICLPEGPQQEGAMVIVSGWGKQFLQRFPETLNEIEIPIVDHSTCQKAYAPLKKKVTRDMICAGEKEGGKDACAGDSGGPMVTLNRERGQWYLVGTVSWGDDCGKKDRYGVYSYIHHNKDWIQRVTGVRNSEQ ID NO :6 人 MASP-1 的 cDNA 序列GMGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGMGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGMGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAMGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGMTGCCAGCCMTTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGMCAMGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCMGTCMGCTGGGAGGACCMGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAMGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAMCAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGMTATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGMTCCTCCTACCTTTGTGMTATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTCCMTGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGGGAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACMCTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACATCCTCCACACAGACMCAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAMCCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATC
GAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCMGATCAAAGTTGGTCCAAMGTTTTGGGGCCTTTCTGTGGAGAGMAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACMCTCGGGAGAGAACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAMTGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATGGGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCMGTATTTCTTCAMGACCMGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGMGGATGGGACGTGGAGTAACMGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGAGAGCTGGMCACGGGCTGATCACCTTCTCTACMGGMCAACCTCACCACATACMGTCTGAGATCAMTACTCCTGTCAGGAGCCCTATTACM GATGCTCMCAATMCACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGGAGAAGCCTACCCACCTGCCTTCCAGTGTGTGGGCTCCCCAAGTTCTCCCGGAAGCTGATGGCCAGGATCTTCAATGGACGCCCAGCCCAGAMGGCACCACTCCCTGGATTGCCATGCTGTCACACCTGAATGGGCAGCCCTTCTGCGGAGGCTCCCTTCTAGGCTCCAGCTGGATCGTGACCGCCGCACACTGCCTCCACCAGTCACTCGATCCGGMGATCCGACCCTACGTGATTCAGACTTGCTCAGCCCTTCTGACTTCAAMTCATCCTGGGCAAGCATTGGAGGCTCCGGTCAGATGAAAATGAACAGCATCTCGGCGTCAMCACACCACTCTCCACCCCCAGTATGATCCCAACACATTCGAGAATGACGTGGCTCTGGTGGAGCTGTTGGAGAGCCCAGTGCTGMTGCCTTCGTGATGCCCATCTGTCTGCCTGAGGGACCCCAGCAGGMGGAGCCATGGTCATCGTCAGCGGCTGGGGGAAGCAGTTCTTGCAAAGGTTCCCAGAGACCCTGATGGAGATTGAMTCCCGATTGTTGACCACAGCACCTGCCAGMGGCTTATGCCCCGCTGMGAAGAAAGTGACCAGGGACATGATCTGTGCTGGGGAGMGGMGGGGGAAAGGACGCCTGTGCGGGTGACTCTGGAGGCCCCATGGTGACCCTGAATAGAGAAAGAGGCCAGTGGTACCTGGTGGGCACTGTGTCCTGGGGTGATGACTGTGGGAAGMGGACCGCTACGGAGTATACTCTTACATCCACCACAACMGGACTGGATCCAGAGGGTCACCGGAGTGAGGMCTGAATTTGGCTCCTCAGCCCCAGCACCACCAGCTGTGGGCAGTCAGTAGCAGAGGACGATCCTCCGATGAAAGCAGCCATTTCTCCTTTCCTTCCTCCCATCCCCCCTCCTTCGGCCTATCCATTACTGGGCAATAGAGCAGGTATCTTCACCCCCTTTTCACTCTCTTTAAAGAGATGGAGCAAGAGAGTGGTCAGMCACAGGCCGAATCCAGGCTCTATCACTTACTAGTTTGCAGTGCTGGGCAGGTGACTTCATCTCTTCGAACTTCAGTTTCTTCATMGATGGAMTGCTATACCTTACCTACCTCGTAAAAGTCTGATGAGGAAMGATTAACTAATAGATGCATAGCACTTAACAGAGTGCATAGCATACACTGTTTTCMTAMTGCACCTTAGCAGMGGTCGATGTGTCTACCAGGCAGACGAAGCTCTCTTACAAACCCCTGCCTGGGTCTTAGCATTGATCAGTGACACACCTCTCCCCTCMCCTTGACCATCTCCATCTGCCCTTAMTGCTGTATGCTTTTTTGCCACCGTGCAACTTGCCCMCATCMTCTTCACCCTCATCCCTAAAAMGTAAMCAGACAAGGTTCTGAGTCCTGTGGTATGTCCCCTAGCAAATGTMCTAGGAACATGCACTAGATGACAGATTGCGGGAGGGCCTGAGAGMGCAGGGACAGGAGGGAGCCTGGGGATTGTGGTTTGGGMGGCAGACACCTGGTTCTAGAACTAGCTCTGCCCTTAGCCCCCTGTATGACCCTATGCMGTCCTCCTCCCTCATCTCAMGGGTCCTCAAAGCTCTGACGATCTAAGATACMTGMGCCATTTTCCCCCTGATAAGATGAGGTAAAGCCMTGTAACCAAAAGGCAAAMTTACMTCGGTTCAMGGMCTTTGATGCAGACAAMTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGAAATACCCACCCCTTTCCACTACGGGTGGGTTCCCMGGACATGGGACAGGCAAAGTGTGAGCCAAAGGATCCTTCCTTATTCCTMGCAGAGCATCTGCTCTGGGCCCTGGCCTCCTTCCCTTCTTGGGAAACTGGGCTGCATGAGGTGGGCCCTGGTAGTTTGTACCCCAGGCCCCTATACTCTTCCTTCCTATGTCCACAGCTGACCCCMGCAGCCGTTCCCCGACTCCTCACCCCTGAGCCTCACCCTGAACTCCCTCATCTTGCMGGCCATMGTGTTTTCCAAGCAAMTGCCTCTCCCATCCTCTCTCAGGAAGCTTC
TAGAGACTTTATGCCCTCCAGAGCTCCMGATATMGCCCTCCAAGGGATCAGAAGCTCCMGTTCCTGTCTTCTGTTTTATAGAMTTGATCTTCCCTGGGGGACTTTAACTCTTGACCTGTATGCAGCTGTTGGAGTAATTCCAGGTCTCTTGAAAAAAMGAGGMGATAATGGAGAATGAGAACATATATATATATATATTAAGCCCCAGGCTGAATACTCAGGGACAGCAATTCACAGCCTGCCTCTGGTTCTATAAACMGTCATTCTACCTCTTTGTGCCCTGCTGTTTATTCTGTMGGGGMGGTGGCAATGGGACCCAGCTCCATCAGACACTTGTCAAGCTAGCAGAAACTCCATTTTCAATGCCAMGAAGMCTGTAATGCTGTTTTGGMTCATCCCAAGGCATCCCMGACACCATATCTTCCCATTTCAAGCACTGCCTGGGCACACCCCMCATCCCAGGCTGTGGTGGCTCCTGTGGGAACTACCTAGATGMGAGAGTATCATTTATACCTTCTAGGAGCTCCTATTGGGAGACATGAAACATATGTAATTGACTACCATGTMTAGAACAAACCCTGCCAAGTGCTGCTTTGGAMGTCATGGAGGTAMAGAAAGACCATTCSEQ ID NO :7 人 MASP-3 的蛋白質序列。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKTKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKMLNNNTGTYTCSAQGVWMNKVL GRSLPTCLPECGQPSRSLPSLVKRIIGGRNAEPGLFPWQALIVVEDTSRVPNDKWFGSGALLSASWILTAAHVLRSQRRDTTVIPVSKEHVTVYLGLHDVRDKSGAVNSSAARVVLHPDFNIQNYNHDTALVQLQEPVPLGPHVMPVCLPRLEPEGPAPHMLGLVAGffGISNPNVTVDETISSGTRTLSDVLQYVKLPVVPHAECKTSYESRSGNYSVTENMFCAGYYEGGKDTCLGDSGGAFVIFDDLSQRffVVQGLVSWGGPEECGSKQVYGVYTKVSNYVDWVWEQMGLPQSVVEPQVERSEQ ID NO :8 人 MASP-3 的 cDNA 序列GMGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGMGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGMGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAMGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGMTGCCAGCCMTTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGMCAMGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCMGTCMGCTGGGAGGACCMGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAMGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAMCAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGMTATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGMTCCTCCTACCTTTGTGMTATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTC6b
0X33VXXV03X0VXX3V0000XVXW033300V3330W0X33VX300VW0X3XVXXVX0XVW0XX30[81790]
0V3XXX3XW30VW3V30W3V0V33X30X30X33V3V33X03000XV33V3V0X30V33V3W00X30[Z.^90]
3V330XVXV333000XXXV3V3W0V3X3W3X0XXV333XXVWXX3330W33V33300V000X0330[91790]
VXW0V30V000X30X3V0X30X0XXX00W000XX0WV0V00XV3V0WW3XXXW00VWXXV333[9^90]
3XX0XVXX333XVXX330WX3X0V30XX3XX30WW333X3X3XXX0000X330XV3XX33V30V00X[忡90]
X333XV0X0X0VXX3X3X3X33330W330VXV3X300XV0V000XXXX00V3XXV30V0W0V00VX0X[ε^90]
33XX33XWX3300XX330VX3V000X3XX330X3X30X33XXXXVXVX0X3XV30330XW0X3W0XX[2棚]
V3WX3XXX00XWW0VXXVX3V0X33V00XX30V0X3WXVX00XX0X3VX33X003XV333VW3XV[1^90]
XX3V33V0X33X3V3XXVXXX3300X0V3333VXX3XX30XV3300V33XXX33X3V30V333XW300X
0X3X3300W33W3X30V00V30XW3VXWX0V033VX3X3V3X33000X3X0X333XXX3X3X0W0[6090]
3X0XX30V0X33XX0X0X33V0V00V300V33X300WW000VXVX00X0X0V0V300V0V0X330V00[8090]
V333330V3V0V033VX33X3XX300X0030VX33V0X3V3V3W00XW00XVXV33V0V3XVXX0VXX[Ζ.ε90]
V3V33X3V3V30V3V033XX3V3033V3VX30W030V0X3333X330X3300003X33XX3VXX3V0X3[9090]
0V0X003W00X00V33330V00X0XX0X0WV3V33VXX3000XV0V30V000X0X000X3V00X03VX[9090]
XW33X3X00VW3V3VX3X0V00XVX3X00V30W30V30030XW0W0X33V0000000X33X0X00[^090]
X3300W30X00X000X3030V330V0XX3V0XV0XXX3XV3X0XXX330000X0030VXV0V00XX330[εε90]
X03V3V0VW3003000V03VX3VX300X30X0X3XX0XV3W0V003V3X030V3VXXW30003X303[2090]
33X0V0XVX30VX3WW30X0V0X303V3X330X00X0333VXX0W3X0XVX0V30X33X0XV0V3X0[1090]
XX33V003V3V300X0V30V3XV3XV0V0XV00X0V3V0X0XW333XW33X3XV30000X3003000X
00X33000X30XV3V3333330033300W0X330V0XX300W330X330X3X0X330XVXX03V3330[6290]
V000X33330X0X330V00V30X30V30X00X3X30VXVXV03V33W3VX3WW33XV3W3XX3V0V[8290]
333V33X30X00X0V03330X30V3X30V3W3X0V3000003XVW3V0V030X0XV0XV30XX0000X[Ζ.290]
33VX3X033V3X0XV30V00W33X3X0V33VXV0X003V33V3V0V0VX030V333X3030X30X0XV3[9290]
X30V30V3V3X33XV00X33X030X3X3X30X3330000X0V000XXX00X0W3V0XVW330X0V0V0[9290]
3XX3V3V00V00X00X0VXV0X33300V300X0333XX3X3300X330V0X30XVW03300000XXV0X[於90]
V00V0W3X00X330W330X333X30333X3330V3X00X0X0V0V33XX330X33V333VX330W0V
0000XXVX0VWXW0XV00X3X0V00W3330X3XX0X33VXVXVXVX00V3V3WXW3W3X30XV0[2290]
W3VXXVX3330V00V3X0X33X3VXWV3XV0V0X3X0W3VXV3V33V3X33W3W00W3VX3X3X[1290]
X33V3XV0X30003V3W00X30V0V00V33330V0VX0X3V0VX0XXWWX0X33V333XXV0W3W
X0V00X03V000XV00W0X3X0X0V0XXV0V33XXV3V3V00XV0V00X0XWXV00W0X30X0VW0[6190]
VX300V3V3V0X0X30V3X03X30X0W33V0VW3XX3XXXVX0W330W333X3330V00XWW00[8190]
0XV33X0X33X330V3VX30V0V3330X0V0XVW00V30X3000V3VXV3X3X300V00X3000030W[Ζ.190]
0V0V0003X3W3V0X0VXV33XX0X33XV0X33X0X0V3V330V0V333V30V3XV333W0V33330V[9190]
W0V0V00X0X3XXX330000XXXX0WW33X00XX0VW3XV0W3XV3VX3V0XVX33330X3300X[9190]
00V0X33XV33V00V0XXV3V0XXXVXV3V00V0XXX0V30X33W3X00XV3XXX000V00V00X30V0[W90]
3XV33VXVX0X330XW0X3X30V0W3333VXX333VW333XX3V0X3330V33V3XV0X0000X0V0
0VW3X3V3XX3X33W3V0X0V30X0V00X0V0330X33V00V3W3V0V3V3V33X33XV3VX3000X[2190]
X30330X33X30X3VX3VX300300XXV3VX3W3V330X3VX3V33V0X0X33X0X30V00V00V00V0[ 1190]
~\ ~\Λ Τ ~\Λ Τ ~\ ~\Λ ΤΛ τ/-\Γ\ τ ~\Λ ΤΓ/-\Λ ΤΓ\Γ\ r\ λ ΤΓ\Γ\ r\ r\r\r\ λ τ/-\Λ Τ /-\Λ T/-\r\r\r\ τ λ rr\ τ τ ττ/-\λ τ/-\ r\r\ r\i rr\r\T τγ\ λτ\τ/-\Γλ ■ λλ
GAAAAAGAAMGACCCACACTGTGTCCTGCTGTGCTTTTGGGCAGGAAMTGGAAGAAAGAGTGGGGTGGGCACATTAGMGTCACCCAMTCCTGCCAGGCTGCCTGGCATCCCTGGGGCATGAGCTGGGCGGAGMTCCACCCCGCAGGATGTTCAGAGGGACCCACTCCTTCATTTTTCAGAGTCAAAGGAATCAGAGGCTCACCCATGGCAGGCAGTGAAAAGAGCCAGGAGTCCTGGGTTCTAGTCCCTGCTCTGCCCCCAACTGGCTGTATAACCTTTGAAAAATCATTTTCTTTGTCTGAGTCTCTGGTTCTCCGTCAGCAACAGGCTGGCATMGGTCCCCTGCAGGTTCCTTCTAGCTGGAGCACTCAGAGCTTCCCTGACTGCTAGCAGCCTCTCTGGCCCTCACAGGGCTGATTGTTCTCCTTCTCCCTGGAGCTCTCTCTCCTGAAMTCTCCATCAGAGCAAGGCAGCCAGAGMGCCCCTGAGAGGGMTGATTGGGMGTGTCCACTTTCTCAACCGGCTCATCAMCACACTCCTTTGTCTATGAATGGCACATGTAMTGATGTTATATTTTGTATCTTTTATATCATATGCTTCACCATTCTGTAAAGGGCCTCTGCATTGTTGCTCCCATCAGGGGTCTCMGTGGAMTAMCCCTCGTGGATAACCAAAAAAAAAAAMAAAAAMSEQ ID NO :9人MASP-2的蛋白質序列MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSffl.CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGFAPTCDHHCHNH.GGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPRPYPKLSSCTYSISLEEGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQTDREEHGPFCGKTLPHRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKIHYTSTAQPCPYPMAPPNGHVSPVQAKYILKDSFSIFCETGYELLQGHLPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPACSIVDCGPPDDLPSGRVEYITGPGVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEADGFWTSSKGEKSLPVCEPVC GLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGTTMGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIRMGTLKRLSPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNMVVINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQRGFLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWFVGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYIPWIENIISDF
SEQ ID NO : 10 人 MASP-2 的 cDNA 序列GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGMGTGGCCTGMCCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCMTGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCMGCTGAGCTCGGGGGCCMGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTMCAAGCGCACCTGCTCAGCCCTGTGCTCCGGCCAGGTCTTCACCCAGAGGTCTGGGGAGCTCAGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAACTCTCCAGTTGCACTTACAGCATCAGCCTGGAGGAGGGGTTCAGTGTCATTCTGGACTTTGTGGAGTCCTTCGATGTGGAGACACACCCTGAMCCCTGTGTCCCTACGACTTTCTCAAGATTCAAACAGACAGAGAAGMCATGGCCCATTCTGTGGGMGACATTGCCCCACAGGATTGAMCAAAMGCMCACGGTGACCATCACCTTTGTCACAGATGMTCAGGAGACCACACAGGCTGGMGATCCACTACACGAGCACAGCGCAGCCTTGCCCTTATCCGATGGCGCCACCTAATGGCCACGTTTCACCTGTGCMGCCAMTACATCCTGAAAGACAGCTTCTCCATCTTTTGCGAGACTGGCTATGAGCTTCTGCAAGGTCACTTGCCCCTGAAATCCTTTACTGCAGTTTGTCAGAMGATGGATCTTGGGACCGGCCAATGCCCGCGTGCAGCATTGTTGACTGTG
GCCCTCCTGATGATCTACCCAGTGGCCGAGTGGAGTACATCACAGGTCCTGGAGTGACCACCTACAMGCTGTGATTCAGTACAGCTGTGAAGAGACCTTCTACACMTGAAAGTGMTGATGGTAMTATGTGTGTGAGGCTGATGGATTCTGGACGAGCTCCAMGGAGAAAMTCACTCCCAGTCTGTGAGCCTGTTTGTGGACTATCAGCCCGCACAACAGGAGGGCGTATATATGGAGGGCAAMGGCAAAACCTGGTGATTTTCCTTGGCMGTCCTGATATTAGGTGGMCCACAGCAGCAGGTGCACTTTTATATGACMCTGGGTCCTAACAGCTGCTCATGCCGTCTATGAGCAAAAACATGATGCATCCGCCCTGGACATTCGMTGGGCACCCTGAAAAGACTATCAC
CTCATTATACACAAGCCTGGTCTGAAGCTGTTTTTATACATGMGGTTATACTCATGATGCTGGCTTTGACMTGACATAGCACTGATTAAATTGMTAACAAAGTTGTAATCAATAGCAACATCACGCCTATTTGTCTGCCAAGAAMGAAGCTGAATCCTTTATGAGGACAGATGACATTGGMCTGCATCTGGATGGGGATTAACCCAMGGGGTTTTCTTGCTAGAAATCTMTGTATGTCGACATACCGATTGTTGACCATCAAAMTGTACTGCTGCATATGAAAAGCCACCCTATCCAAGGGGAAGTGTMCTGCTAACATGCTTTGTGCTGGCTTAGAMGTGGGGGCAAGGACAGCTGCAGAGGTGACAGCGGGGGGCACTGGTGTTTCTAGATAGTGAMCAGAGAGGTGGTTTGTGGGAGGMTAGTGTCCTGGGGTTCCATGAATTGTGGGGAAGCAGGTCAGTATGGAGTCTACACAAAAGTTATTAACTATATTCCCTGGATCGAGMCATMTTAGTGATTTTTMCTTGCGTGTCTGCAGTCAAGGATTCTTCATTTTTAGAMTGCCTGTGMGACCTTGGCAGCGACGTGGCTCGAGMGCATTCATCATTACTGTGGACATGGCAGTTGTTGCTCCACCCAAAAAAACAGACTCCAGGTGAGGCTGCTGTCATTTCTCCACTTGCCAGTTTMTTCCAGCCTTACCCATTGACTCAAGGGGACATAMCCACGAGAGTGACAGTCATCTTTGCCCACCCAGTGTAATGTCACTGCTCAAATTACATTTCATTACCTTAAAMGCCAGTCTCTTTTCATACTGGCTGTTGGCATTTCTGTAAACTGCCTGTCCATGCTCTTTGTTTTTAMCTTGTTCTTATTGAAAAAMAAAAAAAAAASEQ ID NO :11 人 sMAP(MApl9)的蛋白質序列MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSffl,CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPTCDHHCHNH.GGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSEQSLSEQ ID NO :12 人 sMAP(MApl9)的 cDNA 序列GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGMGTGGCCTGMCCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCMTGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCMGCTGAGCTCGGGGGCCMGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTMCAAGCGCACCTGCTCAGAGCAGAGCCTCTAGCCTCCCCTGGAGCTCCGGCCTGCCCAGCAGGTCAGMGCCAGAGCCAGCCTGCTGGCCTCAGCTCCGGGTTGGGCTGAGATGGCTGTGCCCCAACTCCCATTCACCCACCATGGACCCAATAATAAACCTGGCCCCACCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAADNA 引物SEQ ID NO :13 :5' -gcacccagagccacagtg-3'SEQ ID NO :14 :5' -gccttccagtgtgtgggc-31
SEQ ID NO : 15 :5_gccttccagagtgtggtca_3'SEQ ID NO :16 :5' -cgatctggagagcgaactc-3!SEQ ID NO :17 5f -ctgttcttcacactggctg-3fSEQ ID NO :18 :5' -ctgctgagatcatgttgttc-3f SEQ ID NO :19 :5' -TTATACGACTCACTA-3'
權利要求
1.分離的ficolin-相關多肽。
2.按照權利要求I的多肽，其基本上是純的。
3.按照權利要求I或2的多肽，其中所述多肽能夠與甘露糖結合凝集素(MBL)締合。
4.按照權利要求1-3中任一項的多肽,其中所述多肽能夠與ficolin-1,ficolin-2,或ficolin-3中的任一種相締合。
5.按照權利要求1-4中任一項的多肽，其中所述多肽能夠與Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和細胞內膠原樣防禦分子，諸如CL-Ll中的任一種相締合。
6.按照權利要求1-5中任一項的多肽，其中所述多肽能夠與特異性接受體蛋白，諸如特異性受體相締合。
7.按照權利要求1-6中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQNO 3的胺基酸序列20-297、或其功能性變體。
8.按照權利要求1-7中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQNO 1的胺基酸序列20-380、或其功能性變體。
9.按照權利要求1-8中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO 9的胺基酸序列16-296或其功能性變體。
10.按照權利要求1-8中任一項的多肽，其中所述多肽在非還原條件下在SDS-PAGE上具有約40kDa的分子量。
11.按照權利要求1-8或10中任一項的多肽，其中所述多肽在與選自SEQNO 1的49和178的位置相對應的一個或兩個胺基酸處被N-連接糖基化。
12.按照權利要求1-11中任一項的多肽，其中所述多肽是重組蛋白。
13.按照權利要求1-12中任一項的多肽，其中所述多肽是同型二聚體形式的。
14.按照權利要求1-8、10-13中任一項的多肽，其中所述多肽由SEQIDNO I的胺基酸序列20-380組成。
15.按照權利要求1-14中任一項的多肽，其包含SEQID NO 4的胺基酸序列或其變體或免疫學片段。
16.包含SEQID NO 4的胺基酸序列或其變體或免疫學片段的多肽。
17.按照權利要求16的多肽，其由SEQID NO :4、或其變體或免疫學片段組成。
18.按照權利要求1-17中任一項的多肽，其中所述多肽介導瀕死細胞或死亡細胞、和/或細胞碎片的吞噬，所述瀕死細胞或死亡細胞諸如凋亡細胞。
19.按照權利要求1-18中任一項的多肽，其中所述多肽介導微生物的吞噬。
20.按照權利要求1-19中任一項的多肽，其中所述多肽具有與具有序列同源性的其它蛋白相似的活性，所述其它蛋白如吞沒銜接蛋白(GULP)。
21.特異性結合按照權利要求1-20中任一項的多肽的抗體。
22.編碼權利要求1-20中任一項的多肽的分離的核酸分子。
23.包含與SEQNO :2的序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的分尚的核酸分子。
24.包含按照權利要求22-23中任一項的分離的核酸分子的載體。
25.包含按照權利要求24的載體的宿主細胞。
26.按照權利要求25的宿主細胞，其是真核細胞。
27.按照權利要求26的宿主細胞，其是哺乳動物來源的。
28.按照權利要求27的宿主細胞，其中所述細胞選自由CHO細胞、HEK細胞和BHK細胞組成的組。
29.產生如權利要求1-20中任一項定義的多肽的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構建體表達的條件下在適合的生長培養基中培養如權利要求25-28中任一項定義的細胞，並且從所述培養基中回收得到的多肽。
30.包含如權利要求1-20中任一項定義的多肽的組合物。
31.包含如權利要求1-20中任一項定義的多肽的藥物組合物。
32.檢測生物學樣品中的如權利要求1-20中任一項定義的多肽的方法，所述方法包括 a)獲得生物學樣品； b)使所述生物學樣品與按照權利要求21的抗體接觸；並且 c)如果有的話，檢測所述抗體與所述多肽的複合物； 作為所述樣品中存在所述多肽的指示。
33.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用作藥物。
34.如權利要求1-20中任一項定義的多肽用於製備藥物的用途。
35.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證。
36.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療任意自體免疫性病症，諸如艾迪生病，自體免疫性溶血性貧血，自體免疫性甲狀腺炎，局限性迴腸炎，格雷夫斯病，吉蘭-巴雷症候群，系統性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡性腎炎，多發性硬化病，重症肌無力，銀屑病，原發性膽汁性肝硬變，類風溼性關節炎和葡萄膜炎，哮喘，動脈粥樣硬化，I型糖尿病，銀屑病，各種過敏症。
37.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療選自由下列組成的組的任意炎性病症闌尾炎，消化性潰瘍，胃潰瘍，十二指腸潰瘍，腹膜炎，胰腺炎，潰瘍性結腸炎，假膜性結腸炎，急性結腸炎，缺血性結腸炎，憩室炎，會厭炎，失弛緩症，膽管炎，膽囊炎，肝炎，局限性迴腸炎，腸炎，惠普爾病，過敏症，免疫複合物病，器官缺血，再灌注損傷，器官壞死，花粉症,膿毒症,敗血病，內毒素性休克,惡病質,高燒,嗜酸性肉芽腫，肉芽腫病，肉瘤樣病,感染性流產，附睪炎，陰道炎，前列腺炎，尿道炎，支氣管炎，肺氣腫，鼻炎，肺炎，肺塵病，肺泡炎，毛細支氣管炎，咽頭炎，胸膜炎，竇炎，流感，呼吸道合胞病毒感染，HIV感染，B型肝炎病毒感染，C型肝炎病毒感染，彌散性菌血症，登革熱，念珠菌病，瘧疾，絲蟲病，阿米巴病，包蟲囊腫，燒傷，皮炎，皮肌炎，曬傷，蕁麻疫，撫，風疹塊，血管炎，脈管炎，心內膜炎，動脈炎，動脈粥樣硬化，血栓性靜脈炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，結節性動脈周圍炎，風溼熱，阿爾茨海默病，腹腔病，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫症候群，腦膜炎，腦炎，多發性硬化病，腦梗死，腦栓塞，吉蘭-巴雷症候群，神經炎，神經痛，脊髓損傷，癱瘓，葡萄膜炎，關節炎，關節痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病，痛風，牙周病，類風溼性關節炎，滑膜炎，重症肌無力，甲狀腺炎，系統性紅斑性狼瘡，肺出血腎炎症候群，貝赫切特症候群，同種異體移植排斥，移植物抗宿主病，I型糖尿病，強直性脊柱炎，貝格爾病，萊特爾症候群和霍奇金病，角膜炎，2型糖尿病，囊性纖維化，心肌梗死，再灌注損傷，中風，皮肌炎，代謝症候群，系統性炎症反應症候群，膿毒症，多器官衰竭，瀰漫性血管內凝血，過敏性休克，血管併發症和與I型和/或2型糖尿病相關的腎病，腦膜炎，細菌性敗血病，並發性瘧疾，非典型的溶血性尿毒症症候群，溶血性尿毒症症候群，年齡相關的黃斑變性，陣發性睡眠性血紅蛋白尿症，蛇毒咬傷，燒傷，和器官移植併發症。
38.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療選自由下列組成的組的任意炎性病症器官缺血，再灌注損傷，器官壞死，血管炎，心內膜炎，動脈粥樣硬化，血栓性靜脈炎,心包炎,心肌炎,心肌缺血,結節性動脈周圍炎，風溼熱，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫症候群，腦梗死，腦栓塞，血管併發症和與I型和/或2型糖尿病相關的腎病。
39.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的任意適應證。
40.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病或病症有關的適應證，包括炎性反應和與纖維蛋白形成有關的慢性血栓栓塞疾病或病症,包括血管病症,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術後血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG)，經皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風，腫瘤生長，腫瘤轉移，血管發生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形後的再狹窄，急性和慢性適應證，如炎症，膿毒症，膿毒性休克，敗血病，低血壓，成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，系統性炎症反應症候群(SIRS)，彌散性血管內凝血病(DIC)，肺栓塞，病理性血小板沉積，心肌梗死，或用於預防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風險患有血栓形成,外周血祖細胞(PBPC)移植後的靜脈閉塞病，溶血性尿毒症症候群(HUS)，和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和風溼熱。
41.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病或病症有關的適應證，包括炎性反應和與纖維蛋白形成有關的慢性血栓栓塞疾病或病症,包括血管病症,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術後血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG)，經皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風，腫瘤生長，腫瘤轉移，血管發生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形後的再狹窄，急性和慢性適應證如炎症，病理性血小板沉積，心肌梗死，或用於預防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風險患有血栓形成，外周血祖細胞(PBPC)移植後的靜脈閉塞病，溶血性尿毒症症候群(HUS)，和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和風溼熱。
42.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於預防在鑑定的高危患者中發生血栓栓塞併發症，所述鑑定的高危患者如經歷手術的那些或患有充血性心力衰竭的那些。
43.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療與心臟相關的醫學病症。
44.如權利要求1-20中任一項定義的多肽，其用於治療與ficolin-相關多肽缺乏有關的醫學病症。
45.用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
46.用於治療任意自體免疫性疾病或與自體免疫性表現有關的疾病的方法，所述疾病如艾迪生病，自體免疫性溶血性貧血，自體免疫性甲狀腺炎，局限性迴腸炎，格雷夫斯病，吉蘭-巴雷症候群，系統性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡性腎炎，多發性硬化病，重症肌無力，銀屑病，原發性膽汁性肝硬變，類風溼性關節炎和葡萄膜炎，哮喘，動脈粥樣硬化，I型糖尿病，銀屑病，和各種過敏症，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求.1-20中任一項定義的多肽。
47.用於治療選自由下列組成的組的任意炎性病症的方法闌尾炎，消化性潰瘍，胃潰瘍，十二指腸潰瘍，腹膜炎，胰腺炎，潰瘍性結腸炎，假膜性結腸炎，急性結腸炎，缺血性結腸炎，憩室炎，會厭炎，失弛緩症，膽管炎，膽囊炎，肝炎，局限性迴腸炎，腸炎，惠普爾病，過敏症,過敏性休克,免疫複合物病,器官缺血,再灌注損傷,器官壞死,花粉症,膿毒症,敗血病，內毒素性休克，惡病質，高燒，嗜酸性肉芽腫，肉芽腫病，肉瘤樣病，感染性流產，附睪炎，陰道炎，前列腺炎，尿道炎，支氣管炎，肺氣腫，鼻炎，肺炎，肺塵病，肺泡炎，毛細支氣管炎，咽頭炎，胸膜炎，竇炎，流感，呼吸道合胞病毒感染，HIV感染，B型肝炎病毒感染，C型肝炎病毒感染，彌散性菌血症，登革熱，念珠菌病，瘧疾，絲蟲病，阿米巴病，包蟲囊腫，燒傷，皮炎，皮肌炎，曬傷，蕁麻疹，疣，風疹塊，血管炎，脈管炎，心內膜炎，動脈炎，動脈粥樣硬化，血栓性靜脈炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，結節性動脈周圍炎，風溼熱，阿爾茨海默病，腹腔病，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫症候群，腦膜炎，腦炎，多發性硬化病，腦梗死，腦栓塞，吉蘭-巴雷症候群，神經炎，神經痛，脊髓損傷，癱瘓，葡萄膜炎，關節炎，關節痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病，痛風，牙周病，類風溼性關節炎，滑膜炎，重症肌無力，甲狀腺炎，系統性紅斑性狼瘡，肺出血腎炎症候群，貝赫切特症候群，同種異體移植排斥，移植物抗宿主病，I型糖尿病，強直性脊柱炎，貝格爾病，萊特爾症候群和霍奇金病；所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
48.用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的任意適應證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
49.用於治療與凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病或病症有關的適應證，或用於預防性治療具有動脈粥樣硬化血管有風險患有血栓形成、外周血祖細胞(PBPC)移植後的靜脈閉塞病、溶血性尿毒症症候群(HUS)、和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的哺乳動物的方法，所述適應證包括炎性反應和與纖維蛋白形成有關的慢性血栓栓塞疾病或病症，包括血管病症,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術後血栓形成,冠狀動脈旁路移植(CABG)，經皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風，腫瘤生長，腫瘤轉移，血管發生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形後的再狹窄，急性和慢性適應證，如炎症，膿毒症，膿毒性休克，敗血病，低血壓，成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，系統性炎症反應症候群(SIRS)，彌散性血管內凝血病(DIC)，肺栓塞，病理性血小板沉積，心肌梗死，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
50.用於預防在鑑定的高危患者中發生血栓栓塞併發症的方法，所述高危患者如經歷手術的那些或患有充血性心力衰竭的那些，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
51.用於治療與心臟相關的醫學病症的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
52.用於治療與ficolin-相關多肽缺乏有關的醫學病症的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽。
53.在嚴格條件下能夠與權利要求22-23中任一項的核酸序列雜交的核酸探針。
54.檢測生物學樣品中存在編碼權利要求1-20中任一項定義的多肽的核酸的方法，所述方法包括 a)獲得生物學樣品； b)使所述生物學樣品與權利要求53的核酸探針接觸；並且 c)如果有的話，檢測所述核酸探針與編碼所述多肽的所述核酸的複合物； 作為在所述樣品中存在編碼所述多肽的所述核酸的指示。
55.診斷與ficolin-相關多肽異常表達有關的病症的方法，所述方法包括獲得來自患者的生物學樣品，並且測量所述生物學樣品中所述ficolin-相關多肽的表達，其中，與對照相比，所述生物學樣品中所述ficolin-相關多肽增加或減少的表達表示所述患者患有與ficolin-相關多肽異常表達有關的病症。
56.分離的組合物，其包括如權利要求1-20中任一項定義的多肽與選自下列的一種或多種蛋白的組合Ficolin-l、2、3，甘露糖結合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和細胞內膠原樣防禦分子，諸如CL-Ll。
57.按照權利要求56的組合物，其是藥物組合物。
58.如權利要求57定義的藥物組合物，其用作藥物。
59.如權利要求56定義的組合物用於製備藥物的用途。
60.如權利要求57定義的藥物組合物，其用於治療與炎症、凋亡和/或自體免疫性相關的任意適應證。
61.如權利要求57定義的藥物組合物，其用於治療如權利要求36-44中任一項定義的任意適應證。
62.用於治療如權利要求35-44中任一項定義的任意適應證的方法,所述方法包括同時或順次施用治療或預防有效量的如權利要求1-20中任一項定義的多肽和一種或多種選自Ficolin-l、2、3，和甘露糖結合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP_D，和細胞內膠原樣防禦分子，諸如CL-Ll的蛋白。
63.如權利要求1-20中任一項定義的多肽作為血液和組織中的生物標記的用途，用於惡性疾病，諸如癌症疾病，諸如腦瘤、肝腫瘤和生殖道腫瘤的診斷和/或預後。
64.如權利要求1-20中任一項定義的多肽作為血液和組織中的生物標記的用途，用於如權利要求35-44中任一項定義的自體免疫、代謝和/或炎性病症的診斷和/或預後。
全文摘要
本發明涉及新型ficolin-相關多肽，和衍生於這些ficolin-相關多肽的多肽，其用於治療與炎症、凋亡、自體免疫性、凝結、血栓形成或凝血病相關的疾病有關的病症的治療，以及用作生物標記。本發明還涉及識別所述新型ficolin-相關多肽和衍生於其的多肽的抗體、編碼所述多肽的核酸分子、用於生產所述多肽的載體和宿主細胞。
文檔編號C07K14/47GK102712687SQ201080041321
公開日2012年10月3日 申請日期2010年7月16日 優先權日2009年7月17日
發明者彼得·加雷爾, 米克爾-奧勒·舍爾德, 蒂娜·胡梅爾肖伊·格盧 申請人:丹麥國家醫院, 南丹麥大學, 哥本哈根大學