基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法

2023-05-26 13:03:41

專利名稱：：基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法
技術領域：
：本發明屬於轉基因檢測
技術領域：
，特別涉及一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法。
背景技術：
：隨著現代生物技術的發展，轉基因食品已逐步進入普通百姓的生活。由於轉基因食品所具有的潛在非安全件，為保護廣大消費者的權益，滿足其選擇權和知情權以及出於國際貿易的需要，轉基因食品的檢測越來越引起各國政府和有關食品監督機構的重視。目前轉基因產品檢測方法分為兩大類-1、免疫學檢測法免疫學檢測法是從蛋白質水平對轉基因食品進行檢測，即對外源蛋白質的測定。可將其分為Western雜交、酶聯免疫法(ELISA)、試紙條法和快速檢測試劑盒法。免疫學檢測法，其基本原理是通過抗原(antigen)抗體(antibody)之間的特異反應來實現的。這種方法的不足在於第一，由於抗原抗體反應的專一性，因此一種試劑盒只針對一特定轉基因產物，無法高通量、快速地檢測具有多種混合成分的食品樣品；第二，加工過的轉基因食品中的蛋白質抗原性很容易破壞，從而影響檢測結果的準確性；第三，有些轉基因食品不表達蛋白質或表達量很低或很大時，則無法進行檢測。2、PCR檢測法PCR檢測法是目前轉基因存在的檢測方法屮最為成熟的，它具有靈敏度較高、特異性強、可準確定量等優點。現階段常用的PCR技術有定性PCR，定量競爭PCR和實時螢光定量PCR，PCR—ELISA，巢式擴增PCR(NestedPCR)和複合擴增PCR(MultiplexPCR)。但該項技術的檢測結果也有可能與實際不相符合，會出現假陰性或假陽件結果，即檢測物質本身含有轉基因特製而未被檢出，或是本身沒有轉基因物質，而檢出有轉基因成分。
發明內容為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法。該方法設計一條靶基因探針，探針的5'端和3'端能夠與目標的檢測基因序列互補配對，在完全互補配對的情況下，連接酶把能夠完全配對的探針連接成環化的探針，再用一條5'端生物素化複製引物以該環化探針為模板進行滾環擴增，擴增出與環形探針模板互補的串聯重複序列的DNA單鏈；然後將產物與釕標記的探針雜交，最後進行電化學發光檢測。只有當探針能夠與轉基因物種的待測序列完全互補才能被連接酶連接成環化探針，從而能產生用於滾環複製的模板；而不含轉基因的物種因為不能產生滾環複製的模板，因此不能得到擴增產物；通過對擴增產物與釕探針雜交後進行電化學發光檢測能判斷轉基因的有無。本發明的目的通過下述技術方案實現一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，包括以下步驟(1)從轉基因物種樣品中提取樣品的基因組DNA即靶基因1。(2)將靶基因1與過量的靶基因探針2混合，9095。C變性，然後自然冷卻到室溫，靶基因1與靶基因探針2退火、雜交。(3)然後加入25個單位(U)DNA連接酶，37'C下進行連接反應2030分鐘，耙基因探針2被DNA連接酶連接成環化探針3。(4)在上述環化探針3中加入過量的與環化探針3互補的生物素化的複製引物4、1015個單位(U)DNA聚合酶和13毫摩爾dNTPs，在37°C進行滾環擴增複製反應90分鐘左右，產生生物素化滾環擴增產物5。(5)在室溫下，步驟(4)得到的生物素化滾環擴增產物5與過量的釕標記的核酸探針6雜交3060分鐘，得到雜交產物。(6)將上述雜交產物與鏈黴親和素包被的磁珠孵育大約2030分鐘，然後用磁分離器分離，去掉上清，收集磁珠吸附的雜交產物於電化學發光儀器樣品池中。(7)往樣品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，檢測樣品池中的三聯P比啶釕複合物產生的電化學發光信號確定樣品中是否含有轉基因產品。比較樣品檢測的信號與非轉基因樣品的信號，當樣品信號大於非轉基因樣品信號與三倍標準偏差之和的信號時可判斷樣品為含有轉基因的樣品。所述步驟(1)的靶基因l提取方法如下對非粉末狀的固體樣品，採用5研磨處理成粉末狀，然後提取樣品中的DNA。對於液態樣品，採用冷凍乾燥法乾燥並磨碎成粉末狀。所述步驟(l)的轉基因物種樣品中含有的基因是CAMV35S啟動子、NOS終止子、Kmr(抗卡那黴素基因)、Nec/(抗新黴素基因)、Kygf(抗潮黴素基因)或Barr(抗草丁膦基因)的基因，以及人工插入基因組改變物種品質與功能的特異的外源基因。所述步驟(l)的靶基因1為含有CAMV35S啟動子、NOS終止子、Kmr(抗卡那黴素基因)、Nec/(抗新黴素基因)、Kygf(抗潮黴素基因)或Bar「(抗草丁膦基因)的基因，以及人工插入基因組改變物種品質與功能的特異的外源基因。所述步驟(2)的靶基因探針2是一段線性單鏈DNA探針，其長度一般為50200個鹼基長度，每條探針有一個5'磷酸末端和一個3'羥基末端。靶基因探針2包括兩個部分，分別為位於5'端和3'端的目標基因雜交區，以及位於5，端和3，端的目標基因雜交區中的填充區。雜交區的序列與靶基因l完全互補，並根據不同靶基因而變化，填充區則以最優化於滾環擴增條件而定。當轉基因物種樣品中含有CAMV35S啟動子時，所述靶基因探針2為5TGGGTGTTACGTACGGCAGAGGCATC丁TCAACGA3'。所述步驟(2)的高溫變性溫度一般為9095r，退火和雜交條件則依據所檢測的目標轉基因的序列而定，但一般範圍為2050'C，也可以從變性溫度緩慢降溫到室溫執行退火和雜交步驟。所述歩驟(3)的DNA連接酶包括￡.co/z'DNA連接酶、T4DNA連接酶、TaqDNA連接酶或其他適合於DNA連接的酶。所述歩驟(4)的生物素化的複製引物4是一段5，端標記上生物素的DNA單鏈，其長度為1530個鹼基長度為宜，它的序列應該與環化探針3的填充區互補。當轉基因物種樣品中含有CAMV35S啟動子時，所述生物素化的複製引物4為5'biotin-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3，；所述複製引物4為5，-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3，。所述歩驟(4)的DNA聚合酶包括￡.co//DNApolymerase(大腸桿菌DNA聚合酶)、phageM2DNApolymerase(噬菌體M2DNA聚合酶)、T5DNApolymerase(T5DNA聚合酶)、PRD1DNApolymerase(PRD1DNA聚合酶)或者Phi29DNApolymerase(Phi29DNA聚合酶)等。dNTPs為商品化產品。所述步驟(5)釕標記的核酸探針6為標記上釕的核酸探針，其長度一般為1530個鹼基長度，其序列與生物素化滾環擴增產物5的重複序列互補。當轉基因物種樣品中含有CAMV35S啟動子時，所述歩驟(5)中釕標記的核酸探針6為5，AATCCAGTTAGAATGAAG3'。所述步驟(6)的鏈黴親和素包被的磁珠可以採用商品化的產品，比如美國DynalBiotech公司的鏈黴親和素包被的磁珠。所述步驟(7)的電化學發光檢測儀器(見本申請人在先申請，申請號02227608.4，發明名稱電化學發光檢測儀，見圖2)包括樣品池、恆電位儀2、光纖3、光電倍增管4、模數轉換器5、微型計算機6和數據處理軟體；其中樣品池1由進樣管1-1、對電極1-2、工作電極1-3、參比電極1-4、出樣管1-5組成。樣品池可以用清洗液反覆清洗。所述的計算機數據採集軟體，如NationalInstruments公司開發的LabV正W軟體。所述的光電倍增管，如PerkinElmer公司研製的光電倍增管系列。本發明的原理與非轉基因的物種相比，轉基因物種含有-段外源轉入的基因，如CAMV35S啟動子，NOS終止子等。通過檢測這些轉入基因便可以檢測轉基因物種。滾環複製是噬菌體繁殖所採取的一種基岡複製方式，這種方式口」'使單鏈的環形分子在聚合酶和引物的作用下進行體外自我擴增。本發明通過設計一條靶基因探針，其5'端和3'端各含有一段可有轉基因物種靶序列互補的區域，通過與轉基因物種靶序列雜交，便可在DNA連接酶的作用下形成滾環複製中的環化單鏈分子，僅僅當檢測物種含有相應的轉基因片段才能雜交、並被DNA連接酶連接成環化的分子。加入一條特異性的生物素化複製引物，生物素化的複製引物便可以以此環化單鏈分子為模板，在DNA聚合酶的作用下恆溫擴增，產生含有多個重複片段U05109)的DNA線性單鏈分子。設計特異性的釕探針與該DNA線性單鏈互補，因此，雜交後生物素化的擴增產物可攜帶大量釕探針，極大的擴增出信號。加入鏈黴親和素包被的磁珠後，由於鏈黴親和素能選擇性的與生物素產生強大特異的相互作用，因此通過磁分離磁珠，游離的釕探針以及其他非特異的產物能夠被分離洗脫掉。在一定電壓條件下，三聯吡啶釕/三丙胺或者三聯吡啶釕/二丁基乙醇胺能夠在電極表面發生電化學反應並發出光子。光子經過光纖收集到光電倍增管中，然後將其轉化為電信號，經過模式轉換器轉化為數位訊號，經計算機採集處理。通過判斷電化學發光強度來檢測轉基因的有無。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果(1)本發明的連接酶反應需要探針分子和靶序列完全雜交互補才能實現，保證了本發明的特異性。(2)本發明的滾環擴增方法中所擴增的並不是樣品中的目標基因而是探針序列，轉基因物種中的目標基因只是提供了一個探針環化的互補支架，進一步保證了擴增的特異性。(3)本發明的擴增過程在恆溫下進行，不需要特定的PCR儀器和高溫條件下穩定的DNA聚合酶，降低了檢測的硬體要求和檢測成本。(4)本發明所使用的電化學發光檢測技術靈敏度很高；而且由於本方法所用的電化學發光探針只發生特異性的化學發光反應，所以測量的準確性也很(5)本發明與傳統PCR方法相比，更為快速。(6)本發明所利用的檢測裝置簡單，投資少，實現容易，操作簡便。(7)本發明使用範圍廣泛，可以實現通用的轉基因物種檢測，因此節省成本。圖1為電化學發光滾環擴增技術的原理圖。其中，靶基因1，靶基因探針2，環化探針3，生物素化複製引物4，滾環擴增產物5，釕標記的核酸探針6。圖2為本發明電化學發光檢測儀器的裝置示意圖。圖3為本發明檢測轉基因大豆的發光信號圖。圖4為本發明檢測轉基因番木瓜的發光信號圖。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1將本發明的方法應用於轉基因大豆的檢測，檢測轉基因大豆裡的CaMV35S啟動子序列。如圖1所示為電化學發光滾環擴增技術的原理圖。(1)分別提取非轉基因大豆(華農1號)和轉基因大豆(巴西大豆1號)裡的基因組DNA(靶基因l)(對非粉末狀的同體樣品，採用研磨處理成粉末狀，然後提取樣品中的DNA)。針對轉基因大豆的基因組DNA和非轉基因大豆的基因組DNA平行進行如下實驗，且步驟一樣。(2)將O.l納摩爾耙基因探針2(見表1)與IO微升上述非轉基因大豆基因組DNA混合，0.1納摩爾靶基因探針2和10微升上述轉基因大豆基因組DNA(靶基因1)混合，然後分別在95。C變性5分鐘，讓其自然冷卻到室溫促使靶基因探針2退火到35S啟動子序列上的靶基因1上並雜交。(3)然後加入2個單位(U)的T4DNA連接酶，37。C條件下孵育30分鐘，進行連接反應，靶基因探針2被T4DNA連接酶連接成環化探針3(環化探針3與耙基因探針2的序列相同，只是被連接成環狀)。(4)然後在環化探針3中加入過量的與環化探針3互補的生物素化的複製引物4(見表1)，室溫下孵育30分鐘，生物素化的複製引物4自然退火。(5)往上述產物中加入IO個單位(U)的Phi29DNA聚合酶、毫摩爾濃度dNTPs，37"C條件下滾環擴增反應90分鐘，得到含有約為1000個串連重複序列的生物素化滾環擴增產物5。(6)在步驟(5)得到的生物素化滾環擴增產物5中加入0.1納摩爾釕標記的核酸探針6(見表1)，在室溫下，釕標記的核酸探針6與生物素化滾環擴增產物5雜交30分鐘，得到雜交產物。(7)往上述雜交產物中加入鏈酶親和素包被的磁珠(美國DynalBiotech公司的鏈黴親和素包被的磁珠)，室溫下孵育30分鐘，磁分離器分離雜交產物，去除上清即未雜交的釕標記的核酸探針6，得到磁珠吸附的雜交產物。(8)將步驟(7)中磁珠吸附的雜交產物轉入到電化學發光檢測儀器樣品池中。(9)在電化學發光檢測儀器樣品池中加入IOO微升三丙胺，給定電壓1.25V，打開光電倍增管，電化學發光檢測。(9)比較樣品檢測的信號與非轉基因樣品的信號，當樣品信號大於非轉基因樣品信號與三倍標準偏差之和的信號時可判斷樣品為含有轉基因的樣品。如圖3所示，是本實施例中用滾環擴增方法檢測轉基因大豆中的35S啟動子序列的發光信號對比圖。樣品1為TE緩衝液+三丙胺(本底)，樣品2為非轉基因大豆(華農1號)，樣品3為轉基因大豆(巴西大豆1號)，虛線表示9臨界值(非轉基因大豆信號+3倍標準偏差)。由圖可知而轉基因大豆的發光值可達到700左右，高於臨界值，結果信號很明顯，信噪比高，可以準確的判斷轉基因的有無。表l實施例中所用到的核酸探針的序列tableseeoriginaldocumentpage10實施例2將本發明的方法應用於轉基因番木瓜的檢測，檢測轉基因番木瓜裡的CaMV35S啟動子序列。(1)分別提取非轉基因番木瓜和轉基因番木瓜裡的基因組DNA(耙基因1)(對非粉末狀的固體樣品，採用研磨處理成粉末狀，然後提取樣品中的DNA)。針對轉基因大豆的基因組DNA和非轉基因大豆的基因組DNA平行進行如下實驗，且步驟一樣。(2)0.1納摩爾靶基因探針2(見表1)分別與IO微升上述非轉基因番木瓜基因組DNA和IO微升上述轉基因番木瓜基因組DNA(耙基因1)混合，分別在9(TC變性5分鐘，然後讓其自然冷卻到室溫，促使靶基因探針2退火到35S啟動子序列上的靶基因1上並雜交。(3)然後加入5個單位(U)的T4DNA連接酶，4(TC條件下孵育20分鐘，進行連接反應，耙基因探針2被連接成環化探針3(環化探針3與靶基因探針2的序列相同，只是被連接成環狀)。(4)然後在環化探針3中加入過量的與環化探針3互補的生物素化的複製引物4(見表1)，室溫下孵育30分鐘，生物素化的複製引物4自然退火。(5)往上述產物屮加入15個單位(U)的Phi29DNA聚合酶、3毫摩爾濃度dNTPs，37'C條件下滾環擴增卯分鐘，得到含有約為1000個串連重複序列的生物素化滾環擴增產物5。(6)在歩驟(5)得到的生物素化滾環擴增產物5中加入O.l納摩爾釕標記的核酸探針6(見表1)，在室溫下，釕標記的核酸探針6與生物素化滾環擴增產物5雜交60分鐘，得到雜交產物。(7)往上述雜交產物中加入鏈酶親和素包被的磁珠，室溫下孵育20分鐘，磁分離器分離雜交產物，去除未雜交的釕標記的核酸探針6，得到磁珠吸附的雜交產物。(8)將步驟(7)中磁珠吸附的雜交產物轉入到電化學發光檢測儀器樣品池中。(9)在電化學發光檢測儀器樣品池中加入IOO微升二丁基乙醇胺，給定電壓L25V，打開光電倍增管，電化學發光檢測。(9)比較樣品檢測的信號與非轉基丙樣品的信號，當樣品信號大於非轉基因樣品信號與三倍標準偏差之和的信號時可判斷樣品為含有轉基因的樣品。如圖4所示，是本實施例屮用滾環擴增方法檢測轉基因番木瓜中的35S啟動子序列的發光信號對比圖。樣品1為TE緩衝液+三丙胺(木底)，樣品2為非轉基因番木瓜，樣品3為轉基因番木瓜，虛線表示臨界值(非轉基因番木瓜信號+3倍標準偏差)。由圖可知而轉基因番木瓜的發光值可達到300左右，高於臨界值，結果信號很明顯，信噪比高，可以準確的判斷轉基因的有無。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。SEQUENCELISTING華南師範大學基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法483Patentlnversion3.2179DNA<213〉Artificialsequence靶基因探針21tggcctttcctttatcgcaatccagttagaatgaagatagcgcatgaggtgttacgtacg60gcagaggcatcttcaacga79219DNA<213〉Artificialsequence生物素化的複製引物42ttttttagcgctatcttca19318DNAArtificialsequence釕標記的核酸探針63aatccagttagaatgaag權利要求1.一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)從轉基因物種樣品中提取樣品的基因組DNA即靶基因1；(2)將靶基因1與過量的靶基因探針2混合，90～95℃變性，然後自然冷卻到室溫，靶基因1與靶基因探針2退火、雜交；(3)然後加入2～5個單位DNA連接酶，37℃下進行連接反應20～30分鐘，靶基因探針2被DNA連接酶連接成環化探針3；(4)在上述環化探針3中加入過量的與環化探針3互補的生物素化的複製引物4、10～15個單位DNA聚合酶和1～3毫摩爾dNTPs，在37℃進行滾環擴增複製反應90分鐘，產生生物素化滾環擴增產物5；(5)在室溫下，將步驟(4)得到的生物素化滾環擴增產物5與過量的釕標記的核酸探針6雜交30～60分鐘，得到雜交產物；(6)將上述雜交產物與鏈黴親和素包被的磁珠孵育20～30分鐘，然後用磁分離器分離，去掉上清，收集磁珠吸附的雜交產物於電化學發光儀器檢測樣品池中；(7)往檢測樣品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，檢測樣品池中的三聯吡啶釕複合物產生的電化學發光信號確定樣品中是否含有轉基因產品；所述步驟(2)的靶基因探針2是一段線性單鏈DNA探針，其長度為50～200個鹼基長度，每條探針有一個5』磷酸末端和一個3』羥基末端；靶基因探針2包括兩個部分，分別為位於5』端和3』端的目標基因雜交區，以及位於5』端和3』端的目標基因雜交區中的填充區，所述雜交區的序列與靶基因1完全互補；所述步驟(4)的生物素化的複製引物4是一段5』端標記上生物素的DNA單鏈，其長度為15～30個鹼基長度，它的序列與環化探針3的填充區互補；所述步驟(5)釕標記的核酸探針6為標記上釕的核酸探針，其長度為15～30個鹼基長度，其序列與生物素化滾環擴增產物5的重複序列互補。2、根據權利要求1所述的一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於所述步驟(1)的靶基因l的提取方法如下對非粉末狀的固體轉基因物種樣品，採用研磨處理成粉末狀，然後提取樣品中的DNA;對於液態轉基因物種樣品，採用冷凍千燥法乾燥並磨碎成粉末狀。3、根據權利要求l所述的.種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於所述步驟(1)的靶基因1為含有CAMV35S啟動子、NOS終止子、抗卡那黴素基因、抗新黴素基因、抗潮黴素基因或抗草丁膦基因的基因。4、根據權利要求1所述的一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於當轉基因物種樣品中含有CAMV35S啟動子時，所述靶基因探針5、根據權利要求1所述的一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於所述步驟(3)的DNA連接酶包括五.co//DNA連接酶、T4DNA連接酶或TaqDNA連接酶。6、根據權利要求1所述的一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於當轉基因物種樣品中含有CAMV35S啟動子時，所述生物素化的複製引物4為5'biotin-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3'。7、根據權利要求1所述的一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於所述步驟(4)的DNA聚合酶包括大腸桿菌DNA聚合酶、噬菌體M2DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶或者Phi29DNA聚合酶。8、根據權利要求1所述的一種基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，其特徵在於當轉基因物種樣品中含有CAMV35S啟動子時，所述歩驟(5)中釕標記的核酸探針6為5，AATCCAGTTAGAATGAAG3，。全文摘要本發明公開了基於滾環擴增技術檢測轉基因物種的方法，該方法利用可特異性連接環化的寡核苷酸鏈作為探針與轉基因物種的靶基因雜交後在DNA連接酶的作用下形成環化單鏈探針，該探針在恆溫條件下被生物素複製引物滾動複製和支鏈擴增，產生含有多個串連重複片段的生物素化滾環擴增產物，擴增產物與釕標記的DNA探針雜交，再通過鏈黴親和素包被的磁珠分離、電化學發光檢測，判斷轉基因的有無。本發明的滾環擴增檢測方法中所擴增的基因並不是轉基因物種的原基因序列而是探針序列，轉基因物種的原基因只是提供了一個探針環化的互補支架，保證了擴增的安全性和特異性；另外所有的擴增過程都可在恆溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬體的要求。文檔編號G01N21/76GK101260431SQ20081002765公開日2008年9月10日申請日期2008年4月24日優先權日2008年4月24日發明者周小明,朱德斌,達邢申請人:華南師範大學