包含血管生成素的可口服給藥劑型及其用途的製作方法

2023-05-26 14:36:51

專利名稱：包含血管生成素的可口服給藥劑型及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及口服製劑，特別是治療劑特別是蛋白質的口服製劑，及其在治療方法 中的用途。
背景技術：
治療劑的口服給藥是理想的，因為其一般與患者對治療方案的最佳順應性聯繫在 一起，並允許給藥安排的更大靈活性，同時避免了與注射給藥法有關的危險、不便和費用。 然而，採用口服途徑的能力受限於治療劑在口腔和消化道中禁受住酸和酶降解作用的能力 以及穿過上皮細胞層進入體循環的能力。具體地，這對於蛋白質治療是一個問題，已知蛋白質在消化道中要經歷蛋白酶分 解並且難以進入體循環。幾乎所有的藥用蛋白質都不能經口服到達可用的程度。具體地， 已知激素如胰島素、生長激素、促卵泡激素或降鈣素，以及細胞素如幹擾素或白細胞介素， 在不使用特殊製劑的情況下的口服利用率遠低於2%。在這樣的水平下，利用率的時間差異和個體間差異通常很高，致使口服給藥法不 實用、不經濟或危險。蛋白質藥物在藥物治療中的重要性正在不斷增加。然而，它們的應用受限於大多 數蛋白質必須通過注射給藥的這一事實。雖然已經建議使用系統給藥的其他途徑，如肺、鼻 或經皮途徑，然而迄今只對有限的試劑開發了這些途徑並且受限於耐受性和單次劑量可遞 送的化合物量。為改善藥物的生物利用率已經進行了多種嘗試。這些包括摻入滲透促進劑如水楊 酸鹽、脂質-膽汁鹽混合劑、膠團、甘油酯和醯基肉鹼，但是發現這些在大多數情況下會造 成毒性問題。對於蛋白質治療，改善口服利用率的嘗試包括將蛋白質或肽與蛋白酶抑制劑(如 抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制劑和抑氨肽酶素)混合，以限制所給予的治療劑的降解。不幸的 是這些蛋白酶抑制劑是非選擇性的，內源性蛋白酶也被它們抑制而產生不良作用。提供蛋 白質口服製劑的其他嘗試單獨地利用保護塗層如腸溶衣，或者利用保護塗層如腸溶衣和通 過使所述蛋白質或肽偶聯於兩性低聚物或多聚物而對所述肽進行的化學修飾，所述兩性低 聚物或多聚物包含例如親水的聚乙二醇基團和親脂的烷基基團。這些技術只取得了非常有 限的成功。另一種方法是添加放鬆胃腸道中緊密連接的賦形劑，但是這種方法造成耐受性 問題，因為所損壞的屏障可允許附近的所有分子進入，包括細菌。藻酸鈣包衣的脂質體製劑 也可以用於肽類的結腸轉運。然而，到目前為止這種方法只具有有限的應用。本發明的一個優選實施方案的一個目標是提供一種可以發揮生物效應的口服蛋 白製品。在本說明書中引用的所有的參考文獻，包括任何的專利和專利申請，均以引證的 方式納入本文。可以清楚地理解，雖然本文中提及了若干現有技術的出版物，但是這種引用 並不構成認可任何所述文獻的構成本領域公知常識的一部分。

發明內容
第一個方面提供了一種任何受益於血管生成素給藥的疾病的治療方法，其中血管 生成素經口服給藥。特別考慮的是，血管生成素將經口服給藥，而不需要載體或賦形劑，也不需要將所 述蛋白封裝或進行用於改善所述蛋白口服利用率的任何其他方法的處理。血管生成素是一種14kDa非糖基化的多肽，其由多種類型的生長細胞(包括血管 內皮細胞、主動脈平滑肌細胞、成纖維細胞)和某些腫瘤(如結腸癌、卵巢癌和乳腺癌)產 生。血管生成素已從許多來源中分離，包括正常人血漿、牛血漿、牛乳，以及小鼠、兔和豬的 血清；也可以通過重組方法獲得，如人或牛的重組血管生成素。血管生成素涉及許多疾病和紊亂。所有可受益於血管生成素的口服給藥的治療 (包括現有技術提出的血管生成素的給藥)均納入本發明的範圍。儘管現有技術建議血管生成素的口服遞送作為給藥途徑細目清單中的一個，然而 以前並沒有證明血管生成素是口服生物有效的。因此閱讀關於血管生成素口服給藥的現有 技術建議的技術人員會認為載體、賦形劑、封裝或其他穩定技術對於使血管生成素在消化 道中保持完整並且仍有能力穿過消化道壁進入血流是必需的。血管生成素不需要這些操作 就可以口服生物利用的發現是特別意料不到和令人吃驚的。特別地，血管生成素可作為食物或食品補充劑、作為營養品或作為藥物而經口服 給藥。血管生成素可為人或牛的重組血管生成素或者提取自任何合適的來源如乳或血漿。特別考慮的是包含富集血管生成素的乳級分的營養組合物的口服給藥。這種級分 可使用實施例1所描述的方法或其他合適的方法製備。另一個方面提供了血管生成素的口服劑型。所述血管生成素口服劑型也可包含卵 泡抑素，或者所述血管生成素的口服劑型可以以一種包括卵泡抑素劑型的試劑盒的形式提 供。血管生成素的口服劑型可採用片劑、水性或油性懸浮劑、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒劑、乳 劑、膠囊、糖漿劑或酏劑的形式。


圖1示出了在攝取低劑量的血管生成素血管生成素)、中等劑量的血管生成 素(75mg血管生成素)和高劑量的血管生成素(150mg血管生成素)之後2小時和3小時 採集的血漿樣本的一維SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，其中低劑量分別示於泳道1和2，中等劑 量分別示於泳道3和4，高劑量分別示於泳道5和6。在2小時和3小時的時間點上，血液 中血管生成素的水平均顯示出從低劑量到高劑量的明顯增加。圖2示出了在自由餵養條件下以2. 5 μ g/g飼料的飲食飼餵的血管生成素增加了 小鼠四頭肌的重量，所述小鼠飼餵1個月並且被允許在標準齧齒動物轉輪上自由鍛鍊。圖3示出了在自由餵養條件下以2. 5 μ g/g飼料的飲食飼餵的血管生成素增加導 致了小鼠肌肉纖維類型橫斷面積變化，所述小鼠飼餵1個月並且被允許在標準齧齒動物轉 輪上自由鍛鍊。對照動物的組平均值以白色條帶表示，血管生成素處理動物的的組平均值 以黑色條帶表示。給出標準偏差。圖4示出了在自由餵養條件下以2. 5 μ g/g飼料的飲食飼餵的血管生成素減小了MDX小鼠四頭肌中肌肉壞死的面積，所述小鼠被允許在標準齧齒動物轉輪上自由鍛鍊。
具體實施例方式一個方面涉及疾病的治療。本文使用的詞語「治療」和「療法」是指減輕症狀的嚴 重性和/或頻率、消除症狀和/或潛在病因、防止症狀的發生(預防)和/或防止其潛在病 因，以及改善或矯正損傷。因此，例如本發明「治療」疾病的方法既包括在易感染個體中預 防疾病也包括有臨床症狀的個體中治療疾病。本文使用的「治療」涵蓋對脊椎動物、哺乳動物特別是人的病症的任何治療或預 防，並包括抑制病症，如中止其發展；或緩解或改善所述病症的影響，即使所述病症的影 響減弱。本文使用的「預防」或「預防性的」或「預防的」療法包括在易患所述病症但尚未被 診斷為患病的受試者中防止所述病症發生或改善所述病症的繼續發展。閱讀指出血管生成素可以口服給藥的專利說明書的本領域技術人員會理解將採 用某些用於改善血管生成素生物利用率的一些方法。已被建議給予血管生成素的已知紊亂或疾病包括那些需要血管發生的疾病。血管 生成素的口服治療因而被提出用於促進哺乳動物中血管網絡的發育(例如在心臟病發作 後的側枝循環中)，或促進例如關節或其他部位中的創傷癒合。血管生成素已經被證明具有 許多其他活性，包括神經保護作用(Subramanian et al.，(2007)Human MolecularGenetics vol. 17，no. 1ρ130-149)，並且已經被提出可用於治療神經變性疾病，例如ALS或運動神經 元疾病(參見W02006/0M277)。血管生成素還被提出用於抑制初級活化T細胞和慢性感 染細胞中RNA病毒的複製，並且被提出用於治療由逆轉錄病毒科(Retroviridae)、囊病毒 科(Cystoviridae)、雙 RNA 病毒科(Birnaviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、日冕形 病毒禾鬥(Coronaviridae)、黃病毒禾鬥(Flaviviridae,)、披蓋病毒禾鬥(Togaviridae)、「動脈 炎病毒屬」(Arterivirus)、星狀病毒科(Astroviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、 微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)、纖絲病毒禾鬥(Filoviridae)、苜1J粘病毒禾鬥(Paramyxoviridae)、彈狀 病毒科(Rhabdoviridae)、沙狀病毒科(Arenaviridae)和本雅病毒科(Bunyaviridae)引起 的RNA感染，並且被建議用於治療人免疫缺陷病毒(參見W02004/106491)。本發明人的共同未決的申請提出使用血管生成素治療涉及卵泡抑素的疾病，即治 療個體中與肌肉生成抑制素相關疾病的方法，治療其中卵泡抑素和血管生成素之間的相互 作用可用於改善組織功能的疾病的方法，促進個體中肌肉生長的方法，改善個體中肌肉從 創傷或使用中恢復的方法，改善個體中肌肉力量的方法，改善個體中運動耐力的方法，增加 個體中肌肉比例的方法，減少個體中脂肪的方法和降低個體中脂肪與肌肉比例的方法。所 有這些方法都可以利用依照第一方面口服給藥的血管生成素。口服給藥的血管生成素的其他應用包括增加肌肉質量、增加骨密度、減少肌肉萎 縮、或用於治療或預防如下病症的方法其中肌肉生成抑制素的存在造成或促成不良的病 理效應或者肌肉生成抑制素水平的降低在哺乳動物優選人中具有治療益處。此外，血管生 成素還可用於治療如下病症其中肌肉生成抑制素未失調，但通過加入外源的血管生成素 可獲得改善的卵泡抑素介導的細胞刺激。
血管生成素可以用於降低病理病症的嚴重性，所述病症至少部分地由受試者的肌 肉或脂肪組織的異常量的發育或代謝活性所表徵。血管生成素可被給藥以預防、改善或降 低消耗性疾病的嚴重性，所述消耗性疾病例如惡病質、厭食症、AIDS消耗症候群、肌肉萎縮 症、神經肌肉病、運動神經元疾病、神經肌肉接點的疾病和炎性肌病。詞語「肌肉生成抑制素相關疾病」指肌肉、骨骼或葡萄糖平衡的疾病，並包括與異 常的肌肉生成抑制素相關的疾病。肌肉是一種主要作為能量來源發揮作用的身體組織。在體內有三種類型的肌肉 a)骨骼肌——負責產生可以傳遞至骨骼以實現運動、維持姿勢和呼吸的力的橫紋肌；b)心 肌——心臟肌肉；和c)平滑肌——在動脈壁和腸壁中的肌肉。第一方面的方法特別適用於 骨骼肌但也可對心肌和/或平滑肌具有一些效果。本文所稱骨骼肌還包括骨骼、肌肉和腱 之間的相互作用並包括肌肉纖維和關節。儘管之前已指出血管生成素由於其血管生成活性和向肌肉提供更多血流的能力 而對心肌有作用，然而這種作用被限制於可氧化的肌肉(I型和IIa型)。在第一方面中所 見的卵泡抑素介導的血管生成素對肌肉的作用不同於那些可通過所有受影響肌肉纖維而 證明的與血管發生有關的作用。所提出的血管生成素對健康個體的應用可用於專業運動員和業餘運動員、健身 者、渴望減重以及增加體格和體力的勞動者。由於血管生成素在不同物種之間的序列和功能上是高度保守的，因此第一方面的 方法也適用於非人哺乳動物或鳥類[例如家畜(如犬和貓)、運動動物(如馬)、食物來源 動物(如牛、豬和羊)、鳥類(如雞、火鳥、其他獵禽或家禽)]，其中肌肉生成抑制素的存在 造成或促成不良的病理效應或者肌肉生成抑制素水平的降低具有治療益處。在第一方面方法的一個優選實施方案中，血管生成素以一種血管生成素富集的乳 或血漿提取物的形式口服給藥。特別地，所述口服給藥的血管生成素是從牛乳或其級分製得的，例如使用實施例1 所描述的方法。這樣的級分已被發現可以提供能夠起到系統性作用而不在消化道中大量降 解的血管生成素。這樣的級分能夠經口服提供而不需採用載體或其他方法來提高血管生成 素的生物利用率。所述口服給藥的血管生成素可為或包含重組血管生成素，特別是人源的重組血管 生成素。本文提到的「口服遞送」或「口服給藥」意圖包括任何向GI道的給藥或遞送，並包 括直接地向口咽腔給藥和經口給藥，其中所述肽和多肽的實際吸收發生在胃腸道中，包括 胃、小腸或大腸。本文使用的口服給藥包括舌下給藥(通過施用於接受者的舌下來給藥，代 表一種經口咽腔給藥的形式)和頰給藥(一種在接受者的牙齒和面頰之間的劑型給藥)。口服遞送和口服給藥在本文可互換地使用。如果血管生成素以功能性形式存在於被給予血管生成素的個體的血流中，那麼血 管生成素就被描述為「生物有效的」。「功能性形式」是指能夠具有療效的血管生成素。儘管已提出了口服給藥的血管生成素可能與內源的卵泡抑素一起發揮作用，然而 本發明人證明了口服給予血管生成素和卵泡抑素(同時地或慣序地)的效果大於與單獨給 予卵泡抑素或單獨給予血管生成素的加和效果。
因此考慮口服給予血管生成素和卵泡抑素。血管生成素和卵泡抑素可同時在同一 或不同藥劑中經口服提供，或者卵泡抑素可經另外的途徑提供，例如腸胃外地或經透皮貼 劑提供。血管生成素可以藥物、獸藥或營養組合物的形式或作為食物特別是功能性食物提{共。藥物組合物是一種適合對人類給藥的組合物。獸藥組合物是一種適合對動物給藥 的組合物。一般這些組合物會包含純化的血管生成素或者起碼所述組合物的所有組分都可 驗證。第一方面的方法中使用的口服給藥的藥物或獸藥組合物可包含一種或多種可藥 用的載體並任選地包含其他治療劑。每種載體、稀釋劑、佐劑和/或賦形劑都必須是「可藥 用的」。「可藥用的載體」是指一種沒有生物學或其他不良作用的材料，即該材料可與所選 擇的活性藥物一起給予一個個體，而不造成任何不良的生物效應或者以有害的方式與所述 包含其的藥物組合物中的其他組分相互作用。類似地，本文提供的新化合物的「可藥用的」 鹽或酯是沒有生物學或其他不良作用的鹽或酯。本文所使用的「藥物載體」是一種用於向受試者遞送所述試劑的可藥用的溶劑、懸 浮劑或媒介物(vehicle)。所述載體可為液體的或固體的，並且是以計劃好的給藥方式選擇 的。每種載體都必須在沒有生物學或其他不良作用的意義上是「可藥用的」，即所述載體可 以與所述試劑一起給予受試者而不造成任何或大的副作用。卵泡抑素可以經口服或腸胃外給藥。在用於卵泡抑素時，本文中使用的詞語「腸胃 外」包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、結膜下、腔內、經皮和皮下注射，用於向肺部和 鼻腔給藥的氣霧劑或通過例如滲透泵的輸注給藥。血管生成素可以作為片劑、水性或油性懸浮液、錠劑、糖錠、粉劑、顆粒劑、乳劑、膠 囊、糖漿劑或酏劑口服給藥。這樣的組合物可包含一種或多種選自甜味劑、調味劑、著色劑 和防腐劑的試劑以生產出藥學上美觀的和適口的製品。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄 糖、阿斯巴特(aspartame)或糖精。合適的崩解劑包括玉米澱粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯 烷酮、黃原膠、膨潤土、海藻酸或瓊脂。合適的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃油、橘子油或 覆盆子油調味劑。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素Ε、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯 甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、 氯化鈉或滑石。合適的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。片劑可包含與適合 製備片劑的無毒可藥用賦形劑混合的所述試劑。這些賦形劑可為，例如，(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)粒 化和崩解劑，如玉米澱粉或海藻酸；(3)粘合劑，如澱粉、明膠或阿拉伯膠；和(4)潤滑劑，如 硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。這些片劑可不包衣的，也可通過已知技術包衣以延緩在胃腸道中 的崩解和吸收，從而在更長的時間內提供持久的作用。例如，可採用延時材料如單硬脂酸甘 油酯或二硬脂酸甘油酯。用於腸胃外給藥的卵泡抑素製品包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。 非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油以及可注射的有機酯如油酸乙酯。 水性載體包括水，含醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液，林格氏右旋糖，右旋糖和氯化鈉，包括流體和營養補充劑、電解質補充劑 (例如基於林格氏右旋糖的那些)的乳酸化林格氏靜脈內媒介等。還可存在防腐劑和其他 添加劑，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、生長因子和惰性氣體等。所述組合物還可包含提供補充、附加或增強治療作用的其他活性化合物。所述藥 物組合物可與給藥說明書一起也被包含在容器、包裝或分配器內。其他治療上有用的試劑，如生長因子(如BMPs、TGF_P、FGF、IGF)、細胞因子(如白 細胞介素和⑶Fs)、抗生素和對要治療病症有益的任何其他治療劑可任選地被包括在內或 者與血管生成素或血管生成素激動劑同時或慣序給藥。血管生成素或其激動劑也可以獸藥組合物的形式使用，所述獸藥組合物可例如通 過本領域中常規的方法製得。特別有利的是將所述獸藥或藥物組合物配製為單位劑型以便於給藥和保證劑量 的一致性。本文使用的單位劑型是指適合作為用於待治療受試者的單一劑量的物理上分 開的單元；每個單元均包含經計算可產生所需治療效果的預定量的活性化合物和所需的藥 物載體。單位劑型的規格由以下因素決定並且直接取決於所述因素活性化合物的獨特性 質和要達到的具體治療效果，以及本領域中複合這一活性化合物以用於個體治療的固有限 制。包含血管生成素或其激動劑的藥物或獸藥組合物是以治療有效量進行給藥的。本 文所使用的，血管生成素的「有效量」是足以降低肌肉生成抑制素的活性以達到所需生物學 結果的劑量。所需生物學結果可能是任何治療益處，包括肌肉質量的增加、肌肉力量的增 加、代謝的改善、肥胖程度的降低或葡萄糖穩態的改善。這樣的改善可通過多種方法測量， 包括測量以下指標的那些方法瘦體重和脂肪體重(如雙重射線掃描分析)、肌肉力量、血 清瘦素、血脂、血糖、糖化血紅蛋白、葡萄糖耐量以及糖尿病繼發併發症的改善。—般，治療有效量可隨著受試者的年齡、健康狀況和性別，以及受試者醫學病症的 嚴重程度而變化。劑量可由醫師確定並視需要調節以適應觀察到的治療效果。用於給予血 管生成素或其激動劑的合適劑量可為5mg到lOOmg，15mg到85mg，30mg到70mg，或^ig到 60mg。所述組合物可以一次劑量給藥或間隔給藥，如一天一次、一周一次和一月一次。劑量安排可以根據血管生成素或其激動劑的半衰期，或患者病症的嚴重程度而調 整。一般，所述組合物以一次推注劑量的形式給藥，使得在給藥後最長時間內血管生 成素的循環水平最大化。在所述推注劑量後還可使用連續輸注。還考慮的是利用營養組合物提供血管生成素的方法。並且提供了用於所述方法中 的營養組合物。本文使用的詞語「營養製品」是指從食物中——在本申請中從乳製品中——分離 或純化的可食用的產品，該產品被證明當口服給藥時具有生理益處或者對急性或慢性疾病 或損傷提供保護或減輕作用。因此所述營養製品可單獨或者與可食用的食物或飲料一起以 膳食製品或補充劑的形式存在。功能性食品是一種食品，其中已加入組合物使得該食品在口服給藥時具有生理學 益處或者對急性或慢性疾病或損傷提供保護或減輕作用。所述營養組合物或功能性食物可為可溶性粉末、液體或即飲製劑的形式。或者，所述營養組合物可作為食物以固體形式存在；例如以即食棒或早餐穀類食品的形式。還可存 在多種香料、纖維、增甜劑和其他添加劑。所述營養製品優選地具有可接受的感官性質(如可接受的嗅覺、味覺和適口性)， 並還可包含選自維生素A、Bi、B2、B3、B5、B6、B12、生物素、C、D、E、H以及鈣、鎂、鉀、鋅和鐵 中至少一種的維生素和/或礦物質。所述營養組合物可以常規方式生產；例如，所述組合物可通過將蛋白質和其他添 加劑混合在一起製得。如果使用的話，所述混合物中也可包括乳化劑。其他維生素和礦物 質也可在此時加入，但經常會晚一點加入以避免熱降解。如果需要生產粉末狀營養組合物，則可將蛋白質與其他組分以粉末形式混合。所 述粉末應當具有低於約5重量％的水分含量。然後可混入水——優選已進行反滲透處理的 水——形成液體混合物。如果所述營養組合物以即用液體形式提供，那麼可將其加熱以減少細菌負荷。如 果需要生產液體營養組合物，那麼優選將所述液體混合物無菌地灌裝到合適的容器中。所 述容器的無菌灌裝可使用本領域中通常用的技術進行。進行這種無菌灌裝的合適設備是市售的。優選地，所述營養組合物還包含一種或多種可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。營養 組合物可包含緩衝液如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、 蔗糖或葡聚糖；甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑如EDTA ；佐劑 和防腐劑。所述營養製品可為嬰兒配方，特別是用於給予嬰兒的人源化乳配方。這樣的嬰兒 配方可用於治療發育停滯或早產或低出生體重的嬰兒。還可將其給予嬰兒或兒童以改善認 知功能。在第一方面的方法中使用的血管生成素可來自任何來源。它在來源上可為天然 的、合成的或重組的。重組的血管生成素可基於任何物種的血管生成素序列，包括人、奶牛、 綿羊、小鼠等。重組人血管生成素可購自R&D Systems.已知血管生成素存在於正常人血漿、牛血漿、牛乳、牛血漿以及鼠、兔和豬血清中。 至少人血管生成素的DNA和蛋白序列是可得到的，並且重組人血管生成素可以從Abnova Corporation (臺灣)購得以用於小規模的應用。在一個實施方案中，血管生成素從作為在商業規模上容易獲得的血管生成素來源 的家畜動物的血漿或乳中製得。乳可從任何泌乳動物得到，例如反芻類動物如奶牛、綿羊、水牛、山羊和鹿，非反芻 動物包括靈長類如人，以及單胃類動物如豬。在一個優選的實施方案中，血管生成素是從牛 乳中提取的。生產血管生成素的動物可為被設計在其乳中過表達人或牛的血管生成素的轉 基因動物。本申請的發明人已證明在牛乳中，血管生成素在哺乳期的首個1到14天內以最高 或最濃的量(最高達12mg/升)存在。之後，所述濃度降至約1到aiig/升的基礎水平。因 此，優選在哺乳期首個14天內得到的牛乳作為在第一到十一方面的方法中使用的血管生 成素來源。儘管哺乳期較晚期的牛乳中剩餘血管生成素水平較低，然而它仍可在第一方面 的方法中用作來源。
第一方面的方法使用的血管生成素可能是分離的或純化的。分離的或純化的血管 生成素基本上不含至少一種與其天然伴隨的試劑或化合物。例如，分離的蛋白質基本上不 含來自於獲得該蛋白的細胞或組織源的至少某些細胞物質或汙染蛋白。詞語「基本不含細 胞物質」是指製品中血管生成素具有至少50%到59% (w/w)的純度，至少60%到69% (w/ w)的純度，至少70%到79% (w/w)的純度，至少80%到89% (w/w)的純度，至少90%到 95% (w/w)的純度，或者至少 96%、97%、98%、99%或 100% (w/w)的純度。在細菌中製備的重組血管生成素可用作血管生成素的來源，並且可以蛋白聚集體 的形式提供。由於牛乳是已存在於食物鏈中成百上千年的一種天然產物，因此用作營養製品的 血管生成素不必完全純淨。然而，為了減少要給予的組合物的量，血管生成素相對於其在乳 中的濃度被顯著濃縮是優選的。優選地，血管生成素以其在乳中濃度的至少10倍，更優選 其在乳中濃度的20、30、40或50倍的濃度被給予。當作為食物提供時，血管生成素可以採用食物補充劑、營養製劑或嬰兒配方的形 式。本領域技術人員會理解自然界中存在牛血管生成素的變體並可被製備。本領域技術人員會理解所用的血管生成素可使用本領域可用的方法進行修飾以 改善貯藏穩定性、生物活性、循環半衰期或用於其他目的。例如可能需要引用修飾以改善貯 藏穩定性。然而，由於血管生成素特別耐降解，因此這樣的修飾不是必需的。第一方面涉及血管生成素的激動劑。激動劑是一種能直接或間接地通過由血管生 成素激活的受體起作用的化合物。優選地，血管生成素激動劑通過所述血管生成素受體起 作用，並且優選地結合所述受體。本領域技術人員會理解如何設計血管生成素的激動劑。合 適的激動劑包括血管生成素激動劑抗體和模擬化合物。血管生成素、其激動劑和變體都可用於製造用於在第一方面的方法中口服給藥的 藥劑，特別是以血管生成素富集的乳或血漿提取物的形式或以重組血管生成素的形式。具體地，所述口服給藥的血管生成素是從牛乳或其級分製得的，例如使用實施例1 所描述的方法。所述級分已被發現可以提供能夠系統性作用而不在消化道中大量降解的血 管生成素。所述級分能夠經口服提供而不採用載體或其他方法來提高血管生成素的生物利 用率。預期血管生成素與內源卵泡抑素相互作用(如果使用重組血管生成素)或者所述 血管生成素富集的提取物也可包含卵泡抑素。本文中已證明血管生成素加上卵泡抑素的 給藥(同時或以任何順序慣序地)具有大於加和的效果，因此每種治療方法都考慮給予卵 泡抑素和血管生成素。在個體缺乏卵泡抑素的情況下，卵泡抑素和血管生成素的共同給藥 (同時或慣序地)特別重要。由於卵泡抑素水平隨著年齡增長而降低，因此在治療老年人時 特別考慮卵泡抑素和血管生成素的共同給藥。在共同給藥方案中，血管生成素可口服給藥而卵泡抑素可口服或以其他方式給 藥。可能存在不想給予血管生成素的情況。由於發明人已發現血管生成素在乳中可口 服利用，因此他們也提供了血管生成素濃度降低的乳以用於這樣的情況。在一個實施方案中，所述血管生成素濃度降低的乳的血管生成素比全脂或脫脂牛乳少40%、50%、60%、70%、80%、90%或基本上不含血管生成素。使乳的血管生成素降低的方法對本領域技術人員來說是顯而易見的。例如通過陽 離子交換柱或包含抗血管生成素的抗體的免疫親和柱的乳流的血管生成素與施加於所述 柱的乳樣本相比會降低。電透析法也被預期用於提供除去血管生成素(並且除去乳鐵蛋白 和乳酸過氧化物酶)的牛乳。實施例中提供了用於製備血管生成素含量降低的乳的合適方 法。在第一方面的說明書和隨後的權利要求中，除了上下文由於表達語言或必需的含 義而另有規定以外，單詞「包含」或變形如「包括」或「含有」均以包括性意義使用，即具體說 明存在所稱特徵但不排除本發明的多個實施方案中存在或加入其他特徵。除非上下文另外清楚地指出，否則本文所使用的單數形式「一個」、「一」和「所述」 也包括對應的複數指代物。當表達一個數值範圍時，應清楚地理解該範圍包括該範圍的上 限和下限以及在上下限之間的所有數值。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域 內普通技術人員的通常理解相同的含義。儘管任何材料和應清楚地理解，本發明並非限制於本文描述的具體物質和方法，因為這些可改變。 還應理解的是本文所使用的術語只是出於描述特定實施方案的目的，而並非意圖限制本發 明的範圍，本發明的範圍只由所附權利要求來限制。本發明現在通過參考以下非限制性實施例和附圖的方式進行詳細描述。實施例1 用於從脫脂乳製備血管生成素富集的級分的方法向一個 IOcm深的柱子中填充入 SP Sepharose Big Beads(GEHealthcare)以使柱 子的總柱床體積是四.7升。向該柱中以331cm/h(每小時每升樹脂34升脫脂乳)的線性 流速施加脫脂牛乳流2小時，直至施加的脫脂乳的體積為裝入該柱的樹脂體積的68倍。通過以147cm/h(每小時每升樹脂15升緩衝液)的線性流速加入2. 5倍柱體積 (CV)的水或0. 25CV/分鐘的流速加水10分鐘而除去該柱中剩餘的乳使用2. 5CV含有相當於2. 0% (0. 34M)NaCl的鈉離子的緩衝液(pH 6. 5)，通過使 所述陽離子緩衝溶液以75cm/h (每小時每升樹脂7. 5昇陽離子緩衝溶液)或0. 125CV/分 鐘的線性流速流過20分鐘，將不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分從柱子上洗脫下來。 棄去最初的每升樹脂0. 5昇陽離子緩衝溶液，然後收集接下來的每升樹脂2. 5昇陽離子緩 衝溶液(包括與下一種緩衝液施加時間重疊的每升樹脂0. 5昇陽離子緩衝溶液，即突破時 間)作為不含血管生成素的乳酸過氧化物酶級分。然後使用2. 5CV含有相當於2. 5% w/v(0. 43M)NaCl的鈉離子的緩衝液(pH 6. 5)， 通過使所述陽離子緩衝溶液以75cm/h(每小時每升樹脂7. 5昇陽離子緩衝溶液)或 0. 125CV/分鐘的線性流速流過20分鐘，將血管生成素富集的級分從柱子上洗脫下來。棄去 最初的每升樹脂0. 5昇陽離子緩衝溶液，然後收集接下來的每升樹脂2. 5昇陽離子緩衝溶 液(包括與下一種緩衝液施加時間重疊的每升樹脂0.5昇陽離子緩衝溶液)作為血管生成 素富集的級分。最後，使用2. 5CV含有相當於8. 75 % w/v (1. 5M) NaCl的鈉離子的緩衝液(pH 6. 5)，通過使所述陽離子緩衝溶液以75cm/h (每小時每升樹脂7. 5昇陽離子緩衝溶液)或 0. 125CV/分鐘的線性流速流過20分鐘，將乳鐵蛋白級分(也不含血管生成素)從柱子上洗脫下來。棄去最初的每升樹脂0. 5昇陽離子緩衝溶液，然後收集每升樹脂2. 5昇陽離子緩 衝溶液作為乳鐵蛋白級分。將所收集的血管生成素富集的級分進行超濾(NMWCO 5kDa)以濃縮並降低鹽的含 量。將所獲得的濃縮液冷凍乾燥並儲存在室溫下以便後續使用。通過SDS-PAGE分析血管生成素富集的級分中血管生成素含量，發現所述級分含 有57% (基於蛋白)的低分子量(HkDa)蛋白，該蛋白被MALDI-T0F/T0F MS(結果未示出) 證實是血管生成素。本領域技術人員會理解其他來源或通過其他方法純化的血管生成素可用於第一 方面的方法。以上實施例只示出了在以下實驗中使用的血管生成素的實際來源是如何製得 的，絕非以任何方式意圖限制。儘管可認為所述血管生成素富集的級分可包含其他具有作用的生物活性成分，然 而在脫脂乳中可利用的相當量的血管生成素(濃度為2% )與所述血管生成素富集的級分 在實施例中顯示的活性相當(數據未表示)。實施例2 人血液中牛血管生成素的檢測為分析牛血管生成素在攝取後穿入血流的能力，兩個人受試者服用相當於25mg、 75mg或150mg的血管生成素的實施例1中描述的血管生成素富集的乳級分。所述血管生 成素劑量是在臨攝取前由IOOml市售增香乳製成的。在攝取前，採集時間為0的血液樣本。 然後在攝取後2和3小時採集血液樣本。血管生成素的存在是通過以下方法證實的依照Laemmli，1970的方法(Nature 227(5259) :680-685)的方法進行的SDS-PAGE，和依照廠商說明書採用SYPRO Ruby的染色 來證實。例如，將一小份所述蛋白質餾級分的等分試樣在SDS PAGE緩衝液(通常含2%十二 燒基硫酸鈉、10%甘油、50mM Tris HCL(pH 6. 8)、2mM EDTA、140mMβ -巰基乙醇和0. 01 %溴 酚藍)中通過在95°C加熱5分鐘變性。將變性的樣本上樣到SDS PAGE凝膠(可來自供應 商；例如hvitrogen Novex預製1Tris HCl凝膠)上。將所述凝膠置於SDS PAGE設備中， 並且將電泳緩衝液(Tris鹼3.03g/L、甘氨酸14.4g/L和SDS 1. Og/L)置於該設備的底部和 頂部的倉中。電泳在200V下進行1小時。電泳後，將蛋白質用固定/脫色溶液(10%甲醇 和7%乙酸)固定在凝膠中，然後用Sypro Ruby(Invitrogen)染色至少1小時。將凝膠在 固定/脫色溶液中脫色至少lhr，然後在凝膠掃描系統上成像。血管生成素的豐度是通過在 對大約15kDa處的可區分明顯條帶的分析確定。血管生成素的存在還可以通過以下方式證實在SDS PAGE之後，通過用抗牛血 管生成素的抗體進行蛋白質印跡的免疫親和性檢測。包含牛血管生成素的生物學樣品可 溶解在含有或不含還原劑(2-巰基乙醇)的Ix NuPAGE LDS樣品緩衝液(Invitrogen) 中。然後將樣本在95°C加熱5-10分鐘，然後進行上述的SDS PAGE電泳。電泳後，將所述 凝膠置於iTowbin緩衝液(25mM Tris，192M甘氨酸，1 % SDS)中10分鐘。Western轉移操 作使用市售的轉移裝置如iBl0tTM(Invitr0gen)並依據廠商說明書進行。將iBlot 陽極 底板(Anode Stack(Bottom))從它的包裝中移出並置於iBlot 凝膠轉移設備的底部。然 後將預先電泳的凝膠放置在硝酸纖維素膜上(iBlot 膜；Invitrogen)。然後將一張已經 浸泡在去離子水中的iBlot 濾紙放置在所述預先電泳的凝膠上面。然後將iBlot 陰極 頂板(Cathode Mack(Top))放置在所述預先浸泡的濾紙上面且銅電極一側面朝上。然後
12將iBlot —次性海綿(DisposableSponge)放置在所述蓋的內側上以確保與iBlot 轉移 板(transferstack)接觸。將25V的電泳施加於所述裝置，持續7分鐘。在轉移的最後， 將所述硝酸纖維素膜置於封閉溶液(含5%脫脂乳粉的TBST)中1小時。然後將所述膜 轉移到一抗溶液中。此溶液包含一種抗牛單克隆抗體如克隆編號為1B14D4(Property of the Department ofBiochemistry, Chungbuk National University, Cheongju,Chungbuk, Korea)的單克隆抗體或多克隆抗體在含有5% BSA的TBST(IOmMTris HCl，pH 7. 5，150mM NaCl,0. 05% Tween20)中的合適稀釋液。在4°C下將所述硝酸纖維素膜在一抗溶液中輕輕 搖晃孵育過夜。然後在室溫下將所述硝酸纖維素膜在TBST中輕輕搖晃洗滌4次，每次5分 鍾。然後將所述硝酸纖維素膜置於包含用於檢測一抗的標記抗體的二抗溶液中。對於抗牛 血管生成素的單克隆抗體lB14d4，可使用在包含5%脫脂乳粉的TBST中以1 15，000稀 釋的IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG 二抗(Licor)。在這種情況下，在室溫下將所述硝酸纖維 素膜在二抗溶液中於黑暗中孵育45分鐘。然後在室溫下將所述硝酸纖維素膜在TBST中於 黑暗中輕輕搖晃洗滌4次，每次5分鐘。然後將所述硝酸纖維素膜用TBS(IOmM Tris HCl, pH 7.5,150mM NaCl)洗滌並在兩張濾紙(Whatman)間乾燥。然後將所述硝酸纖維素膜用 紅外成像儀(Licor Odyssey)在合適的波長下掃描。血管生成素的具體豐度是通過對大約 15kDa處的明顯條帶的分析確定。如圖1所示，在2小時和3小時的時間點上，血液中的血管生成素水平均顯示從低 劑量到高劑量的明顯增加，表明血管生成素可口服利用。實施例3 體內動物實驗為分析正常小鼠體內血管生成素的生物利用率，進行了動物實驗。所有工作均由 西澳大學(University of Western Australia)動物倫理委員會批准。小鼠在每個試驗中均以2. 5μ g/g小鼠體重的量飼餵以兩種飲食對照飲食和包 含依據實施例1製得的牛血管生成素(bAngiogenin)富集級分的飲食。這些研究按照以 下方式進行對於每次實驗、每種飲食和每個小鼠品種均是用成年(8周齡)雄性正常小鼠 (C57)和營養不良(mdx)小鼠進行的，其中η = 8。使正常小鼠經歷一個月自由飼餵並自由鍛鍊的飲食期；將一個金屬小鼠轉輪放置 在籠內用於自由鍛鍊並且通過與輪連接自行車計程器記錄各個小鼠的跑動距離。也使MDX 小鼠經歷相同的一個月的飲食期。在獨立的實驗中，對mdx小鼠給予上述自由鍛鍊處理或 不給予上述自由鍛鍊滾輪。實驗分析在試驗中，體重、食用食物的量和肌肉力量(握力測試)都是每周測量兩次。在每 個實驗的結束時，將小鼠通過氟烷麻醉和頸脫位法處死。然後將實驗小鼠用於以下分析以確定任何因對營養不良和正常肌肉的治療而導 致的表型變化。1)身體組成分析對每隻剝皮小鼠屍體的一半進行身體組成分析。此外，個體的 腿部肌肉包括四頭肌(quad)、脛骨前肌(TA)和腓腸肌都被切割並稱重，並且腹部的脂肪墊 和心臟也被記錄以確定所述飲食誘導的總表型變化。2)組織學分析採集並製備骨骼肌和心臟樣品用於冷凍和石蠟包埋。組織學分析 對以下肌肉四頭肌、TA和膈進行。對這些肌肉進行蘇木精和曙紅、蘇丹黑和多種免疫組織學染色。測定肌肉的骨骼肌原纖維壞死、肌原纖維肥大和脂肪含量。正常小鼠體內試驗的結果示於圖2和3。清楚地顯示了補充有2.5 μ g/g血管生 成素富集的級分的飲食誘導肌肉與對照組相比增加(圖幻最高達50%。肌肉質量的增加 與大多數肌肉纖維類型的橫斷面積的增加相符合，除了對應於慢收縮氧化纖維的小暗纖維 外(圖幻。這證明了當口服利用時血管生成素的生物可利用性，表明血管生成素穿過腸道 並在組織水平上具有活性。當飼餵給mdx小鼠時，血管生成素在允許小鼠自由鍛鍊的情況 下減少了壞死肌肉的比例(圖4)。這證明了血管生成素在攝取後可在mdx小鼠中被生物利 用，並且能夠在mdx小鼠中抑制鍛鍊對肌肉衰退的效果。這意味著口服給藥的血管生成素 不管是否口服給藥時均具有治療效果。實施例4 脫脂乳中血管生成素的減少向一個深IOOmm並且容積為30L的柱子中填充入SP Big Bead陽離子交換樹脂 (GE Healthcare)。所述柱子通過用180L(6倍柱體積)的1. OM氯化鈉以1，300L/h的速度 衝洗，隨後用180L(6倍柱體積)的水以1，800L/h的速度衝洗製得(乳和所有溶液的pH均 為6. 5士 1)來製備。將脫脂乳以1，300L/h的速度施加於所述樹脂直至施加2，100L(70倍 柱體積)。在臨上柱前或剛過柱後收集脫脂乳的樣品。在過柱後立即收集的乳是血管生成 素減少的乳。將脫脂乳和血管生成素減少的乳冷凍在不鏽鋼託盤中，冷凍乾燥(溫度50°C; 時間48h ；真空度ImBar)，並密封於密閉的箔袋(foil pouch)中直到可以進行分析時。血管生成素是經低壓陽離子交換色譜法預先濃縮的，然後通過陽離子交換HPLC 測量。將乳粉(20g)通過用磁力攪拌棒攪拌30分鐘而溶於400mL水中。加入鹽酸QM)直 至乳溶液達到pH 4. 6。通過先以Whatman#113濾紙再以Whatman#l濾紙相繼進行過濾來移 除沉澱的酪蛋白，並收集澄清的乳清。通過加入30%氫氧化鈉將乳清調至pH 6.2 士 0.1。將SP Big Bead陽離子交換樹脂(35g溼重)加入乳清中並攪拌1小時。將乳清和 樹脂分多次倒入一次性IOmL柱中直至所有的樹脂都沉積在柱中。將柱子用蒸餾水衝洗並 隨後用4M氯化鈉洗脫。在^Onm下監測從柱子中流出的洗脫液以確保所有的蛋白質都被收 集。所收集的洗脫液的體積是45g。通過加入蒸餾水將洗脫液QOO μ L)稀釋至1000 μ L (對 使得可以通過HPLC正確分析富含鹽的溶液是必需的)並取100 μ L進行陽離子交換HPLC 分析。在脫脂乳中存在的血管生成素的面積是8，461mAUX s並且在血管生成素減少的乳中 存在的血管生成素的面積是893mAUXs，這代表所存在的血管生成素的量減少了 89. 44%。
權利要求
1.一種任何可受益於血管生成素給藥的疾病的治療方法，其中血管生成素經口服給藥。
2.權利要求1的治療方法，其中血管生成素經口服給藥，而不需要載體或賦形劑，也不 需要將所述蛋白封裝或進行用於改善該蛋白口服利用率的其他任何方法的處理。
3.權利要求1或2的方法，其中所述疾病選自代謝疾病、胰島素依賴型(1型)糖尿 病、非胰島素依賴型O型)糖尿病、高血糖症、葡萄糖耐量降低、代謝症候群、X症候群、創 傷誘發的胰島素抵抗、脂肪組織障礙、肥胖症、肌肉和神經肌肉障礙、肌營養不良、嚴重或 良性X連鎖肌營養不良、肢帶型肌營養不良、面肩肱型肌營養不良、強直性肌營養不良、遠 端型肌營養不良、進行性營養不良眼肌麻痺症、眼咽型肌營養不良、裘馨杜氏肌營養不良、 和!^kuyama型先天性肌營養不良；肌萎縮性側索硬化症(ALS)；肌肉萎縮；器官萎縮症；虛 弱；腕管症候群；充血性阻塞性肺疾病；先天性肌病；先天性肌強直；家族性周期性癱瘓； 陣發性肌紅蛋白尿症；重症肌無力；伊頓-蘭伯特肌無力症候群；繼發性肌無力；去神經性 萎縮；陣發性肌萎縮；以及肌肉減少症、惡病質、其他肌肉萎縮症候群、骨質疏鬆症，尤其是 在老年人和/或絕經期後婦女中；糖皮質激素誘發的骨質疏鬆症；骨質減少；骨關節炎；骨 質疏鬆性骨折；肌肉組織的創傷性或慢性損傷、由於長期糖皮質激素療法造成的骨質疏鬆、 性腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏症、繼發性甲狀旁腺功能亢進症、營養不良、神經性厭 食症、可因促進血管發生獲益的病症和創傷癒合。
4.前述權利要求任一項的方法，其中血管生成素包括重組血管生成素。
5.權利要求1到4任一項的方法，其中血管生成素來自牛乳。
6.前述權利要求任一項的方法，還包括給予卵泡抑素。
7.權利要求6的方法，其中卵泡抑素為腸胃外給藥。
8.權利要求6的方法，其中血管生成素和卵泡抑素是共同給藥。
9.以口服劑型存在的血管生成素。
10.以口服劑型存在的血管生成素和卵泡抑素。
11.一種試劑盒，包含以口服劑型存在的血管生成素和卵泡抑素。
全文摘要
本發明提供一種疾病的治療方法，其中所述疾病是可受益於血管生成素給藥的任何疾病，其中血管生成素經口服給藥。具體地，所述口服血管生成素不需要載體或賦形劑，也不需要將該蛋白封裝或進行用於改善其口服利用率的其他任何方法的處理。
文檔編號A61P17/02GK102099050SQ200980127807
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月14日 優先權日2008年5月14日
發明者A·泰斯特, B·庫克斯, M·麥克多諾, P·霍布曼 申請人:墨累古爾本合作有限公司, 維多利亞農業服務控股公司