集成分析器件陣列的製作方法
2023-05-26 18:26:31
相關申請的交叉引用
本申請要求於2014年8月27日提交的美國臨時申請no.62/042,793的權益，其公開以引用方式全文併入本文中。
背景技術：
在分析系統中，增加給定系統在任何給定時間實施的分析的數量的能力一直是提高這類系統的效用並延長其壽命的關鍵組成部分。特別地，通過增加給定系統的分析復用因子，可以增大系統的總體吞吐量，從而在增加其有用性的同時降低與使用相關的成本。
在光學分析中，增加復用通常會造成更多的困難，因為這可能需要更複雜的光學系統、更優良的照射或檢測能力、以及新的反應控制策略。在某些情況下，系統試圖成倍地甚至成數量級地來增加復用，這進一步牽連到以上那些注意事項。同樣，在某些情況下，系統要被用於的分析環境非常敏感，以至於給定系統中不同分析之間的變化會是不可接受的。這些目標通常與單純地使系統更大並具有更高性能的蠻力法相矛盾，因為這樣的方法通常會造成更壞的後果，例如，相互反應串擾、由於信號降低和噪聲升高中的任一者或兩者而導致的信噪比降低等。因此，期望的是，提供對於它們期望的分析具有大幅增加的復用並且尤其用於高度敏感反應分析的分析系統，並且在許多情況下，在這樣做的同時使這種增加的復用所帶來的負面影響最小化。
同時，還需要提高分析系統的性能，並降低與生產和使用該系統相關的成本。特別地，還需要增加分析系統的吞吐量。還需要縮小分析系統的規模並降低其複雜度。還需要具有靈活構造和易於擴展的分析系統。
技術實現要素：
在一個方面，本發明通過提供一種集成分析器件陣列來解決上述問題和其它問題，其中，每一個器件包括：
納米級發射體；
檢測器層，其光學地耦接到所述納米級發射體；
衍射光束成形元件，其設置在所述納米級發射體和所述檢測器層之間；以及
濾色層，其設置在所述衍射光束成形元件和所述檢測器層之間；
其中，通過所述發射體內的多個發射物從該納米級發射體發射光；
其中，所述檢測器層包括多個感測區域；並且
其中，所述衍射光束成形元件在空間上分離從所述納米級發射體發射的光，並且將空間上分離的光引導穿過所述濾色層從而到達所述多個感測區域。
在另一方面，本發明提供了一種集成分析器件陣列，其中每個器件包括：
納米級發射體；
檢測器層，其光學地耦接到所述納米級發射體；
衍射光束成形元件，其設置在所述納米級發射體和所述檢測器層之間；以及
濾色層，其設置在所述衍射光束成形元件和所述檢測器層之間，其中,所述濾色層包含2個至9個濾色元件，每個濾色元件專用於一定範圍的光波長；
其中，通過所述發射體內的多個發射物從該納米級發射體發射光；
其中，所述檢測器層包括多個感測區域，並且其中，所述感測區域光學地耦接到所述濾色元件；並且
其中，所述衍射光束成形元件將從所述納米級發射體發射的光在空間上分離成多個光束，並將空間上分離的光束引導穿過所述濾色元件從而到達所述感測區域。
在一些實施方案中，上述陣列還包括設置在納米級發射體積內的分析物。在具體實施例中，分析物包括生物樣品，在更具體的實施例中，生物樣品包括核苷酸，並且在更加具體的實施例中，生物樣品包括聚合酶。
上述陣列可以包括至少1000個、至少10000個、至少100000個、至少1000000個、或甚至至少10000000個納米級發射體。
在另一方面，本發明提供了用於生產本文所公開的集成分析器件陣列的方法。
附圖說明
圖1a至圖1b示意性地示出了可以使用所公開的集成分析器件陣列來執行的示例性核苷酸測序處理。
圖2提供了集成分析器件的示意性框圖。
圖3a提供了兩個信號事件的激發光譜的示意和標出的窄帶激發照射，而圖3b示意性地示出了基於這兩個信號事件的窄帶照射所得到的檢測到的信號。
圖4示意性地示出了四個螢光標記基團中的每一個的信號輪廓，其中，該信號輪廓與兩個不同的濾光器輪廓中的每一個重疊。
圖5示意性地示出了用於檢測來自測序反應的信號的集成分析器件，其中透鏡元件在空間上分離從反應單元發射的光，並將光引導穿過濾色層從而到達檢測器層。
圖6示意性地示出了雙色雙幅度邊合成邊測序(sequence-by-synthesis)反應的信號跡線。
圖7示出了簡化的集成分析器件的兩個視圖，其中，該集成分析器件包括用於在空間上對發射光進行分離的衍射光束成形元件。
圖8示出了對衍射光束成形元件的設計(例如，衍射光束成形元件和檢測器層之間的間隔)進行修改的效果。
圖9表示來自zmw/納米孔的發射光透射穿過代表性的衍射光束成形元件設計。
圖10示出了在沒有濾光器的情況下波長對穿過雙衍射光束成形元件的發射路徑的影響及其效率。
圖11示出了代表性的納米級器件的設計、構造和分析，該納米級器件包括用於對從發射體傳輸的光進行空間分離的衍射光束成形元件。
圖12a示出了介電幹涉濾光器對光學抑制的入射角的依賴性。圖12b和圖12c示意性地示出了在集成器件中各個位置處包括低折射率層以提高光學抑制效率。
圖13示出了示例性吸收染料層的光學性質。
圖14示出了示例性介電疊層的光學性質。
圖15示意性地示出了示例性混合式雷射抑制濾光器的結構和該濾光器的光學性質。
圖16示出了示例性介電疊層的物理性質以及疊層數和光透射之間的關係。
圖17示出了包括tio2/al2o3介電疊層和aptinared1吸收層的混合濾光器的光學性質。
圖18示出了包括tio2/sio2介電疊層和aptinared1吸收層的混合濾光器的光學性質。
圖19示出了由兩個示例性暗鏡塗層所實現的降低了的反射率。
圖20示出了本公開的示例性陣列內的集成器件的布局。
圖21示出了本發明的示例性器件陣列內的集成分析器件的具體特徵。
圖22示出了本器件的示例性單位晶格的組件及其一般特徵。
圖23示出了圖22的組件的組裝圖。
圖24提供了本公開的示例性單位晶格的橫截面圖。
圖25示出了根據本公開而製造的示例性集成器件的橫截面sem顯微圖。
圖26示出了用於製造包括衍射光束成形元件的集成分析器件陣列的示例性工藝流程。
具體實施方式
集成分析器件
復用光學分析系統用於多種不同的應用。這樣的應用可以包括單分子的分析，並且可以涉及例如在各單生物分子進行反應時對它們進行實時觀察。為了便於討論，本文中根據以下優選應用來對這樣的復用系統進行探討：核苷酸序列信息的分析，特別是單分子核苷酸序列分析。雖然根據特定應用進行描述，但是應當理解，本文所述的器件和系統的應用範圍更廣泛。
在單分子核苷酸測序分析的上下文中，對單個固定的核苷酸合成複合物(其包括聚合酶、嘗試闡明其序列的模板核苷酸和與模板序列的一部分互補的引物序列)進行觀察，以識別被摻入到延伸引物序列中的各個核苷酸。通常通過在核苷酸摻入之前、期間或之後觀察核苷酸上的光學可檢測標記來監測摻入。在某些情況下，這種單分子分析採用「一次一鹼基方法(onebaseatatimeapproach)」，由此將單一類型的標記核苷酸一次引入到複合物中並與該複合物相接觸。摻入時，將未成功摻入的核苷酸從複合物中洗去，並且將摻入的標記核苷酸作為固定的複合物的一部分進行檢測。
在某些情況下，僅添加單一類型的核苷酸用以檢測摻入。然後，需要反覆地對各種不同類型的核苷酸(例如，a、t、g和c)重複這些方法，從而能夠確定模板的序列。由於在任何給定時間僅有單一類型的核苷酸與複合物相接觸，任何摻入事件定義為所接觸的核苷酸的摻入。這些方法雖然有些效果，但是當模板序列包括多個重複的核苷酸時，通常會遇到困難，這是因為可以摻入多個鹼基，而其無法與單摻入事件相區分。在某些情況下，針對該問題所提出的解決方案包括調整現有核苷酸濃度，以確保單次摻入事件為動力學主導的。
在其它情況下，同時添加多種類型的核苷酸，但可通過存在於每種類型的核苷酸上的不同光學標籤來對各核苷酸進行區分。因此，這樣的方法可以使用單個步驟來識別序列中給定的鹼基。特別地，將四個各自具有可區分標記的核苷酸均加入到固定的複合物中。然後，對該複合物進行鑑定(interrogate)以識別被摻入到模板序列中的是哪種類型的鹼基，並照此識別被摻入的下一個鹼基。
在某些情況下，這些方法僅對一次一鹼基的添加進行監測，因此這些方法(以及在某些情況下的單核苷酸接觸方法)需要額外的控制來避免在任何給定步驟中加入多個鹼基並由此被檢測系統漏檢。通常，這類方法在核苷酸上使用終止體基團(terminatorgroup)，使得一旦摻入了一個核苷酸就能阻止引物的進一步延伸。這些終止體基團通常是可去除的，以便在檢測到的摻入事件之後對再延伸進行控制。同樣，為了避免與先前摻入的核苷酸的標籤混淆，這些核苷酸上的標記基團通常被配置為是可去除或可滅活的。
在另一個處理中，對單分子引物延伸反應進行實時監測，以識別出持續被摻入到延伸產物中的核苷酸，以闡明潛在的模板序列。在這種單分子實時(或smrttm)測序中，當在聚合酶介導模板依賴性引物延伸反應(polymerase-mediatedtemplatedependentprimerextensionreaction)中發生了核苷酸摻入的過程時，對該過程進行監測。在優選的方面中，模板/聚合酶引物複合體通常被設置為被固定在光學受限區域(例如，零模式波導(zmw))內或靠近透明基底、光波導等的表面處(參見例如美國專利no.6,917,726和no.7,170,050以及美國專利申請公開no.2007/0134128，其全部公開內容針對所有目的以引用方式整體併入本文中)。針對待被使用的螢光標記核苷酸，利用適當的激發輻射對光學受限區域進行照射。由於複合物在光學限制區域或非常小的照射體內，所以只有緊密環繞該複合物的反應體才受到激發輻射。因此，例如，在摻入事件期間，與複合物相互作用的那些螢光標記核苷酸存在於照射體中足夠時間，從而被確定為已經摻入。雖然本文公開的器件中的相關分析物是摻入螢光標記核苷酸的模板/聚合酶引物複合物，但是應當理解，可以使用本公開的器件來對其它相關分析物(特別是相關的螢光分析物)進行監測。
圖1中示出了該測序處理的示意圖。如圖1a所示，在例如零模式波導106的光限制的觀察體(如虛線104所示)中提供了由聚合酶、模板核苷酸和引物序列構成的固定複合物102。當將合適的核苷酸類似物(例如，核苷酸108)摻入到新生核苷酸鏈中時，在摻入期間，對該合適的核苷酸進行一段時間(該時間與標記的核苷酸類似物保留在觀察體內的時間相對應)的照射，這樣做生成了與該保留相關的信號(例如，如圖1b中的a跡線所示的信號脈衝112)。一旦已摻入，就將附著至被標記的核苷酸類似物的多磷酸鹽成分的標記釋放。當下一個適當的核苷酸類似物(例如核苷酸110)與複合物相接觸時，該核苷酸類似物也被摻入，從而使圖1b的t跡線中的信號114升高。如模板序列的潛在互補所指定的那樣，通過對鹼基摻入到新生鏈的過程進行監測，可以獲得模板的長延伸的序列信息。
可以將上述測序反應併入到這樣一個器件(通常是集成分析器件)中，其提供用於(理想上實時地)同時觀察多個測序反應。雖然系統中的每個器件的各個部件和各器件的構造會變化，但是每個集成分析器件通常至少部分地包括如圖2中的框圖所示的通用結構。如圖所示，集成分析器件200通常包括反應單元202，該反應單元202中設置有分析物(即，聚合酶-模板複合物和相關聯的螢光反應物)並且光學信號從該反應單元發出。該分析系統還包括檢測器元件220，其被設置為與反應單元202進行光通信。反應單元202和檢測器元件220之間的光通信由光具組204(其包括通常被指定為206、208、210和212的一個或多個光學元件)提供，用於有效地將信號從反應單元202引導到檢測器220。根據應用的細節，這些光學元件通常包括任意數量的諸如透鏡、濾光器、光柵、反射鏡、稜鏡、折射材料、孔隙之類的元件或這些元件的各種組合。通過將這些元件集成到單個器件架構中，提高了反應單元與檢測器之間光耦合的效率。集成分析系統(包括用於對反應單元進行照射和對從反應單元發射的光信號進行檢測的各種方法)的示例在美國專利申請公開no.2012/0014837、no.2012/0019828和no.2012/0021525中描述，其全部內容針對所有目的以引用方式併入本文中。
如上所述，設置在反應單元(例如，圖2中的元件202)內或固定在器件表面的分析物(例如，聚合酶-模板複合物及相關聯的螢光反應物)發射光，並且該光被傳輸至檢測器元件(例如，圖2中的元件220)。對於螢光分析物，通過激發光源對分析物進行照射，而對於其它分析物(例如，化學發光物質或其它這樣的分析物)，可以不需要激發光源。作為反應單元體的至少一部分的發射體光學地耦接到檢測器元件，使得通過檢測器元件對從該體內的分析物發射的光進行測量。為了使同時測量的分析物的數量最大化，應當儘可能地縮小本(instant)集成分析器件的尺寸，使得每個器件內的發射體均是納米級發射體。理想地，納米級發射體和檢測器元件之間的光學耦合是高效的，以使器件的靈敏度最大化並使信號輸出最大化。如下面進一步詳細描述的那樣，在從納米級發射體發射的光到達檢測器元件之前，可以例如通過透鏡元件和濾色層來進一步操作所述光。
常規的分析系統通常對在光譜上有區別的多個信號或信號事件進行測量，因此為了對那些不同的信號事件進行分離並進行確定地檢測，就必須要利用複雜的光學系統。然而，可以通過減少所檢測到的在光譜上可區分的信號的數目或數量來簡化集成器件的光路。然而，這種減少是在不減少可檢測到的不同反應事件的數量的情況下被理想化地實現的。例如，在基於四個不同可檢測信號事件來區分四個不同反應的分析系統中，其中，典型的系統會為每個不同的反應分配不同的信號光譜，從而檢測和區分每個信號事件，而在替代方法中，將通過少於四個的不同信號光譜來表示四個不同的信號事件，作為替代，這四個不同的信號事件會至少部分依賴於信號事件之間的其它非光譜區別。
例如，為了識別和表徵四種不同核苷酸中的每一種的摻入，常規下採用四個在光譜上可區分的信號的測序操作(例如，「四色」測序系統)在替代構造的上下文中可以採用單色或雙色分析，例如，依賴於僅具有一個或兩個有區別的或可區分的光譜信號的信號。然而，在這種替代構造中，對信號光譜複雜度的依賴性的這種降低並未以犧牲從產生反應事件的多個(即，大量)不同信號中區分信號的能力為代價。特別地，與僅依靠信號光譜來區分反應事件不同，這種替代構造可以依賴於與發射光譜不同的一個或多個信號特性(包括例如信號強度、激發光譜或二者)來將信號事件彼此區分開。
在一個特定的替代構造中，可以通過將信號強度用作兩個或更多個信號事件之間的區別特徵來由此簡化集成分析器件中的光路。在其最簡單的迭代中，參考示例性測序處理，兩種不同類型的核苷酸均攜帶螢光標記，所述螢光標記在相同的激發照射(即，具有相同或基本上重疊的光譜帶)下均發射螢光，由此將提供使用單個激發源進行激發的益處。由每個螢光標記所產生的信號將在相同的照射下具有不同的信號強度或幅度，並且因此可以根據它們各自的信號幅度來對這些信號進行區分。這兩個信號可以具有部分或完全重疊的發射光譜，但是基於發射光譜的任何差異來進行信號的分離將是不必要的。
因此，對於使用信號幅度不同的兩個或多個信號事件的分析系統，通過將通常用於分離在光譜上區分開的信號的那些部件(比如用於信號事件的多個激發源及其關聯光具組以及例如濾光器和分色器的顏色分離光學器件)中的一部分或全部去除，這類系統的集成分析器件可以容易地獲益，因為在許多情況下，所述集成分析器件針對每個在光譜上區分開的信號需要至少部分地分離的光具組和檢測器。因此，這些集成分析器件的光路被大大簡化，從而允許將檢測器元件放置地更靠近反應單元，並且改善了這些器件的檢測處理的總體性能。
可以以多種方式來提供在特定激發照射分布(profile)下產生不同信號幅度的信號產生分析物。例如，可以使用不同的螢光標記，所述不同的螢光標記呈現重疊但包括不同最大值的激發光譜分布。因此，窄波長的激發通常會針對每個螢光基團產生不同的信號強度。這如圖3a中所示，其示出了兩個不同螢光標記基團(分別為實線302和虛線304)的激發光譜。當每個螢光標記經受如垂直線306所示的波長範圍內的激發照射時，每個螢光標記將發出相應幅度的信號。然後，將在給定激發波長處所得到的信號強度分別表示為圖3b的條形圖中的實線條和虛線條。可以容易地使用這兩個信號產生標記在給定激發波長下的強度差異來對這兩個信號事件進行區分。應當理解，當同時出現時，將不容易區分這種光譜相連信號，因為它們將產生疊加的重疊信號，除非如下文所述的那樣，從光譜不同的激發波長產生這種光譜相連信號。應當理解，在兩個以上標記基團情況下可以使用一樣的方法，其中在給定激發光譜下產生的發光具有可區分的強度或幅度。
類似地，兩個不同的螢光標記基團可以具有相同或基本相似的激發光譜，但是由於這些標記基團的量子產率而導致這兩個不同的螢光標記基團可提供不同的且可區分的信號發射強度。
此外，雖然是按照兩種不同的螢光染料來進行描述的，但是應當理解，每個不同的標記基團可以各自包括多個標記分子。例如，每個反應物可以包括能量轉移染料對，其在受到單個照射源激發時會產生不同強度的發射光。例如，標記基團可以包括供體螢光團(其在給定激發波長處被激發)和受體螢光團(其在供體的發射波長下被激發，使得能量被轉移到受體)。通過使用不同的受體(其激發光譜與供體的發射光譜進行不同程度地重疊)，該方法可以生成這樣的總體標記基團，其針對給定激發波長和電平以不同的信號幅度進行發射。同樣，調節供體和受體之間的能量轉移效率也將在給定的激發照射下產生不同的信號強度。
作為替代，可以通過給定反應物上多個不同的信號產生標記基團(例如，將單個標記分子放在一個反應物上，同時將2個、3個、4個或更多個標記分子置於不同的反應物上)來提供不同的信號幅度。所產生的發射信號將反映存在於反應物上的標記的數目，並且由此指示該反應物的身份。
例如，在美國專利申請公開no.2012/0058473；no.2012/0077189；no.2012/0052506；no.2012/0058469；no.2012/0058482；no.2010/0255488；no.2009/0208957中描述了用於上述目的的涉及螢光試劑(例如，核苷酸類似物)的示例性組合物和方法，上述各申請針對所有目的通過全部引用方式併入本文。
如上所述，利用這種方法的集成分析器件例如通過將信號幅度或其它非光譜特性用作信號辨別的基礎來消除光譜辨別要求從而降低複雜度。將這種非光譜辨別方法與更常見的光譜辨別方法結合的集成分析器件也可以提供勝過更複雜的光譜辨別系統的優點。通過將「四色」辨別系統改變為基於信號強度和顏色來區分信號的系統，相對於常規的四色分離方案，仍然可以降低整個光學系統的複雜度。例如，在檢測四個離散反應事件的分析操作中(例如，在核苷酸測序分析中)，可以在給定的發射/檢測光譜內提供兩個信號事件(即，在同一光譜窗口內發射信號)，並且在不同的發射/檢測光譜內提供其它兩個事件。在每個頻譜窗口內，這對信號事件產生相對於彼此可區分的信號強度。
為了便於討論，依據兩組螢光信號事件來描述該概念，其中每組的成員由於螢光強度而不同，並且各組由於其發射光譜而不同。應當理解，簡化的光學系統(例如，針對兩個不同發射光譜使用兩個檢測通道的光學系統)的使用不要求兩組信號的發射分布不重疊或者不要求每個組的成員的發射光譜完全重疊。相反，在許多優選方面，可以使用更複雜的信號分布，在該分布中每個不同的信號事件具有獨特的發射光譜，但是每個信號將基於每個通道中的信號強度來在兩個檢測通道內呈現獨有的信號分布(signalprofile)。
為在本器件中使用，樣本中的每個「發射物」應該由此具有如剛剛描述的那樣的獨有的信號分布，以便被正確地識別。因此，可以使用本器件來容易地區分包含多個發射物的樣本。在一些實施例中，器件區分4個到18個發射物、4個到12個發射物、或者甚至4個到8個發射物。在具體實施例中，器件區分四個發射物(例如，核苷酸測序反應的四個不同鹼基)。
圖4示意性地示出了四個螢光標記基團中的每一個的信號分布，其與兩個不同的濾光器分布中的每一個均重疊。如圖所示，四個標記基團分別產生發射光譜402、404、406和408。雖然來自這四個基團的信號彼此部分地重疊，但它們各自具有不同的最大值。當經受如由通過濾光器(passfilter)線410和412所示的雙通道濾光器方案時，來自每個標記的信號將在兩個檢測通道之間產生獨有的信號分布。特別地，信號經由包括兩條路徑的光具組，這兩條路徑根據所示的光譜分布而被過濾。對於每個信號，不同級別的發射光將通過每個路徑，並且在相關聯的檢測器上被檢測到。通過信號的光譜特性來描述通過每個濾光器路徑的信號量。
在上述混合模式方案的情況下，可以提供包括至少兩個不同的檢測通道的檢測系統，其中每個檢測通道使不同於其它通道的光譜內的光通過。這樣的系統還包括檢測通道的光通信中的反應混合物，該反應混合物產生至少三個不同的光信號，並且其中與其它光信號相比，每個光信號在兩個檢測通道內產生獨有的信號圖案。
在所有情況下，選擇每個信號產生反應物來提供在信號強度和信號通道中的至少一個方面與其它信號彼此完全不同的信號。如上所述，給定通道中的信號強度部分地受光信號的性質(例如，其發射光譜)以及該信號所通過的濾光器(例如，允許到達給定通道中的檢測器的那部分光譜)的支配。然而，也可以通過隨機變量(例如，標記基團在發射信號時的定向)或特定反應的其它變量來調製信號強度。因此，為了確保信號的強度與給定通道內的另一個信號的強度完全不同，在優選方面，考慮這種變化例。
隨著在光譜上區分開的信號事件的數量減少，集成器件的光路的複雜度也降低了。圖5示出了用於執行光學分析(例如，核苷酸測序處理)的非等比例的示例器件架構，所述光學分析部分地依賴於對不同信號的非光譜辨別，以及可選地，部分地依賴於光譜區分。如圖所示，集成分析器件500可以包括被限定在器件的表面層上的反應單元502。如圖所示，反應單元包括設置在表面層中的納米孔(nanowell)。這樣的納米孔可以構成襯底表面中的凹陷，或者構成被設置為通過附加的襯底層到達下面的透明襯底的孔(例如，如在零模式波導(zmw)陣列中所使用的那種孔)(參見例如美國專利no.7,181,122和no.7,907,800以及下文)。然而，還應當理解，在一些實施例中，可以以其它方式來限制所感興趣的樣本，並且可以從分析器件中省略那些實施例中的納米級反應單元。例如，如果在缺乏各個分離的反應單元的器件的表面上將所感興趣的目標固定為圖案中，則可以在不需要對樣本進行物理分離的情況下在那些位置處觀察到結合事件(bindingevent)或其它感興趣的事件。如本領域技術人員將理解的那樣，可以適當地使用這種方法來監測雜交反應(例如，在固定化核苷酸和其互補序列之間的雜交反應)或結合反應(例如，在抗體和其配體之間的結合反應，其中結合對中的任一個成員可以固定在器件表面上的特定位置處)。
激發照射從激發光源(未示出，該激發光源可以與襯底分離，或者也可被集成到襯底中)被傳送到反應單元或固定的目標。如圖所示，可以使用光波導(或波導層)505來將激發光(被示出為朝向一個方向的箭頭，儘管光可以根據期望而在任一方向或兩個方向上傳播)傳送到反應單元502或其它固定目標，其中從波導505發出的瞬逝場對照射體內的反應物進行照射。例如，在美國專利no.7,820,983和美國專利申請公開no.2012/0085894中描述了用於照射反應單元的光波導的使用，其全部內容通過引用併入本文以實現通用。納米級反應單元(本文中也稱為「納米孔」或「zmw」)起到這樣的作用：其使得向下發射到器件中的螢光增強並限制向上散射的光的量。
通過集成光具組504(其包括一個或多個光學元件)將無論是從納米級反應單元還是從固定的目標所發射的光引導到檢測器。光具組包括透鏡元件層508，用以將來自反應單元內的發射體的發射光引導到設置在反應單元下方的檢測器層512。如下面更詳細地描述的，本公開的集成分析器件中的透鏡元件層優選地包括衍射光束成形元件，其用於將發射光高效地分離成至少兩個光束以通過濾色層510。衍射光束成形元件可以例如將發射光分離成被引導到檢測器層的兩個、三個、四個、或者甚至更多個至少部分地分離的光束。根據衍射光束成形元件的構造，可以以線性方式來組織分光束，或者它們可以諸如2×2光束陣列等陣列的形式進行排列。這種排列通常由檢測器層的感測區域的構造決定。
檢測器層通常包括一個或優選的多個感測區域512a、512b(例如，陣列檢測器(例如，cmos檢測器)中的像素)，其通過衍射光束成形元件光耦接到給定分析器件內的發射體。雖然像素512a、512b被示出為線性排列，但是應當理解，這樣的像素可以以網格、n×n的正方形、n×m的矩形、環形陣列或任何其它方便的定向的方式進行排列。下面更詳細地描述示例性排列。
應當理解，在本公開的上下文中，器件中的兩個部件的「光耦接」並非旨在意指耦接的方向性。換句話說，由於通過光學器件的光能的透射是完全可逆的，所以應當認為第一部件到第二部件的光耦接等同於第二部件到第一部件的光耦接。
然後，檢測並記錄來自反應單元502的、對檢測器層的像素進行撞擊的發射信號。如上所述，優選地，濾色層510設置在檢測器層和納米級發射體之間，以使得在光譜上區分開的不同信號行進到檢測器層512中的不同的相關感測區域512a和512b。例如，濾光器層510的部分510a僅允許具有可區分的第一發射光譜的信號到達與其相關聯的感測區域512a，而濾光器層510的濾光器部分510b僅允許具有可區分的第二光譜的信號到達與其相關聯的感測區域512b。
在利用這種構造的測序系統的上下文中，四個核苷酸中的兩個的摻入將產生這樣的信號，其通過濾光器部分510a到達感測區域512a並被濾光器部分510b阻擋。在這兩個信號之間，一個信號將具有高於另一信號的信號強度，使得檢測器層512中的感測區域512a將能夠產生指示這種不同信號強度的信號響應。同樣地，四個核苷酸中的另外兩個的摻入將產生這樣的信號，其通過濾光器部分510b到達感測區域512b並被濾光器部分510a阻擋。在這兩個信號之間，一個信號將具有高於另一信號的信號強度，使得檢測器層512中的感測區域512b將能夠產生指示這種不同信號強度的信號響應。
檢測器層可操作地與通常集成到襯底中的適當電路相耦接，用於向這樣的處理器提供信號響應，所述處理器可選擇地集成包括在同一器件結構內，或者與檢測器層和相關電路相分離但是與檢測器層和相關電路電耦接。在美國專利申請公開no.2012/0019828中描述了這種類型的電路的示例。
從前面的公開內容和圖5中可以看出，本文所描述的集成分析器件不需要在使用常規四色光學器件的系統中所必須的更複雜的光路，從而在某些情況下避免需要過多的信號分離光學器件、發射鏡、稜鏡或濾光層。特別地，儘管如前所述僅給出了單個濾光層，但是在可選方面，可以消除濾光層或可以用這樣的濾光層(例如，雷射抑制濾光層(見下文))取代，該濾光層對來自激發源的雜散光進行阻擋而非對來自反應單元的不同發射信號進行區分。與常規四色系統相比，即便本申請中所描述的集成分析器件包括了濾光層510，但是仍能使得光學器件更簡化和/或更有效，因為常規四色系統需要多層濾光器或窄帶通濾光器，這通常需要混合層或感測區域的每個子集上的複合方式，從而阻止具有任何給定發射波長的信號到達一個或多個感測區域子集，從而使得從每個信號事件檢測到的光子更少。另一方面，圖5中所示的光學器件構造僅阻止整個信號光的較小部分到達檢測器。作為替代，這樣的常規系統將需要所有四種不同信號類型的分離和有差別的方向，因此需要包含用於實現光譜分離的額外的光學元件(例如，稜鏡或光柵)。美國專利申請公開no.2012/0021525中提供了包括光譜轉向元件(即，基於顏色在空間上對光進行分離的光學元件)的納米級集成分析器件的實例。
圖6示出了使用來自本發明的集成系統的兩個顏色/兩個振幅信號組的實時測序操作的示例信號輸出，其中，一個跡線(虛線)表示與a鹼基(高強度信號)和t鹼基(低強度信號)的摻入相關聯的信號，而另一條信號跡線(實線)表示與g(高)鹼基和c(低)鹼基相關聯的不同發射光譜的信號。然後，使用根據信號的彩色通道和強度所推導出的摻入時間和摻入的鹼基的身份來說明鹼基序列。
用於空間分離發射光的透鏡元件
如上所述，本公開的納米級集成分析器件包括設置在納米級發射體和檢測器層之間的透鏡元件層。這種層的透鏡元件用於沿著兩個或更多個空間上分離的光路高效率地引導從納米級發射體發射的光。除了將發射光信號分離成分開的光路之外，透鏡元件還可以使發射光準直和/或聚焦。特別地，這種透鏡元件理想地能夠用近軸線射線來使發射光準直，並且例如在通過濾色層進行分色之前對發射光進行分離。此外，使用標準技術容易生產這種透鏡元件。
如本領域技術人員將理解的那樣，根據所期望的光學性質和物理性質，本器件的集成光學透鏡元件可以是折射透鏡或衍射透鏡。在某些情況下，與可比較的折射透鏡相比，衍射透鏡可以提供改善的圖像質量、更容易小型化和/或生產成本更低。在一些情況下，透鏡可以包括分開的折射部件和衍射部件，或者可以是將兩個特徵組合在單個透鏡元件中的混合透鏡。
在優選實施例中，本分析器件的透鏡元件是衍射光束成形元件或其變型。這樣的元件通常包括類似菲涅爾透鏡特徵的特徵。關於入射輻射，菲涅爾透鏡(當它們通過是衍射而非折射或反射來起作用時也被稱為波帶板或菲涅耳波帶板)由具有特定錐形形狀或具有交替的透明和不透明區域(也稱為菲涅爾帶)的一系列同心環構成。通過選擇性吸收或選擇性相移，這些結構導致穿過器件的光聚焦，從而使得器件起到透鏡的作用。如本領域中所公知的，特定的透鏡設計取決於待聚焦的輻射、用於構造透鏡的材料的折射率、以及所期望的焦距。在一些實施例中，本器件的透鏡元件是用作衍射陣列聚焦元件的改進的菲涅爾透鏡。這種混合透鏡元件由於其將發射光空間地分離成多個點的能力而被稱為衍射光束成形元件。雖然在各實施例中將本公開的集成分析器件描述為包括衍射光束成形元件，但是應當理解，這些實施例是該器件的優選實施例，並且其它透鏡元件可以不受限制地被包括在本分析器件中。
如本領域技術人員將理解的那樣，可以使用各種材料和方法來生產本器件的透鏡元件。例如，透鏡元件可以通過對透光材料的平坦表面中的相關區域進行蝕刻並隨後將吸收材料或相移材料沉積到蝕刻後區域中而形成。例如，相位菲涅耳波帶板是相位菲涅耳透鏡的階梯近似。相位菲涅耳波帶板的效率隨著階數的增加而增加。具體地，可看出兩相菲涅耳波帶板的最大衍射效率為40.5％，而四相菲涅耳波帶板的最大衍射效率為81％。因此，在一些實施例中，透鏡元件(例如，衍射光束成形元件)的光學效率為至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或甚至更高。在優選實施例中，光學效率為至少40％。用於設計具有所期望的空間分離能力的透鏡元件的技術在本領域中是已知的。例如，legeretal.(1988)thelincolnlaboratoryjournal1(2):225描述了在設計用於操縱雷射束(例如，分離和組合雷射束)的光學元件時二元光學技術的應用。可以使用光線追跡軟體(例如，光學設計程序zemax)來設計這些元件。
菲涅耳透鏡及其變型已經被併入使用各種技術的先進光學器件中，例如，在照明系統(參見例如美國專利no.6,002,520)、發光器件(參見例如美國專利no.6,987,613)、固態成像器件(參見例如美國專利號7,499,094)、圖像傳感器(參見例如美國專利no.8,411,375)和集成紅外傳感器(參見例如美國專利申請公開no.2013/0043552)中作為成像光學器件。可以使用類似的方法來實現本公開的透鏡元件的設計以及透鏡元件與本分析器件陣列的集成。
在本器件的檢測路徑中使用對光進行空間分離的衍射光束成形元件提供了優於傳統光學元件(例如，反射錐體或拋物面反射鏡)的若干個優點。特別地，這種衍射光束成形元件提供從發射體發射的光的離軸聚焦。這樣的元件進一步需要最小面積、最小間距，並且使得相鄰檢測器元件之間串擾最小。與通常用於納米級集成分析器件或傳統折射透鏡元件的反射錐體或拋物面反射鏡不同，本公開的衍射光束成形元件可以同時高效率地準直和分離從發射體發射的光。此外，使用標準微晶片製造技術(例如，使用標準沉積、去除和圖案化技術)容易生產本衍射光束成形元件。
圖7中示出了包括用於對發射光進行空間分離的衍射光束成形元件的簡化示例性集成分析器件的兩個視圖。圖7a示出了雙像素器件(即，在檢測器層中包含兩個感測區域的器件)的俯視圖，其中zmw/納米孔702位於兩個感測區域712a和712b之間的邊界上。應當注意，圖7a的視圖中省略了器件的介於中間的衍射光束成形元件、濾色層以及其它特徵。圖7b示出了同一器件的側視圖，其示出了從zmw/納米孔發出的光如何通過衍射光束成形元件708和濾色元件710a和710b到達檢測器層的感測區域712a和712b。
本器件的衍射光束成形元件的設計可以根據需要而變化，以獲得通過元件的發射光的期望的空間分離、準直和/或聚焦。例如，如圖8所示，標稱設計(圖a)可以包括位於衍射光束成形元件和檢測器層之間的足夠的空間，以允許包括例如雷射抑制幹涉濾光層(見下文)或其它光學特徵。在某些情況下，在衍射光束成形元件和檢測器層之間增加橫向間隔(圖b)可能是有利的，而在其它情況下，通過減小衍射光束成形元件和檢測器層之間的橫向間隔(圖c)可以有利於構建更緊湊的結構。如本領域技術人員將理解的那樣，通過改變衍射光束成形元件的設計容易地實現衍射光束成形元件的光學特性的改變。
圖9示出了來自zmw/納米孔的發射體的發射光通過代表性衍射光束成形元件設計的模擬透射。圖9a中示意性地示出了所模擬的器件的基本設計，其包括zmw/納米孔902、衍射光束成形元件908和濾色層910的位置。如圖9b所示，利用衍射光束成形元件的衍射效應將透射通過如圖9a所示設計的衍射光束成形元件的光的強度在空間上進行分離。使用zemax光線追跡軟體設計如圖9a所示的衍射光束成形元件908的組成和結構，並使用lumericalfdtd(時域有限差分)maxwell方程電磁傳播軟體來對如圖9b所示的通過衍射光束成形元件的光的透射特性進行建模。
應當注意，本衍射光束成形元件並不意在基於顏色來分離光。相反，這些衍射光束成形元件的特徵在於它們提供了所有光譜的最大傳輸效率，並且顏色區分由濾色層提供。就這一點而言，圖10示出了在沒有濾色器的情況下波長對通過雙衍射光束成形元件的發射路徑的效率和影響。圖10a中示出了如上所述的衍射光束成形元件的相位分布圖。圖10b中示出了用於630nm發射的檢測器水平處的場分布。針對沒有任何透鏡圖案結構但是具有沉積的a-si的聚集路徑，圖10c示出了作為發射波長的函數的衍射光束成形元件的效率。2μm氧化物線是針對具有距離a-si層2μm的檢測器的器件，4μm氧化物線是針對具有距離a-si層4μm的檢測器的器件。在這些器件中，像素相對較大(約8μm×10μm)。圖10d中示出了波長對器件的焦點的影響。
圖11示出了根據本公開製造的納米級器件的設計、構造和分析，所述納米級器件包括用於對從發射體發出的光進行空間分離的衍射光束成形元件。圖11a示出了該器件的設計特徵，包括zmw/納米孔1102、衍射光束成形元件1108和濾色層1110。該器件還包括用於將激發光傳送到zmw/納米孔的波導(wg)、位於器件表面上的金屬(al)塗層和抗反射(tin)塗層、位於衍射光束成形元件的上方和下方的氧化矽隔離層、以及位於衍射光束成形元件的表面上的孔隙層。附圖中提供了各特徵的大致尺寸。圖11b示出了與根據圖11a中概述的設計而構造的器件相對應的sem顯微圖。
孔隙層
本公開的集成分析器件可以可選地包括一個或多個孔隙層。孔隙層製作在納米級分析器件的其他層之間(例如，在zmw/納米孔層和衍射光束成形元件層之間、在衍射光束成形元件層和濾色層之間、和/或在濾色層和檢測器層之間)。這些孔隙提供了開口，以實現發射光從zmw/納米孔到給定單元晶格內的檢測器元件的感測區域的最大透射，同時使來自激發源(例如，波導)、器件內的自體螢光或相鄰單位晶格之間的串擾的光的背景傳輸最小化。孔隙層通常由在其中不期望出現光的透射的遮光材料和在其中希望出現光的透射的透明材料構成。用於孔隙層的合適的遮光材料包括例如氮化鈦、諸如鉻的金屬或任何其它合適的遮光材料。優選地，遮光材料為氮化鈦。用於孔隙層的合適的透明材料包括例如sio2、si3n4、al2o3、tio2、gap等。在優選實施例中，孔隙層厚度約為100nm。
雷射抑制濾光元件和濾色元件
本公開的集成分析器件還包括被設計為在透射特定波長的光的同時顯著減少或阻擋其它波長的光的特徵。特別地，期望將儘可能多的信號相關的光透射到檢測器的適當區域，並且阻止所有或至少大部分噪聲相關的光。此外，由於本器件的透鏡元件被設計為使得從分析物發射的所有波長的光透射，因此通常需要在透鏡元件和檢測器層的不同感測區域之間採用濾色元件，以便區分分析物中的不同的發射物。
因此，該器件包括設置在透鏡元件層和檢測器層之間的濾色層。通常，針對透射穿過透鏡元件的每個空間上分離的光束均使用濾色層中的不同濾色元件。空間上分離的光通常在被檢測器層中的相應感測區域檢測到之前穿過濾色層。在本發明的一些實施例中，濾色層包括多個濾色元件，每個濾色元件針對一定範圍的光波長。在更具體的實施例中，濾色層包括2個至9個濾色元件。在更具體的實施例中，濾色層包括2個濾色元件、感測區域和分離的光束。
本器件可以額外地或可選地包括位於雷射抑制濾光層內的一個或多個雷射抑制濾光元件。雷射抑制濾光層設置在激發源和檢測器層之間，通常設置在濾色層和集成器件的檢測器層之間。在全集成分析器件(例如，本公開的器件)的情況下，這種雷射抑制濾光元件(也稱為「泵」抑制元件))是特別重要的，因為這些器件的集成性能可以對所有層的總厚度施加約束，並且還可以增加必須確保抑制的角度帶寬。對於非集成檢測器器件，負責抑制非信號光的沉積層可以是幾十微米厚(對參合在一起的若干個濾光器求和)，但通常只需要在＜10度的角度範圍(包括視野(「fov」)和濾光器傾斜)內對光進行抑制。然而，對於諸如本文所例示的器件的集成器件，用於泵抑制的層的厚度可能需要為5微米甚至更小。
集成器件的進一步的考慮是確保被抑制的非信號光被有效地終止(即，確保從光學系統中將其有效地移除，例如，通過吸收將其轉化為熱)。對於非集成器件，這樣的終止通常不是關鍵的，而對於集成器件，反射光可以通過幾次(原則上為一次)反射而到達另一個檢測器位置，此外，不存在讓被抑制的光從該器件逃逸的本地出口。由於這些原因，確保將散射光有效地(理想地，在一次反射中)轉換為熱是重要的。本公開的後續部分中描述了適用於本集成器件的兩種類型的雷射抑制濾光元件的詳細特性。
濾色元件和雷射抑制濾光元件具有彼此共同的特徵，因為它們都被設計成在使某些波長的光透射的同時對其它波長的光進行阻擋。然而，濾色元件用於區分從分析物中的不同發射物發射的光的波長，而雷射抑制濾光元件被設計成通過散射或其它方式來對由波導或其它激發源產生的背景噪聲進行阻擋。因此，通常在來自透鏡元件的空間上分離的光和檢測器層中的多個感測區域之間放置不同的濾色元件，並且通常在透鏡元件和檢測器層之間(優選地在濾色層和檢測器層之間)放置單個雷射抑制濾光元件或多個具有相似特性的雷射抑制濾光元件。用於本器件的濾色元件和雷射抑制濾光元件的合適材料包括例如非晶矽/氧化矽幹涉疊層、類聚合物抗蝕劑、摻雜的pecvd氧化物、具有吸收染料的有機矽化合物等。在優選實施例中，濾色元件和雷射抑制濾光元件均是薄膜幹涉濾光器。在更優選的實施例中，根據非晶矽和氧化矽層來製備濾色元件和雷射抑制濾光元件。在其它優選實施例中，雷射抑制元件設置在濾色層和檢測器層之間。
多層雷射抑制濾光元件和混合雷射抑制濾光元件
理想的雷射抑制濾光器提供對樣品激發波長處的光能量的深度抑制(例如，對於典型的雷射照明源，在532nm處od≥6)，呈現樣品發射波長處寬的高透射率窗口，並且進一步呈現感興趣的波長之間的較小的斯託克斯位移。此外，希望雷射抑制濾光器呈現最小色散角和偏振、最小厚度、以及受控的終止。此外，優選地，濾光器疊層是廉價的並且在適於生產集成器件的其它部件的條件(例如，溫度)下容易生產。
在介電薄膜雷射抑制濾光器的情況下，涉及這種堆疊來在非信號光的寬範圍的入射角度下獲得足夠的濾光器性能有時會是具有挑戰性的。例如，給定的指定波長範圍內，邊緣濾光器僅在特定的入射角範圍內(通常從垂直入射角度到某一值)可以提供高反射效率。在本文所述的一些集成器件設計中，為了使激發源的散射光子不能到達檢測器，可能需要在寬角譜上對光子進行抑制，特別是阻擋具有比典型薄膜疊層能夠足夠支持的入射角更大的入射角的光子。
本公開通過在一個方面中提供包括低折射率(lowindex)全內反射(tir)層的多層雷射抑制濾光器來解決該問題，以便減少高角度散射光的透射。具體地，在激發源和檢測器層之間的器件疊層中包括低折射率層，以便使背景信號最小化。傳統的介電長通濾光器(例如，如圖12a的左圖所示)反射具有較低入射角的光線(例如，附圖中的中間光線)比反射具有較高入射角的光線(例如，附圖中的外側光線)的效率更高。如圖12a的右圖所示，當將該濾光器設計結合到集成器件中時，來自波導的高角度散射光透射通過濾光器疊層併到達傳感器的機會相對較高。然而，在本公開的設計解決方案中(例如，在圖12b的左圖所示的結構中)，在集成激勵波導和諸如介電濾光器疊層的低角度抑制濾光器之間添加了低折射率tir層。高角度散射光在遇到低折射率tir層時經歷全內反射，並且在多次反彈後，從側面離開集成器件。同時，較低角度的散射光透過低折射率tir層，但被介電濾光器疊層所抑制。因此，tir層和濾光器疊層的組合效應產生了阻擋具有廣角光譜的散射光的屏障濾光器。
用於本主題多層濾光器疊層的低折射率tir層的一種候選材料是具有幾乎零色散和低折射率的空氣，但是其它低折射率材料也是合適的，包括具有低折射率和其它合適的性質的其它氣體、液體和固體。如本領域技術人員所理解的那樣，用於低折射率tir層的材料的具體選擇將取決於折射率和相鄰層的其它物理性質。
為了有助於對散射光進行收集並減少多次散射的機會，可以選擇性地將吸收層或吸收塊添加到器件中(如圖12b的右圖所示)。基於材料的吸收波長、消耗光能的能力和在製造集成器件時的適宜性來選擇用於這種吸收層的材料。
根據低折射率層的位置、厚度、材料選擇和層數，上述寬角度光譜多層邊緣濾光器的各種構造是可行的。如上所述，低折射率層可以直接放置在激發波導包覆層的下方，從而產生最短的諧振腔長度，因此限制了二次散射的機會。然而，作為替代，可以如圖12c的左圖所示的那樣在薄膜疊層內放置低折射率層，或者如圖12c的右圖所示的那樣在薄膜疊層和檢測層之間放置低折射率層。這些構造增加了諧振腔長度，並且因此可以增加二次散射的機會，但是這些構造可以有利地便於器件的生產。這些示例中未示出透鏡元件層，該透鏡元件層可以在雷射抑制濾光元件的上方或下方，但優選地在雷射抑制濾光器的上方。
在任何情況下，將附加的tir設計約束結合到雷射抑制濾光器設計中為低折射率層產生附加值。例如，通過將(一個或多個)低折射率層作為整體部件結合到雷射抑制濾光器設計中，例如，因為濾光器不再局限於薄膜疊層而是可以包括從激發波導到檢測層的各層，所以集成器件的性能可以被充分地優化。
本公開還在另一方面中提供了包括介電疊層和吸收層的組合的雷射抑制濾光元件。這種混合濾光器利用幹涉塗層和吸收層的入射角互補依賴性。具體地，如上所述，用於抑制的幹涉塗層通常針對以垂直入射為中心的光錐表現最佳，其中幹涉薄膜中的分散體按角度的餘弦影響性能，而吸收抑制層的性能趨向於隨著入射角增加，其中吸收抑制層中的分散體按角度的餘弦影響性能。由於這種互補性，可以獲得在廣角範圍內以最小厚度將目標抑制得最小的混合塗層。對於較高折射率薄膜和較低折射率吸收層來說，減小了該厚度。注意，在混合抑制濾光器中可以有效地使用對非信號光進行吸收(但是信號光的吸收量最小)的薄膜。
作為適合與介電濾光器組合使用的吸收染料的示例，aptinared1具有高於600nm的高透射率的吸收光譜。參見pangetal.(2011)labchip11：3698中的圖2。雖然該出版物中所使用的厚度相對較大(8μm)，但是根據器件的雷射激發波長可以使用更薄的層。例如，5μm厚度的層在532nm處提供od＞6，4.7μm厚度的層在540nm處提供od＞6，並且2.8μm厚度的層在562nm處提供od＞6。本領域技術人員容易確定適用於本混合濾光器疊層的其它吸收染料和顏料。
特別地，通過吸收染料層(例如，通過aptinared1染料層)進行雷射抑制有利地呈現出無偏振色散、弱角色散和非信號光的受控終止。此外，角度上不均勻的散射體可以允許吸收染料層的進一步變薄。如果半球的某些部分具有待被抑制的較低強度的非信號光，或者如果在某些角度處強度具有已知的偏振依賴性，則該信息可用於(針對給定的抑制目標)進一步減小混合抑制濾光器的厚度。吸收抑制濾光器(例如aptinared1染料層)的缺點包括適度地大的消光係數、相對較大的厚度(5μm)、以及需要使用具有相當大的斯託克斯位移(532nm至約620nm)的樣品染料。然而，在本混合抑制濾光器中通過將吸收層與介電疊層進行組合，可以在很大程度上彌補這些缺點。圖13示出了吸收染料層的弱角色散(左圖)和缺乏偏振色散(右圖)。
關於混合抑制濾光器的介電疊層部件，通過將非常高折射率的材料用於濾光器的幹涉部分，特別優越的抑制濾光器(特別是角度依賴性低的濾光器)是可行的。在532nm泵情況下可以用於這些目的的示例性材料為作為高折射率材料的gap(磷化鎵)、作為低折射率材料的tio2，但是如下所述且如本領域技術人員理解的那樣，也可以使用其他適當材料。值得注意的是，對於普遍生產的塗層，通常將tio2用作高折射率材料。圖14示出了nh/nlgap/tio2介電疊層的有利的性質，特別是在532nm的泵源(由向下的箭頭表示)的範圍中的高消光係數和可控制的斯託克斯位移。然而，該材料還呈現出了在0度和45度之間的顯著的角色散(帶有藍移)、以及p型偏振光信號(靠近570nm的上部的跡線)和s型偏振光信號(靠近570nm的中部的跡線)之間的顯著偏振色散(分光)。
圖15中示出了在單個混合雷射抑制濾光器中將吸收染料層和介電幹涉疊層進行組合的優點。具體地，圖15a示出了這樣的混合濾光器的示意性示意圖，在該圖中下層是gap/tio2薄膜疊層，上層是aptinared1染料。混合濾光器在3μm總厚度的情況下獲得od＝6(其中，od＝2由吸收層提供，od＝4由幹涉層提供)的抑制。可以通過濾光器元件的設計來補償偏振色散和角度色散。如圖15b和圖15c所示，圖15b針對p型偏振光(上跡線)和s型偏振光(下跡線)示出了入射角對透射率的影響，圖15c針對45度入射光(左跡線，p型偏振和s型偏振)和0度入射光(右跡線)示出了波長對透射率的影響。吸收層對透射光的終止進行控制，並且整體設計提供了可容忍的斯託克斯偏移、合理的厚度和在樣品發射波長下的良好透射。
可以根據需要通過用於構建疊層的材料的選擇、每層的厚度和層數來調節混合抑制濾光器的介電疊層組件的光學性質。用於製造幹涉濾光器的介電材料通常是非導電材料(通常為具有特定折射率的金屬鹽和金屬氧化物)。示例性材料包括sio2、sio、si2o3、al2o3、beo、mgo、cef3、lif、naf、mgf2、caf2、tio2、ta2o5、zro2、hfo2、sb2o3、y2o3、ceo2、pbcl2和zns。同時還因為gap的極高的折射率而對其進行使用。優選地，將介電疊層設計為(h/2lh/2)n的整體結構，其中，h層是具有相對較高折射率的第一材料，l層是具有相對低折射率的第二材料。如本領域技術人員所理解的那樣，基於所期望的光學性質來選擇疊層內每層的物理厚度。值「n」是括號內的結構的重複單位數，並且其為整數。隨著總厚度的增加(例如，隨著n增加)，抑制頻帶中的透射率(針對給定的入射角)趨於零。圖16a示出了具有各種n值的gap/ti02疊層的物理性質和光學性質。圖16b示出了使用不同的h和l對的幹涉疊層的物理和光學性質的進一步比較。
圖17和圖18突出了與使用其它傳統介電疊層材料相比在混合抑制濾光層中使用gap/ti02疊層的優點。包含gap/tio2介電疊層和aptinared1吸收層的混合抑制濾光器的光學性質在上文中以及圖15b和圖15c中得到了描述。為了比較，圖17a和圖17b中示出了包括tio2/al2o3介電疊層和aptinared1吸收層的混合抑制濾光器的光學性質，圖18a和圖18b中示出了包括tio2/sio2介電疊層和aptinared1吸收層的混合抑制濾光器的光學性質。重要的是，tio2/al2o3和tio2/sio2疊層的有效折射率比gap/tio2疊層的有效折射率低，從而導致這些濾光器具有更大的角度和偏振色散。tio2/al2o3混合抑制濾光器的色散補償需要4.7μm的厚度(吸收層為約3.6μm，介電疊層為約1.1μm)。tio2/sio2混合抑制濾光器的色散補償需要4.5μm的厚度(吸收層為約3.6μm，介電層為約0.9μm)。從圖17b可以清楚看出，tio2/al2o3混合抑制濾光器理想地將與具有相對較大的斯託克斯位移(例如，532nm的激發和大於635nm的發射)的螢光染料一起使用，而tio2/sio2混合抑制濾光器最好與具有甚至更大的斯託克斯位移的染料一起使用。
應當理解，可以改變塗層的順序以實現混合雷射抑制濾光元件的最佳性能。例如，這些層可以被排序為首先是吸收層其次是幹涉塗層，或相反。吸收材料可以在諸如pmma的主體材料中攜帶，並且可以使吸收材料成形或圖案化以適應有限的體積或允許更簡單的集成。
如本領域技術人員將會理解的那樣，可以以不同的工序來生成塗層，並且可以將該圖層結合到組裝件中。
因此，本公開在該方面提供有：
一種集成分析器件陣列，每個器件包括：
納米級發射體；
光學地耦接到納米級發射體的檢測器層；
設置在納米級發射體和檢測器層之間的衍射光束成形元件；
設置在衍射光束成形元件和檢測器層之間的濾色層；
光學地耦接到納米級發射體的激發源；以及
設置在激發源和檢測器層之間的雷射抑制濾光元件；
其中，通過發射體內的多個發射物從該納米級發射體發射光；
其中，檢測器層包括多個感測區域；並且
其中，衍射光束成形元件在空間上分離從納米級發射體發射的光，並且將空間上分離的光引導穿過濾色層從而到達多個感測區域。
在一些實施例中，雷射抑制濾光元件是多層抑制濾光元件或混合抑制濾光元件。
在具體實施例中，雷射抑制濾光元件是包括介電幹涉濾光層和低折射率全內反射層的多層濾光元件。在更具體的實施例中，每個器件還包括吸收層。
在其它具體實施例中，雷射抑制濾光元件是包括吸收層和介電疊層的混合抑制濾光元件。
在一些實施例中，雷射抑制濾光元件在532nm處呈現低光學透射率和在高於620nm呈現高光學透射率。
暗鏡元件
在另一方面，本公開的集成分析器件還包括暗鏡元件。術語暗鏡通常用於描述具有趨向於吸收入射光而不固有地對光進行散射並且還具有低透射率的塗層的表面。在具有在光源附近處的非樣品螢光材料的儲存器的集成器件中，非信號光傳播到螢光材料的儲存器中可導致附加的噪聲背景，所以其應當被避免。在器件的當信號(或照射)光通過時不會激活的區域上設置暗鏡塗層提高了集成器件在被抑制的非信號光可能撞擊到另一個器件位置之前有效地終止非信號光的能力。
圖19中示出了示例性暗鏡塗層的光學性質，其中，圖19a示出了在塗覆有cr的介電疊層上可以實現反射率的顯著降低。如圖19b所示，在替代塗層(例如，tan塗層)的情況下，甚至更低的反射率是可行的。如本領域技術人員將理解的那樣，其它材料適於用作暗鏡塗層。
可以在散射表面設置暗鏡塗層，以降低撞擊信號角帶內的另一個器件位置的可能性，或者延長在到達另一個器件位置之前的吸收路徑長度。
角度敏感和/或偏振敏感的暗鏡塗層可用於實現信號光的高效透射，同時實現非信號光的某種目標吸收水平。
因此，本公開在該方面提供有：
一種集成分析器件陣列，每個器件包括：
納米級發射體；
光學地耦接到納米級發射體的檢測器層；
設置在納米級發射體和檢測器層之間的衍射光束成形元件；
設置在衍射光束成形元件和檢測器層之間的濾色層；
暗鏡濾光元件；
其中，通過發射體內的多個發射物從該納米級發射體發射光；
其中，檢測器層包括多個感測區域；並且
其中，衍射光束成形元件在空間上分離從納米級發射體發射的光，並且將空間上分離的光引導穿過濾色層從而到達多個感測區域。
在實施例中，暗鏡元件包括散射表面上的暗鏡塗層。
集成分析器件陣列
為了獲得基因測序的廣泛應用(例如，研究和診斷)可能需要的大量序列信息，需要高吞吐量系統。如上所述，舉例來說，為了增強系統的測序吞吐量，通常監測多個複合物，其中每個複合物對單獨的模板序列進行測序。在基因組測序或其它大型dna組分測序的情況下，這些模板通常包含基因組dna的重疊片段。通過對每個片段進行測序，可以隨後根據來自片段的重疊序列數據來組裝連續的序列。
如上所述，並且如圖1所示，這樣的測序系統的模板/dna聚合酶-引物複合物通常被固定設置在光學限制區域(例如，零模式波導(zmw)或納米孔、或靠近透明襯底的表面、光波導等)內。優選地，在襯底上排列大量的這樣的反應單元，以實現基因組或其它大規模dna測序方法所需的規模。優選地，這樣的陣列包括完全集成分析器件(例如，圖2和圖5的框圖中所示的器件等)。美國專利申請公開no.2004/0014837；no.2012/0019828；和no.2012/0021525中提供了包括光學分析器件陣列的集成系統的示例。
可以以超高密度的方式(在任何地方處提供1000個zmw/cm2至1000000個zmw/cm2或更多個)來製造諸如包括zmw/納米孔的器件陣列的集成分析器件陣列。因此，在任何給定的時間，可以分析單個反應系統內甚至單個襯底上的100、1000、3000、5000、10000、20000、50000、100000、1百萬、1千萬、甚至更多個納米級發射體或其他反應區域中發生的反應。
使用上述系統，已經對陣列中的數千或數萬個zmw/納米孔的同時定向照明進行了描述。然而，隨著復用的需求增加，難以增加陣列上的zmw的密度以及這種陣列提供定向照明的能力，這是因為如下問題增加：zmw串擾(來自相鄰zmw的信號在離開陣列時彼此相互汙染)、由更高水平的密集照明引起的信噪比降低等。本發明的陣列和方法解決了這些問題中的一些。
給定的信號在檢測器上的入射位置表示：(1)陣列中的zmw/納米孔內的起始發射體，以及(2)信號分量的發射特性，其用於例如識別被摻入到延伸反應的螢光標記的核苷酸類似物的類型。如上所述，在一些情況下，檢測器可以包括多個感測區域，每個感測區域用於檢測從發射體穿過衍射光束成形元件和濾色層到達檢測器層的光。例如，在測序的情況下，每個反應單元的傳感器可以具有4個元件，每個元件用於四個鹼基中的一個。在一些情況下，感測區域可以提供顏色區分，儘管濾色層優選地用於區分適當的感測區域的光的適當顏色。在這些實施例中，感測區僅檢測信號的強度，而不區分顏色。在某些情況下，傳感器元件使用發射特性的組合來識別被摻入的核苷酸。
圖20示出了有用地用於本公開的陣列中的示例性器件布局。在每種情況下，從上方對陣列進行觀察，黑色圓圈表示zmw/納米孔。如圖所示，zmw/納米孔直接位于波導(其被標識為寬箭頭)上方。在圖20a和圖20c所示的陣列的情況下，波導的「間距」是2列(即，波導被隔開兩列感測區域/像素的寬度)，而對於圖20b和圖20d的陣列，波導的間距為1列(即，波導被隔開一列感測區域/像素的寬度)。通過與一些zmw/納米孔相關聯的兩個細箭頭來指示受每個陣列中的衍射光束成形元件影響的發射光的空間分離。例如，在圖20a的器件中，衍射光束成形元件將發射的光引導到與波導垂直(即，成90°)對準的兩個感測區域上。在圖20b的器件中，衍射光束成形元件將發射光引導到與波導共線(即，成0°)的兩個感測區域上。對於圖20c和圖20d的器件，衍射光束成形元件將發射光引導到與波導成對角線(即，成45°)的兩個感測區域上。從附圖可以清楚看出，圖20c和圖20d的器件關於各個波導的間距而各不相同。
圖21示出了從上方所觀察的器件的陣列，其中更詳細地示出了特定單位晶格內的示例性衍射光束整形元件2108的設計。單位晶格內還標記出了zmw/納米孔2102、波導2105以及將被設置在檢測層的感測區域上的兩個濾色區域2110中的一個。在這些器件中，檢測區域將與波導共線，並且波導間距將為1列。該圖中未示出第二濾色區域和上面已經描述了的器件的各種其它特徵(例如，孔隙元件、雷射抑制元件、金屬抗反射表面層、波導覆層、電子電路等)。
圖22示出了用於構建本器件的示例性單位晶格的各種典型元件及其一般特徵。從單位晶格的平面上方對元件進行觀察。具體地，圖22a示出了衍射光束成形元件，其中衍射光束成形元件(以及單位晶格本身)的尺寸大約為10μm×15μm。圖22b示出了zmw/納米孔(被示出為小方形)及其相關聯的波導。如圖所示，波導的寬度大約為0.3μm至0.7μm，並且其被製作在大約9μm寬的溝槽中。圖22c示出了半徑為2.8μm和3.0μm的兩個圓形濾色區域。然而，當裝配在器件內時，每個濾色區域將相對於zmw/納米孔偏移約3.0μm。圖22d示出了zmw/納米孔(被示出為小方形)和兩個相關聯的孔隙元件(在每種情況下其對應於兩個偏移的透明圓)。典型地，在檢測器層和雷射抑制層/濾色層之間設置有具有大約2.5μm的直徑並且相對於zmw/納米孔偏移約+/-2.7μm的圓的較大孔隙元件層。典型地，在濾色層和衍射光束成形元件層之間設置有具有大約2.0μm的直徑並且相對於zmw/納米孔偏移大約+/-1.6微米的圓的較小的孔隙元件層。圖22e示出了zmw/納米孔(被示出為小正方形)和與兩個偏移透明圓相對應的第三個相關聯的孔隙元件。這些圓直徑約為1.5μm，並且相對於zmw/納米孔偏移約+/-1.0μm。該孔隙元件通常設置在衍射光束成形元件層和波導之間。
圖23示出了將圖22的部件組裝到本發明的示例性集成單位晶格器件中的示意圖。zmw/納米孔為清楚地示出在單位晶格的中心處的小方形，波導被示出為騎跨zmw/納米孔的垂直平行線。該示例性器件按照以下順序從上至下地包括zmw/納米孔、波導、第三孔隙元件、衍射光束成形元件、第二孔隙元件、濾色層、第一孔隙元件和檢測器層。示例性器件可以可選地包括位於濾色層和第一孔隙元件之間或在器件中的另一位置處的雷射抑制層。納米級集成分析器件的該實施例中的衍射光束成形元件將對從垂直于波導的zmw/納米孔發射的光進行引導。換句話說，該示例性器件將與圖20a中所示的陣列布局相對應。
圖24提供了圖23中所描述的器件的更詳細的示意性橫截面，包括尺寸和示例性材料。圖25示出了根據圖24的設計製造的器件的橫截面sem顯微圖。
集成分析器件陣列的製作方法
在另一方面，本公開提供了用於製作集成分析器件陣列的方法。如上所述，這樣的陣列可用於例如核苷酸的大規模測序，特別是基因組測序。可以通過各種方法來製作這樣的陣列。用於製作該陣列的一種優選方法涉及使用針對集成電路的製作而被高度開發了的精密加工方法(例如，半導體或mems工藝方法)。已經使用類似的工藝來建立用於各種應用(包括噴墨印表機、加速度計、壓力傳感器和顯示器(例如，數字微鏡顯示器(dmd))的微機電系統(mems)。可以將精密加工方法應用於大型襯底(比如晶圓)，其可以隨後被切割成許多器件，從而實現一次生產許多器件。
本發明的方法可以例如將抗蝕工藝(例如，光致抗蝕劑)應用於限定襯底或其它層上的結構性元件。蝕刻工藝可用於生產三維結構，包括集成分析器件中的部件結構。沉積工藝可用於在器件上添加層。還可以採用其它半導體工藝(例如，灰化、拋光、釋放、剝離和溼法清洗)來建立本發明的結構，這將在下文更詳細描述。
例如，可以使用光刻技術(例如，常規光刻法、電子束光刻法等)來從聚合物材料(例如，光致抗蝕劑)中界定掩模層。作為替代，可以將光刻技術與層沉積方法一起使用，以使用例如鋁、金、鉑、鉻或其它常規使用的金屬來沉積金屬掩模層，或沉積其它無機掩模層(例如，基於矽(比如，矽、二氧化矽等)的襯底)。作為替代，可以採用負色調工藝(negativetoneprocess)來限定與例如納米孔相對應的抗蝕劑柱。參見例如美國專利no.7,170,050，其全部內容以引用方式併入本文中以實現通用。然後，可以將掩模層沉積在抗蝕劑柱上，並且隨後移除該柱。在特別優選的方面，下面的襯底和掩模層都是由相同的材料製成的，在特別優選的方面，該材料是諸如玻璃、石英或熔融石英的基於sio2的襯底等的透明襯底材料。通過提供相同材料的掩模和下層，可以確保這兩個層與其所暴露的環境具有相同的相互作用，從而使任何混合表面相互作用最小化。
在基於sio2的襯底和掩模層的情況下，可以採用常規的製造工藝。例如，具有諸如波導的表面暴露特徵的玻璃基底可以在其表面上沉積有抗蝕劑層。然後通過抗蝕劑層的適當曝光和顯影來限定掩模層的負像(negative)，以提供在其中希望保持對底層特徵的訪問的抗蝕島狀物。然後將掩模層沉積在表面上，並且例如通過剝離工藝去除剩餘的抗蝕劑島狀物，以提供到達下面的特徵的開口。在金屬層的情況下，可以通過許多方法(包括蒸發、濺射等)來實現沉積。這樣的工藝已經在例如美國專利no.7,170,050中描述。在基於二氧化矽的掩模層的情況下，可以使用化學氣相沉積(cvd)工藝來將矽層沉積到表面上。在剝離抗蝕劑層之後，熱氧化工藝可以將掩模層轉化為sio2。作為替代，可以使用蝕刻方法來使用常規工藝蝕刻到達下層的接入點。例如，可以在下面的襯底上沉積矽層。然後，將抗蝕劑層沉積在矽層的表面上，並對其曝光並進行顯影以限定掩模的圖案。然後，使用適當的差異蝕刻(differentialetch)移除矽但不移除下面的sio2襯底，以從矽層中蝕刻出接入點。一旦限定了掩模層，則還是使用例如熱氧化工藝將矽層轉化為sio2。
本發明的一個方面涉及一種用於製造集成分析器件的陣列的方法，該方法包括以下步驟：提供襯底層，其可以是感光檢測器層(例如，cmos傳感器層、ccd層等)；在襯底層上沉積雷射抑制濾光元件層；在雷射抑制濾光元件層上沉積濾色層；在濾色層上沉積透鏡元件層，特別是包括衍射光束成形元件的層；在透鏡元件層上沉積激發波導層，在透鏡元件層上沉積zmw層；以及對zmw材料構圖和蝕刻以限定穿透zmw層的上包覆層的納米孔陣列。除非具體描述，否則在適當的情況下可以改變本文所述工藝的步驟的順序。在一些實施例中，可以添加附加步驟，特別是在器件的其它層之間對一個或多個孔隙層所執行的沉積和構圖。下文提供了這種製造工藝的具體示例的細節。可以在美國專利申請no.13/920,037(其全部內容以引用方式併入本文中以實現通用)中找到用於生產集成分析器件陣列的方法的其它示例。
在上述每個示例性精密加工技術中，從清潔的襯底層開始處理。本方法中所使用的襯底層可以是任何合適的剛性材料。襯底層材料可以包括例如無機氧化物材料(比如，二氧化矽)。優選地，襯底層材料包括諸如cmos晶片(即，由cmos傳感器或ccd陣列組成的晶片)之類的檢測器層。例如，參見cmosimagersfromphototransductiontoimageprocessing(2004)yadid-pechtandetienne-cummings,eds.；springer；cmos/ccdsensorsandcamerasystems(2007)holstandlomheim；spiepress。
如上所述，在一些情況下,本發明的方法利用光刻技術使用抗蝕劑來限定和製造結構。這些抗蝕劑可以是例如光致抗蝕劑或電子束抗蝕劑。可以使用uv、深uv、g線、h線、i線或其它合適的波長或一組波長來使光致抗蝕劑顯影。所使用的抗蝕劑的類型以及由此而用於工藝的儀器的類型將取決於所生成的特徵的尺寸。在本文所述的許多工藝中，將使用較高解析度抗蝕劑和裝置來生產與反應體相對應的納米孔，其中，納米孔的尺寸可以在10nm至500nm的量級上，並且可以使用較低解析度抗蝕劑和相關聯的儀器來生成集成分析器件的其餘部分，其可以具有1微米至20微米尺寸的特徵。許多抗蝕劑在本領域中是已知的，並且許多抗蝕劑可從諸如rohm和haas和shipley的公司商業獲得。本發明的工藝中所使用的抗蝕劑可以是負性光致抗蝕劑或正性光致抗蝕劑。雖然本文中對使用負性光致抗蝕劑的工藝進行了描述，但是應當理解，在實際情況中也可以使用合適的正性光致抗蝕劑，反之亦然。在適當的情況下，也可以使用化學增幅抗蝕劑來增加抗蝕劑的敏感度。可以根據本領域中的教導和已知的方式而視情況地執行抗蝕劑的去除、襯底的清洗、漂洗、灰化和乾燥。
在一些情況下，用於對納米孔進行光刻的工具為光刻曝光工具，其能夠生成具有尺寸為約10nm至約100nm的特徵的結構。這樣的系統包括例如asmlxt1250曝光工具。
本發明的一些方面中使用了蝕刻工藝，用以在襯底或其它層中生成三維特徵，從而形成例如光學元件或透鏡、或諸如納米孔的反應體。所使用的蝕刻工藝將取決於所使用的材料的類型、特徵的尺寸和抗蝕劑體系。在某些情況下，採用溼法蝕刻或溼法化學蝕刻。也可以採用電化學蝕刻。在一些實施例中，將等離子體蝕刻或反應離子蝕刻(rie)用作蝕刻工藝。例如，在需要具有高縱橫比的結構的情況下，也可以採用深反應離子蝕刻(drie)。也可以使用諸如利用二氯化氙而進行蝕刻的幹法氣相蝕刻。可以適當地使用體微加工或表面微加工來生成本公開的器件結構。在本公開的方法中使用的蝕刻可以是灰度蝕刻。對抗蝕劑形成和蝕刻的條件進行控制以生成具有所期望的幾何圖形(例如，具有所期望的側壁角度)的側壁。
本發明的一些工藝涉及反射層或包覆層的沉積。可以通過溼法工藝(包括在各層上旋轉溶液)或通過氣相工藝來實現這些反射層的沉積。合適的工藝包括電鍍、濺射沉積、物理氣相沉積、蒸發、分子束外延、原子層沉積和化學氣相沉積。可以將金屬用作反射層和包覆層。合適的金屬包括金、鎳、鋁、鉻、鈦、鉑和銀。反射層和/或覆層可以包括鋁，其可以通過使用可從cvc、novellus或mrc獲得的商業獲得濺射工具進行濺射來實現沉積。
當在本發明的工藝期間沉積層時，在某些情況下，在移動到該工藝的下一步驟之前處理這些層。例如，可以對沉積層進行退火、平面化、清潔、鈍化或輕微蝕刻，以改善其性能。
在本發明的一些方法中，沉積保護層或犧牲層。保護層可以是聚合物層、或可以是無機層。合適的保護層或犧牲層包括鍺(ge)和非晶矽(a-si)。可以使用保護層來生成如本文所述的特徵。可以針對保護層或犧牲層的選擇反應性(例如，對溼法化學蝕刻劑的反應性)來選擇用於保護層或犧牲層的材料的類型。例如，在一些情況下，在二氧化矽和鋁存在的情況下，利用加熱的過氧化氫來選擇性地對鍺進行蝕刻的能力使得可以利用其來生成與納米孔相結合的光學結構。
在一些工藝中，可以採用回退(pull-back)工藝。回退工藝通常涉及從層內的特徵的邊緣處進行蝕刻，以便減小特徵的尺寸。可以使用選擇性地與具有暴露邊緣的層進行反應的溼法化學試劑來進行回退。在某些情況下，使用過氧化氫來對鍺層執行回退。
一些方法採用拋光步驟來從表面去除表面區域。合適的方法包括化學機械拋光或化學機械平面化(cmp)。
本發明的一些方法包括平坦化層。用於沉積平坦化層的方法取決於所用材料的類型。平坦化層可以是諸如無機材料的硬質材料(例如，氮化矽)；其可以是諸如鋁的金屬材料；或者其可以是諸如聚合物材料的軟材料(例如，有機聚合物或矽基聚合物)。平坦化層可以是諸如二氧化矽材料的玻璃。在一些情況下，平坦化層包括旋塗玻璃(例如，矽酸鹽、磷矽酸鹽或矽氧烷材料)。合適的旋塗玻璃材料可從例如霍尼韋爾(honeywell)公司獲得。平坦化層可以包括例如摻雜有其它物質以控制其熔融性質的玻璃(例如，硼矽磷矽玻璃(bpsg))。合適的聚合物平面化材料包括例如聚醯亞胺。
比如在通過例如遵循下面示例的處理流程而完成本公開的陣列之後，比如可以通過例如將陣列分離成單獨的晶片並準備將它們用於測序來對陣列進行進一步的處理。進一步的處理步驟將視情況而定，但是其通常可以包括以下處理：表面處理(用於設置將dna聚合酶吸引至納米孔的底部的特定表面的一系列溼/氣相處理)；堆疊(用於保護表面經過處理的器件晶片的上表面的處理，在某些情況下，為測序混合物創建孔)；薄化(可以使複合的頂部鍍過且表面處理過的器件晶片減薄的處理--包括磨光、拋光或其它處理)；切割(使用標準半導體切割鋸來將複合的晶片分成單個晶片的處理)；以及封裝(涉及標準拾取和放置工具將晶片安裝到襯底上並建立用於數據採集的電/光輸出的處理)。這些進一步的處理步驟是本領域已知的或者已經在諸如美國專利申請公開no.2008/0176769和no.2011/0183409(其全部內容以引用方式併入到本文中以實現通用)的參考文獻中公開。
如上所述，可以將本發明的陣列併入到分析系統中以分析在陣列的納米孔中發生的多重反應。本文描述的陣列通常具有流體可從頂部進入並且可從底部進行光學分析的納米孔。因此，通常將陣列併入到其中引入了感興趣的反應混合物的容器中。在一些情況下，各個納米孔均與一定體積的流體相接觸，其中，該流體可以具有例如可以被分析的多個核苷酸模板分子，並且可以具有核苷酸、輔因子和用於進行待分析的反應的其它添加劑。
可以將包括陣列的容器放置在具有適當的光學部件、計算機控制和數據分析系統的儀器內。可以將包括陣列的容器保留在該儀器內，以便可以控制反應條件(例如，容器溫度和容器大氣條件)。容器大氣條件可以包括樣品上方的氣體的組成(例如，溼氣)以及其它氣態物質(比如，氧)的含量。
對於相關領域的普通技術人員將顯而易見的是，在不脫離本發明的範圍或其任何實施例的情況下，可以對本文所述的方法和應用進行其它適當的修改和改變。現在已經對本發明進行了詳細的描述，通過參考以下實施例將更清楚地理解本發明，下面的實施例僅僅出於說明的目的而包括於此，其不旨在限制本發明。
示例
圖26中示出了根據本發明的一個方面的示例性半導體製造工藝，其示出了集成分析器件陣列的製造，該集成分析器件陣列包括衍射光束成形元件，所述衍射光束成形元件用於在空間上將從納米級發射體發射的光進行分離，並且將空間上分離的光引導穿過多個濾色器從而到達檢測器層內的多個感測區域。
在示例性方法中，儘管陣列可被設計成附接到單獨的檢測器裝置，但是該工藝均從乾淨的半導體襯底層處(優選地是集成的cmos檢測器層)開始。因此，襯底層可以是具有對於從反應孔發射的光而言的足夠透明度的任何合適的剛性材料。對於適當的檢測器層的示例，參見cmosimagersfromphototransductiontoimageprocessing(2004)yadid-pechtandetienne-cummings,eds.；springer；cmos/ccdsensorsandcamerasystems(2007)holstandlomheim；spiepress。
可以通過例如溼條法或其它合適的清潔步驟來準備用於沉積的襯底的表面。如圖26a的步驟1-3所示的那樣，通過sin層的鈍化來打開接合焊盤，並且利用氧化物對表面進行填充，並且使表面平坦化。
接下來，如圖26a的步驟4-6所示，利用氧化物對傳感器襯底層進行構圖以生成圖案零層對準標記。圖案結構與cmos頂部金屬對準標記相對準，並且零標記了用於後續疊層圖案構圖的最低級別對準層。如圖26a的步驟7-12所示，沉積孔隙1。如上面更詳細指出的，該層用於從衍射光束成形元件中篩選出低角度信號噪聲。此外，孔隙1層還可以對零標記進行裝飾，以使其更容易可見以用於隨後的對準。在這個示例中，孔隙層由氮化鈦組成，且其厚度約為100nm。圖26b中示出了傳感器襯底和孔隙1層的圖形表示。
接下來，如圖26c的步驟13-15所示，沉積雷射抑制濾光層。如所示沉積後那樣，該濾光層包括非晶矽和二氧化矽的交替層。圖26d示出了傳感器襯底、孔隙1層和雷射抑制層的圖示。注意，步驟14還包括沉積cf1(濾色層的第一部分)。圖26d中未示出該濾色層。
如圖26e的步驟16-26所示，在雷射抑制濾光層的頂部設置有濾色層。對於該示例，在陣列的每個器件的檢測器層上均存在兩個單獨的感測區域，因此，如圖26f中形象地示出的那樣，每個器件中的濾色層包括兩個不同的濾色器cf1和cf2。如所示沉積後那樣，各濾光器自身包括非晶矽和二氧化矽的交替層。濾色器cf1作為雷射抑制濾光器沉積的一部分而被沉積。在該工藝的步驟16-19中對該濾色器cf1進行構圖和蝕刻。在該工藝的步驟20中沉積濾色器cf2，並在步驟22至25中對其進行構圖和蝕刻。圖26f示出了傳感器襯底、孔隙1層、雷射抑制濾光層和濾色層的圖示。在該示例中，濾光器cf1和cf2的不同之處僅在於兩個氧化物層厚度不同。
如圖26g的步驟27至32所示，製備本示例中的第二孔隙層(孔隙2)，並且如步驟33至36所示，第二孔隙層的頂部製備有透鏡隔墊氧化層。圖26h中示出了傳感器襯底、孔隙1層、雷射抑制層、濾色層、孔隙2層和透鏡隔墊氧化層的圖示。
通過對透鏡隔墊氧化層進行光刻構圖(如圖26i的步驟37-46所示)且隨後沉積富碳非晶矽並拋光(如圖26i的步驟47-48所示)來製備包括衍射光束成形元件的透鏡元件層。圖26j中提供了在對透鏡隔墊氧化層進行光刻構圖之後和沉積富碳非晶矽之前形成的中間襯底的圖示。
接下來，如圖26k的步驟49-56所示，對構圖、填充和拋光後的透鏡層進行構圖、向其沉積氮化鈦、並再次構圖以形成孔隙3。圖26l圖形化地示出了所得到的襯底，其包括傳感器襯底、孔隙1層、雷射抑制濾光層、濾色層、孔隙2層、透鏡隔墊氧化層、透鏡層和孔隙3層。
隨後的如圖26m中所提供的步驟57-68表示反射器氧化層的沉積。圖26n中示出了這種沉積的結果。
如圖26o的步驟69-78所示，向襯底添加激發波導層。在該示例中，在步驟69中，沉積包括氮化矽波導的材料，在步驟71和74中，對該波導進行蝕刻，並且在步驟76和78中，沉積氧化物包覆層。圖26p中形象地示出了這些工藝步驟的產物，其包括傳感器襯底、孔隙1層、雷射抑制濾光層、濾色層、孔隙2層、透鏡隔墊氧化層、透鏡層、孔隙3層和波導層。
圖26q的步驟79-91示出了零模式波導(zmw)層的製造。具體地，該圖示出了在步驟79中沉積鋁/氮化鈦表面層，以及隨後在步驟86中對zmw孔進行光刻開口。圖26r形象地示出了添加零模式波導(zmw)層所形成的產物，其包括上述所有層以及zmw/納米孔層。應當注意，圖26中的任何一種圖中所示出的尺寸僅是處於說明的目的而示出的，不應將其視為任何方式的限制。
在所有其它工藝流程步驟完成後，使用清潔工藝步驟來處理陣列以去除所有殘餘物。附加步驟可以包括例如深蝕刻步驟，以生成到cmos接合焊盤的接線，並將陣列耦接到器件的其它部件。
本文提及的所有專利、專利公布和其它出版的參考文獻均通過引用方式將其整體併入到本文中，就如同以引用方式來單獨且專門地將它們中的每一個併入到本文中一樣。
雖然已經提供了具體實施例，但是上述描述是說明性的而非限制性的。先前描述的實施例的任何一個或多個特徵可以以任何方式與本發明中的任何其它實施例的一個或多個特徵組合。此外，本領域技術人員在閱讀本說明書之後，本發明的許多變型對於本領域技術人員來說是顯而易見的。因此，應該通過參考所附權利要求及其等同物的全部範圍來確定本發明的範圍。