一種菸葉浸提液培養基及其應用的製作方法

2023-06-24 06:02:46 1

專利名稱：一種菸葉浸提液培養基及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種培養基，尤其涉及一種培養菸鹼降解微生物的菸葉浸提液培養基 及其應用，屬於微生物技術領域。
背景技術：
菸鹼是菸草中的生物鹼，它對人的中樞神經有強烈的刺激和麻痺作用，少量使人 興奮，大量會引起眩暈、嘔吐甚至中毒死亡。菸葉中菸鹼含量過高，就會嚴重危害菸民的健 康。另外菸鹼也是一種環境有毒物質，在菸草製品的生產加工過程中會產生大量的固體、液 體和氣體廢棄物，這些廢棄物如果不加處理就投放到環境中，會嚴重破壞生態環境，危害人 類健康。微生物法降解菸鹼因具有針對性、快速有效性的優點，受到越來越多的重視。至今， 國內外研究者已經從環境中分離了多種菸鹼降解菌。目前所報導的培養菸鹼降解菌株的培養基成分複雜，例如添加Na2HPCV KH2PO4, K2SO4^MgCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、FeCl3 · 6H20、CaCl2 等基礎離子成分後，再添加一定含量的 菸鹼，不僅製備繁瑣，而且菸鹼價格昂貴，成本較高，因而迫切需要尋找簡單廉價的替代培
養基配方。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種簡單廉價適合培養菸鹼降解微生物的培養 基及其應用。發明概述本發明所述的菸葉浸提液培養基中添加了菸葉浸提液，採用該培養基培養菸鹼降 解類微生物可以獲得更大的生物量，而且該菸葉浸提液培養基不需要額外添加各種微量元 素和無機鹽，使該培養基配製簡單、使用方便、成本低、適合工業化應用。發明詳述一種菸葉浸提液，其特徵在於，由如下步驟製得將菸葉碎片和水按照質量體積比10 80 1的比例混合，煮沸25 35分鐘，過 濾除去沉澱，定容，即得菸葉浸提液；所述的質量體積比單位為g/L。經檢測，菸葉碎片與水按照10 1比例混合時，菸葉浸提液含有菸鹼1. 3 1. Sg/ L，菸葉碎片與水按照20 1比例混合時，菸葉浸提液含有菸鹼1.9 2. 5g/L，菸葉碎片與 水按照40 1比例混合時，菸葉浸提液含有菸鹼3.9 4. 5g/L，菸葉碎片與水按照60 1 比例混合時，菸葉浸提液含有菸鹼6. 2 6. 8g/L，菸葉碎片與水按照80 1比例混合時，煙 葉浸提液含有菸鹼9. 2 9. 8g/L。一種菸葉浸提液培養基，其特徵在於，組分如下菸葉浸提液1L，牛肉膏3 5g、蛋白腖5 10g、NaCl 5 10g、瓊脂18 22g， ρΗ7· 0 7· 5。
優選的，菸葉浸提液培養基成分如下菸葉浸提液1L，牛肉膏3g、蛋白腖10g、 NaC15g、瓊脂20g，pH7. 0 7. 5，所述的菸葉浸提液由菸葉碎片與水按照20 1的比例混合.一種菸葉浸提液培養基，其特徵在於，組分如下菸葉浸提液1L，葡萄糖3 7g、蛋白腖3 7g、酵母粉3 7g、瓊脂18 22g，pH 自然。優選的，菸葉浸提液培養基成分如下菸葉浸提液1L、葡萄糖3g、蛋白腖5g、酵母 粉3g、瓊脂20g，pH自然，所述的菸葉浸提液由菸葉碎片與水按照20 1的比例混合。一種菸葉浸提液培養基，其特徵在於，組分如下菸葉浸提液1L，酵母粉0. 5 lg，pH7. 0 7. 5或pH自然。當pH7. 0 7. 5時適 合培養細菌類菸鹼降解微生物，當PH為自然時適合培養真菌類菸鹼降解微生物。優選的，菸葉浸提液培養基成分如下菸葉浸提液1L，酵母粉0. 5g，pH7. 0 7. 5 或PH自然，所述的菸葉浸提液由菸葉碎片與水按照20 1或80 1的比例混合。本發明還提供上述菸葉浸提液培養基在培養菸鹼降解微生物方面的應用。優選的，所述菸鹼降解微生物為米麴黴(Aspergillus oryzae)CGMCC NO. 3687、假單胞菌(Pseudomonas sp.) CCTCC Ν0· M207083、菸草假單胞菌(Pseudomonas nicotianae)CGMCC N0. 0757、根癌土 壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)CCTCC N0.M206131、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) CGMCC Ν0· 0674 之一。所述菸葉碎片可由普通捲菸廠獲得。在本發明製備的適合培養菸鹼降解微生物的培養基方法中，採用菸葉碎片，經煮 沸後，菸葉碎片中的營養成分釋放溶解於水中，為培養微生物提供了豐富的微量元素及營 養物質，同時也提供了菸鹼降解微生物的選擇營養物質——菸鹼。本發明將菸葉碎片用來 製備培養菸鹼降解微生物的培養基，可以達到節約菸鹼降解菌株培養基的配製成本。由於 本發明方法不需要額外添加各種微量元素和無機鹽，因此，培養基的製備簡便、快速。利用 本發明培養基培養的菸鹼降解菌生長量高，降解菸鹼能力強，同時本發明的方法還解決了 現有技術中純品菸鹼添加的高成本問題，具有廣闊的工業應用前景。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步闡述，但本發明所保護範圍不僅限於此。實施例中所述的試劑均為市售產品，菸葉碎片由山東濟南將軍集團購得，所述操 作方法如無特別說明均為本領域通用操作方法。實施例1菸葉浸提液的製備將菸葉碎片和水按照質量體積比(g/L) 20 1和80 1的比例混合，煮沸30分 鍾，抽濾除去沉澱，加水定容至1L，分別製得2%的菸葉浸提液和8%的菸葉浸提液；經檢 測，2%的菸葉浸提液含有菸鹼2. 2g/L，8%的菸葉浸提液含有菸鹼9. 5g/L。(1)菸葉浸提液培養基的製備①菌種活化培養基(細菌)的組分2%的菸葉浸提液1L，牛肉膏3g、蛋白腖10g、 NaCl 5g、瓊脂 20g;
菌種活化培養基(真菌)的組分2%的菸葉浸提液1L，葡萄糖3g、蛋白腖5g、酵 母粉3g、瓊脂20g。②種子培養液的組分2%的菸葉浸提液1L，酵母粉0. 5g。③發酵培養基的組分8%的菸葉浸提液1L，酵母粉0. 5g。按照上述組分混合，pH自然(真菌)，或者，用lmol/L的NaOH調pH7. 0 7. 5 (細 菌)，在115°C高溫下滅菌30分鐘，即可。(2)對比實驗1 ①菌株活化培養基的製備在無機鹽培養基中加入菸鹼，使其終濃度為2g/L。②種子培養基的製備在無機鹽培養基中加入菸鹼，使其終濃度為2g/L。③發酵培養基的製備在無機鹽培養基中加入菸鹼，使其終濃度為9. 5g/L。上述無機鹽培養基的製備=K2HPO4·3Η20 13. 3g/L,KH2PO4 4g/L、MgS04 ·7Η20 0. 2g/ L、0. 5ml微量元素溶液，蒸餾水配製。上述微量元素溶液的製備=CaCl2·2Η20 0. 05g/L,CuCl2 ·2Η20 0. 05g/L,MnSO4 ·Η20 0. 008g/L、FeS04 ·7Η20 0. 004g/L,ZnSO4 0. lg/L,Na2MoO4 ·2Η20 0. lg/L,Na2WO4 ·2Η20 0. 05g/ L，0. lmol/LHCl 配製。上述培養基pH7. 0 7. 5，用於培養細菌。上述培養基使用前都在115 °C高溫下滅菌30分鐘。上述培養基中，菸鹼單獨經0. 22 μ m濾膜過濾除菌步驟後加入。(3)對比實驗2①菌株活化培養基的製備牛肉膏3. Og/L、蛋白腖10g/L、NaCl 5. Og/L、瓊脂20g/ L0②種子培養基的製備牛肉膏3. Og/L、蛋白腖10g/L、NaCl 5. 0g/L。③發酵培養基的製備在基礎培養基中加入菸鹼，使其終濃度為9. 5g/L。上述基礎培養基的製備=NH4NO31. 00g/L、MgSO4 · 7H20 0. 50g/L、(NH4)2SO4 0. 50g/ L、KH2PO4 0. 50g/L、NaCl 0. 50g/L、酵母粉 0. 05g/L、K2HPO4 1. 50g/L。上述培養基均為蒸餾水配製，pH7. 0 7. 5，用於培養細菌。上述培養基使用前都在115°C高溫下滅菌30分鐘。所述步驟③中，菸鹼單獨經0. 22 μ m濾膜過濾除菌步驟後加入。(4)對比實驗3①菌株活化培養基的製備=K2HPO4·3Η20 13g/L, (NH4)2SO4 lg/L,KH2PO4 4g/L、酵母 粉 lg/L、菸鹼 2g/L、瓊脂 20g/L。②種子培養基的製備=K2HPO4· 3H20 13g/L、(NH4)2SO4 lg/L、KH2PO4 4g/L、酵母粉 lg/L、菸鹼 2g/L。③發酵培養基的製備=K2HPO4· 3H20 13g/L、(NH4)2SO4 lg/L、KH2PO4 4g/L、酵母粉 lg/L、菸鹼9. 5g/L、ImL微量元素溶液。上述微量元素溶液的製備=MgSO4·7Η20 10g/L、MnS04 ·4Η20 4g/L、CaCl2 · 2H20 2g/ L、FeSO4 · 7H20 2g/L，0. lmol/L HCl 配製。上述培養基均為蒸餾水配製，pH7. 0 7. 5，用於培養細菌。上述培養基使用前都在115 °C高溫下滅菌30分鐘。
上述培養基中，菸鹼單獨經0. 22 ym濾膜過濾除菌步驟後加入。(5)對比實驗4①菌株活化培養基的製備在無機鹽培養基中加入菸鹼，使其終濃度為2g/L。②種子培養基的製備在無機鹽培養基中加入菸鹼，使其終濃度為2g/L。③發酵培養基的製備在無機鹽培養基中加入菸鹼，使其終濃度為9. 5g/L。上述無機鹽培養基的製備Na2HP045. 57g/L、KH2P04 2 . 44g/L、K2S04 lg/L、 MgCl2 6H20 0. 2g/L、MnCl2 4H20 0. 0004g/L、FeCl3 6H20 0. 001g/L、CaCl2 0. 001g/L。上述培養基均為蒸餾水配製，pH7. 0 7. 5，用於培養細菌。上述培養基使用前都在115°C高溫下滅菌30分鐘。上述培養基中，菸鹼單獨經0. 22 ym濾膜過濾除菌步驟後加入。⑶對比實驗5①菌株活化培養基的製備在基礎培養基中加入菸鹼，使其終濃度為2g/L。②種子培養基的製備在基礎培養基中加入菸鹼，使其終濃度為2g/L。③發酵培養基的製備在基礎培養基中加入菸鹼，使其終濃度為9. 5g/L。上述基礎培養基的製備:KH2P040 . 65g/L、K2HP04 1. Og/L、MgS04 7H20 0. 5g/ L、(NH4)2S04 0.5g/L、NaCl 0. 5g/L、CaCl2 2H20 0. lg/L、NaMo04 0 . 00 5g/L、FeS04 7H20 0. 005g/L、MnS04 0 . 01g/L、酵母粉 0. 05g/L、0. 5mL 微量元素溶液。上述微量元素溶液成分為CuCl2 2H20 0. 05g/L、ZnS04 0. lg/L。上述培養基均為蒸餾水配製，pH7. 0 7. 5，用於培養細菌。上述培養基使用前都在115°C高溫下滅菌30分鐘。上述培養基中，菸鹼單獨經0. 22 ym濾膜過濾除菌步驟後加入。(7)對比實驗6①菌株活化培養基的製備大豆粉5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L、 K2HP045g/L、瓊脂 20g/L。②種子培養基的製備大豆粉5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L、 K2HP045g/L。 ③發酵培養基的製備大豆粉5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L、 K2HP045g/L、菸鹼 9. 5g/L。上述培養基均為蒸餾水配製，pH6. 5 7. 0，用於培養真菌。上述培養基在115°C高溫下滅菌30分鐘，所述步驟③中，菸鹼單獨經0. 22 ym濾膜過濾除菌步驟後加入。⑶對比實驗7①菌株活化培養基的製備馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L、自然pH。馬 鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然後用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化後補足水至1L，115°C 滅菌30分鐘。②種子培養基的製備麥芽浸粉3g/L、酵母粉3g/L、蛋白腖5g/L、葡萄糖10g/L， pH6. 5。③發酵培養基的製備:KH2P04lg/L、MgS04 0. 5g/L、FeS04 0 . 00 3g/L、CaCl2 0. 003g/L、MnS04 0 . 001g/L、菸鹼 9. 5g/L, pH6. 5。
上述培養基均為蒸餾水配製，用於培養真菌。上述培養基在115°C高溫下滅菌30分鐘。所述步驟③中，菸鹼單獨經0. 22 ym濾膜過濾除菌步驟後加入。由以上比較可以看出，本專利提供的培養基配方配製更加方便，成本低，適宜於工 業化應用。實施例2利用菸葉浸提液培養基培養具有菸鹼降解能力的米麴黴CGMCC NO. 3687本實施例中的菌株活化培養基(真菌)、種子培養液、發酵培養基的配製同實施例 1。(1)選擇米麴黴CGMCC NO. 3687，接種至菌株活化培養基(真菌)活化40小時，培 養溫度為28°C，然後，取活化後的米麴黴CGMCC NO. 3687接種於種子培養液，培養30小時， 培養溫度為28°C，得初級培養液；將初級培養液，按體積比5% (v/v)的接種量轉接於發酵 培養基中，培養溫度為28°C，搖床轉速為150轉/分。培養40小時後，抽濾收集菌絲體，測 定菌體生長量，並分析發酵液上清中菸鹼殘留量。其40小時生物量達到8. lg/L，菸鹼降解 量為 7. 8g/L。上述生物量的測定方法為抽濾菌絲體，用蒸餾水洗滌3次，將菌絲體冷凍乾燥至
恆重，稱量。菸鹼降解量的測定方法為初始菸鹼含量(g/L)與培養40小時後測得的菸鹼剩餘 含量(g/L)之差。上述菸鹼含量分析所用設備及條件分析型高壓液相色譜儀(Agilent 1 lOOSeries)，美國安捷倫公司；樣品經煮沸5分鐘、12000轉/分離心10分鐘後，用 同體積甲醇稀釋，4°C冰箱靜置30分鐘，0.22i!m Millipore膜過濾待檢測。分析柱為 TC-C18 (150X4. 6mm)，流動相為體積比為15 85的甲醇甲酸(濃度0. 05 % )，流速 0. 5mL/min,柱溫30°C，紫外檢測波長254nm。(2)對比實驗1參照實施例2(1)，所不同的是①米麴黴CGMCC NO. 3687在發酵培養基中培養40小時後生物量為5. lg/L，菸鹼降 解量為3. 8g/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (7)所述。(3)對比實驗2參照實施例2(1)，所不同的是①米麴黴CGMCC NO. 3687在發酵培養基中培養40小時後生物量為4. 9g/L，菸鹼降 解量為3. lg/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (8)所述。以上對比實驗表明，利用本專利提供的培養基培養米麴黴CGMCC NO. 3687，獲得的 生物量更多，菸鹼降解量更高。實施例3利用菸葉浸提液培養基培養具有菸鹼降解能力的巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674。本實施例中的菌株活化培養基(細菌)、種子培養液、發酵培養基的配製同實施例1。(1)選擇巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674，接種至菌株活化培養基(細菌)活化18小 時，培養溫度為37°C，然後，取活化後的巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674接種於種子培養液， 培養20小時，培養溫度為37°C，得初級培養液；將初級培養液，按體積比5% (v/v)的接種 量轉接於發酵培養基中，培養溫度為37°C，搖床轉速為150轉/分。培養20小時後，測定菌 體生長量，並分析發酵液上清中菸鹼殘留量。其20小時生物量達到0D_ = 3. 1，菸鹼降解 量為 1. 8g/L。上述菌體生物量的測定方法為細菌發酵液5mL經過12000轉/分離心10分鐘後 獲得菌體，用蒸餾水洗滌3次，然後用5mL蒸餾水重新懸浮，在600nm處測定其0D值。上述菸鹼含量分析所用設備及條件同實施例2(1)所述。(2)對比實驗1參照實施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674在發酵培養基中培養20小時後生物量為0D6(1(1 = 2. 1，菸鹼降解量為1. lg/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (2)所述。(3)對比實驗2參照實施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674在發酵培養基中培養20小時後生物量為0D6(1(1 = 1.9，菸鹼降解量為0. 6g/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (3)所述。(4)對比實驗3參照實施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674在發酵培養基中培養20小時後生物量為0D6(1(1 = 1.6，菸鹼降解量為0. 4g/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (4)所述。(5)對比實驗4參照實施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674在發酵培養基中培養20小時後生物量為0D6(1(1 = 1.5，菸鹼降解量為0. 3g/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (5)所述。(6)對比實驗5參照實施例3(1)，所不同的是①巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674在發酵培養基中培養20小時後生物量為0D6(1(1 = 1.6，菸鹼降解量為0. 4g/L。②菌株活化培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1 (6)所述。以上對比實驗表明，利用本專利提供的培養基培養巨大芽孢桿菌CGMCC NO. 0674， 獲得的生物量更多，菸鹼降解量更高。
權利要求
一種菸葉浸提液，其特徵在於，由如下步驟製得將菸葉碎片和水按照質量體積比10～80∶1的比例混合，煮沸25～35分鐘，過濾除去沉澱，定容，即得菸葉浸提液；所述的質量體積比單位為g/L。
2.一種由權利要求1所述的菸葉浸提液配製的菸葉浸提液培養基，其特徵在於，組分 如下菸葉浸提液1L，牛肉膏3 5g、蛋白腖5 10g、NaCl 5 10g、瓊脂18 22g，pH 7. 0 7. 5。
3.如權利要求2所述的菸葉浸提液培養基，其特徵在於，牛肉膏3g、蛋白腖10g、NaCl 5g、瓊脂20g，pH 7. 0 7. 5，所述的菸葉浸提液由菸葉碎片與水按照20 1的比例混合。
4.一種由權利要求1所述的菸葉浸提液配製的菸葉浸提液培養基，其特徵在於，組分 如下菸葉浸提液1L，葡萄糖3 7g、蛋白腖3 7g、酵母粉3 7g、瓊脂18 22g，pH自然。
5.如權利要求4所述的菸葉浸提液培養基，其特徵在於，葡萄糖3g、蛋白腖5g、酵母粉 3g、瓊脂20g，pH自然，所述的菸葉浸提液由菸葉碎片與水按照20 1的比例混合。
6.一種由權利要求1所述的菸葉浸提液配製的菸葉浸提液培養基，其特徵在於，組分 如下菸葉浸提液1L，酵母粉0. 5 lg，pH7.0 7. 5或pH自然。
7.如權利要求6所述的菸葉浸提液培養基，其特徵在於，酵母粉0.5g，pH7. 0 7. 5或 pH自然，所述的菸葉浸提液由菸葉碎片與水按照20 1或80 1的比例混合。
8.權利要求2、4或6所述的菸葉浸提液培養基在培養菸鹼降解微生物方面的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述菸鹼降解微生物為米麴黴 (Aspergi 1 lusoryzae) CGMCC NO. 3687、假單胞菌(Pseudomonas sp.) CCTCC NO. M207083, 菸草假單胞菌(Pseudomonas nicotianae) CGMCC NO. 0757、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaci ens) CCTCC NO. M206131、巨大芽孢桿菌(Bacillus me gat erium) CGMCC NO. 0674 之
全文摘要
本發明涉及一種培養基，尤其涉及一種培養菸鹼降解微生物的菸葉浸提液培養基及其應用，屬於微生物技術領域。本發明提供的菸葉浸提液培養基，其主要成分含有菸葉浸提液，製備方法為將菸葉碎片和水按照質量體積比10～80∶1的比例混合，煮沸25～35分鐘，抽濾定容，即得菸葉浸提液。本發明還提供菸葉浸提液培養基在培養菸鹼降解微生物方面的應用，該培養基適用於多種菸鹼降解微生物的培養，並且可以獲得更大的生物量，同時提高菸鹼降解能力。本發明所述培養基配製簡單、使用方便、成本低、適合工業化應用。
文檔編號A24B15/24GK101856143SQ20101017358
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者盧麗麗, 孟祥璟, 肖敏 申請人:山東大學