西姆瓦什坦叮的生化純化的製作方法

2023-06-24 04:09:21

專利名稱：西姆瓦什坦叮的生化純化的製作方法
技術領域：
本發明涉及將Lovastatin生物合成轉化為7-[1′，2′，6′，7′，8′，8a′(R)-六氫-2′(S)，6′(R)-二甲基-8′(S)-羥基-1′(S)-萘基]-3(R)，5(R)-二羥基庚酸，即「三醇酸」，它是在由Lovastatin合成Simvastatin中通過微生物的水解得到的，這種方法便於將Simvastatin從未反應的Lovastatin原料中分離和離析出來。該方法使用能夠水解Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈的細菌或真菌，或使用由其中衍生而來的這類微生物的突變體或水解酶。
所說的三醇酸和它的內酯形式是本技術領域中已知的，並且是3-羥基-3-甲基穀氨醯基-輔酶A(HMG-CoA)還原酶(包含在膽固醇生物合成中的一種酶)的抑制劑。
Lovastatin鹽成為三醇鹽的選擇性轉化可用於在由Lovastatin生產Simvastatin的過程中分離未反應的Lovastatin和Simvastatin。Lovastatin酸在8′位上具有2-甲基丁醯氧基側鏈，並且將其與在8′位上具有2，2-二甲基丁醯氧基側鏈的新形成的Simvastatin酸分離是困難的。現申請人已發現，為了形成三醇鹽，使用來自微生物的水解酶，採用本發明的方法而進行的由Lovastatin酸鹽的2-甲基丁醯氧基側鏈的選擇性分裂結果形成了更容易分離的混合物和純度更高的Simvastatin產物。上述的衍生物包括真菌，例如Clonostachys compactiuscula(ATCC38009和ATCC74178)，Monascus ruber，Mortierella isabellina，Emericella unguis，Diheterospora chlamydosporia，Humicola fuscoatra，Dechotomomyces cejpii，Neocosmospora africana，Xylogone sphaerospora，Torulomyces ragena，Thielavia fimeti，Aspergillus unguis，卷枝毛微(Mucor circinelloides)，腐皮鐮孢(Fusarium solani)，產黃青黴(Penicillium chrysogenum)，棒麴黴(Aspergillus Clavatus)，Scopulariopsis communis，Gilmaniella humicola，Mucor bainieri，Tricharus spiralis和chaetomium cochliodes，或細菌，特別是放線菌類例如白淺灰鏈黴菌(Streptomyces albogriscolus)，寡生孢鏈黴菌(Streptomyces paucisporogenes)，吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopius)，產綠色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)，排孢遊動單孢菌(Planomonospora parontospora)和Kibdelosporangium aridum。
本發明涉及的是用作抗血膽甾醇過多製劑的HMG-CoA還原酶的抑制劑的領域，現在相當確定的是，血膽甾醇過多是在心血管疾病特別是粥樣硬化的發展階段的重要危險因素。能夠抑制HMG-CoA還原酶的化合物幹擾和限制膽固醇的生物合成，並且以上述的方法起抗血膽甾醇過多製劑的作用。
正如上面已敘述的那樣，三醇酸和它的內酯形式是已知化合物。以內酯形式的三醇酸，例如描述在Endo，公開的日本專利申請86-13798(1986)中，其中它是通過Monascus ruber的發酵來生產的，並且也陳述了其具有還原血膽固醇含量的能力的論證。
Lovastatin和Simvastatin作為HMG-CoA還原酶抑制劑也是本技術領域已知的化合物。這兩種化合物的不同在於Lovastatin在8′位上具有2-甲基丁醯氧基側鏈和Simvastatin具有2，2-二甲基丁醯氧基側鏈。
雖然Simvastatin已由Lovastatin合成出來，但由Simvastatin和Lovastatin的混合物中將其分離並純化一直是困難是。該兩種化合物(這兩種化合物的不同點只是一個甲基)之間在結構上的相似性使得高壓液相色譜(HPLC)分離進行困難，這是因為這兩種化合物具有如此相似的保留時間。為從Simvastatin和Lovastatin的混合物中分離出Simvastatin所使用的一種分離方法是使用鹼性水解如用氫氧化鈉(NaOH)或氫氧化鉀(LiOH)將未反應的Lovastatin轉化為三醇酸或二醇內酯。然而，這種鹼性水解僅水解一定百分率的Lovastatin，未反應的Lovastatin作為最終Simvastatin產物的雜質而留下。鹼性水解的另外的問題是Simvastatin的部分水解，於是便減少了所需的Simvastatin產物的收率。本發明提供了以較高的純度和在沒有伴隨收率損失的情況下從Simvastatin和Lovastatin的混合物中分離Simvastatin的方法。
Komagata等人[J.Antibiotics，39，1574-77(1986)]描述了將Compactin(ML-236B)酶水解轉化成8-羥基類似物(ML-236A)，其中除去了正如在本發明中所述的相同側鏈。在經試驗的1600種真菌菌株中，發現有59種對催化該水解反應是有效的，並且，Emericella unguis表現出最有效的活性。
Endo[公開的日本專利申請85-176595(1985)]描述了與上述的Komagata等人相同的轉化，但是，另外還包括轉化「monacolin K」(其為Lovastatin)成為「monacolin J)(其為本發明中所述的三醇酸)。認為特別有用的黴菌是Mortierella isabellina，Emericella unguis，Diheterospora chlamydosporia，Humicola fuscoatra，Dichotomomyces cejpii，Neocosmospora africana，Xylogone Sphaerospora，Torulomyces ragena和Thielavia fimeti。
歐洲專利公開EOP486153認為Clonostachys compactiuscula ATCC38009能夠轉化Lovastatin酸成為三醇酸。這種相同的菌株已用美國型培養收集(American Type Culture Collection)作為ATCC74178而再存儲。
通過天然的2(S)-甲基丁醯氧基側鏈的C-甲基化可將Lovastatin轉化成為更活潑的HMG-CoA還原酶抑制劑以便得到Simvastatin。通過適合於分子的官能度的任何已知方法可以完成C-甲基化。
一種用於將2(S)-甲基丁醯氧基側鏈直接進行C-甲基化的方法描述於美國專利4，582，915中。這種方法詳述於圖解Ⅰ和隨之進行的說明中。
圖解Ⅰ
圖解Ⅰ(續)
其中M為鹼金屬鹽，優選鉀鹽;
X為滷素，如氯、溴或碘，優選溴或碘;
M+1為來自鋰、鈉或鉀的陽離子，優選鋰;及R1和R2為下述基團1)獨自地為C1-3烷基，或2)R1和R2與它們連接的氮原子一起形成5元或6元雜環如吡咯烷或哌啶，優選為吡咯烷。
在通過將Lovastatin直接進行甲基化而形成Simvastatin的方法中，該Lovastatin內酯化合物首先被轉化成二羥基羧酸的鹼金屬鹽，優選為鉀鹽。雖然用於製備幹鹽的任何方法會足以滿足需要，但合適的是，將基本上為化學計算量的氫氧化鉀水溶液加入到在含有少量的C1-3鏈烷醇(優選異丙醇、乙醇或甲醇)的烴類溶劑(如苯、甲苯或環己烷)的內酯原料的溶液中，或者，在含有或不含有加入鏈烷醇的四氫呋喃(THF)中，攪拌幾分鐘至約1小時，最後在真空中濃縮至幹。該剩餘物經嚴格乾燥，例如通過與環己烷、甲苯或乾燥的四氫呋喃[優選是非常乾燥(少於0.08mg H2O/ml)的四氫呋喃]的共沸蒸餾而進行的乾燥。
將乾燥的鹼金屬鹽溶於醚溶劑(如四氫呋喃、乙醚、1，2-二甲氧基乙烷)中，冷卻到-80℃至-25℃，並用過量的強鹼性如鹼金屬醯胺處理，其中，所說的鹼金屬為鋰、鈉或鉀(優選鋰)，且所說的醯胺為處於乾燥的惰性環境下的醚溶劑中的二乙基醯胺、吡咯烷、二甲基醯胺或二異丙基醯胺。在-80°到-25℃優選-35°至-30℃下，約2至8小時優選約2小時之後，將滷代甲烷如溴代甲烷、氯代甲烷或碘代甲烷，優選溴代甲烷或碘代甲烷加入到該混合物中，同時保持低溫。如果仍然剩下明顯多的原料量，那麼可重複進行所述的用強鹼和滷代甲烷處理的步驟。0.5至約3小時後，隨之最後加入滷代甲烷，通過向其中加入過量的水將該反應混合物驟冷。
接著進行上述的直接甲基化，為了達到最終產物提純的目的使用NaOH或LiOH試圖將未反應的Lovastatin轉化成為三醇酸或二醇內酯。然而，這種鹼性水解僅使很少百分含量的Lovastatin進行水解。因此，未反應的Lovastatin仍作為最終Simvastatin產物的雜質而存在。此外，鹼性水解也使Simvastatin進行了水解，於是減少了所需的Simvastatin產物的收率。當接著進行水解時，這時使Simvastatin或其鹽形式的開環的酸形式通過加熱或酸催化內酯化作用而轉化成內酯，並通過結晶法進行分離和提純。
本發明涉及使用真菌或細菌以高純度和高收率地從Simvastatin和Lovastatin的混合物中純化和分離Simvastatin的方法，上述的真菌和細菌能夠選擇性水解Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈成為6(R)-[2-8(S)-羥基-2(S)，6(R)-二甲基-1′，2′，6′，7′，8′，8a′(R)-六氫萘基)乙基]-4(R)-羥基-3，4，5，6-四氫-2H-吡喃-2-酮，即三醇酸或相應的二醇內酯。該三醇酸或二醇內酯通過常規方法如結晶法、高壓液相色譜法或其他色譜方法很容易從Simvastatin(或Lovastatin酸)中分離出來。本發明特別是用於在由Lovastatin合成Simvastatin中從Simvastatin中除去未反應的Lovastatin。
本發明的方法可以以它們的內酯形式或其酸形式來分離Simvastatin和Lovastatin的混合物。因為Lovastatin和Simvastatin的酸形式比其內酯形式更能溶於含水系統中，因此使用酸形式是優選的。
一般來說，Lovastatin和Simvastatin將以鹽形式使用。當應用於本發明的該原料、中間產物和最終產物時，除非另有說明，所說的術語「酸」、「開環酸」和「酸形式」同樣也包括它的任何適合的鹽形式。使之有可能具有良好溶解性並且不幹擾在進行特定反應中所經受的其他條件的任何鹽都是容許的。可使用例如，鹼金屬鹽如鋰、鈉和鉀鹽;鹼土金屬鹽如鈣或鎂鹽;或其他金屬的鹽如鋁、鐵、鋅、銅、鎳或鈷鹽;由鹼性胺基酸所形成的胺基酸鹽如精氨酸、賴氨酸、α，β-二氨基丁酸和烏氨酸鹽;胺鹽如叔辛基胺、二苄胺、乙二胺、嗎啉和三(羥甲基)氨基甲烷的鹽;或銨鹽。可使用且優選的是Lovastatin酸的鹼金屬鹽(Li、Na和K鹽)和銨鹽形式。特別優選的是鉀和銨鹽的形式。
為方便起見，對於Lovastatin酸、三醇酸、它的內酯形式和Simvastatin的結構式分別以式1、2、3和4列出如下
1 Lovastatin酸 2 三醇酸
3 二醇內酯 4 Simvastatin其中M3選自如下a)H，b)鹼金屬鹽如Li、Na或K鹽，c)鹼土金屬鹽如Ca或Mg鹽，d)其他金屬鹽如Al、Fe、Zn、Cu、Ni或Co鹽，e)由鹼性胺基酸所形成的胺基酸鹽如精氨酸、賴氨酸、α，β-二氨基丁酸或烏氨酸鹽，f)胺鹽如叔辛基胺、二苄胺、乙二胺、嗎啉或三(羥甲基)氨基甲烷的鹽，和g)銨鹽。
正如已敘述的那樣，由於溶解性的原因，已發現最好使用以其開環或酸形式的Lovastatin和Simvastatin的混合物，並且為了達到這一目的，優選的是Lovastatin的銨、鉀、鈉和鋰鹽形式。
用於本發明方法中的真菌是在Simvastatin存在下可選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈的那些真菌。能夠水解Lovastatin側鏈的真菌種屬有Clonostachys，Emericella，Diheterospora，Humicola，Dichotomonyces，新赤殼屬(Neocosmospora)，帚黴屬(Scopulariopsis)，Xylogone，Torulomyces和Thievela。特別有用的真菌包括Clonostachys compactiuscula，Monascus ruber，Mortierella isabellina，Emericella unguis，Diheterospora chlamydosporia，Humicola fuscoatra，Dechotomomyces cejpii，Neocosmospora africana，Xylogone sphaerospora，Torulomyces ragena，Thielavia fimeti，Aspergillus unguis，卷枝毛微(Mucor circinelloides)，腐皮鐮孢(Fusarium solani)，產黃青黴(Penicillium chrysogenum)，棒麴黴(Aspergillus clavatus)，Scopulariopsis communis，Gilmaniella humicola，Mucor bainieri，Tricharus spiralis和chaetomium cochliodes。特別優選的真菌為Clonostachys Compactiuscula，Humicola fuscoatra，Neocosmospora africana，Scopulariopsis communis和Xylogone sphaerospora。最優選的菌株為Clonostachys compactiuscula(ATCC74178或ATCC38009)。
用於本發明方法中的細菌是在Simvastatin存在下可選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈的那些細菌。
能夠水解Lovastatin側鏈的放線菌類的種屬有鏈黴菌屬(Streptomyces)，遊動單孢菌屬(Planomonospora)和Kibdelosporangium。特別有用的細胞包括白淺灰鏈黴菌(Streptomyces albogriscolus)，寡生孢鏈黴菌(StreptomycesPaucisporogenes)，吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopius)，產綠色鏈黴菌(Streptomyces Viridochromogenes)，排孢遊動單孢菌(Planomonospora Parontospora)和Kibdelosporangium aridum。
用微生物本身，或其突變體，或由其中得到的無細胞提取液，或由無細胞提取液(或是真菌或細菌在其中生長的廢棄的無細胞液體培養基或培養基)提純的水解酶可處理Lovastatin和Simvastatin或其酸的混合物。
術語「突變體」指的是一種有機體，在該有機體中，在其基因組內的某些基因(或它的DNA的調節部位)被修飾，剩下的該基因或多種基因具有擔負著該有機體將Lovastatin酸水解成為三醇酸的功能性的和遺傳性的能力。本發明範圍內的突變體具有與親代菌株的那些突變體基本相同的特徵，並且能夠水解Lovastatin2-甲基丁醯氧基側鏈。
由微生物的培養基或其突變體產生的酶可以各種任何方法與Simvastatin和Lovastatin的混合物接觸，其中所有這些對於本技術領域中的普通技術人員都是顯而易見的。所有這些都是在如本發明定義的術語「處理」所定義的範圍內。例如，可使用全部發酵的液體培養基，並且按照這種方法，可簡單地將Simvastatin和Lovastatin的混合物加到所產生的微生物的發酵培養基中，並回收純的Simvastatin產物。
變化上述全部液體培養基的方法是其中如上所述的產生微生物的發酵培養基的方法中的一種。但是為了誘導水解活性，加入小濃度(0.5至2.5g/L，優選1.0至2.0g/L)的Lovastatin酸。然後，通過離心或過濾來採集細胞體，並且以小片或菌絲塊將其回收，它們可立即使用或被冷凍為以後使用。隨後，可將所說的小片或菌絲塊直接加入到通過甲基化由轉化Lovastatin成為Simvastatin的過程中而產生的Simvastatin和Lovastatin的混合物中。另一種方法是，可部分純化Lovastatin和Simvastatin的混合物，然後，使之與上述的微生物培養基的冷凍小片相接觸。
全部真菌的細胞都是活著的是不必要的，同樣可能的是使用死細胞，例如已被丙酮乾燥的那些細胞。
可能的是，使用由那些全部細胞培養基得到的粗均漿作為全部細胞的替換物，從粗均漿分離水解酶本身和使用基本上純化的水解酶也是可能的。
當微生物分泌水解酶而進入發酵/培養基中時，使用分離的酶是可能的。
使水解酶與Simvastatin和Lovastatin原料的混合物相接觸的方法可分批進行，或者可以連續的方法進行。可以各種方法改變這些反應物本身相接觸的方式，以保持工藝技術的進步性。因此，對於水解酶而言，可使用固相酶柱，使Simvastatin和Lovastatin的混合物通過該固相酶柱。這種工藝技術的另一實例是涉及膜式反應器。反應物相接觸的優選方法是通過上述的固相酶柱的方法或使用純化的酶製劑。
下面進一步陳述的操作實施例描述了通常所使用的方法，以便證明，在Simvastatin存在下，將汙染的Lovastatin進行酶水解成為三醇酸，以達到高純度的Simvastatin的程度。然而，對於工業生產來說，不必建議使用這些操作實施例中的一些方法。
本發明所使用的從Simvastatin和Lovastatin的混合物中分離和提純Simvastatin的方法示於圖解Ⅱ中。
將Simvastatin和Lovastatin內酯的混合物轉化成相應的開環酸的混合物，其方法最好是用在含有少量的C1-3鏈烷醇(優選異丙醇、乙醇或甲醇)的烴類溶劑(如苯、甲苯或環己烷)中的基本上為化學計算量的鹼金屬氫氧化物(如氫氧化鉀或氫氧化鈉)的水溶液處理，同時攪拌幾分鐘至約1小時。然後，萃取該底物進入含水介質中，該含水介質為例如如下緩衝劑TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、甘氨酸、TES(N-三[羥甲基)甲基氨基]-2-羥基-丙磺酸)、磷酸鈉、MOPSO(3-[N-嗎啉代]-2-羥基丙磺酸)、BIS-TRIS PROPANE(1，3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N，N-二[2-羥乙基]-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-[N-嗎啉代]丙磺酸)、HEPES(N-[2-羥乙基]-哌嗪-N′-[2-乙磺酸])、DIPSO(3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羥甲基)甲基氨基]-2-羥基丙磺酸)、HEPPSO(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-羥基丙磺酸])、POPSO(哌嗪-N，N′-二[2-羥基丙磺酸])、EPPS(N-[2-羥乙基]-哌嗪-N′-[3-丙磺酸])、TEA(N-三[羥甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)、TRICINE(N-三[羥甲基]-甲基甘氨酸)、BICINE(N，N-二[2-羥乙基]甘氨酸)、TAPS(N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸)、AMPSO(3-[(1，1-二甲基-2-羥乙基)胺]-2-羥基丙磺酸)或CHES(2-[N-環己基氨基]-2-羥基丙磺酸)緩衝劑，PH7-10，25mM至1M，蒸餾水或上面補充列出的含有多達20%(Vol./Vol.)的水混溶的溶劑(如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或四氫呋喃)的一種含水介質。優選的是TRIS、甘氨酸、TES和磷酸鈉緩衝劑，PH7.5-9.5，25mM至75mM(含12%甲醇)。然後，溶解的或懸浮的底物用微生物或其突變體或從其中得到的無細胞提取液或由微生物得到的水解酶來處理，或者將該底物轉化成為銨鹽，並用微生物或其突變體或從其中得到的無細胞提取液或從其中得到的水解酶來處理。在加入選擇的微生物或其可接受的突變體或從其中得到的無細胞提取液或水解酶之前或與其同時加入含水體系。
採用酸催化或加熱催化方法進行內酯化反應，例如，採用在室溫下在含有7mM甲磺酸的乙酸異丙酯(IPAC)中攪拌2小時的方法進行內酯化反應。生成的Simvastatin內酯和二醇內酯可用高壓液相色譜(HPLC)或結晶法分離，得到基本純的Simvastatin。
使用含有0.01-1.0%磷酸或三氟乙酸或其它合適酸的含水組分和包括乙腈、甲醇和乙醇的合適的有機組分的有機-含水混合物作為流動相進行反相HPLC。
Simvastatin也可從三醇酸/二醇內酯中分離出來，並通過從乙酸乙酯、乙酸異丙酯和甲醇中結晶而提純。
圖解Ⅱ
圖解Ⅱ(續)
也可將Lovastatin酸進行酶催化水解成三醇酸的反應用於通過直接甲基化Lovastatin來製備Simvastatin的方法中。這個全過程示於圖解Ⅲ中。
在通過直接甲基化Lovastatin以生成Simvastatin的方法中，先將Lovastatin內酯化合物轉化成鹼金屬鹽，優選二羥基羧酸的鉀鹽。雖然製備幹鹽的任何可能的方法都可以使用，但是方便的方法是，將基本化學計算量的氫氧化鈉水溶液加入到內酯原料的烴溶劑如苯、甲苯或環己烷的溶液中，該溶液含有少量的C1-3鏈烷醇，優選異丙醇、乙醇或甲醇，或另一種方法是使用含有或不含有加入的鏈烷醇的四氫呋喃(THF)，並攪拌幾分鐘至約1小時，最後真空濃縮至幹。例如通過與環己烷、甲苯或乾燥的四氫呋喃，優選是極幹的(少於0.08mg H2O/mL)四氫呋喃共沸蒸餾使剩餘物嚴格除水。
將幹鹼金屬鹽溶於醚溶劑如四氫呋喃、乙醚、1，2-二甲氧基乙烷等中，冷卻至約-80℃至-25℃，優選-35℃至-30℃，然後在乾燥隋性環境中在醚溶劑中用過量的強鹼如鹼金屬醯胺處理，其中鹼金屬是鋰、鈉或鉀，優選鋰，醯胺是二乙基醯胺、吡咯烷、二甲基醯胺或二異丙基醯胺。在-80℃至-25℃，優選-35℃至-30℃下約2至8小時，優選約2小時後，將滷代甲烷，例如溴代甲烷、氯代甲烷或碘代甲烷，優選溴代甲烷或碘代甲烷加入到混合物中，同時保持低溫。如果剩下相當大量的原料，可重複進行所述的用強鹼和滷代甲烷處理的步驟。0.5至約3小時後接著最後加入滷代甲烷，通過加入過量水使反應混合物驟冷。
圖解Ⅲ
圖解Ⅲ(續)
然後，優選的是，用在乙酸乙酯中的氫氧化銨-甲醇將Lovastatin酸鹽和Simvastatin酸鹽的混合物轉化成相應的銨鹽，接著分離銨鹽(優選用結晶法)並再懸浮於含水介質中，用選擇的微生物，或其突變體或由其衍生的水解酶處理。
另一種方法是，將水解酶直接加入到Lovastatin鹽和Simvastatin鹽的混合物中，然後用蒸餾法除去殘留的有機物。
通過合適的方法，例如加熱催化或酸催化內酯化可以將得到的Simvastatin酸和三醇酸的混合物轉化成相應的內酯的混合物。用HPLC或結晶法可將Simvastatin從得到的Simvastatin和二醇內酯的混合物中分離出來。另外，可通過HPLC或結晶法將Simvastatin酸從三醇酸中分離出來，接著將純的Simvastatin酸轉化成Simvastatin內酯。如果用結晶法將Simvastatin酸分離和提純，優選的是在內酯化之前將Simvastatin酸轉化成銨鹽。
本發明也涉及能夠將Lovastatin酸轉化成三醇酸的微生物培養基的特殊菌株的突變體Clonostachys Compactiuscula(ATCC38009和ATCC74178)，Monascus ruber(FERM-P.No.4822)，Mortierella isabellina(IFO7844，ATCC42613，ATCC36670，ATCC38063，或ATCC44853)，Emericella unguis(IFO8087，ATCC10073，ATCC12063，ATCC13431，或ATCC16812)，Diheterospora chlamydosporia(IFO9249，ATCC16449，ATCC18956，ATCC20537)，Humicola fuscoatra(IFO9530，ATCC12774，ATCC52073，ATCC62175)，Dechotomomyces cejpii(IFO9929，ATCC22149，ATCC42284)，Neocosmospora africana(IFO7590，ATCC24342)，Xylogone sphaerospora(IFO9516，ATCC42027)，Torulomyces ragena(IFO30008)，Thielavia fimeti(IFO30419)，Aspergillus unguis(MF1416)，卷枝毛黴(Mucor circinelloides)(ATCC1207a)，腐皮鐮孢(Fusarium solani)(ATCC12826)，產黃青黴(Penicillium chrysogenum)(ATCC10002)，棒麴黴(Aspergillus Clavatus)(ATCC1007)，Scopulariopsis communis(MF3769)，Gilmaniella humicola(ATCC16013)，Mucor bainieri(ATCC42642)，Tricharus spiralis(MF5295)，Chaetomium cochliodes(ATCC10195)，白淺灰鏈黴菌(Streptomyces albogriscolus)(NRRL5748)，寡生孢鏈黴菌(Streptomyces Paucisporogenes)(ATCC25482)，吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopius)(ATCC21722)，產綠色鏈黴菌(Streptomyces Viridochromogenes)(ATCC21724)，排孢遊動單孢菌(Planomonospora Parontospora)(ATCC23864)，和Kibdelosporangium aridum(NRRL12647)。在發酵技術中有一些公知的方法可提高用微生物的各種菌株產生的所需產物的產率。例如，將得到的產生的菌株進行照射或曝露於已知的其他刺激源之下以大大地增加微生物的原生物的正在進行的突變。然後通過使用一種敏感篩，可能的是，從僅這樣產生的許多突變體中選擇可增加所需產物產量的那些突變體。用這種方法，通常可能的是，通過其各種選擇的派生物不斷地改善產生的菌株的產量。突變體的生物純的培養物是基本上包括突變體的一種菌株的培養物。對於本發明，通過選擇真菌或放線菌類的突變體可以實現對於Lovastatin酸水解酶的產量的類似改善。對此目的來說，令人滿意的篩是使用高效液相色譜(HPLC)，其可測定在非常低濃度下的酶催化分裂產物，這樣清楚地確定了Lovastatin通過上述任何特殊突變體已轉化成三醇酸。
培養基微生物的發酵是在水介質例如用於製備其他發酵產物的那些水介質中進行，這種水介質含有可被微生物吸收的碳、氮的來源和無機鹽。
通常，碳水化合物例如糖如乳糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、木糖、甘露糖醇等，和澱粉如酒糟象燕麥、黑麥、玉米澱粉、小米或玉米面等可以單獨或混合用作培養基中可吸收的碳的來源。培養基中所用的碳水化合物的來源或多種來源的準確量部分取決於培養基中的其他組分，但是，通常，碳水化合物的量一般在培養基重量的約1%和6%之間變化。這些碳來源可以單獨地使用，或幾種這樣的碳來源在培養基中混合使用。通常許多蛋白質物質可用作發酵過程中的氮來源。合適的氮來源包括，例如酵母水解產物、原生酵母、大豆粉、棉子粉、酪蛋白的水解產物、玉米漿、酒糟或番茄糊等。氮來源可以單獨或以混合形式使用，其量範圍為水介質重量的約0.2%至6%。
能產生鈉、鉀、銨、鈣、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根等離子的普通鹽是在可被加入到培養基中的營養物的無機鹽之中，也包括痕量金屬如鈷、錳、鐵和鎂鹽。另外，如果需要，可加入消泡劑如聚乙二醇或聚矽氧烷，尤其是如果培養基過多地起泡時。
應注意的是，實施例中所述的培養基僅是舉例說明可使用的各種各樣的培養基，而不是對於培養基的限定。具體地說，用於培養基中的碳來源包括葡萄糖、糊精、燕麥粉、燕麥麵、糖漿、檸檬酸鹽、大豆油、甘油、麥芽膏、鱈魚肝油、澱粉、乙醇、天花果、抗壞血酸鈉和豬油。氮來源包括腖化牛奶、自溶酵母、酵母RNA、番茄糊、酪蛋白、原生酵母、花生面、酒糟、玉米漿、大豆粉、玉米粉、NZ胺、豆提取液、天冬醯胺、棉子粉和硫酸銨。主要的離子組分是CaCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和NaCl，也存在少量的CoCl2·6H2O和痕量的Fe、Mn、Mo、B、Co和Cu。
內酯化作用根據本發明的方法，用可水解Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈的微生物培養基、或其突變體、或由其得到的無細胞提取液、或由其得到的水解酶處理Simvastatin酸和Lovastatin酸的混合物，得到容易分離的Simvastatin酸和三醇酸的混合物。如果需要Simvastatin的內酯形式，則可將產物混合物內酯化並分離，然後二醇內酯與Simvastatin內酯分離。另一種方法是，Simvastatin酸可與三醇酸分離，接著將Simvastatin酸內酯化成Simvastatin。三醇酸的內酯反應是用標準方法，即加熱或酸催化內酯化方法來進行。用於Lovastatin酸的有關化合物的酸催化內酯化的方法是已知的，並敘述於美國專利4，916，239中。對於Simvastatin酸和三醇酸，內酯化反應通過在室溫下在含7mM甲磺酸的乙酸異丙酯中攪拌2小時來進行。
實施例1通過Clonostachys Compactiuscula的全細胞將Lovastatin酸生物轉化成三醇酸在具有1.8L操作體積的2L空氣升液發酵罐中，在29℃和1.25vvm的充氣速率下使Clonostachys Compactiuscula ATCC38009在培養基EN(葡萄糖1%;腖0.2%;牛油提取液0.1%;酵母提取液0.1%和玉米漿0.3%)中生長48-72小時。加入Lovastatin銨鹽(0.5g/L最終濃度)，以降低水解活性。加入Lovastatin銨鹽後24-72小時，通過篩子過濾得到發酵物，並用緩衝劑(20mM Tris，PH8.5)洗滌該小片，冷凍細胞小片直到容易使用為止。
為了生物轉化，在由Aspergillus terreus發酵得到的碳酸鹽緩衝劑中由空氣升液發酵得到的Clonostachys Compactiuscula小片(17g溼重)與20mL粗Lovastatin酸(Cd 20g/L)接觸，在250mL Erlenmeyer燒瓶中在27℃和160rpm下進行生物轉化，17小時後，約60%的Lovastatin酸轉化成三醇酸。
在另一試驗中，由空氣升液發酵得到的Clonostachys Compactiuscula小片(5g溼重)與通過甲醇從Aspergillus terreus發酵提取的10mL粗Lovastatin酸(3.5g/L)接觸。在生物轉化混合物中甲醇的最終濃度為25%。生物反應在250mL Erlenmeyer燒瓶中在27℃和160rpm下進行，2小時後，通過薄層色譜測定，使用Clonostachys Compactiuscula的生物轉化反應使近100%的Lovastatin酸轉化成三醇酸。
實施例2用Clonostachys Compactiuscula的粗均漿使Lovastatin酸生物轉化成三醇酸在含有12mL培養基EN的250mL搖燒瓶中在29℃下使Clonostachys Compactiuscula ATCC38009生長3天，加入Lovastatin銨鹽以得到濃度為2.5g/L，並使發酵另外繼續進行2天。為了製備粗均漿，通過在3000rpm下離心分離10分鐘得到培養基，然後用50mM PH值為7.7的N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)緩衝劑洗滌。將培養基再次離心分離，並在冰上冷凍細胞塊，然後用裝有玻璃碎片和粉末乾冰的研缽和研杵來研磨，將相當於1搖燒瓶量的研磨的均漿再懸浮於2.0mL50mM TES緩衝劑中，並在6000rpm下離心分離10分鐘以除去細胞碎片和玻璃碎片。上層清液用作含有蛋白質濃度為約0.5mg/mL的粗均漿。
為了進行生物轉化，1體積的粗均漿與等體積的Lovastatin酸銨鹽(5g/L)混合，將混合物在29℃下保溫培養。使用該方法，在2小時內觀察到80-90%的Lovastatin酸轉化成三醇酸。
實施例3從Clonostachys Compactiuscula細胞提純Lovastatin水解酶使用下述方法將使Lovastatin酸生物轉化成三醇酸的水解酶提純，該提純方法是使用MONO Q
陰離子交換柱的快速蛋白質液相色譜(FPLC
)，使Clonostachys Compactiuscula均漿接近均一性。
如上述實施例2所述，但其中用50mM三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩衝劑(pH7.8)代替50mM TES緩衝劑，通過6000rpm離心分離得到的上層清液在15，000rpm下離心分離20分鐘，得到的上層清液通過0.45mm過濾器過濾。然後將含有0.3-0.5mg/mL蛋白質的濾液分批地(10mL)以1.0-2.0mL/分的速率加入到與Pharmacia快速蛋白質液相色譜(FPLC)系統連接的Pharmacia MONO Q
(HR5/5)陰離子交換柱中。
使陰離子蛋白質結合到柱間質上後，用在20mM TRIS中的PH值為7.8的氯化鈉(0-500mM)的線性梯度逐一地洗脫水解酶。以1mL部分的量收集洗脫的蛋白質，並用Lovastatin銨鹽[在這種情況下水解百分數用TLC(薄層色譜)和光密度分析法或HPLC測定]或比色底物(鄰硝基苯基丁酸鹽，O-NPB)來測定，達到酶已顯示出具有水解活性。當使用比色底物時，水解反應是用在410nm下用分光光度分析法測定，該方法主要敘述於Lawrence，R.C.等人的J.Gen.Microbiol.(1967)48，401-418中。這兩種測定方法都顯示出當NaCl濃度接近300mM時水解酶被洗脫。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺(SDS)凝膠電泳現象顯示出含Lovastatin酸水解酶的部分的峰含有分子量約45000Da的顯著光帶。
使用提純酶的製備方法，生物轉化反應是按照實施例1、2、4和6中所述的方法進行，並且測定是用Lovastatin銨鹽作為底物由水解酶的Km和比活性構成。得到的Km值為4.14mM，在飽和底物條件下，發現所說的酶具有比活性為0.04mmol水解的Lovastatin銨鹽/mg蛋白質/分。
實施例4通過由Clonostachys Compactiuscula得到的純化的水解酶將Lovastatin酸生物轉化成三醇酸使用下述方法，通過使用MONO Q
陰離子交換柱的快速蛋白質液相色譜法(FPLC
)將使Lovastatin酸轉化成三醇酸的水解酶提純，使之Clonostachys Compactiuscula均漿接近均一性。
如上實施例2所述，但其中用20mM三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩衝劑代替50mM TES緩衝劑，將來自6000rpm離心分離得到上層清液，在15000rpm下離心分離，得到的上層清液通過0.45mm過濾器過濾。然後將含有0.3-0.5mg/mL蛋白質的濾液分批地(10mL)加入到與Pharmacia快速蛋白質液相色譜(FPLC)系統連接的Pharmacia MONO Q
陰離子交換柱中。
使陰離子蛋白質結合到柱間質上後，使用線性梯度的氯化鈉(0-500mM)逐一地洗脫水解酶。以1mL部分的量收集洗脫的蛋白質，並用Lovastatin銨鹽(在這種情況下水解百分數用TLC和光密度分析法或HPLC測定)或比色底物(鄰硝基苯基丁酸鹽，O-NPB)來測定，達到酶已顯示出具有水解活性。當使用比色底物時，水解反應是在410nm下用分光光度分析法測定，該方法主要敘述於Lawrence，R.C.等人的J.Gen.Microbiol.(1967)48，401-418中。這兩種測定方法都顯示出當NaCl濃度接近300mM時水解酶被洗脫。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺(SDS)凝膠電泳現象顯示出含Lovastatin酸水解酶的部分峰含有分子量約45000Da的顯著光帶。
使用純化酶的製備方法，生物轉化是按照上述實施例1和2所述的方法進行，並且測定是用Lovastatin銨鹽作為底物由水解酶的Km和比活性構成。得到的Km值為4.14mM，在飽和底物條件下，發現所說的酶具有比活性為110μmol Lovastatin銨鹽/mg蛋白質/小時。
實施例5在過量Simvastatin銨鹽的存在下Lovastatin銨鹽的生物轉化將45g在實施例2中所述的培養基EN中生長的(冷凍前用50mM PH為7.8的Tris緩衝劑洗滌)冷凍的ClonostachysCompactiuscula(ATCC38009)細胞用含玻璃碎片和乾冰的研缽和研杵均化。將得到的均化的冷凍的粉末移到合適的管中，並用最少量的50mM Tris(PH7.8)洗滌研缽中剩餘的物質而將其加入到相同的管中。然後將混合物熔化、並在6000rpm下離心分離10分鐘以除去大的細胞碎片和玻璃碎片。
將在6000rpm下得到的上層清液用作水解酶的粗來源，並將0.8mL的該上層清液與0.2mL甲醇和1.0mL溶液[在50mM Tris中的18.6mM Simvastatin和Lovastatin(1.4mM)銨鹽，PH7.8]混合。反應混合物在29℃下保溫培養，在1小時、2小時和17小時後通過取出0.1mL而取樣，並用0.9mL甲醇稀釋，然後通過使用Whatman C-8柱作為穩定相和60∶40的乙腈∶0.5%磷酸的混合物作為流動相的HPLC分析樣品;在這些條件下，Simvastatin、Lovastatin和三醇銨鹽的相應的保留時間分別為4.4分、3.8分和2.5分。17小時後，Lovastatin峰的面積百分數由23.2%降至0.7%，這表明轉化率大於99%，在此相同接觸期間內，大於96%的初始Simvastatin銨鹽保持不變。
實施例6按照直接甲基化由Lovastatin酸合成Simvastatin酸的方法將剩餘的Lovastatin酸生物轉化成三醇酸步驟1製備Lovastatin鉀鹽在氮氣中製備在325mL四氫呋喃(THF)中的Lovastatin溶液(99%純度;25g;60.57mmol)，然後冷卻至5℃。在15分鐘內加入10.01M氫氧化鉀的水溶液(6.1mL)，然後升溫至25℃並攪拌老化，直到完全(＞99%)轉化成鉀鹽(用HPLC分析)。
步驟2製備Simvastatin鉀鹽將步驟1製備的Lovastatin鉀鹽溶液加熱至回流，通過10英寸Vigreaux柱蒸餾總的500-700mL THF，同時將THF進行篩乾燥以保持最小罐體積為215mL。於是Lovastatin鉀鹽溶液中的水量減少至＜0.1mg/mL。然後用150mL經篩乾燥的THF(水含量＜0.1mg水/mL)稀釋該溶液，得到的總體積為365mL。將經篩乾燥的吡咯烷(5.81g;81.7mmol;水含量＜0.2mg/mL)作為一批加入，反應物在乾冰/丙酮浴中冷卻至-78℃。然後，在1小時內在液面以下加入在己烷中的117mL的1.6M正丁基鋰，同時保持快速攪拌和內溫低於-70℃。
將當時含有吡咯烷鋰中間體的Lovastatin鉀鹽溶液用乾冰-乙腈浴升溫至-35℃並老化2小時，冷卻至-45℃後，將13.32g經篩乾燥的碘代甲烷(93.0mmol;密度2.89g/mL)一批加入，混合物在-30℃(加入碘代甲烷後的內溫)下老化30分鐘。用200ml水驟冷混合物，並在分液漏鬥中進行相分離，通過再加入水將低層的水層稀釋至體積1250mL，然後冷卻至低於10℃。用6M鹽酸將PH調節至6，然後加入250mL乙酸乙酯，將PH進一步調節到2.0(再用HCl)。再進行相分離，然後用175mL冷(5-10℃)乙酸乙酯再萃取水層。將兩部分有機(乙酸乙酯)層合併，並用150mL水洗滌，然後用硫酸鈉乾燥最終的有機層(至＜10mg/mL水)並過濾。然後，在25℃下將112.3mL甲醇加入到(425mL)乾燥的過濾的混合物中，然後在5分鐘內加入1.3mL甲醇∶氫氧化銨水溶液(3∶1)。用Simvastatin銨鹽(SAS)接種混合物並老化10分鐘，然後在1小時內再滴加35.9mL甲醇∶氫氧化銨水溶液(3∶1)，然後在2.5小時內將混合物冷卻至-10℃，再老化1小時。過濾產物並用25mL冷(0℃)甲醇洗滌，真空乾燥得到的白色晶體，得到白色針狀的Simvastatin銨鹽(含有作為銨鹽的10%剩餘的Lovastatin的87%純度的SAS)。
步驟3將剩餘的Lovastatin酸(作為銨鹽)生物轉化成三醇酸使用實施例1和3中所述的方法，將Clonostachys Compactiuscula酯酶提純除去已在培養基EN中生長的57g菌絲體細胞。使用Pharmacia HR10/10 MONO Q 柱，可使每次提純試驗應用85mL粗無細胞提取液。得到總量為0.89mg提純的酯酶(在10mL體積中)，然後通過使用10000分子量斷流CENTRIPREP 裝置(AMICON )的超濾方法濃縮至0.175mg蛋白質/mL。
然後用通過直接甲基化Lovastatin製得的Simvastatin銨鹽保溫培養酯酶樣品。蛋白質的最終濃度為0.4、4.0和40mg/mL，所用的Simvastatin濃度為10、35和50mM。被改變的其他條件是PH值(確定為7.8和9.5)和甲醇濃度(0、10和20%[V/V，最終濃度])。通過夾雜物100mM TRIS(在PH7.8下進行反應的情況下)或100mM甘氨酸(PH9.0)將反應緩衝。在下列條件下在16小時內得到大於90%的剩餘的Lovastatin酸水解成三醇酸
酶濃度 Simvastatin濃度 PH 甲醇濃度(mg/ml) (mM) (%v/v)4.0 10 7.8 04.0 10 7.8 104.0 10 9.5 04.0 10 9.5 104.0 10 9.5 204.0 35 9.5 1040.0 35 7.8 040.0 35 7.8 1040.0 35 9.5 040.0 35 9.5 1040.0 35 9.5 20實施例7通過直接甲基化按照從Lovastatin酸合成Simvastatin酸的方法將剩餘的Lovastatin酸生物轉化成三醇酸步驟1製備Simvastatin銨鹽按照實施例6中步驟1的方法開始製備在THF中的5g Lovastatin的鉀鹽溶液。在乾冰/乙腈浴中將經篩乾燥的吡咯烷(2.48mL;2.4當量;29.67mmol;＜0.2mg水/ml)，的12.3mL經篩乾燥的THF溶液冷卻至-20℃，然後以保持溫度低於-10℃的這樣的速率加入1.6M丁基鋰的己烷(18.2mL;2.35當量)溶液，加完該溶液後，吡咯烷鋰/THF溶液在-20℃下老化15分鐘。在乾冰/乙腈冷浴中，將在THF中的Lovastatin鉀鹽的乾燥溶液冷卻至-35℃，將在-20℃下的吡咯烷鋰/THF溶液以這樣的速率加入到快速攪拌的混合物中，以保持在整個加入過程中的內溫低於-30℃。然後混合物在-35℃下老化2小時，接著冷卻至-40℃，將1.16mL(18.67mmol;1.5當量)碘代甲烷按一批加入到該溶液中，這樣引起混合物的內溫升高(至約-20℃)。將內溫降低回至-30℃並老化1小時，然後升溫至-10℃並老化30分鐘。
用40mL水將混合物驟冷並在分液漏鬥中進行相分離，通過再加入水將低部的水層稀釋至250mL體積，然後冷卻至低於10℃。用6M鹽酸水溶液調節PH值至6，然後加入50mL乙酸乙酯，並將PH值進一步調節至2.0(再用HCl)。再進行相分離，然後用35mL冷(5-10℃)乙酸乙酯再萃取水層，合併兩部分有機(乙酸乙酯)層，然後用30mL水洗滌，之後，用硫酸鈉乾燥最終有機層並過濾。接著，將22.5mL甲醇加入到25℃下的乾燥的過濾的混合物中，然後在5分鐘內加入0.26mL甲醇∶氫氧化銨水溶液(3∶1)。用Simvastatin銨鹽接種混合物並老化10分鐘，然後在1小時內再逐滴加入7.2mL甲醇/氫氧化銨，在2.5小時內將混合物冷卻至-10℃，並再老化1小時。過濾產物並用5mL冷(0℃)甲醇洗滌，真空乾燥得到的白色晶體，以便得到Simvastatin銨鹽。
步驟2將剩餘的Lovastatin酸(作為銨鹽)生物轉化成三醇酸按照實施例6中步驟3的方法進行生物轉化。
實施例8Simvastatin銨鹽的內酯化以及純Simvastatin內酯的結晶和分離步驟1Simvastatin銨鹽的內酯化在氮氣氛下將蒸餾水(20mL)、冰醋酸(40mL)和丁基化羥基苯甲醚(BHA，50mg)加入到250mL3頸園底燒瓶中，該批物料溫度調節至20-25℃，加入Simvastatin銨鹽(12.5g，27.56mmol)，並在20-25℃下攪拌15分鐘，或直到溶解為止。加入甲磺酸(70%，4.35g，30.8mmol，1.118當量)，混合物在20-25℃下老化2小時，直到內酯化反應完成多於75%為止。
按照製備例A中的條件用HPLC測定轉化率。該轉化度計算如下(面積%(Simvastatin銨鹽))/(面積%(Simvastatin銨鹽+Simvastatin)) ×100%步驟2純Simvastatin的結晶和分離用粗Simvastatin晶種(60mg)將該批物料接種，並在20-25℃下老化0.5小時。在3小時內加入蒸餾水(22.5mL)(0.13mL/分)，然後加入第二批蒸餾水[在1小時內加入35mL(0.58mL/分)]。將該批物料在20-25℃下老化1小時，然後用28W/W%氫氧化銨(4.0mL)逐滴加入來處理。
該批物料在20-25℃下老化1小時，並過濾收集Simvastatin粗晶體，用2∶1的蒸餾水和乙酸乙酯(50mL)、蒸餾水(50mL)和1∶1的甲醇和蒸餾水(50mL)洗滌Simvastatin粗溼濾瓶。在25-30℃下用氮氣吹掃並真空乾燥該產物一整夜，得到Simvastatin的粗白色針狀物(10.38g，HPLC測定，98W/W%)。
實施例9純Simvastatin的結晶和分離在氮氣氛下，將粗Simvastatin(10g，23.89mmol)和丁基化羥基苯甲醚(50mg)加入到含有126.4mL脫氣甲醇的燒瓶中，將該批物料溫度調節至20-25℃，並攪拌15分鐘直到固體溶解。該溶液通過活性炭的ECOSORB C
床層過濾，該床層的組成為水、活性炭、纖維素纖維、苯乙烯二乙烯苯和陰離子交換樹脂[91.5g甲醇(50mL)洗滌的ECOSORB C
]。並且該炭餅用40mL脫氣甲醇洗滌。將合併的甲醇溶液移到250mL 3頸園底燒瓶中並在氮氣氛下加熱至38-40℃。在30分鐘內在液面以下加入脫氣蒸餾水(83.3mL)(2.78mL/分)，並在38-40℃下老化30分鐘。經1小時將該批物料冷卻至25℃，在1小時內於25℃在液面以下加入脫氣蒸餾水(83.3mL)(1.38mL/分)，並經1小時將其冷卻至10-15℃。
將該漿液過濾，在10℃下用50mL50%甲醇/蒸餾水(V/V)洗滌溼濾餅。在35-40℃下用氮氣吹掃並真空乾燥該產物一整夜，得到純Simvastatin白色針狀物(9.49g，HPLC測定＝99W/W%)。
實施例10篩選用於Lovastatin酯酶活性的真菌微生物列於下表Ⅰ中的菌株在10mL培養基EN中生長48至72小時，然後將Lovastatin(對於該篩選敘述在第2欄中)或Simvastatin(對於該篩選敘述在第3欄中)以它們的銨鹽形式加入到燒瓶中至最終濃度為2.5g/L。在用薄層色譜分析用於Lovastatin或Simvastatin轉化成三醇酸的流體培養基之前，將該培養基再保溫培養96小時。通過TLC板的密度掃描將水解程度定量，並與使用標準濃度的Lovastatin銨鹽、Simvastatin銨鹽和三醇酸銨鹽的純樣品的平行試驗對比。

實施例11篩選用於Lovastatin酯酶活性的放線菌類將列於下表Ⅱ的菌株在10mL YN流體培養基(1%肉膏、0.5%酵母提取物、0.5%葡萄糖、0.6%腖，PH7.2)或10mL ISP-1培養基中生長72小時，然後將lovastatin(對於該篩選敘述在第2欄中)或simvastatin(對於該篩選敘述在第3欄中)以它們的銨鹽形式加入到燒瓶中至最終濃度為2.5g/L。在用薄層色譜法分析用於lovastatin或simvastatin轉化成三醇酸的流體培養基之前，將該培養基再保溫培養96小時。通過TLC板的密度掃描將水解程度定量。
權利要求
1.一種從式(4)化合物與雜質式(1)化合物的混合物中分離式(4)化合物的方法，
該方法包括用能夠選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈的微生物的培養基，或用由該微生物的培養基得到的水解酶處理所說化合物的混合物，以便轉化式(1)化合物成為式(2)化合物，
(2)三醇酸/鹽並且分離和離析以開環酸、鹽或酯形式的式(4)和式(2)化合物，其中M3和M4獨自地為(a)H，(b)Li、Na或K，(c)Ca或Mg，(d)Al、Fe、Zn、Cu、Ni或Co，(e)精氨酸、賴氨酸、α，β-二氨基丁酸或烏氨酸，(f)叔辛基胺、二苄胺、乙二胺、嗎啉或三(羥甲基)氨基甲烷，或(g)NH4。
2.根據權利要求1的方法，其中微生物培養基是真菌培養基。
3.根據權利要求2的方法，其中所說的真菌選自下述種屬(a)Clonostachys，(b)Emericella，(c)Diheterospora，(d)Humicola，(e)Dichotomonyces，(f)新赤殼屬(Neocosmospora)，(g)帚黴屬(Scopulariopsis)，(h)Xylogone，(i)Torulomyces，和(j)稜孢殼屬(Thievela)。
4.根據權利要求3的方法，其中所說的真菌為(a)Clonostachys compactiuscula，(b)Monascus ruber，(c)Mortierella isabellina，(d)Emericella unguis，(e)Diheterospora chlamydosporia，(f)Humicola fuscoatra，(g)Dechotomomyces cejpii，(h)Neocosmospora africana，(i)Xylogone sphaerospora，(j)Torulomyces ragena，(k)Thielavia fimeti，(l)Aspergillus unguis，(m)卷枝毛微(Mucor circinelloides)，(n)腐皮鐮孢(Fusarium solani)，(o)產黃青黴(Penicillium chrysogenum)，(p)棒麴黴(Aspergillus clavatus)，(q)Scopulariopsis communis，(r)Gilmaniella humicola，(s)Mucor bainieri，(t)tricharus spiralis，或(u)Chaetomium cochliodes。
5.根據權利要求4的方法，其中所說的真菌為(a)Clonostachys compactiuscula，(b)Humicola fuscoatra，(c)Neocosmospora africana，(d)Xylogone sphaerospora，或(e)Scopulariopsis communis。
6.根據權利要求5的方法，其中所說的真菌為Clonostachys compactiuscula(ATCC74178或38009)或其突變體。
7.根據權利要求4的方法，其中所說的混合物用從其中的培養基得到的純化形式的水解酶來處理。
8.根據權利要求1的方法，其中所說的微生物培養基是細菌培養基。
9.根據權利要求8的方法，基中所說的細菌為放線菌類。
10.根據權利要求9的方法，其中所說的放線菌類選自下述種屬(a)鏈黴菌屬(Streptomyces)，(b)遊動單孢菌屬(Planomonospora)，和(c)Kibdelosporangium。
11.根據權利要求10的方法，其中所說的放線菌類選自如下(a)白淺灰鏈黴菌(Streptomyces albogriscolus)，(b)寡生孢鏈黴菌(Streptomyces paucisporogenes)，(c)吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopius)，(d)產綠色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)，(e)排孢遊動單孢菌(Planomonospora parontospora)，和(f)Kibdelosporangium aridum。
12.根據權利要求1的方法，其中所說的式(4)化合物與雜質式(1)化合物的混合物是通過式(1)化合物的直接甲基化而產生的，而且其中的式(4)化合物通過高壓液相色譜(HPLC)或結晶法來分離並將其回收。
13.根據權利要求12的方法，其中式(1)化合物或其鹽的直接甲基化包括用式CH3X和M+1NR1R2-來處理，其中X為a)氯，b)溴，或c)碘;M+1為a)Li+，b)Na+，或c)K+;和R1和R2為a)獨自地為C1-3烷基，或b)R1和R2一起相連並與它們連接的氮原子形成5元或6元雜環如吡咯烷或哌啶。
14.根據權利要求13的方法，其中X是碘，R1R2一起相連並與它們連接的氮原子形成吡咯烷，且M3和M4為NH4或K。
15.根據權利要求12的方法，其中式(4)產物用結晶法離析和分離。
16.根據權利要求12的方法，其中所說的產物用HPLC來分離。
17.根據權利要求1的方法，其中式(2)和式(4)化合物的分離和離析包括(a)用乙酸異丙酯和甲磺酸處理，以形成式(3)和式(5)的內酯，和(b)通過HPLC或結晶法來分離和提純式(3)和式(5)的內酯，以及(c)以式(3)和式(5)的閉環內酯形式來回收所說的產物。
18.一種以其回收的量製備式(5)化合物或其鹽的方法，
(5)Simvastatin該方法包括，通過將式(6)的內酯轉化成開環酸而直接甲基化式(6)化合物，
(6)Lovastatin接著用式CH3X和M+1NR1R2-處理，其中X為(a)氯，(b)溴，或(c)碘;M+1為(a)Li+，(b)Na+，或(c)K+;和R1和R2為(a)獨自地為C1-3烷基，或(b)R1和R2一起相連並與它們連接的氮原子形成5元或6元雜環如吡咯烷或哌啶;隨後用能夠選擇性分裂Lovastatin的2-甲基丁醯氧基側鏈的微生物培養基或由該微生物培養基得到的水解酯來處理，之後進行內酯化，然後用HPLC或結晶法來分離並回收式(5)產物。
19.根據權利要求18的方法，其中X為碘，R1R2一起相連並與它們連接的氮原子形成吡咯烷，且M3和M4為NH4或K。
20.根據權利要求18的方法，其中所說的式(4)的產物用結晶法來離析和分離。
21.根據權利要求19的方法，其中所說的產物用HPLC來分離。
22.根據權利要求21的方法，其中所說的混合物用Clonostachys compactiuscula(ATCC74178或38009)的水解酶的提純形式來處理。
23.根據權利要求21的方法，其中內酯化包括用乙酸異丙酯和甲磺酸來處理，以形成式(3)和式(5)的內酯。
(3)二醇內酯 (5)Simvastatin
全文摘要
在直接甲基化Lovastatin來合成Simvastatin中，通過使用能夠水解2-甲基丁醯氧基側鏈的細菌或真菌或這類微生物的突變體或從其中得到的無細胞提取液或從其中得到的水解酶來處理而將剩餘的Lovastatin、Lovastatin酸或其鹽進行選擇性水解，得到7-[1′、2′、6′、7′、8′、8a′(R)-六氫-2′(S)，6′(R)-二甲基-8′(S)-羥基-1′(S)萘基]-3(R)，5(R)-二羥基庚酸，即三醇酸或三醇鹽，其在內酯化成為內酯形式之前或之後很容易與Simvastatin分離。該方法產生了高收率和高純度的Simvastatin。
文檔編號C12R1/88GK1083111SQ93102509
公開日1994年3月2日 申請日期1993年2月6日 優先權日1992年2月7日
發明者M·J·康達, G·L·蒂沃爾特, S·J·西安西奧西, E·T·皮斯克 申請人:麥克公司