使用Ⅲ型限制酶分離包括超過25個核苷酸的鑑定標誌的製作方法

2023-06-24 04:34:46

專利名稱：使用Ⅲ型限制酶分離包括超過25個核苷酸的鑑定標誌的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域和基因表達分析。在此範圍內，其涉及使用III型限制酶分離轉錄物的限定區。
背景技術：
通過基因工程方法對基因的結構和表達的修飾為各種醫學、藥物和農業應用提供了巨大的潛力。為了檢測和選擇用於基因工程的靶基因，通過表達譜廣泛篩選在不同發育階段和在各種環境條件(如應激)下的細胞、組織、器官或生物體。基因表達分析最有效的技術之一是由Velculescu等，Science 270484-487，1995開發的SAGETM(基因表達的系列分析)。
在最初的SAGETM方案(

圖1)中，確定的細胞、組織或器官的信使RNA(mRNA)庫用作來源材料，使用生物素化的寡聚-dT引物，通過反轉錄酶從mRNA反轉錄形成互補DNA(cDNA)。將產生的單鏈cDNA轉換成雙鏈DNA，並用限制酶NlaIII消化，其識別基序5』-CATG-3』。使用鏈黴抗生物素包被的磁珠回收雙鏈cDNA的3』端片段。將cDNA分成兩部分。然後將兩個接頭(接頭1和接頭2)連接到每個cDNA部分上。接頭含有基序5′-GGGAC-3′。這是II型限制酶BsmFI的識別位點，其以3』方向將13bp從識別位點上切割下來。因此，BsmF1對連接的cDNAs的處理釋放cDNA的13-bp片段，稱作「標誌」序列，連同接頭片段(「接頭-標誌」片段)一起。然後將從cDNAs的兩個部分中產生的兩個接頭-標誌片段以兩個標誌在相鄰的位置以形成雙標誌的這種方式相互連接，隨後用對接頭序列特異的引物進行PCR。通過NlaIII消化除去接頭片段後，將雙標誌連接起來並克隆到適當的質粒中。質粒插入片段的測序顯示一系列兩側是4-bp 5』-CATG-3』序列的9bp標誌。使用13-bp標誌序列，在許多情況中通過查詢可利用的被表達序列標誌(EST)資料庫，可鑑定標誌序列來源的基因。因此，測量了成千上萬個標誌的序列後，可計數樣品中每個標誌的數量，並且進一步鑑定與其對應的基因。
上述SAGETM方案因而是一種研究總體基因表達的有效方法。然而，標誌序列的大小有限(僅13bp)不足以明確地鑑定標誌來源的基因。一個標誌序列可能對應於幾種不同的EST序列，並且可能使進一步分析不知所措。
為了改進這種情況，最近開發了一種所謂的「LongSAGETM」方案，包括II型限制性內切酶MmeI。由於使用MmeI(代替最初SAGETM方案中的BsmFI)，可回收19到21-bp長的標誌(Saha等Nature Biotechnology20508-512，2002)。
MmeI消化產生3』-突出末端(2個鹼基突出)。在雙標誌連接前，為了在MmeI消化後產生鈍端，必需除去3』-突出。當前沒有一種酶可用於填充3』-突出。產生鈍端必需除去3』-突出，結果使標誌序列的長度減少到17-19bp，導致標誌序列中所包含的信息減少。
因此，在公開的LongSAGETM方案中(Saha等，Nature Biotechnology20508-512，2002)，MmeI消化後末端沒有被磨光，並且在具有3』-突出的片段之間進行連接。這意味著接頭-標誌片段自身僅與另一個含有相容3』-末端的接頭-標誌片段連接。這使得連接後形成的雙標誌不是標誌隨機聯合的結果。該方法理論上扭曲了所得雙標誌中每種標誌的表現，並且LongSAGETM的最後結果可能不能忠實地反映每種基因的表達量。因此，LongSAGETM不適合用於基因表達的準確定量分析。這表現了LongSAGETM的嚴重缺陷。由於這種原因，當前的LongSAGETM僅用於幫助注釋通過常規SAGETM方案獲得的13-bp標誌序列。
LongSAGETM方案向前邁進了一步，因為它提高了成功鑑定與標誌對應基因的可能性，假設可獲得EST和/或基因組DNA序列信息。然而，為了將SAGETM方案應用於生物體，由於其沒有EST或基因組DNA資料庫可利用，因此必需使用標誌序列作為引物，通過PCR恢復更長的cDNA，或者作為寡核苷酸探針，通過基於雜交的技術篩選相關的cDNA文庫。對於這些目的，19-21bp的標誌長度仍然太短，不能明確地鑑定標誌序列來源的基因。
因此，急需一種分離顯著更長，至少25bp長的標誌的方法，使用該標誌可進行表達的準確定量分析。然而，到目前為止一直沒有得到這種方法。
發明概述本發明提供一種分離超過25bp長的「標誌(tag)」序列的方法，優選地長26到50bp，最優選地長26到28bp，從DNAs的已知位置開始，因而提高了通過常規SAGETM分析可靠地鑑定相應基因的效率。此外，由於雙標誌是通過標誌的隨機聯合製備的，因此通過該方法獲得的基因表達譜理論上比那些從LongSAGE分析中獲得的更準確。我們在下文中稱這種具有超過25bp的新標誌片段的改良SAGETM方法為「SuperSAGE」。
這裡所描述的方法是基於使用III型限制酶，用於從cDNA的確定位置開始分離超過25bp長的標誌序列。在本發明中，術語標誌指能鑑定被表達基因的特異性核苷酸序列。標誌的3』末端通過III型限制酶的切割位點確定，標誌的5』末端通過最接近cDNA 3』末端的另一種限制酶的切割位點確定。
「限制酶」是能識別雙鏈DNA上4到8個核苷酸的特異性序列並且切割該序列的內切酶的總稱。當前將限制酶分成四個不同的類型，稱作I、II、III和IV型(Roberts等2003，Nucleic Acids Res.311805-1812)。III型限制酶是由甲基化酶和內切酶亞單位構成並且識別靶DNA中非回文核苷酸序列的複合蛋白。對於核酸內切酶活性，它們需要與兩個拷貝的識別序列在功能上合作，此外，這兩個拷貝需要在DNA雙鏈內方向相反(Muecke等2001，J.Molec.Biol.312687-698)。
在本發明中，使用上述III型限制酶分離長度超過25bp的標誌序列。在http//rebase.neb.com/cgi-bin/azlist？re3.中公開了這種III型酶的實例。優選在本發明中使用的III型酶包括EcoPI、EcoP15I等。
在本發明最優選的實施方案中，III型限制酶是EcoP15I。III型限制酶EcoP15I識別靶DNA分子上兩個未甲基化的反向5』-CAGCAG-3』位點，並且將25到28bp從識別位點之一的3』端消化下來。因此，EcoP15I提供具有突出的5』末端的片段，其使用常規3』填充反應很容易鈍端化。
另一種酶的優選實例是能將cDNA切割成每個片段平均長200bp到300bp的酶，如

最優選的酶是NlaIII。
本發明也提供一種包括超過25個核苷酸並且能鑑定被表達基因的標誌，其中標誌的3』末端通過III型限制酶的切割位點確定，標誌的5』末端通過最接近被表達基因的cDNA 3』末端的另一種限制酶的切割位點確定。
在本發明的優選實施方案中，III型酶是EcoP15I並且另一種限制酶是能將cDNA切割成每個片段平均長200bp到300bp的酶，如上所述。最優選的酶是NlaIII。
在下面表1中顯示了本發明標誌的實例。這些標誌比常規SAGE標誌或LongSAGE標誌更長，並且允許更準確地鑑定對應的基因。
本發明進一步提供包括兩個標誌的雙標誌-寡核苷酸，其中的每一個標誌來自不同的被表達基因。雙標誌-寡核苷酸通過包括下列步驟的方法製備1)使用包括寡-dT和III型限制酶識別序列的引物從被表達基因的mRNA合成cDNA庫，隨後用另一種限制酶消化cDNA庫；2)從上述cDNA庫中純化包括多聚腺苷酸序列的片段，並將片段與接頭-A或接頭-B連接，兩者都包括III型限制酶的識別序列；3)用III型限制酶消化上述片段，進行3』-填充反應後將得到的包括接頭-A的片段與得到的包括接頭-B的片段連接；和4)用步驟1)的另一種限制酶消化上述所連接的片段，以便將接頭序列切割下來，因而獲得雙標誌-寡核苷酸。
如在上述步驟中所示，通過用於從mRNA反轉錄形成cDNA的RT引物，將III型限制酶的第一個識別位點整合到靶cDNA中，通過接頭序列將III限制酶的第二個識別位點整合到靶cDNA中。
由序列5』-N18-25-CAGCAG-T15-25-3』定義RT引物，其中N18-25是18到25個任意核苷酸序列，不包括序列5』-CAGCAG-3』和序列5』-CATG-3』。可修飾RT引物的5』末端，例如通過生物素修飾。
本發明的III型限制酶提供具有突出5』末端的片段，其可使用常規3』填充反應很容易地鈍端化。換句話說，在上述步驟3)中，可以很容易地使包括接頭-A的片段和包括接頭-B的片段鈍端化並且因而允許片段的隨機聯合而標誌大小沒有任何減小。
在本發明的優選實施方案中，III型限制酶是EcoP15I，另一種限制酶是能將cDNA切割成每個片段平均長200bp到300bp的酶，如NlaIII。
在本發明的生產雙標誌-寡核苷酸的方法中，使用兩個接頭(接頭-A和接頭-B)。接頭A和接頭-B是互不相同的雙鏈DNA。參與連接的雙連結頭片段的一端包括與連接序列相鄰的III限制酶的識別序列。例如，當III型限制酶是EcoP15I，另一種限制酶是NlaIII時，兩個接頭在它們第一條鏈的3』端都包括5』CAGCAGCATG-3』序列。有下劃線的序列5』CAGCAG-3』構成EcoP15I的一個識別位點，5』-CATG-3』序列構成3』突出的單鏈區與NlaIII消化所產生的片段相連。
不參與連接的雙連結頭片段的另一端可通過標記試劑如FITC(異硫氰酸螢光素；第一鏈的5』末端)以及通過氨基部分(第二鏈的3』末端)進行修飾。
因此，通過將下列DNA(1)的第一鏈和DNA(2)的第二鏈退火而製備接頭；DNA(1)5』-N30-40-CAGCAGCATG-3』DNA(2)3』-N30-40-GTCGTC-5』其中，DNA(1)的N30-40和DNA(2)的N30-40是30到40個鹼基的任意核苷酸序列，其相互之間互補，並且其中可標記DNA(1)的5』末端以及可氨基修飾DNA(2)的3』末端。
本發明進一步提供通過連接上述雙標誌-寡核苷酸獲得的多核苷酸。可通過PCR克隆並擴增每種雙標誌-寡核苷酸。多核苷酸包括至少2個雙標誌-寡核苷酸，優選包括2到200個雙標誌-寡核苷酸。通過兩個標誌的隨機聯合製備本發明的雙標誌-寡核苷酸，因此多核苷酸也是標誌的隨機串連。
本發明進一步提供基因表達分析的方法，包括多核苷酸的核苷酸序列分析，以及基於與多核苷酸中包含的被表達基因對應的標誌的數量對所表達基因的表達水平進行定量。
例如，本發明的方法包括下列步驟1)使用包括寡-dT和III型限制酶識別序列的RT引物從表達基因的mRNA合成cDNA庫，隨後用另一種限制酶消化cDNA庫；2)從上述cDNA庫中純化包括多聚腺苷酸序列的片段，以及將片段與接頭-A或接頭-B連接，兩者都包括III限制酶的識別序列；3)用III型限制酶消化上述片段，3』-填充反應後將得到的包括接頭-A的片段與得到的包括接頭-B的片段連接；4)用步驟1)的另一種限制酶消化上述所連接的片段，以便將接頭序列切下來，因此獲得包括兩個超過25個核苷酸並能鑑定被表達基因的標誌的雙標誌-寡核苷酸；5)連接雙標誌-寡核苷酸產生多核苷酸；和6)分析上述多核苷酸的核苷酸序列，基於與多核苷酸中所包含的被表達基因對應的標誌的數量對被表達基因的表達水平進行定量。
在該方法優選的實施方案中，III型酶是EcoP15I，另一種限制酶是能將cDNA切割成每個片段平均200bp到300bp長的酶，如NlaIII。關於接頭，可優選使用上述雙鏈DNA。
本發明進一步提供分離包括超過25個核苷酸並能鑑定被表達基因的標誌的試劑盒，包括下列成分a)由序列5』-N18-25定義的RT引物，不包括序列5』-CAGCAG-3』和序列5』-CATG-3』，其中RT引物的5』末端可以生物素化。
b)接頭-A和接頭-B，其是互不相同的雙鏈DNA並通過將下列DNA(1)的第一鏈和DNA(2)的第二鏈退火製備；DNA(1)5』-N30-40-CAGCAGCATG-3』DNA(2)3』-N30-40-GTCGTC-5』其中，(1)的N30-40和(2)的N30-40是30到40個任意的核苷酸序列，其相互之間互補，可標記DNA(1)的5』端以及可氨基修飾DNA(2)的3』端。
c)能與上述接頭-A或接頭-B雜交的引物試劑盒也可包括III型限制酶如EcoP15I酶和/或另一種限制酶如NlaIII。除了上面提到的成分外，試劑盒可進一步包括進行本發明基因表達分析所必需的其它成分。實例包括標記試劑、緩衝液、磁珠等。
附圖簡述圖1顯示常規SAGETM方案的示意圖(Velculescu，等，Science270484-487，1995)。
圖2顯示使用EcoP15I分離26-bp cDNA SuperSAGE標誌方法的示意圖。
圖3總結了使用通過EcoP15I所獲得的26-bp標誌的SuperSAGE分析的應用。
圖4顯示了EcoP15I消化後產物電泳的實例(步驟6，圖2)，通過FITC螢光顯示。在圖的右側描述了每個片段的結構。在這個實例中，來自水稻葉的mRNA分子用作cDNA合成的模板。
圖5顯示來自圖2步驟9的PCR產物的電泳(PAGE)實例。預期的PCR產物的大小是大約97bp。
圖6顯示PCR產物(步驟10)NlaIII消化後所得片段的電泳(PAGE)實例。雙標誌的大小是大約52bp。
圖7顯示雙標誌的串連片段的電泳實例(步驟11)。
圖8顯示菌落PCR產物的電泳實例(步驟14)。
圖9顯示克隆的多聯體中所含DNA序列的實例(步驟15)。
圖10顯示使用從稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)感染的水稻葉中分離的RNAs，使用26-bp標誌序列作為PCR引物的RT-PCR結果。
圖11顯示在用馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)的INF1激發子(elicitor)蛋白處理或者用水作為對照處理的本塞姆氏菸草(Nicotiana benthamiana)中RT-PCR的結果。
圖12顯示由SuperSAGE鑑定的四個基因的基因表達的RT-PCR動態研究。
本發明的優選實施方案參考圖2，以下描述使用EcoP15I作為III型限制酶的本發明的優選
III型限制-修飾的酶EcoP15I識別靶DNA分子中兩個未甲基化的反向5』-CAGCAG-3』位點，並且將25到28bp從識別位點之一的3』-末端消化下來。本發明涉及EcoP15I酶用於從cDNAs的確定位置分離25-到28-bp標誌序列的所有潛在的應用。
使用生物素化的寡-dT-錨式引物(以下稱作「RT引物」或反轉錄引物)從mRNA合成雙鏈cDNA。該RT引物包括18到25個鹼基的任意核苷酸序列和5』-CAGCAG-3』序列，隨後是15到25個鹼基的寡-dT序列。在RT引物中所包含的5』-CAGCAG-3』序列構成EcoP15I的一個識別位點(圖2，步驟1)。例如，包括22個核苷酸序列和5』-CAGCAG-3』序列，隨後是19-dT序列的RT引物是5』-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCCAGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3』(SEQ ID NO1)。
用限制性內切酶NlaIII消化合成的cDNA，該酶識別基序5』-CATG-3』。僅包括RT引物序列的消化片段(生物素標記)被鏈黴抗生物素蛋白包被的磁珠捕獲(圖2，步驟2和3)。
將雙連結頭片段(46bp)與磁珠捕獲的cDNA片段(包括多聚腺苷酸序列)的末端連接。這種參與連接的接頭片段的一端包括與第一鏈中5』-CATG-3』序列相鄰的5』-CAGCAG-3』序列(圖2，步驟4)。5』-CAGCAG-3』序列構成EcoP15I的一個識別位點，5』-CATG-3』序列構成與NlaIII消化所產生片段的粘性末端連接的3』突出的單鏈區。通過FITC(異硫氰酸螢光素；第一鏈的5』末端)和氨基部分(第二鏈的3』末端)修飾不參與連接的雙連結頭片段的另一末端。
在本發明中，使用兩個接頭。例如，通過將下列兩個寡核苷酸退火而製備接頭-AFITC-5′-TTTGGATTTGCTGGTGCAGTACAACTAGGCTTAATACAGCAGCATG-3』(SEQ ID NO2)和5′-CTGCTGTATTAAGCCTAGTTGTACTGCACCAGCAAATCCAAA-3′-NH2(SEQ ID NO3)。
通過將下列兩個寡核苷酸退火製備接頭-B
ETTC5′-TTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCTAACGATGTACGCAGCAGCATG-3′(SEQ ID NO4)和5′-CTGCTGCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAA-3′-NH2(SEQ ID NO5)。
將cDNA庫分成兩半，一半與接頭-A連接，另一半與接頭-B連接，得到「接頭-A連接的cDNAs」和「接頭-B連接的cDNAs」。
對於接頭-A連接的cDNAs和接頭-B連接的cDNAs，用EcoP15I消化結合到磁珠上的DNA片段(圖2，步驟5)。EcoP15I識別一對反向基序5』-CAGCAG-3』，並且將25到28bp從識別位點之一的3』-末端上切下來。消化後，從磁珠上釋放兩個片段。一個是包括接頭和27-或28-bp標誌片段的片段(總的大小是69或70bp)，另一個片段是位於雙鏈cDNA片段中央的大小可變的片段。包括多聚腺苷酸序列的片段仍然與磁珠結合，不參與下列步驟。
在UV輻射下，通過FITC螢光顯示包括接頭和27-或28-bp標誌序列的69-或70-bp片段，並且通過凝膠切除很容易地從聚丙烯醯胺凝膠中分離。
EcoP15I提供具有突出的5』末端的片段，其很容易地通過常規3』-填充反應鈍端化，因而允許片段的隨機聯合。因此，通過3』-填充反應使分別由接頭-A連接的cDNAs和接頭-B連接的cDNAs產生的每個69-或70-bp片段(接頭-標誌片段)鈍端化，並且相互連接，通過兩個標誌的隨機聯合形成雙標誌。通過氨基修飾阻斷接頭片段的3』末端，因此僅在鈍端化的cDNA標誌序列兩側之間發生連接(圖2，步驟6，7)。
通過PCR擴增所得的雙標誌分子(圖2，步驟9)。下面顯示從接頭序列設計的PCR引物的實例雙標誌引物1E生物素-5』-CAACTAGGCTTAATACAGCAGCA-3′(SEQ ID NO6)雙標誌引物2E生物素-5』-CTAACGATGTACGCAGCAGCA-3′(SEQID NO7)使用上述引物通過PCR獲得的PCR產物的預期大小是大約97bp。
用NlaIII消化大約97bp的PCR產物(圖2，步驟10)，因而釋放大約52-bp雙標誌片段。從凝膠中回收這些片段並純化。
通過連接反應將雙標誌片段串連起來(圖2，步驟11)。通過瓊脂糖凝膠電泳分離多聯體。從凝膠中洗脫並回收超過500bp的片段。
將根據大小分離的多聯體片段連接到用SphI預消化並用小牛腸磷酸酶處理的適當質粒載體上(圖2；步驟12)，將質粒轉化到大腸桿菌(E.coli)中(圖2；步驟13)。
PCR擴增質粒的插入片段(圖2；步驟14)。
對PCR產物直接測序(圖2；步驟15)。一系列大約44-bp雙標誌序列的兩側是NlaIII識別序列CATG。該大約52(44+8)-bp序列信息提供兩個從每個cDNA的確定位置分離的26-到28-bp標誌序列。
計數樣品中26-bp標誌的數量後，可獲得如在最初SAGETM方案中所述的基因表達譜。由於本發明的雙標誌是通過鈍端化標誌的隨機聯合形成的，因此結果忠實地反映了每種基因的表達情況。
26-bp標誌序列含有足夠的信息能唯一地鑑定標誌來源的基因。由於26-bp DNA序列中的信息量，因此使對應基因的in silico鑑定變得很容易。甚至26-bp標誌序列對Genbank序列整體的BLAST搜索將顯示對標誌來源基因的正確匹配(圖3)。
如果將所描述的方法應用於沒有可利用的DNA序列數據的生物體，那麼26-bp標誌序列可直接用作3』-RACE的PCR引物用以恢復cDNA的3』區。這種cDNA序列可用於BLAST搜索以鑑定基因(圖3)。
如RT-PCR一樣，可用26-bp標誌序列直接進行3』-RACE以定量信息的量，用於證明SuperSAGE所揭示的樣品之間的基因表達差異(圖3)。
26-bp標誌序列比引起「RNA幹擾」(RNAi)所需DNA序列的最小大小(21bp)長(Elbashir等Nature 411494-498，2001)。因此，可將包括標誌序列的雙鏈RNA立即用於功能性分析以敲除與標誌對應的基因。這意味著可將通過SuperSAGE進行的基因表達分析直接與具有26-bp標誌分離的基因功能分析聯繫起來。
對於在植物物種的應用，可將上述3』-RACE片段克隆到植物病毒載體中，並用於「病毒-誘導的基因沉默(VIGS)」(Baulcombe，Curr.Opin.Plant Biol.2109-113，1999)，因此所述的SuperSAGE法將基因表達分析也與植物中的基因功能分析聯繫起來。
實施例參考下列實施例更詳細地描述本發明，儘管本發明的範圍不限於這些實施例。
作為原理的證據，通過上述方法從水稻(Oryza sativa cv.Kakehashi)的模擬損害的突變體IB2020的葉中分離26-和27-bp標誌序列。
1)製備mRNA通過常規RNA分離方法從水稻的葉片中分離總RNA。使用「mRNA純化試劑盒」(Amersham Pharmacia)從該RNA中分離5μg mRNA。將mRNA溶於29μl DEPC水中，並用作來源材料。
2)使用寡-dT引物合成cDNA使用下列包括EcoP15I酶的識別序列5』-CAGCAG-3』基序的反轉錄引物，使用「cDNA合成系統」(Invitrogen)反轉錄該mRNA產生單鏈cDNA。
反轉錄引物5』-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCCAGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3』(SEQ ID NO1)使用相同的試劑盒將產物轉換成雙鏈cDNA，乙醇沉澱，溶於20μLLoTE緩衝液(3mM Tris-HCl pH7.5，0.2mM EDTA)。
3)NlaIII消化將得到的雙鏈cDNA(20μL)在200μL包括溶於含有0.1mg/ml BSA的1x NEB緩衝液4(NEB)的50單位NlaIII(New England BioLabs；NEB)的反應液中37℃消化90分鐘。消化後，用TE-平衡的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1；pH8.0)提取cDNA，乙醇沉澱，以及溶於20μl LoTE緩衝液。
在兩個Eppendorf管的每一個中，轉移1ml鏈黴抗生物素磁珠懸液(鏈黴抗生物素Magnesphere順磁顆粒，Promega)。使用磁分離臺(Magnesphere技術磁分離臺)，將磁珠用200μl 1x BW溶液(5mMTris-HCl pH7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl)衝洗一次。衝洗後，向每個管中添加100μl 1x BW緩衝液和從上述步驟中獲得的10μl cDNA以及90μl水，混合，並在室溫孵育30分鐘。將由磁珠結合的cDNA用1xBW緩衝液衝洗3次並用LoTE緩衝液衝洗3次。
4)接頭連接商業合成下列寡核苷酸(Qiagen)。
接頭-A1FITC-5′-TTTGGATTTGCTGGTGCAGTACAACTAGGCTTAATACAGCAGCATG-3』(SEQ ID NO2)接頭-A25′-CTGCTGTATTAAGCCTAGTTGTACTGCACCAGCAAATCCAAA-3′-NH2(SEQ ID NO3)接頭-B1FITC5′-TTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCTAACGATGTACGCAGCAGCATG-3′(SEQ ID NO4)接頭-B25′-CTGCTGCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAA-3′-NH2(SEQ ID NO5)通過T4多核苷酸激酶(NEB)使接頭-A2和接頭-B2的5』末端磷酸化。通過將接頭-A1和磷酸化的接頭-A2退火製備接頭-A，通過將接頭-B1和磷酸化的接頭-B2退火製備接頭-B。接頭-A和接頭-B兩者都含有EcoP15I識別序列(5』-CAGCAG-3』)。
向含有與磁珠結合的cDNA的兩個管中的每一個添加17μl LoTE、3μl 5X連接酶緩衝液(Invitrogen)和1μg接頭-A或接頭-B。混合後，將管在50℃孵育2分鐘並置於室溫中15分鐘。隨後，向管中添加2μl T4DNA連接酶(5單位/μl，Invitrogen)並在16℃孵育90分鐘。接頭連接後，將磁珠用1X BW衝洗4次，用LoTE緩衝液衝洗3次以及用無菌蒸餾水衝洗一次。
5)EcoP15I消化在100μl反應混合物(10mM Tris-HCl pH8.0、10mM KCl、10mMMgCl2、0.1mM EDTA、0.1mM DTT、5μg/ml BSA、2mM ATP)中用10單位EcoP15I消化磁珠上接頭連接的cDNA。將管在37℃孵育90分鐘。
6)接頭-標誌片段的純化EcoP15I消化後，將管置於磁臺上。通過鏈黴抗生物素包被的磁珠除去生物素化的最外面的3』末端片段後，收集含有接頭-標誌片段的未結合部分，並轉移到新管中。通過苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1；pH8.0)提取所收集的溶液，乙醇沉澱，溶於10μl LoTE緩衝液，並通過8％聚丙烯醯胺凝膠電泳分離。在相鄰的泳道，加入用SYBR綠(FMC)預染的大小標記(20bp梯，TAKARA)。電泳後，將凝膠置於UV發光器上，通過其FITC介導的螢光顯示大約69bp大小的接頭-標誌片段(圖4)。也顯示了兩個推測來自接頭-接頭連接物(大約90bp)和單個接頭片段(46bp)的額外片段。如果FITC-螢光產生太弱的信號，可用SYBR綠(FMC)將凝膠染色以顯示接頭-標誌片段。將大約69-bp接頭-標誌片段從凝膠中切下來並置於底部有由注射器針所製備的針孔的0.5ml管中。將0.5ml管置於2ml管內，並以15000rpm離心2分鐘。向在2ml管底部收集的小凝膠碎片中添加LoTE緩衝液(300μl)，將它們在37℃孵育2小時，隨後在65℃孵育15分鐘。將凝膠懸液轉移到SpinX柱(Coaster)中並以15000rpm離心2分鐘。將回收的溶液通過苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1；pH8.0)提取一次，乙醇沉澱並溶於8μl LoTE緩衝液。
7)標誌片段的鈍化使用試劑盒(Blunting High；TOYOBO)通過DNA聚合酶填充接頭-標誌片段的5』突出。向含有接頭-標誌片段的溶液(8μl)中添加1μl反應緩衝液(KOD緩衝液；TOYOBO)和1μl KOD聚合酶(TOYOBO)，並在72℃孵育2分鐘。
8)連接形成雙標誌將來自接頭-A和接頭-B的接頭-標誌片段連接形成雙標誌片段。將等體積(2μl)的鈍端化的接頭-A-標誌和接頭-B-標誌溶液混合，並添加6μl LoTE和10μl連接混合物(Ligation High，TOYOBO)。在16℃，孵育連接溶液4小時到過夜。
9)雙標誌PCR將得到的雙標誌溶液稀釋5倍和10倍，並用作雙標誌PCR的模板。在288個(＝96×3)每個含有50μL溶液的0.2ml管中進行PCR反應，其中溶液中含有1μL稀釋的雙標誌模板、3單位Taq聚合酶(AmpliTaqGold；Applied Biosystems)、1x AmpliTaq Gold緩衝液和PCR引物。將PCR引物的5』末端進行如下生物素化(由Qiagen商業合成)。
雙標誌引物1E生物素-5』CAACTAGGCTTAATACAGCAGCA-3′(SEQ ID NO6)雙標誌引物2E生物素-5』-CTAACGATGTACGCAGCAGCA-3′(SEQID NO7)PCR由在95℃起始變性12分鐘，隨後進行27-29個循環，每個循環94℃40秒和60℃40秒構成。擴增的雙標誌片段的預期大小是大約97bp(圖5)。
10)雙標誌PCR產物的純化將雙標誌PCR產物(約300管)混合到10ml塑料管內。苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1；pH8.0)提取和乙醇沉澱後，將其溶於100μl LoTE緩衝液。將該PCR產物在1.5％低熔點的瓊脂糖(SeaPlaque，FMC)凝膠上電泳，將大約97bp片段從凝膠上切下來，將其通過Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。
11)通過NlaIII消化除去接頭用溶於含有0.1mg/ml BSA的1x NEB緩衝液4(NEB)的120單位MaIII(NEB)消化在121μl LoTE緩衝液中洗脫的經過純化的大約97bp片段。通過凝膠電泳證實消化後(顯示52bp、22bp和23bp大小的三個片段，圖6)，將消化液在室溫下用鏈黴抗生物素蛋白磁珠處理30分鐘除去接頭片段。通過磁臺收集管中的磁珠後，將上清液轉移到新管中，用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1；pH8.0)提取DNA，乙醇沉澱並溶於10μl LoTE緩衝液。
12)52bp雙標誌片段的純化將回收的DNA在12％聚丙烯醯胺凝膠中電泳。為了顯示片段，將凝膠用SYBR綠(FMC)染色。在UV透射儀上將大約52bp大小的片段從凝膠上切下來。根據上述方法從凝膠中洗脫DNA。將從凝膠中洗脫的DNA溶液用鏈黴抗生素磁珠在室溫下處理30分鐘。收集上清液，並通過苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1；pH8.0)提取，乙醇沉澱並溶於7μl LoTE緩衝液。
13)形成多聯體對於雙標誌片段的串連，將7μl雙標誌溶液、2μl 5X連接酶緩衝液和5單位T4連接酶(Invitrogen)混合併在16℃孵育1-4小時。將連接溶液在65℃孵育10分鐘，並加樣到1％瓊脂糖凝膠上(圖7)。將大於500bp的DNA片段從凝膠中切下來並洗脫。將純化的多聯體溶於6μlLoTE緩衝液。
14)載體克隆將5μg克隆載體(pGEM3Z，Promega)用SphI消化，並用小牛小腸鹼性磷酸酶(CIAP)處理。為了克隆多聯體，使用T4連接酶(Invitorgen)連接這種消化的pGEM3Z載體和雙標誌多聯體。4小時連接後，反應液用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取，並用乙醇沉澱。將沉澱用70％乙醇衝洗4次以完全除去鹽，並溶於10μl無菌蒸餾水。
15)轉化將電感受態大腸桿菌細胞(DH10B，Invitrogen)用於克隆含有雙標誌多聯體的質粒。在管中，在冰上將40μl感受態細胞懸液與1μl經過純化的連接的DNA混合，並轉移到電穿孔杯內(0.1cm縫隙；BioRad)。電穿孔的條件如感受態細胞生產商所建議的(2.5kV，25μFD，100Ω)。電穿孔後，加入1ml SOC培養基(Invitrogen)並將溶液在37℃孵育1小時。將得到的大腸桿菌懸液平鋪於含有100μg/ml氨苄青黴素、20μg/ml X-gal和0.1mM IPTG的LB培養基上。將平板在37℃培養14小時。
16)菌落PCR和測序使用牙籤將在平板上產生的白色菌落挑出來，並在含有1X PCR緩衝液、0.4mM dNTP、0.05單位/μl Taq聚合酶(TAKARA)、2pmols/μlM13-20引物和2pmols/μl M13RV引物的PCR混合物中重懸。通過PCR擴增質粒中的克隆片段並通過瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小(圖8)。使用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化擴增的PCR片段。
17)多聯體的測序將純化的PCR片段(多聯體)用BigDye終止子(AppliedBiosystems)和M13-20引物測序。測序反應後，通過「Montage SEQ96測序反應清除試劑盒」(Millipore)純化DNA。通過RISA384毛細管DNA測序儀(Shimadzu)分析DNA序列。在圖9顯示了克隆片段的DNA序列的實例。通過CATG NlaIII位點界定了一系列包括兩個26-或27-bp片段的52-到54-bp雙標誌。
18)數據分析從多聯體的DNA序列中提取了26-bp標誌序列並且使用由JohnsHopkins大學提供的SAGETM2000軟體計數了每種標誌的數量。測量幾個克隆的序列後，進行了表1中所示的基因表達譜分析。
從水稻葉中獲得的SuperSAGE結果的實例。顯示除共有的NlaIII位點(CATG)外的標誌序列。




因此，從水稻葉中成功地分離了與cDNAs的NlaIII位點相鄰的26-或27-bp序列。可通過應用這裡所描述的實驗方法從任何cDNA中獲得包括26-或27-bp序列的鑑定標誌。基於分離包括26-或27-bp序列標誌的該方案表現了對使用包括18-到21-bp序列標誌的最先進SAGETM方法(稱為「LongSAGETM」)的重要定性改進。
在SuperSAGE方法中，EcoP15I酶在標誌中產生很容易通過DNA聚合酶鈍端化的5』-突出端。因此，通過鈍端化標誌的隨機聯合形成雙標誌，因而確保標誌的數量忠實地代表了與標誌對應基因的表達。當在LongSAGETM方案中僅在包括相容的2-bp 3』-突出端的21-bp標誌之間形成雙標誌時，不能利用這種性質。為了在LongSAGETM中保證標誌的隨機聯合，應當通過除去3』-突出區使標誌鈍端化。這導致標誌大小減少了2-bp並且因此減少了標誌的信息量。因此，從標誌具有更多信息量的觀點來看，這裡所描述的SuperSAGE法優於LongSAGETM法而且更忠實地代表基因表達譜。
為了證明SuperSAGE的26-bp大小的標誌允許標誌對基因非常可靠的注釋，進行下列實驗。
從表1中隨機選擇30個26-bp標誌。將這些DNA序列從3』末端截短使得標誌大小分別變成20、18和15bp。15bp大小的標誌與常規SAGETM中使用的標誌大小一致。當接頭-標誌片段相互連接，分別具有和不具有鈍端時，從LongSAGETM的標誌中提取18-bp或20-bp標誌。使用不同大小標誌中的每一種，在代表來自超過130,000個物種的DNA序列的Genbank所存儲的整個DNA序列中進行BLAST搜索。對包含顯示與指定大小的標誌完全匹配的DNA序列的物種的數量進行計數，跨30個標誌序列獲得物種的平均和最大量。在表2中總結了搜索結果。
30個水稻SAGE標誌對整個Genbank數據BLAST搜索的總結

DNA序列的數量顯示與標誌序列完全匹配，標誌大小的增加減少了標誌對基因注釋的不明確性。
常規SAGETM同志(15bp)平均與4個以上，最多9個物種的DNA序列匹配。所有30個標誌與兩個或更多物種相關(表2)。18-bp標誌平均與1.8個，最多7個物種匹配。30個中的10個標誌與兩個或更多的物種相關。20-bp標誌平均與1.16個，最多4個物種匹配。30個中僅有3個標誌與2個以上物種相關，提示對最初SAGETM同志長度(15bp)有很大改進。然而，注意到只有當接頭-標誌在不對末端進行鈍化的情況下連接時可提取20-bp標誌，因此該方法的最終結果不是必然代表準確的基因表達。SuperSAGE法的26-bp標誌平均與1.06個，最大僅2個物種匹配。30個中僅有2個與2個以上物種的DNA序列相關。這些結果清楚地顯示了26-bp DNA序列中的信息量大大提高了標誌的基因注釋的效率。
26-bp標誌平均僅與一個物種的DNA序列匹配，在決大多數情況中僅與特定物種的一個基因匹配。因此，幾乎完全可以進行標誌序列的注釋。在SuperSAGE中可對EST序列資料庫以及對整個基因組序列進行標誌注釋。
SuperSAGE中26-bp標誌的高信息量允許同時進行兩個生物體的基因表達分析。作為實例，我們將所描述的方法用於研究受真菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea )導致的枯萎病(blast disease)感染的水稻作物的基因表達譜。從枯萎病感染的水稻葉中分離總計12,119個標誌後，通過對水稻和稻瘟病菌(M.grisea)的所有基因組序列的BLAST搜索對每個標誌進行注釋。如預期的，大多數標誌被注釋為水稻基因(表3)，而74個標誌不與水稻序列匹配而與枯萎病序列匹配(表4) 通過Super SAGE所揭示的在枯萎病感染的水稻葉中10個最豐富表達的基因

*標誌表示為除NlaIII位點(CATG)外的22-bp序列。
由SuperSAGE揭示的在枯萎病感染的水稻葉中表達的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)基因的部分列表

*標誌表示為除NlaIII位點(CATG)外的22-bp序列**從與每個標誌匹配的稻瘟病菌的cDNA序列或基因組序列中推定的基因名稱。
為了證明由SuperSAGE獲得的結果，使用下列錨式寡-dT引物從上述同一RNA通過反轉錄合成cDNA5』-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3』(SEQID NO8)。
用該cDNA作為模板，使用疏水蛋白、二磷酸核苷激酶和60S核糖體蛋白基因(表4)的26-bp標誌與下列引物一起進行3』-RACE5』-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3』(SEQ ID NO9)。
獲得所有這三種基因的特異性PCR產物(圖10，左邊)。在假接種的易患枯萎病的栽培品種(Kakehashi)、接種的易患枯萎病的栽培品種(Kakehashi)、假接種的枯萎病抗性栽培品種(Himenomochi)和接種的枯萎病抗性栽培品種(Himenomochi)中使用相同的引物組用於RT-PCR。如預期的那樣，僅從用枯萎病真菌接種的易患品種中擴增了與三個枯萎病基因對應的PCR產物(圖10，右側)，證明了SuperSAGE注釋的可靠性。
不能通過以前的技術在與這裡舉例說明的相同樣品中進行兩個物種的基因表達的定量分析。使用26-bp標誌進行基因表達分析(「SuperSAGE」)將極大地便於同時進行兩個或更多相互作用的生物體如宿主和病原體的基因表達分析。
為了證明具有26-bp標誌的SuperSAGE可用於無法獲得其DNA序列數據的生物體的基因表達分析，進行下列實驗。將SuperSAGE應用於植物物種，本塞姆氏菸草(Nicotiana benthamiana)的基因表達分析，其用馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)的蛋白激發子(elicitor)INF1處理(Kamoun等Mol.Plant-Microbe Interact.1013-20，1997)或者用水處理。激發子或水滲透(浸沒)後一小時收集葉子，並從中分離RNA。
從每個樣品中成功地分離了超過5000個標誌(表5)。使用表5中列出的10個最常觀察到的標誌直接用於3』-RACE，並對所得的cDNA進行測序。CDNAs的BLAST搜索鑑定了與表5中所給標誌對應的基因。
由SuperSAGE揭示的在本塞姆氏菸草(Nicotiana benthamiana)葉中10個最經常觀察到的標誌

*標誌表示為除NlaIII位點(CATG)外的22-bp序列。
**從通過使用26-bp標誌序列引物的3』RACE擴增的cDNA片段的序列中推定出的對應基因。
通過比較INF1-和浸沒處理的樣品中每種標誌的頻率，鑑定了在兩個樣品中統計學上有顯著差異表現的標誌(表6)。將這些標誌直接用於3』-RACE，並將回收的cDNA用於BLAST搜索。這允許絕大多數標誌的注釋。
在INF1-和浸沒處理的本塞姆氏菸草(Nicotiana benthamiana)葉中差異表達的基因

*標誌表示為除NlaIII位點(CATG)外的22bp序列。
**從通過使用26-bp標誌序列引物的3』RACE擴增的cDNA片段的序列中推定的對應基因。
將26-bp標誌序列與錨式引物一起進行RT-PCR以證實表6中所顯示的SuperSAGE的結果。RT-PCR結果(圖11)清楚地證明了SuperSAGE結果忠實的反映了INF1和浸沒處理的樣本之間的基因表達差異。
可很容易地使用同樣的26-bp標誌引物進行RT-PCR，用於每種基因表達的動態研究(圖12)。其顯示用INF1處理後15分鐘四種所檢驗基因(葉綠素a/b結合蛋白、光合系統II蛋白、磷酸甘油酸激酶和ATP合酶的基因)的表達被關閉。
這個實施例證明了SuperSAGE在不能獲得其DNA序列數據的生物體中進行基因表達分析的巨大潛力。這種潛力來自標誌的大小足以用作特異性PCR引物以及通過SuperSAGE獲得的基因表達譜忠實地代表真實的基因表達的事實。
序列表文本SEQ ID NO1RT-引物SEQ ID NO2接頭-A的第一鏈SEQ ID NO3接頭-A的第二鏈SEQ ID NO4接頭-B的第一鏈SEQ ID NO5接頭-B的第二鏈SEQ ID NO6雙標誌引物(正向)SEQ ID NO7雙標誌引物(反向)SEQ ID NO8RT-引物SEQ ID NO93′-RACE的引物序列表110Iwate Prefectural GovernmentKAHL，GuenterWINTER，PeterKRUEGER，DetlevREICH，Stefanie120使用III型限制酶分離包括超過25個核苷酸的鑑定標誌130PH-1719-PCT140
141
1609170PatentIn Ver.2.1210121147212DNA213人工序列220
223發明人KAHL，Guenter；WINTER，Peter；KRUEGER，Detlev；REICH，Stefanie；MATSUMURA，Hideo；TERAUCHI，Ryohei220
223人工序列的描述RT-引物4001ctgatctaga ggtaccggat cccagcagtt tttttttttt ttttttt 47210221146212DNA213人工序列220
223人工序列的描述接頭-A的第一鏈4002tttggatttg ctggtgcagt acaactaggc ttaatacagc agcatg 462103
21142212DNA213人工序列220
223人工序列的描述接頭-A的第二鏈4003ctgctgtatt aagcctagtt gtactgcacc agcaaatcca aa 42210421144212DNA213人工序列220
223人工序列的描述接頭-B的第一鏈4004tttctgctcg aattcaagct tctaacgatg tacgcagcag catg44210521140212DNA213人工序列220
223人工序列的描述接頭-B的第二鏈4005ctgctgcgta catcgttaga agcttgaatt cgagcagaaa 40210621123212DNA213人工序列220
223人工序列的描述雙標誌引物(正向)4006caactaggct taatacagca gca 232107
21121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述雙標誌引物(反向)4007ctaacgatgt acgcagcagc a21210821137212DNA213人工序列220
223人工序列的描述RT-引物4008ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37210921120212DNA213人工序列220
223人工序列的描述3』-RACE的引物4009ggccacgcgt cgactagtac 20
權利要求
1.III性限制酶用於從被表達基因的cDNA中分離包括超過25個核苷酸並且能夠鑑定被表達基因的標誌的用途，其中標誌的3』末端通過III型限制酶的切割位點確定，標誌的5』末端通過最接近被表達基因的cDNA 3』末端的另一種限制酶的切割位點確定。
2.權利要求1的用途，其中III型限制酶是EcoP15I。
3.權利要求2的用途，其中另一種限制酶是NlaIII。
4.一種包括超過25個核苷酸並且能夠鑑定被表達基因的標誌，其中標誌的3』末端通過III型限制酶的切割位點確定，標誌的5』末端通過最接近被表達基因的cDNA 3』末端的另一種限制酶的切割位點確定。
5.權利要求4的標誌，其中III型限制酶是EcoP15I。
6.權利要求5的標誌，其中另一種限制酶是NlaIII。
7.一種雙標誌-寡核苷酸，包括兩個來自不同被表達基因的標誌，其中每個標誌包括超過25個核苷酸並且能夠鑑定被表達基因，標誌的3』末端通過III型限制酶的切割位點確定，標誌的5』末端通過最接近被表達基因的cDNA 3』末端的另一種限制酶的切割位點確定。
8.權利要求7的雙標誌-寡核苷酸，由包括下列步驟的方法製備1)使用包括寡-dT和III型限制酶識別序列的引物從表達基因的mRNA合成cDNA庫，隨後用另一種限制酶消化cDNA庫；2)從上述cDNA庫中純化包括多聚腺苷酸序列的片段，以及將片段與接頭-A或接頭-B連接，兩者都包括III限制酶的識別序列；3)用III型限制酶消化上述片段，以及在進行3』-填充反應後將得到的包括接頭-A的片段與得到的包括接頭-B的片段連接；和4)用步驟1)的另一種限制酶消化上述連接的片段，以便將接頭序列切割下來，因此獲得雙標誌-寡核苷酸。
9.權利要求7或8的雙標誌-寡核苷酸，其中通過兩個來自不同被表達基因的標誌的隨機聯合製備雙標誌-寡核苷酸。
10.權利要求7、8或9的雙標誌-寡核苷酸，其中III型限制酶是EcoP15I
11.權利要求10的雙標誌-寡核苷酸，其中另一種限制酶是NlaIII。
12.權利要求11的雙標誌-寡核苷酸，其中接頭-A和接頭-B是互不相同的雙鏈DNA並且通過將下列DNA(1)的第一鏈與DNA(2)的第二鏈退火而製備；DNA(1)5』-N30-40-CAGCAGCATG-3』DNA(2)3』-N30-40-GTCGTC-5』其中，DNA(1)的N30-40和DNA(2)的N30-40是相互互補的30到40個任意的核苷酸序列，其中可標記DNA(1)的5』末端以及可氨基修飾DNA(2)的3』末端。
13.包括至少兩個權利要求7到12中任何一項的雙標誌-寡核苷酸的多核苷酸。
14.權利要求13的多核苷酸，其中多核苷酸包括2到200個雙標誌-寡核苷酸。
15.一種基因表達分析的方法，包括分析權利要求13或14的多核苷酸的核苷酸序列，以及基於與多核苷酸中所包含的被表達基因對應的標誌的數量對被表達基因的表達水平進行定量。
16.一種基因表達分析的方法，包括下列步驟1)使用包括寡-dT和III型限制酶識別序列的引物從被表達基因的mRNA合成cDNA庫，隨後用另一種限制酶消化cDNA庫；2)從上述cDNA庫中純化包括多聚腺苷酸序列的片段，以及將片段與接頭-A或接頭-B連接，兩者都包括III限制酶的識別序列；3)用III型限制酶消化上述片段，以及在進行3』-填充反應後將得到的包括接頭-A的片段與得到的包括接頭-B的片段連接；和4)用步驟1)的另一種限制酶消化上述連接的片段，以便將接頭序列切割下來，因此獲得包括兩個超過25個核苷酸並且能鑑定所表達基因的雙標誌-寡核苷酸；5)將雙標誌-寡核苷酸連接起來產生多核苷酸；6)分析上述多核苷酸的核苷酸序列，以及基於與多核苷酸中所包含的被表達基因對應的標誌的數量對被表達基因的表達水平進行定量。
17.權利要求16的方法，其中III型限制酶是EcoP15I。
18.權利要求17的方法，其中另一種限制酶是NlaIII。
19.權利要求18的方法，其中接頭-A和接頭-B是互不相同的雙鏈DNA並且通過將下列DNA(1)的第一鏈與DNA(2)的第二鏈退火而製備；DNA(1)5』-N30-40-CAGCAGCATG-3』DNA(2)3』-N30-40-GTCGTC-5』其中，DNA(1)的N30-40和DNA(2)的N30-40是相互互補的30到40個任意的核苷酸序列，其中可標記DNA(1)的5』末端以及可氨基修飾DNA(2)的3』末端。
20.分離包括超過25個核苷酸並且能鑑定表達基因的標誌的試劑盒，包括下列成分a)由序列5』-N18-25-CAGCAG-T15-25-3』定義的RT引物，其中N18-25是不包括序列5』-CAGCAG-3』和序列5』-CATG-3』的18到25個任意的核苷酸序列，其中RT引物的5』末端可生物素化；b)接頭-A和接頭-B是互不相同的雙鏈DNA並且通過將下列DNA(1)的第一鏈與DNA(2)的第二鏈退火製備；DNA(1)5』-N30-40-CAGCAGCATG-3』DNA(2)3』-N30-40-GTCGTC-5』其中，DNA(1)的N30-40和DNA(2)的N30-40是相互互補的30到40個任意的核苷酸序列，並且可標記DNA(1)的5』末端以及可氨基修飾DNA(2)的3』末端；c)能與上述接頭-A或接頭-B雜交的引物。
21.權利要求20的試劑盒，進一步包括EcoP15I和/或NlaIII。
全文摘要
用III型限制酶EcoP15I從被表達基因的cDNA中分離包括超過25個核苷酸並能鑑定所表達基因的標誌，其中標誌的3』末端通過III型限制酶的切割位點確定，標誌的5』末端通過最接近被表達基因的cDNA 3』末端的另一種限制酶的切割位點確定。本發明的標誌允許進行準確定量基因表達分析以及在沒有可利用的被表達序列標誌(EST)資料庫的任何生物體中進行快速的基因表達譜分析。
文檔編號C12N15/10GK1802439SQ0382676
公開日2006年7月12日 申請日期2003年5月9日 優先權日2003年5月9日
發明者彼得·溫特, 岡特·卡爾, 德特列夫·克魯格, 史蒂芬尼·賴克, 松村英生, 寺內良平 申請人:巖手縣