增加植物中果實大小的方法

2023-06-24 01:54:56 5

專利名稱：增加植物中果實大小的方法
本申請要求1997年6月27日申請的美國臨時申請號60/051,030的優先權，其全文內容在本文作為參考文獻引用。
本發明由國家科學基金授予的DCB9018749和MCB9408042政府資助完成。政府在本發明中享有一定的權利。
本發明背景發明領域本發明一般涉及植物分子生物學和遺傳工程，更具體地說涉及生產遺傳修飾的種子植物，從該植物中可獲得增大或減小的種子或果實。
背景信息種子和果實生產是數十億美元的商品產業，在美國的許多州和世界的許多國家它是收入的主要來源。具有商業價值的種子包括，例如，油菜籽，棉籽和向日葵籽，它們由於可從種子中榨取植物油而且有價值。諸如豌豆，蠶豆和小扁豆的豆科植物的種子也具有商業價值，因為它們富含蛋白質，例如，大豆含有40-45％的蛋白質和18％的脂肪及油脂。另外，咖啡是一種有價值的作物，它從小果咖啡(Coffeaarabica)植物乾燥並烘烤的種子製備，而巧克力則從可可樹種子或「咖啡豆」製得。同樣，許多果實是有商業價值的，例如，包括玉米，水稻、小麥、大麥和其它穀類，堅果、豆科植物，西紅柿和柑桔屬果實。
遺憾的是，種子和果實生產均受到內在因素的限制，例如，合適的生長季節和生長條件，包括有限的耕地資源。另外，種子和果實生產受到從植物獲得的產量的限制，該產量是所產生的種子和果實平均大小的部分函數。因此，增加種子植物種子或果實產量的方法將有助於抵消特別是隨著世界人口的持續膨脹而對食物需求的增加。因此，需要開發從載培植物中增加種子和果實產量的方法。本發明滿足了這一需要並提供了有關的益處。
本發明小結本發明提供了一種非天然存在的種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子。AGL8-相關基因產物可以基本上具有例如AGL8定向進化同源物，如擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
在一個實施方案中，本發明提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的外源性核酸分子而產生增大的種子。編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子可與諸如組成型調節元件或種子選擇性調節元件的外源性調節元件有效連接。另外，本發明提供了一種組織。例如種子，它來自本發明的非天然存在的種子植物。
本發明進一步提供了生產非天然存在的種子植物的方法，所述種子植物的特徵在於產生增大的種子。經過在種子植物中異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子而實施該方法，其中由於異位表達該核酸分子而增大了種子。在另一個實施方案中，經過將編碼AGL-8相關基因產物的外源性核酸分子導入種子植物而實施該方法。
本文還提供了用於產生轉基因種子植物的試劑盒，該植物的特徵在於產生增大的種子。本發明的試劑盒包括編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子和種子選擇性調節元件。在本發明的試劑盒中，AGL8-相關基因產物基本上具有例如，AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。如果需要，用於製備以產生增大種子為特徵的轉基因種子植物的試劑盒可包括含有可操作地連接到種子選擇性調節元件上的編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的植物表達載體。
本發明還提供了一種非天然存在的種子植物，其特徵在於由於抑制AGLS-相關基因產物表達而產生減小的種子。AGL8-相關基因產物基本上具有，例如，AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。在一個實施方案中，AGL8-相關基因產物的表達在種子組織中被選擇性抑制。另外，本發明提供了一種組織，如種子，它來自非天然存在的種子植物，其特徵在於由於AGL8-相關基因產物的表達受抑制而產生減小的種子。
本文進一步提供了一種非天然存在的種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-家族基因產物的核酸分子而產生增大的果實。AGL8-家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列，例如，擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
在有關實施方案中，本發明提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-家族基因產物的外源性核酸分子而產生增大的果實。編碼AGL8-家族基因產物的外源性的異位表達的核酸分子可有效連接到外源性調節元件上，該調節元件可以是，例如，組成性調節元件或殼瓣(valve)選擇性調節元件。
本文提供了來自非天然存在的種子植物的組織，其特徵在於該植物由於異位表達編碼AGL8-家族基因產物的核酸分子而產生增大的果實。例如，本發明提供了來自非天然存在的種子植物的果實。
本發明還提供了生產非天然存在的種子植物的方法，該植物的特徵在於產生增大的果實。該方法包括在該種子植物中異位表達編碼AGL8-家族基因產物的核酸分子的步驟，其中由於異位表達該核酸分子而增大果實大小。在一個實施方案中，該方法包括向該種子植物中導入編碼AGL8-家族基因產物的外源性核酸分子。
本發明進一步提供了產生其特徵在於產生增大的果實的轉基因種子植物的試劑盒。該試劑盒包括編碼AGL8-家族基因產物的核酸分子以及心皮瓣選擇性調節元件。例如，該AGL8-家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。如果需要，本發明的試劑盒可包括含有可操作連接到心皮瓣選擇性調節元件上的編碼AGL8-家族基因產物的核酸分子的植物表達載體。
本發明進一步提供了其特徵在於產生減小的果實的非天然存在的種子植物，其中AGL8-家族基因產物的表達受抑制。在這種非天然存在的種子植物中，AGL8-家族基因產物基本上具有例如，AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。在一個實施方案中，AGL8-家族基因產物的表達在心皮瓣組織中選擇性地被抑制。本文還提供了一種組織，如果實，它來自非天然存在的種子植物，該植物的特徵在於產生減小的果實，其中AGL8-家族基因產物的表達受到抑制。
附圖的簡要描述

圖1顯示了擬南芥屬AGL8的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
本發明的詳細描述本發明提供了非天然存在的種子植物，該植物的特徵在於由於異位表達編碼ALG8-相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子。AGL8-相關基因產物基本上具有例如，AGL8定向進化同源物，如擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
在一個實施方案中，本發明提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的外源性核酸分子而產生增大的種子。編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子可被有效連接到外源性調節元件，如組成型調節元件或種子選擇性調節元件上。
本發明涉及一種令人驚奇的發現，即AGL8轉錄因子調節植物中種子的大小。如本文所述，使用DsE增強子捕獲(trap)轉座元件和GUS報導基因(Sundaresan等，基因進展，91797-1810(1995))，本文作為參考文獻引用)經過對擬南芥屬的Ds轉座子插入誘變產生AGL8功能喪失突變體。選擇轉座事件並篩選報導基因表達型和突變表型。突變影響心皮瓣的細胞分化，胎座框外表皮與兩個心皮瓣融合產生鋸齒形圖案。突變植物的種子除了其形狀較小外看起來正常，且與野生型一樣保持4排排列。然而，在果實內種子高度緻密，且每個果實內種子數目減少到野生型植物產生的種子數的大約75％。
正如本文進一步所公開的，擬南芥屬AGL8的過度表達導致與野生型擬南芥屬產生的種子相比產生增大的種子。如實施例I所述，在串聯的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子控制下的AGL8(SEQ IDNO2)的組成型表達導致產生異常大小的種子，其大小大約是野生型植物產生的種子大小的3倍。鑑於在玉米中AGL8定向進化同源物SaMADS B的存在和表達，以及AGL定向進化同源物的存在和表達，本領域的技術人員將認識到AGL8-相關基因產物，如AGL8定向進化同源物可在本發明的方法中用於產生，例如，具有本文公開的特徵的轉基因植物。因此，本發明提供了非天然存在的種子植物，如轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子。
本文所用的術語「非天然存在的」用於指種子植物時，意思是經人工進行遺傳修飾的種子植物。例如，本發明的轉基因種子植物是非天然存在的種子植物，它含有外源性核酸分子，如編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子，因此，它是經人工遺傳修飾的。另外，例如，在內源性AGL8相關基因產物調節元件或編碼序列中由於適當接觸誘變劑，如化學誘變劑或「插入誘變劑」，如轉座子而含有突變的種子植物也認為是非天然存在的種子植物，因為它是經人工遺傳修飾的。相反，僅含自發或天然存在的突變的種子植物不是本文定義的「非天然存在的種子植物」，因此不包含在本發明內。本領域的技術人員應明白，儘管非天然存在的種子植物一般是有與天然存在的種子植物相比被改變的核苷酸序列，但非天然存在的種子植物也可經人工進行遺傳修飾而不改變其核苷酸序列，例如經過修飾其甲基化方式。
本文所用的術語「異位地」當指核酸分子的表達時，指的是其表達方式不同於野生型種子植物的表達方式。因此，本領域的技術人員應明白編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的異位表達是指在正常表達該核酸分子的細胞類型之外的細胞類型中表達，或在正常表達該核酸分子的時期之外的時期表達，或與正常表達該核酸分子的水平不同的水平上表達。在野生型擬南芥屬中，例如，AGL8的表達正常情況下局限於花發育晚期在心皮瓣內表達，在種子中看不到表達。然而，在組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒35S啟動子的控制下，AGL8在種子中表達，另外在心皮瓣組織中以高於正常水平的水平表達，因此是異位表達。
本文所用的術語「增大」當指由本發明的非天然存在的種子植物產生的種子時，意思是與缺乏異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的相應種子植物，如野生型種子植物產生的種子的體積或乾重相比，種子體積或乾重明顯更大。如本文實施例I所公開的，來自異位表達AGL8(SEQ ID NO2)的轉基因擬南芥屬植物的種子產生更大體積和更大重量的種子，表現出比野生型擬南芥植物產生的種子乾重幾乎重3倍。例如，增大可由種子中細胞數的增加而產生。
應認識到由特定種子植物種類或品種產生的種子大小存在天然變化。然而，由使用本發明方法的種子植物產生的增大種子可經過對產生的種子群體取樣並測定比缺乏異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的相應種子植物品種產生的種子的正態分布平均更大的種子大小的正態分布來較容易地測定。因此，本發明非天然存在的種子植物的生產提供了偏離種子植物產生的種子大小的正態分布的方法，使種子體積或乾重平均比不含異位表達編碼ALG8-相關基因產物的核酸分子的相應種子植物種類至少增大大約5％，10％，20％，30％，50％，75％，100％，200％，300％，400％或500％。
本發明涉及使用編碼特定「AGAMOUS-LIKE」或「AGL」基因產物的核酸分子。AGAMOUS(AG)是一種花器官特性的基因，是轉錄因子相關家族的一個基因，該因子以各種組合限定花器官心皮瓣，萼片，雄蕊和心皮的特性(Bowman等，Devel.1121-20(1991)；Weigel和Meyerowitz，Cell，78203-209(1994)；Yanofsky，Annual Rev.PlantPhysiol.Mol.Biol.46167-188(1995))。AGAMOUS基因產物是限定心皮和雄蕊特性所必需的(Bowman等，The Plant Cell.137-52(1989)；Yanofsky等，Nature 34635-39(1990)。最近已鑑定了相關的基因並稱為「AGAMOUS-LIKE」或「AGL」基因(Ma等，GenesDevel.5484-495(1991)；Mandel和Yanofsky，The Plant Cell1763-1771(1995)，本文作為參考文獻引用)。
AGL8，象AGAMOUS和其它AGL基因一樣，其部分特徵在於它是植物MADS盒基因。植物MADS盒基因一般編碼具有大約260個胺基酸的蛋白質，其中包括大約56個胺基酸的高度保守的MADS結構域(Riechmann和Meyerowitz，Bol.chem.3781079-1101(1997)，本文作為參考文獻引用)。首先在擬南芥屬AGAMOUS基因和金魚草DEFICIENS基因中被鑑定的MADS結構域在人類(血清反應因子；SRF)和酵母(MCM1；Norman等，Cell，55989-1003(1988)；Passmore等，J.Mol.Biol.204593-606(1988)中發現的轉錄因子中是保守的，且是MADS結構域蛋白質最高度保守的區域。MADS結構域是序列特異性DNA結合活性的主要決定簇且也可進行二聚體化和其它輔助功能(Huang等，The Plant Cell 881-94(1996)。MADS結構域通常位於N-端，儘管有些蛋白質在MADS結構域的N端還含有其它的殘基。
位於MADS結構域相鄰C端的「間插結構域」或「I-結構域」是保守性較低的結構域，具有大約30個胺基酸的可變長度(Puruggananff等，Genetics.140345-356(1995))。在有些蛋白質中，I結構域在形成DNA結合二聚體中發揮作用。在植物MADS結構域蛋白質中存在的第三個結構域是中等保守的70個胺基酸的區域，稱為「角蛋白樣結構域」或「K-結構域」。因其相似於角蛋白分子的區域而得名，K結構域的結構似乎能形成兩親性螺旋並且可介導蛋白質-蛋白質相互作用(Ma等，Genes Devel.5484-495(1991))。在序列和長度上可變性最大的結構域是MADS結構域蛋白質的羧基末端或「C-結構域」。該區域在某些MADS結構域蛋白質中對於DNA結合和蛋白質二聚體化是非必需的，這種C-結構域的功能仍是未知的。
擬南芥屬AGL8是一個242個胺基酸的MADS盒蛋白質(SEQ IDNO2；Mandel和Yanofsky，同處同上，1995)。AGL8 MADS結構域位於SEQ ID NO2的胺基酸2至56。AGL8的K-結構域位於SEQ ID NO2的胺基酸92至158。
在野生型擬南芥屬中，在兩個不同的時期積累AGL8 RNA，第一個出現在莖和莖生葉中花序發育期間，第二個出現在花發育的晚期(Mandel和Yanofsky，出處同上，1995)。特別是，AGL8 RNA在植物剛從營養發育轉變為生殖發育時在花序分生組織中首先檢測到。隨著花序莖的伸長，AGL8 RNA在花序分生組織和莖中積累。其次，儘管在花發育的起始時期(1和2)不能檢測到AGL8，推測在大約第3時期在相應於第4(心皮)輪區域的花冠中央有AGL8表達。在所有其它的原基和花梗中不進行AGL8表達。在第4心皮輪中AGL8表達的時間一般相應於器官特性基因APETALA3，PISTILLATA和AGAMOUS開始表達的時間(Yanofsky等，自然，34635(1990)；Drews等，細胞，65991-1002(1991)；Jack等，細胞68683-697(1992)；Goto和Meyerowitz，Genes Devel.81548-1560(1994)。在晚期，AGL8表達開始位於心皮壁，在組成子房瓣的區域，而在心皮的幾乎所有其它細胞類型中均無表達。在胚珠，柱頭組織或分隔子房的隔膜中檢測不到AGL8 RNA表達。因此，在自發狀態下，花發育晚期AGL8表達局限於心皮瓣和花柱內的細胞中。
本文所用的術語「ALG8-相關基因產物」指與擬南芥屬AGL8具有相同或相似功能的基因產物，當它在種子植物中異位表達時，改變正常發育，導致產生增大的種子。擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)是本文限定的AGL8-相關基因產物的一個例子。如實施例I中所公開的，在串連CaMV35S啟動子控制下的擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)(其中內在啟動子元件已被複製)的異位表達改變了正常植物發育，導致產生大約3倍正常大小的種子。
一般來說，AGL8-相關基因產物的部分特徵在於含有MADS結構域。AGL8-相關基因產物的特徵還在於一般具有與擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO2)有至少大約50％胺基酸相同性的胺基酸序列。例如，AGL8-相關基因產物具有與擬南芥屬AGL8(SEQ IDNO2)大於大約65％的胺基酸序列相同性的胺基酸序列，優選與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)具有大於大約75％的胺基酸相同性，更優選與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)具有大於大約85％的胺基酸相同性，並可以是與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)具有大於大約90％，95％或97％胺基酸相同性的序列。
優選的是，AGL8-相關基因產物與異位表達它的種子植物種類是定向進化同源的。例如，編碼擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的核酸分子可在擬南芥屬植物中異位表達以產生其特徵為產生增大種子的非天然存在的擬南芥屬品種。同樣，例如，編碼canola AGL8的核酸分子可在canola植物中異位表達以產生出其特徵為增大的canola種子的非天然存在的canola品種。
編碼ALG8-相關基因產物的核酸分子也可在異源性種子植物中異位表達以產生其特徵在於產生增大種子的非天然存在的種子植物。AGL8-相關基因是AGAMOUS一類基因，它存在於大多數(如果不是全部)被子植物中。例如，AGAMOUS在西紅柿(TAG1)和玉米(ZAG1)中保守，表明AGAMOUS類基因產生在整個植物界中廣泛保守(Pnueli等，The Plant Cell，6163-173(1994)；Schmidt等，The PlantCell 5729-737(1993))。AGL8相關基因產物，如AGL8定向進化同源物也可能是保守的，且可在物種間交叉發揮功能以產生增大的種子。因此，例如，在芸苔科，如蔓青(油菜子)或在豆科，如大豆屬(大豆)中在異源性種子植物中異位表達編碼擬南芥屬AGL8(SEQ IDNO2)的核酸分子可改變正常發育並導致產生增大的種子。而且，例如，編碼擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的核酸分子可在親緣關係更遠的異源性種子植物，包括雙子葉和單子葉被子植物和裸子植物中被異位表達，且異位表達時可改變正常發育，導致異源種子植物產生增大的種子。
本文所用的術語「AGL8-相關基因產物」包括AGL8-相關基因產物的活性片段，它是AGL8-相關基因產物的多肽部分，當被異位表達時，可改變正常發育，使產生增大的種子。例如，活性片段可以是擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基末端，內部的，或羧基末端片段，當在種子植物中被異位表達時，它可改變正常發育，使產生增大的種子。例如，AGL8-相關基因產物的活性片段可包括MADS結構域，且可具有特異性結合DNA的能力。本領域的技術人員將認識到編碼AGL8-相關基因產物的活性片段的核酸分子可用於產生本發明的種子植物，該植物的特徵在於產生增大的種子，該核酸分子也可用於下文進一步描述的本發明的有關方法和試劑盒。
使用實施例I中所述的方法或使用其它常規方法可鑑定AGL8-相關基因產物的活性片段。簡單地說，諸如擬南芥屬的種子植物用在諸如串聯CaMV 35S啟動子的組成型調節元件控制下的核酸分子轉化。對種子植物的表型分析顯示異位表達特定多肽部分的種子是否產生增大的種子。為了分析大量的AGL8-相關基因產物的多肽部分，可在分子庫中測試編碼多肽部分的核酸分子，隨後進一步劃分出活性分子庫以鑑定活性核酸分子。
在一個實施方案中，本發明提供了非天然存在的種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列的AGL8-相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子。本文所用的術語「AGL8定向進化同源物」指擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的定向進化同源物並包括在特定種子植物品種中與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)在胺基酸水平上具有最高同源百分數。例如，AGL8定向進化同源物可以是芸苔屬AGL8定向進化同源物，如蔓青AGL8定向進化同源物，或豆科AGL8定向進化同源物，如大豆、豌豆，小扁豆或蠶豆AGL8定向進化同源物。已描述了來自長日照植物歐白芥的AGL8定向進化同源物，命名為SaMADS B(Menzel等，PlantJ.9399-408(1996)，本文作為參考文獻引用)。使用核苷酸序列作為探針並用分子生物學領域熟知的方法可從其它種子植物種類中分離新的AGL8定向進化同源物的cDNA(Glick和Thompson(編輯)，植物分子生物學和生物技術方法，Boca Raton，FLCRC出版社(1993)；Sambrook等(編)，分子克隆實驗手冊(第二版)，Plainview，NY冷泉港實驗室出版社(1989)，本文分別作為參考文獻引用)。
本文所用的術語「基本上具有胺基酸序列」，當用於指AGL8定向進化同源物時，意思是具有相同胺基酸序列的多肽或多肽片段，或具有相似，不相同的序列，被本領域的技術人員認為是功能上等價的胺基酸序列的多肽或多肽片段。例如，基本上具有擬南芥屬AGLB胺基酸序列的AGL8-相關基因產物可具有與擬南芥屬AGL8(SEQ IDNO2)的序列相同的胺基酸序列或功能等價的相似但不相同的序列。具體地說，基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列的基因產物可相對於SEQ ID NO2的AGL8胺基酸序列具有一個或多個修飾，如胺基酸增加，缺失或取代，包括保守的或非保守的取代，例如，只要將修飾的多肽基本上保留改變正常發育的能力使在種子植物中異位表達該核酸分子時可產生增大的種子。在任意長度的2個序列間進行基本相似的序列比較，通常在大約6個到1200個殘基間的序列上進行，優選大約10到100個殘基之間，更優選大約25到35個殘基之間。使用本領域的常規方法進行這種基本相似性的比較。
應明白對一級胺基酸序列的輕微修飾可產生AGL8-相關基因產物。與產生它的AGL8定向進化同源物相比基本上具有等價或增強的功能。另外，可將各種分子附著到AGL8定向進化同源物或其活性片段上，例如，其它多肽，抗原性或其它肽標記，糖類，脂類或化學基團。這種修飾包括在本文定義的術語AGL8定向進化同源物範圍內。
可將一個或多個點突變導入編碼AGL8定向進化同源物的核酸分子中以產生修飾的核酸分子，例如，可使用定點誘變法進行(參見Wu(編)，酶學方法，第217卷，San DiegoAcademic Press(1993)；Higuchi，「重組PCR」，Innis等(編)，PCR方法，San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)，本文分別作為參考文獻引用)。可使用這種誘變導入特定的，所需的胺基酸插入，缺失或取代；另外，可合成在一個或多個預定位置具有隨機核苷酸的核酸序列以產生隨機胺基酸取代。淘選誘變也可用於產生基本上編碼AGL8定向進化同源物胺基酸序列的修飾的核酸分子。
可按常規測試修飾的核酸分子改變正常植物發育使產生增大的種子的能力。按實施例I所述相同的方式，可異位表達基本上編碼AGL8定向進化同源物胺基酸序列的核酸分子，例如，使用組成型調節元件，如CaMV 35S啟動子或使用組織特異性調節元件，如下文進一步描述的種子選擇性調節元件。如果該異位表達導致種子植物產生增大的種子，這種修飾的多肽或片段就是本文所定義的「AGL8定向進化同源物」。
本發明的其特徵在於產生增大種子的非天然存在的種子植物可以是種子植物中的一個品種，包括單子葉或雙子葉被子植物或裸子植物。例如，本發明的有用的種子植物可以是芸苔科的一員，如油菜子，或是豆科的一員，如大豆，豌豆，小扁豆或蠶豆植物。
本文所用的術語「種子植物」指被子植物或裸子植物。被子植物是種子生於成熟的子房(果實)中的產種子的植物。被子植物通常被當作有花植物。被子植物根據子葉數目分成2大類，子葉一般是貯存或吸收營養的種子葉片。因此，單子葉被子植物是具有單片子葉的被子植物，而雙子葉植物是具有兩片子葉的被子植物。被子植物的品種是已知的，例如，包括油料種子植物，豆科植物，帶果實的植物，觀賞花卉，穀類植物和硬木樹，其一般分類不需排除在外。本領域的技術人員將認識到可按需要用這些或其它被子植物實施本發明的方法。本發明也可用裸子植物來實施，該植物是種子不被子房包圍的產種子的植物。
在一個實施方案中，本發明提供了一種非天然存在的種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子，其中該種子植物是芸苔科的一個成員。芸苔科常稱為「芸苔」，它是包括特別有價值的油料種子植物canola的作物植物的一個分支群體(例如，參見，Williams和Hill，科學，2321385-1389)1986，本文作為參考文獻引用)。芸苔科包括6個主要的種類，每種分別包含一類植物形式蔓菁，花椰菜，油菜(蕪菁)，芥菜；和Brassicacarinata。本領域的技術人員應明白芸苔科的任何成員可按本文所述進行修飾以產生其特徵在於產生增大的種子的非天然存在的芸苔種子植物。
本發明還提供了非天然存在的種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子，而該種子植物是豆科的一個成員。豆科通常稱為豆科的成員，它是產生稱為豆莢的特徵性乾裂果實的種子植物。豆科的成員，如產生諸如大豆(黃豆)，豌豆，鷹嘴豆，蛾豆，蠶豆，菜豆，利馬豆，小扁豆，豇豆，幹豆，或花生的顆粒豆莢的植物可按本文所述進行修飾以產生非天然存在的品種，該品種的特徵在於產生增大的種子。
本發明的其特徵在於產生增大種子的非天然存在的種子植物也可以是油料種子植物，如萼距屬(千屈菜科)植物的成員。萼距花屬種子植物特別有價值，因為萼距花屬油籽種子含有工業上和營養學上重要的中鏈脂肪酸，特別是月桂酸，通常僅能由椰子和棕櫚核油提供。可按本文公開的方法進行修飾以產生增大的種子的其它油料種子植物包括，例如，栽培的向日葵(Helianthus annuus L.)和棉花植物，如栽培以獲取棉籽的棉屬植物。
本發明的其特徵在於產生增大的種子的非天然存在的種子植物還可以是，例如，咖啡植物(小果咖啡)或可可植物(可可)。本領域的技術人員將認識到可按需要用這些或其它種子植物種類實施本發明以增加有商業價值的種子的產量。
本發明還提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的外源性核酸分子而產生增大的種子。在本發明的轉基因種子植物中，異位表達的編碼AGL8-相關基因產物的外源性核酸分子可有效連接到外源性調節元件上。在一個實施方案中，本發明提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於產生增大的種子，它具有異位表達的有效連接到組成型調節元件上的編碼AGL8-相關基因產物的外源性核酸分子。例如，本發明提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達有效連接到花椰菜花葉病毒35S啟動子上的基本上編碼AGL8定向進化同源物的胺基酸序列的外源性核酸分子而產生增大的種子。在另一實施方案中，本發明了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達有效連接到種子選擇性調節元件上的編碼AGL8-相關性基因產物的外源性核酸分子而產生增大的種子。
本文所用的術語「轉基因」指含有外源性核酸分子的種子植物，該核酸分子可來自相同的種子植物種類或來自異源性種子植物種類。
本文所用的術語「外源性」指核酸分子和轉基因種子植物時，指來自該種子植物之外的核酸分子。外源性核酸分子可以具有天然存在的或非天然存在的核苷酸序列。本領域的技術人員應明白，外源性核酸分子可以是來自與導入該核酸分子的種子植物不同的種子植物種類的異源性核酸分子或可以是來自與被導入的種子植物相同的種子植物種類的核酸分子。
術語「有效連接」用於指調節元件和核酸分子，如編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子時，指調節元件對有效連接的核酸分子提供調節表達。因此，術語「有效連接」用於指諸如組成型調節元件的外源性調節元件和編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子時指組成型調節元件與編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子連接使組成型調節元件的表達方式提供給編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子。應認識到被有效連接的調節元件和核酸分子應最少具有用於轉錄所必需的所有元件，例如，包括TATA盒。
本文使用的術語「組成型調節元件」指給有效連接的核酸分子提供表達水平的調節元件，該核酸分子相對獨立於表達組成型調節元件的細胞或組織類型。在種子植物中表達的組成型調節元件一般廣泛地在細胞和組織類型中大量表達。
在本發明的轉基因種子植物中異位表達有用的各種組成型調節元件是本領域熟知的。例如，花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)啟動子是被充分鑑定的組成型調節元件，它在所有植物組織中產生高水平的表達(Odell等，Nature 313810-812(1985))。CaMV 35S啟動子由於其在許多不同的種子植物種類中具有活性而特別有用(Benfey和China，科學，225959-966(1990)；Futterer等，植物生理學，79154(1990)；Odell等，出處同上，1985)。其中內部啟動子元件已被複製的串聯35S啟動子與非修飾的35S啟動子相比提供更高的表達水平(Kay，等，科學，2361299(1987)。在本發明的轉基因種子植物中異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子有用的其它組成型調節元件包括，例如，花椰菜花葉病毒19S啟動子；玄參花葉病毒啟動子；和胭脂氨酸合酶(nos)基因啟動子(Singer等，植物分子生物學，14433(1990)；An，植物生理學，8186(1986))。
其它的組成型調節元件，包括那些在單子葉植物中有效異位表達的元件也是本領域已知的，例如pEmu啟動子和水稻Actin-15』區為基礎的啟動子(Last等，Theor.Appl.Genet.81581(1991)；Mcelroy等，Mol.Gen.Genet.231150(1991)；Mcelroy等，Plant Cell 2163(1990))。組成來自不同基因的元件得到的嵌合調節元件也可用於異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子(Comai等，PlantMol.Biol15373(1990)。本領域的技術人員應明白，具體組成型調節元件的選擇部分以異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的種子植物種類和以所需的表達水平為基礎。
本文的術語「種子選擇性調節元件」指當有效連接到核酸分子上時，給有效連接的核酸分子在有限數量的植物組織，包括一種或多種種子組織中提供選擇性表達的核苷酸序列。種子選擇性調節元件可專一性地在種子組織中提供特異性表達，或可在有限數量的植物組織，包括一種或多種組織中提供選擇性表達。
例如，種子選擇性調節元件可來自在種子植物的種子組織中選擇性表達的各種基因，例如，在種皮、胚乳或種子胚中選擇性表達的基因(例如，參見West和Harada，Plant Cell，51361-1369(1993)，和Goldberg等，科學，266506-614(1994)，本文分別作為參考文獻引用)。例如，AGL15基因是在種子中選擇性表達的基因，其描述參見Helk等，Plant Cell，71271-1282(1995)和Perry等，Plant Cell 81977-1989(1996)，本文分別作為參考文獻引用。因此，AGL15啟動子或其活性片段可以是本文所定義的種子選擇性調節元件。1511種皮基因也在種皮中選擇性表達，因此，1511啟動子或其活性片段，如可以GenBank登記號AC000375獲得的基因組序列的片段可以是種子選擇性調節元件。玉米醇溶蛋白貯存蛋白基因的啟動子或活性片段也可以是有用的種子選擇性調節元件，例如在種子胚乳中選擇性表達的編碼22Kda蛋白質的基因(Burr等，J.Mol.Biol.15433-49(1982)；Aukerman等，Genes Devel.5310-320(1991)；和Schmidt等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8746-50(1990)，本文分別作為參考文獻引用)。諸如SHOOTMERISTEMLESS的其它基因已知在種子胚中選擇性表達；SHOOTMERISTEMLESS啟動子或其活性片段，如可從GenBank登記號AC003113中獲得的序列的片段也可以是在實施本發明中有用的種子選擇性調節元件(Long等，Nature 37966-69(1996)，本文作為參考文獻引用)。本領域的技術人員應明白，在種子組織中選擇性表達的任何這類基因的調節元件均可以是本文限定的種子選擇性調節元件，只要該元件給有效連接的核酸分子在一種或多種種子組織中提供選擇性表達。
使用常規方法可鑑定和分離其它的種子選擇性調節元件。例如，使用從種皮，胚乳或種子胚製備的RNA和從非種子組織，如根或葉組織製備的RNA的不同篩選方案可用於分離在種子中選擇性表達的cDNA；隨後，使用cDNA序列作探針分離相應的基因。
也可使用增強子捕獲或基因捕獲方案鑑定和分離本發明的種子選擇性調節元件(Sundaresan等，出處同上，1995；Springer等，Science268877-880(1995)；Koncz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868467-8471(1989)；Kertbundit等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885212-5216(1991)；Topping等.Development 1121009-1019(1991)，本文分別作為參考文獻引用)。增強子捕獲元件包括報導基因，如具有弱或最小啟動子的GUS，而基因捕獲元件缺乏啟動子序列，依賴於從側翼染色體基因進行轉錄而實現報導基因表達。包含在構建體中的可轉座元件介導與內源性基因座的融合；選擇性地在種子組織，如在種皮，胚乳或種子胚中表達的構建體以其表達方式被鑑定。用插入元件作為標記，使用例如，反向聚合酶鏈式反應方法克隆側翼的種子選擇性調節元件(例如，參見，Aarts等，Nature，363715-717(1993)；也參見Ochman等，「以反向PCR擴增側翼序列」，Innis等，Supra，1990)。Sundaresan等，出處同上，1995的AC/DS轉座系統在鑑定和分離本發明的種子選擇性調節元件中特別有用。
經過在無啟動子的報導基因前插入隨機基因組DNA片段的文庫並篩選用種子選擇性報導基因表達文庫轉化的轉基因種子植物也可分離種子選擇性調節元件。含有分別在最小35S啟動子控制下的npt基因和GUS基因的無啟動子載體pROA97也可用於這種篩選。基因組文庫可以是，例如，擬南芥基因組DNA或來自，例如，另一芸苔科，豆科或感興趣的油料種子植物的基因組DNA的Sau 3A片段(Ott等，Mol.Gen，Genet.223169-179(1990)；Claes等，The Plant Journal 115-26(1991)，在本文中分別作為參考文獻引用)。
本發明的調節元件的種子選擇性表達可用常規技術證實，例如，使用報導基因和原位表達分析。GUS和螢火蟲螢光素酶報導基因對於植物基因表達的原位定位特別有用(Jefferson等，EMBO J.63901(1987)；Ow等，Science，34856(1986)，在本文中分別作為參考文獻引用)；含有GUS表達盒的無啟動子載體可作為商品獲得，例如，來自Clontech(Palo Alto，CA)。為了鑑定種子選擇性調節元件，使用酶或以PCR為基礎的方法產生所需的核酸分子(Glick和Thompson，出處同上，1993)；Innis等，出處同上，1990)；所得的片段與報導基因如GUS融合，並按上述進行分析。
本發明的在轉基因種子植物中有用的外源性調節元件也可以是可誘導的調節元件，它是一種對有效連接的核酸分子提供條件表達的調節元件，其中有效連接的核酸分子的表達在特定誘導劑或刺激劑存在的條件下與沒有誘導劑或刺激劑時核酸分子的表達相比增加。特別有用的誘導調節元件包括銅誘導調節元件(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904567-4571(1993)；Furst等，Cell 55705-717(1988))；四環素和氯四環素誘導調節元件(Gatz等，Plant J.2397-404(1992)；Roder等，Mol.Gen.Genet，24332-38(1994)；Gatz，Meth.Cell Biol.50411-424(1995))；蛻皮激素誘導調節元件(Christopherson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896314-6318(1992)；Kreutzweiser等，Ecotoxicol.Environ.Safety 2814-24(1994))；熱休克誘導調節元件(Takahashi等，Plant Physiol.99383-390(1992)；Yabe等，Plant Cell Physiol 351207-1219(1994)；Ueda等，Mol.Gen.Genet.250533-539(1996))；和乳糖操縱子元件，它用於與組成型表達的乳糖抑制子組合以提供，例如，IPTG誘導的表達(Wilde等，EMBO J.111251-1259(1992))。
在本發明的轉基因種子植物中有用的誘導調節元件也可以是，例如，來自菠菜亞硝酸還原酶基因的硝酸鹽誘導啟動子(Backt等，PlantMol.Biol.179(1991))或光誘導啟動子，如與RuBP羧化酶的小亞基或LHCP基因家族相聯的啟動子(Feinbaum等，Mol.Gen.Genet.226449(1991)；Lam和Chua，Science 248471(1990))。其它誘導調節元件包括水楊酸誘導調節元件(Uknes等，Plant Cell5159-169(1993)；Bi等，Plant J.8235-245(1995)；植物激素誘導調節元件(Yamaguchi-Shinozaki等，Plant Mol.Biol.15905(1990)；Kares等，Plant Mol.Biol.15225(1990))；和人激素誘導調節元件，如人糖皮質激素反應元件(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421(1991))。
本發明進一步提供了來自非天然存在的種子植物的組織，該植物的特徵在於由於異位表達編碼AGL8相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子。特別有價值的組織可以是，例如種子。
本文所用的術語「組織」指種子植物細胞的聚集體以及組織成一種結構和功能單位的細胞間物質。本發明的組織可以是，例如，種子，果實，葉，根或其部分。本發明特別有用的組織是種子或果實。本發明特別有用的組織也可以是營養或非營養繁殖的組織以便再生產生該組織的種子植物。
本文所用的術語「種子」指受精後種子植物的胚珠成熟形成的結構。從本發明的非天然存在的種子植物很容易收穫這類種子。
應認識到含有異位表達的編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的本發明的非天然存在的種子植物也可含有一個或多個其它的修飾，包括天然和非天然存在的突變，例如該突變可調節種子大小的增大。
本發明進一步提供了產生非天然存在的種子植物的方法，該植物的特徵在於產生增大的種子。經過在種子植物中異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子，而由於該核酸分子的異位表達而增大種子大小來實施該方法。在一個實施方案中，經過將編碼AGL8-相關基的的核酸分子導入種子植物來實施該方法。
如上文所討論的，術語「異位」指編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的表達在正常表達該核酸分子的細胞類型以外的細胞類型，在正常表達該核酸分子的時期以外的時期或以與正常表達該核酸分子的水平不同的表達水平進行。
AGL8-相關基因產物實際的異位表達取決於各種因素。異位表達可在大多數或所有植物組織中廣泛進行或可局限於在少數植物組織中表達，且可經過各種常規技術實現。包括種子或花粉誘變的誘變可用於產生非天然存在的種子植物，其中異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子。乙基甲磺酸(EMS)誘變，轉座子介導的誘變或T-DNA介導的誘變也可用於異位表達AGL8-相關基因產物以產生種子增大的種子植物(一般參見Glick和Thompson，出處同上，1993)。儘管不希望受任何具體機制的限制，但誘變植物中的異位表達可由一個或多個AGL8負調控物的失活引起，例如，由AGL1和AGL5一起失活引起。
AGL8-相關基因產物的異位表達由從異源調節元件或以其自身啟動子的修飾變異體表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子來實現。異源性調節元件包括組成型調節元件和種子選擇性調節元件，前者導致在種子以及各種其它細胞類型中表達AGL8-相關基因產物，後者在有限的植物組織，包括一種或多種種子組織中使AGL8-相關基因產物產生選擇性表達。
使用內源性或外源性編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子可實現編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的異位表達。重組外源性核酸分子可含有有效連接編碼AGL8-相關基因產物的核酸序列的異源調節元件。產生在異源性調節元件控制下的所需重組核酸分子和產生本發明的非天然存在的種子植物的方法是本領域熟知的(一般參見，Sambrook等，出處同上，1989，Glick和Thompson，出處同上，1993)。
使用各種轉化方法，包括土壤桿菌介導的轉化和諸如電穿孔和微粒介導的轉化的直接基因轉移方法可將外源性核酸分子導入異位表達的種子植物中(一般參見，Wang等(編)，植物和土壤微生物的轉化，Cambridge，UKUniversity Press(1995)，本文作為參考文獻引用)。基於土壤細菌根癌土壤桿菌的轉化方法對於將外源性核酸分子導入種子植物特別有用。土壤桿菌的野生型含有Ti(腫瘤誘導)質粒，它導致在宿主植物上產生致瘤的冠狀菌癭生長。將Ti質粒的腫瘤誘導T-DNA區域轉移進植物基因組需要Ti質粒編碼的毒性基因以及T-DNA邊界，它是劃定轉移區域的一組直接DNA重複。以土壤桿菌為基礎的載體是Ti質粒的修飾形式，其中腫瘤誘導功能被要導入植物宿主的感興趣的核酸序列所取代。
土壤桿菌介導的轉化一般採用共整合載體，或優選雙重載體系統，其中Ti質粒的組份被分開在永久位於土壤桿菌宿主中並攜帶毒性基因的輔助載體和含有以下T-DNA序列為邊界的目的基因的穿梭載體之間。各種雙重載體是本領域所熟知的且是商業上可獲得的，例如，來自Clontech(Palo Alto，CA)。例如共同培養土壤桿菌與培養的植物細胞或愈傷組織，如葉組織，根外植體，下胚軸，莖片或塊莖的方法也是本領域熟知的(Glick和Thomson，出處同步，1993)。受土壤桿菌感染的植物組織內愈傷細胞在合適的條件下培養時可從頭髮育成器官；所得的轉基因幼苗最終產生異位表達編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子的轉基因植物。土壤桿菌也可用於轉化整株種子植物，其描述參見Bechtold等，C.R.Acad.Sc.Paris，Life Sci.3161194(1993)，本文作為參考文獻引用)。土壤桿菌介導的轉化用於產生各種轉基因種子植物(Wang等，出處同上，1995)，包括芸苔科的轉基因植物，如油菜子和亞麻，以及豆科的轉基因植物，如大豆，豌豆，小扁豆和蠶豆。
微粒介導的轉化也可用於產生異位表達AGL8-相關基因產物的轉基因種子植物。首先由Klein等(Nture 32770-73(1987)，本文作為參考文獻引用)描述的這種方法依賴於諸如金或鎢的微粒，該微粒經過與氯化鈣，亞精胺或PEG沉澱用所需的核酸分子覆蓋。使用諸如BIOLISTIC PD-1000(Biorad；Hercules CA)的裝置將微粒以高速度加速進入被子植物組織。
微粒介導的轉移或「粒子轟擊」對於轉化使用其它方法難以轉化或再生的種子植物特別有用。例如，微粒介導的轉化用於產生各種轉基因植物種類，包括棉花，菸草，玉米，雜交楊和番木瓜(參見Glick和Thompson，出處同上，1993)以及穀類作物，如小麥，燕麥，大麥，蜀黍和水稻(Duan等，Nature Biotech.14494-498(1996)；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.5158-162(1994)，在本文中分別作為參考文獻引用)。綜上所述，本領域的技術人員將認識到本文公開的土壤桿菌介導的或微粒介導的轉化或本領域已知的其它方法可用於產生本發明的轉基因種子植物。
如本文所述，agl8突變體植物與野生型擬南芥屬植物產生的種子相比具有較小的種子。因此，除了上述實施方案外，本發明還提供了一種非天然存在的種子植物，其特徵在於由於AGL8-相關基因產物表達受抑制而產生減小的種子。例如，該AGL8-相關基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。在一個實施方案中，AGL8一相關基因產物的表達在種子組織中被選擇性抑制。另外，本發明還提供了一種組織，如種子，它來自非天然存在的種子植物，該植物的特徵在於由於AGL8-相關基因產物表達受抑制而產生減小的種子，可按本文所述修飾以產生減小的種子的特別有價值的種子植物種類包括，例如，產生棉籽的為布料生產而栽培的植物，黃瓜植物，西紅柿植物，柑桔樹和西瓜植物。
本文所用的術語「減小」當指由本發明的非天然存在的種子植物產生的種子時，意思是與AGL8-相關基因產物的表達未抑制的相應種子植物，如野生型種子植物產生的種子的體積或乾重相比體積或乾重明顯減少。尺寸減小的種子可具有的體積或乾重平均不超過相應野生型種子植物產生的種子體積或乾重的大約9/10，8/10，7/10，5/10，3/10，2/10或1/10。
本文所用的術語「抑制」指AGL8-相關基因產物的表達時意思是在種子植物中的功能性AGL8-相關基因產物的量與在相應野生型種子植物中功能性AGL8-相關基因產物的量相比減少。因此，本文所用的術語「抑制」包含在種子植物中缺乏AGL8-相關基因產物，以及存在AGL8-相關基因產物的表達，但其水平與野生型種子植物中該基因產物的水平相比減少。而且，術語抑制指AGL8-相關基因產物的表達在AGL8相關基因產物表達的全部結構域中減少，或指在AGL8相關基因產物表達結構域的某部分中表達減少，只要所得的種子植物具有產生減小的種子的特徵。
本文所用的術語「抑制」還包含AGL8-相關基因產物的量相當於相應野生型種子植物中AGL8-相關基因產物的量，但其中AGL8-相關基因產物的活性水平下降。如上所述，AGL8-相關基因產物可含有保守的MADS結構域，因此，例如，在MADS結構域內減少AGL8-相關基因產物的DNA結構活性的點突變或總體缺失會降低或破壞其活性，因而「抑制」本文所定義的AGL-相關基因產物的表達。本領域的技術人員將認識到，在一個實施方案中，AGL8相關基因產物表達基本上在種子植物中缺乏或AGL8相關基因產物基本上無功能。
可使用各種方法抑制種子植物中AGL8-相關基因產物表達。經過直接修飾AGL8-相關基因產物的基因組基因座，例如，經過修飾AGL8定向進化同源物的調節序列使從AGL8定向進化同源性基因座的轉錄或翻譯減少，或經過修飾AGL8定向進化同源物的編碼序列使產生無功能的AGL8相關基因產物可實現抑制。種子植物中AGL8-相關基因產物表達的抑制也可間接實現，例如，經過修飾調節AGL8相關基因產物表達的蛋白質的表達或活性實現。實現種子植物中的AGL8相關基因產物表達抑制的方法包括，例如，同源重組，化學和轉座子介導的誘變，共抑制和基於反義核酸的技術以及顯性失活方法。
AGL1或AGL5的同源重組可用於抑制種子植物中AGL8相關基因產物表達。植物中同源重組的使用已被描述，例如，參見Kempin等，自然，389802-803(1997)，本文作為參考文獻引用。
經過用Ds轉座子或Stm轉座子使用轉座子介導的插入誘變產生功能喪失突變也可實現AGL8-相關基因產物表達的抑制(例如，參見Sundaresan等，Genes Devel，91979-1810(1995)，本文作為參考文獻引用)。轉座子插入AGL8相關基因產物靶基因中的鑑定可使用，例如，限制性圖譜法，它可鑑定基因啟動子或編碼區域中插入的存在，插入導致功能性基因產物的表達受抑制。經過檢測靶基因編碼的mRNA的缺乏或經過檢測基因產物的不存在也可鑑定轉座子的插入，抑制AGL8相關基因產物的表達也可經過使用T-DNA介導的插入誘變產生功能喪失突變來實現(例如，參見，Krysan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 938145-8150(1996))。
種子植物中AGL8相關基因產物表達的抑制也可使用共抑制實現，共抑制是熟知的方法，它依賴於有義方向的核酸分子表達以產生導入的核酸分子和同源的內源性基因的協同沉默(參見，例如，Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，913490-3496(1994)；Kooter和Mol，Current Opin.Biol，4166-171(1993)，本文分別作為參考文獻引用)。用經過大量的轉基因拷貝或經過過度表達轉基因RNA可最強烈地誘導共抑制，經過修飾轉基因使其不能翻譯可增強共抑制。
編碼AGL8相關基因產物的反義核酸分子或其片段也可用於抑制種子植物中AGL8-相關基因產物的表達。反義核酸分子減少mRNA翻譯或增加mRNA降解，從而抑制基因表達(例如，參見，Kooter和Mol，出處同上，1993；Pnueli等，The Plant Cell，Vol.6.175-186(1994)，本文作為參考文獻引用)。
為了產生AGL8相關基因產物表達受抑制的非天然存在的種子植物，可在強調節元件，如組成型調節元件或上文所述的種子選擇性調節元件的控制下表達一個或多個有義或反義核酸分子。
本領域的技術人員將認識到有效抑制內源性AGL8相關基因產物表達依賴於與相應內源性基因座具有高同源百分數的一個或多個導入的核酸分子。本文提供了編碼擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的核酸分子。編碼擬南芥屬AGL8的核酸分子可用於本發明的方法或用於分離定向進化同源的AGL8序列。
使用同源重組，共抑制或反義方法進行有效抑制所需的同源性可憑經驗測定。一般來說，有效抑制AGL8相關基因產物表達優選最小具有大約80-90％的核酸序列相同性。因此，優選來自導入該核酸分子的種子植物科或屬的編碼基因定向進化同源物的核酸分子用於使用同源重組，共抑制或反義技術產生本發明的非天然存在的種子植物。更優選的是，使用來自相同種子植物種類的編碼基因定向進化同源物的核酸分子在本發明的種子植物中抑制AGL8-相關基因產物的表達。例如，編碼canola AGL8相關基因產物，如canola AGL8的核酸分子優選被用於在cannola植物中抑制AGL8相關基因產物的表達。
儘管在本發明的方法中優選使用高度同源的核酸分子，但用於同源重組，共抑制或反義抑制的核酸分子不必含有完整的被抑制的AGL8-相關基因產物序列。因此，例如，僅編碼擬南芥AGL8(SEQ ID NO2)一部分的有義或反義核酸分子可用於產生AGL8相關基因產物表達受抑制的本發明的非天然存在的種子植物。
同源重組的部分核酸分子一般至少含有與靶基因同源的大約1kb的序列，優選含至少大約2kb，更優選至少大約3kb且可含有與靶基因同源的至少大約5kb的序列。用於共抑制或反義抑制的編碼AGL8相關基因產物的部分核酸分子一般含有至少大約50個鹼基對到編碼AGL8相關基因產物全長的核酸分子。與本文定義的活性片段相反，用於同源重組，共抑制或反義抑制的部分核酸分子不必編碼基因產物的功能部分。
也可使用顯性失活構建體以抑制種子植物中AGL8相關基因產物的表達。本發明有用的顯性失活構建體一般含有編碼完整AGL8相關基因產物的序列的一部分，例如，該部分足以具備DNA結合或蛋白質-蛋白質間相互作用，如同型二聚體或異型二聚體蛋白質-蛋白質間相互作用，但缺乏野生型蛋白質的轉錄活性。例如，AGAMOUS羧基末端缺失突變體用作顯性失活構建體以抑制MADS盒基因AGAMOUS的表達(Mizukami等，Plant Cell，8831-844(1996)，該文作為參考文獻引用)。本領域的技術人員應明白，同樣，顯性失活AGL8相關基因產物構建體，如顯性失活AGL8定向進化同源物構建體可用於抑制種子植物中AGL8相關基因產的的表達，從而導致產生減小的種子。有用的顯性失活構建體可以是缺失突變體，例如，編碼單獨的MADS序列盒結構域(「M」)，MADS序列盒結構域和「間插」區(「MI」)；MADS序列盒，「間插」區和「K」結構域(「MIK」)或「間插」，「K」和羧基末端結構域(「IKC」)。
以產生減小的種子為特徵的種子植物可經過操縱AGL1和AGL5的表達來產生。經過抑制種子植物中AGL1和AGL5的表達可間接實現抑制AGL8-相關基因產物表達。AGL8相關基因產物表達受抑制的非天然存在的種子植物可以是，例如，agl1 agl5雙重突變體。本文所用的術語「agl1 agl5雙重突變體」指具有AGL1基因座功能喪失突變和AGL5基因座功能喪失突變的種子植物。功能喪失突變包括點突變，其中包括取代，缺失和插入，還包括AGL1和AGL5基因座的總體修飾，且突變可位於編碼或非編碼序列中。本領域的技術人員應明白，在AGL基因座的任何這種功能喪失突變可與在AGL5基因座的任意這種突變組合以產生本發明的agl1和agl5雙重突變體。已描述了在芸苔科種子植物擬南芥屬中產生舉例性的agl1 alg5雙重突變體，參見Kempin等，Nature 389802-803(1997)，本文作為參考文獻引用。
AGL1和AGL5是具有相對新近趨異的近親基因。儘管不受下面描述的限制，一些植物可能僅含有AGL1或僅含有AGL5，或者可含有與AGL1和AGL5相關的單一祖先基因。在這些植物中，其特徵為產生減小種子的種子植物可經過僅抑制AGL1的表達，或AGL5的表達，或與AGL1和AGL5相關的單個祖先基因的表達來產生。因此，在有些植物種類中，由於抑制AGL8相關基因產物表達而產生減小種子的非天然存在的種子植物可以是AGL1表達受抑制的植物。這種由於抑制AGL8相關基因產物表達而產生減小種子的非天然存在的種子植物可以是，例如agl1單一突變體。同樣，在某些植物種類中，由於抑制AGL8相關基因產物表達而產生減小種子的非天然存在的種子植物可以是AGL5表達受抑制的植物。例如，該植物可以是agl5單一突變體。
本文還提供了用於產生其特徵在於產生增大的種子的轉基因種子植物的試劑盒。本發明的試劑盒包括編碼AGL8-相關基因產物的核酸分子和種子選擇性調節元件。在本發明的試劑盒中，AGL8相關基因產物可基本上具有，例如，AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。如果需要，產生其特徵在於產生增大種子的轉基因種子植物的試劑盒可包括含有有效連接到種子選擇性調節元件上的編碼AGL8相關基因產物的核酸分子的植物表達載體。
上文已描述了編碼AGL8相關基因產物的核酸分子，如基本上具有AGL8定向進化同源物胺基酸序列的那些分子。本發明的一種試劑盒可含有一種編碼AGL8相關基因產物的核酸分子和任意一種種子選擇性調節元件，如上文所述的元件。
如果需要，本發明的試劑盒也可含有植物表達載體。本文所用的術語「植物表達載體」指自我複製的核酸分子，它提供將外源性核酸分子轉移進種子植物宿主細胞並在其中表達該分子的工具。植物表達載體包括適合於土壤桿菌介導的轉化的載體，包括雙重和共整合載體，以及用於物理轉化的載體。
植物表達載體可用於瞬時表達外源性核酸分子，或可整合併穩定表達外源性序列。本領域的技術人員應明白，植物表達載體可含有轉移和表達外源性核酸分子所需的所有功能；另外，雙重載體系統中可反式提供一種或多種用於土壤桿菌介導的轉化的功能。
除了含有有效連接種子選擇性調節元件上的編碼AGL8相關基因產物的核酸分子外，如果需要，本發明的植物表達載體可含有其它元件。用於土壤桿菌介導的轉化的雙重載體也可含有例如，下面的一種或多種成份；寬宿主範圍複製子，用於從大腸桿菌有效轉移給土壤桿菌的ori T，細菌選擇標記，如氨苄青黴素，和含有多個克隆位點的多接頭。
如果需要，用於物理轉化的植物表達載體可具有植物選擇標記並以一種載體為基礎，如pBR322，pUC，pGEM和M13，它們可作為商品獲得，例如，從Pharmacia(Piscatawa，NJ)或Promega(Madison，WI)獲得。在用於物理轉化種子植物的表達載體中，可任選包括T-DNA邊界或ori T區域，但無益處。
如本文所述，擬南芥屬中AGL8的過度表達導致產生的果實大小比野生型擬南芥屬產生的果實更大(參見實施例II)。儘管野生型擬南芥屬產生的果實為大約3/4」長和大約1/8」寬，而組成型表達AGL8的轉化擬南芥產生的果實平均大約1-1/8」長。儘管不希望受到下面描述的限制，35SAGL8轉基因植物中的花柱組織轉變為子房組織，導致使用花柱延長了果實。根據在組成型表達AGL8的種子植物中觀察到的果實增大，本發明提供了一種非天然存在的種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子而產生增大的果實。AGL8家族基因產物可以基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。例如，擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO2) 。
在有關實施方案中，本發明提供了一種轉基因種子植物，其特徵在於由於異位表達編碼AGL8家族基因產物的外源性核酸分子而產生增大的果實。外源異位表達的編碼AGL8家族基因產物的核酸分子可有效連接到外源性調節元件上，例如，該元件可以是組成型調節元件或心皮瓣選擇調節元件。
本文還提供了來自非天然存在的種子植物的組織，該植物的特徵在於由於異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子而產生增大的果實。例如，本發明提供了來自其特徵為產生增大的果實的本發明的非天然存在的種子植物的果實。
本發明還提供了產生非天然存在的種子植物的方法，該植物的特徵在於產生增大的果實。該方法包括在該種子植物中異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子的步驟，其中由於異位表達該核酸分子而產生增大的果實。在一個實施方案中，該方法包括將編碼AGL8家族基因產物的外源性核酸分子導入種子植物的步驟。
其特徵在於產生增大的果實的本發明的非天然存在的種子植物可以是任何帶果實的種子植物，例如，芸苔科的成員，豆科的成員，或穀類植物，如玉米植物，水稻植物或小粒穀類植物，如大麥，小麥，燕麥或黑麥植物。
其特徵在於產生增大果實的本發明的非天然存在的種子植物的其它例子包括柑橘屬樹，如橙子樹、葡萄柚樹、檸檬樹和酸橙樹。其特徵在於產生增大果實的本發明的非天然存在的種子植物可以是例如結出葡萄、蘋果、梨、桃、李、櫻桃、香蕉、黑莓、烏飯樹果、木莓、草莓、鳳梨、海棗、鱷梨、橄欖、椰子、西紅柿、黃瓜或茄子的植物，該果實與相應的野生型植物產生的果實相比具有增大的大小。根據上述觀察到的花柱轉變為子房組織，本領域的技術人員應明白；本發明產生非天然存在的種子植物的方法特別適用於結出的果實具有相當大花柱的種子植物。技術人員應認識到，按需要用這些或其它結果實的種子植物可實施本發明。
本文所用的術語「增大」當指本發明的非天然存在的種子植物產生的果實時，意思是與沒有異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子的相應種子植物，如野生型種子植物產生的果實的體積或乾重相比具有明顯更大的果實體積或乾重。
應認識到由具體種子植物種類或品種產生的果實大小存在天然的差異。然而，經過對產生的果實群體取樣並測量果實大小的正態分布平均比沒有異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子的相應種子植物品種或種類產生的果實的正態分布更大可容易地鑑定用本發明方法的種子植物產生的增大果實。因此，本發明的非天然存在的種子植物的生產提供了偏離種子植物產生的果實大小的正態分布的方法，使果實體積或乾重平均比不含異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子的相應種子植物種類至少大大約5％、大10％、大20％、大30％、大50％、大75％、大100％、大200％、大300％、大400％或大500％。
本文使用的術語「AGL8家族基因產物」指與擬南芥屬AGL8具有相同或相似功能的基因產物，當它在種子植物中被異位表達時，可改變正常發育使產生增大的果實。擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)是本文定義的AGL8家族基因產物的一個例子。如實施例II中所述，在內部啟動子元件被複製的串聯CaMV 35S啟動子控制下的擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的異位表達改變了正常的植物發育，使產生的果實與野生型植物產生的果實相比增大大約50％。
一般來說，AGL8家族基因產物的部分特徵在於含有MADS結構域。AGL8家族基因產物一般特徵在於具有一個胺基酸序列，該序列與擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO2)具有至少大約50％的胺基酸相同性。例如，AGL8家族基因產物的胺基酸序列與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)具有大於大約75％的胺基酸的相同性，更優選與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)具有大於大約85％的胺基酸相同性，且可以是與擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)具有大於大約90％、95％或97％胺基酸相同性的序列。
編碼AGL8家族基因產物的核酸分子可在異源性種子植物中異位表達以產生非天然存在的種子植物，該植物的特徵在於由於AGL8家族基因產物，如AGL8定向進化同源物充分保守且在種類界限間交叉發揮功能而產生增大的果實。因此，編碼擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的核酸分子在芸苔科內異源性種子植物中的異位表達可改變正常發育且導致產生增大的果實。同樣，例如，編碼擬南芥屬AGL8(SEQID NO2)核酸分子可在親緣關係更遠的異源性種子植物，包括雙子葉和單子葉被子植物和裸子植物中異位表達，且異位表達時，可改變正常發育，使異源種子植物產生增大的果實。
本文所用的術語「AGL8家族基因產物」包括AGL8家族基因產物的活性片段，它是AGL8家族基因產物的多肽部分，當異位表達時，改變正常發育使產生增大的果實。例如，活性片段可以是擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基末端片段，內部片段或羥基末端片段，當在種子植物中異位表達時，改變正常發育使產生增大的果實。AGL8家族基因產物的活性片段可包括，例如，MADS結構域，且可具有特異性結合DNA的能力。本領域的技術人員將認識到，編碼AGL8家族基因產物活性片段的核酸分子可用於本發明的其特徵在於產生增大的果實的種子植物的生產中和用於本發明的有關方法和試劑盒中。使用實施例II所述的方法或使用其它常規方法可鑑定AGL8家族基因產物的活性片段。簡單地說，諸如擬南芥屬的種子植物可用在組成型調節元件，如串聯CaMV 35S啟動子控制下的核酸分子轉化。對種子植物的表型分析顯示異位表達特定多肽部分的種子植物是否產生增大果實。
AGL8家族基因產物可基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列，它包含具有相同胺基酸序列的多肽或多肽片段或具有相似而不同的序列且本領域的技術人員認為是功能等價的胺基酸序列的多肽或多肽片段。基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列的AGL8相關基因產物可相對於SEQ ID No2的AGL8胺基酸序列具有一種或多種修飾，如胺基酸添加，缺失或取代，只要該修飾的多肽基本上保留改變正常發育的能力使核酸分子在種子植物異位表達時產生增大的果實。
本發明進一步提供了產生其特徵在於產生增大的果實的轉基因種子植物的試劑盒，該試劑盒包括編碼AGL8家族基因產物的核酸分子以及心皮瓣選擇性調節元件。例如，AGL8家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
如果需要，本發明的試劑盒可包括含有有效連接到心皮瓣選擇性調節元件上的編碼AGL8家族基因產物的核酸分子的植物表達載體。
本文所用的本語「心皮瓣選擇性調節元件」指一種核酸序列，當有效連接到核酸分子上時，使有效連接的核酸分子在有限的植物組織，包括心皮瓣組織中選擇性表達。本文所用的術語心皮瓣選擇調節元件指該元件能專一性地在心皮瓣組織中提供特異性表達，或能在有限的植物組織，包括心皮瓣組織中提供選擇性表達。
例如，心皮瓣選擇性調節元件可來自選擇性地在種子植物的心皮瓣組織中選擇性表達的基因。例如，在種子植物心皮瓣組織中選擇性表達的基因包括在擬南芥轉座品系GT142中提供選擇性GUS表達的基因(Sundaresam等，Genes Devel.91797-1819(1995)，本文作為參考文獻引用)。其它的子房瓣選擇性調節元件可使用常規方法鑑定和分離。例如，使用從心皮瓣組織製備的RNA和從非心皮瓣組織，如根或葉組織製備的RNA的不同篩選方案可用於分離在心皮瓣組織中選擇性表達的cDNA。按上文對於種子選擇性調節元件的分離所述，也可使用增強子捕獲或基因捕獲方案和文庫的表達篩選來鑑定其它的心皮瓣選擇性調節元件。
本發明進一步提供了非天然存在的種子植物，其特徵在於產生減小的果實，其中AGL8家族基因產物的表達受到抑制。這種非天然存在的種子植物對於產生，例如小黃瓜有價值，它在某些類型的泡菜製品中有用。在本發明的這種非天然存在的種子植物中，AGL8家族基因產物可基本上具有，例如，AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。在一個實施方案中，AGL8家族基因產物的表達在心皮瓣組織中選擇性地受到抑制。本文還提供了一種組織，如果實，它來自其特徵在於產生減小的果實的非天然存在的種子植物，其中AGL8家族基因產物的表達受到抑制。
本文所用的術語「減小」指由本發明的非天然存在的種子植物產生的果實時，意思是與沒有異位表達編碼AGL8家族基因產物的相應種子植物，如野生型種子植物產生的果實的體積或乾重相比果實的體積或乾重明顯減小。減小的果實可具有體積或乾重平均不超過相應野生型種子植物產生的果實體積或乾重的大約9/10，8/10，7/10，5/10，3/10，2/10或1/10。
下面實施例打算說明但並非限制本發明。
實施例I產生增大種子的35SAGL8轉基因擬南芥屬植物的製備本實施例描述了用於製備改變發育使產生增加大小和重量的種子的轉基因擬南芥屬植物。
用引物AGL8-γ(SEQ ID NO9；5』-CCGTCGACGATGGGAAGAGGTAGGGTT-3』)和引物OAM14(SEQ ID NO10；5』-AATCATTACCAAGATATGAA-3』)經聚合酶鏈式反應擴增製備全長AGL8，並隨後克隆進表達載體pBIN-JIT的SalI和BamHI位點，pBIN-JIT以pBIN19修飾而成，它含有串聯CaMV 35S啟動子，多克隆位點和CaMV PolyA信號。使用在植物中的土壤桿菌介導的轉化方法轉化擬南芥屬，該方法基本上按Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris3161194(1998)所述，本文作為參考文獻引用。使用35S啟動子特異性引物和AGL8 cDNA特異性引物進行PCR，這些引物在35S-AGL8轉基因植物中產生850和550bp的2個片段，以此分析卡那黴素抗性品系中是否存在35S-AGL8構建體。這兩個片段在未被35SAGL8構建體轉化的植物中不存在。
分析兩種代表性和具有獨立的插入事件的35SAGL8品系的表型。在兩種轉基因品系中，轉基因果實保鮮時間更長的事實表明似乎老化被延遲。具體地說，轉基因果實在變黃大約14天後乾燥，而野生型果實在變黃大約2天後乾燥。
對35SAGL8轉基因種子植物的進一步鑑定揭示種子表現出增大的體積和重量。轉基因種子體積顯著增加，與對照的非轉化擬南芥屬植物相比每維增加大約30％。而且，該種子平均比對照植物的種子大約重3倍。野生型植物的200粒幹種子重7.6mg，35SAGL8品系#2的200粒幹種子重7.7mg。
上述數據表明異位表達AGL8可在種子植物延遲老化，果實保鮮時間更長。而且，異位表達AGL8可導致產生增加大小和重量的種子。
實施例II產生增大果實的35SAGL8轉基因擬南芥屬植物的製備本實施例描述了用於製備產生增大果實的轉基因擬南芥屬植物的方法。
使用在串聯CaMV 35S啟動子控制下的全長AGL8製備如上所述的35SAGL8轉基因擬南芥植物。對35SAGL8轉基因擬南芥品系的鑑定表明轉基因果實與來自野生型植物的果實相比增大。其中野生型擬南芥屬產生的果實大約3/4」長和大約1/8」寬，組成型表達AGL8的轉化擬南芥屬產生的果實平均長1-1/8」。果實長度的增加可能由於花柱組織轉變為子房組織。
上述結果表明，AGL8的異位表達，如組成型AGL8表達可導致與野生型植物產生的果實相比產生明顯更大的果實。
實施例III酵母中AGL8與AGL5的相互作用本實施例證實，在酵母雙雜交系統中，AGL8基因產物與AGL5相互作用。
Finley和Brent(基因探針實驗方法(1994)；也參見Gyuris等，細胞75791-803(1993))的「相互作用捕獲」是Fields和Song，自然，340245-246(1989)的酵母雙雜交系統的變形。在該系統中，第一個蛋白質與DNA結合結構域融合，第二個蛋白質與轉錄激活結構域融合。經過激活lacZ報導基因分析擬南芥屬AGL5和AGL8基因產物之間的相互作用。
基本上按Chevray和Nathans，美國科學院學報，895789-5793(1992)所述，分別在各含有組成型ADH1啟動子的單拷貝著絲粒質粒pBI-880和pBI-771中製備「誘餌」和「捕獲」構建體。誘餌構建體含有融合到全長AGL8編碼序列上的GAL4 DNA結合結構域(胺基酸1到147)。捕獲構建體具有在核定位序列後融合到GAL4轉錄激活結構域(胺基酸768-881)上的AGL5全長編碼序列。在GAL4和GAL8缺陷型且含有在GAL1啟動子元件控制下的整合lacZ報導基因的啤酒糖酵母YPB2菌株中測定誘餌和捕獲構建體(Feilotter等，核酸研究221502-1502(1994))。
經過YPB2菌株在含X-GAL的培養基中形成藍色菌落證實AGL8「誘餌」和AGL5「捕獲」間的相互作用。僅包含GAL4(1-147)DNA結合結構域和GAL4轉錄激活結構域的對照「誘餌」-「捕獲」組合僅產生白色菌落。這些結果證實在酵母中AGL8可與AGL5相互作用並表明AGL8和AGL5植物MADS盒基因產物也在種子植物中相互作用。
上面在括號中或以其它方式提供的所有雜誌文章，參考文獻和專利文獻不論前面是否註明均在本文中作為參考文獻引用。
儘管參考上面實施例描述了本發明，但應明白在不偏離本發明實質的前提下可做出各種修改。因此，本發明僅受下面權利要求書的限制。
權利要求
1.一種非天然存在的種子植物，包含異位表達的編碼AGL-8相關基因產物的核酸分子，所說的種子植物特徵在於產生增大的種子。
2.權利要求1的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8相關基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
3.權利要求2的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8相關基因產物具有擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ IQ No2)。
4.權利要求1的非天然存在的種子植物，它是含有外源的異位表達的編碼AGL8相關基因產物的核酸分子的轉基因種子植物。
5.權利要求4的轉基因種子植物，其中所說的編碼AGL8相關基因產物的外源性異位表達的核酸分子有效連接到外源性調節元件上。
6.權利要求5的轉基因種子植物，其中所說的調節元件是組成型調節元件。
7.權利要求6的轉基因種子植物，其中所說的調節元件是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
8.權利要求5的轉基因種子植物，其中所說的調節元件是種子選擇性調節元件。
9.來自權利要求1的非天然存在的種子植物的組織。
10.權利要求9的組織，它是種子。
11.生產權利要求1的非天然存在的種子植物的方法，包含在所說的種子植物中異位表達編碼AGL8相關基因產物的核酸分子，其中由於異位表達所說的核酸分子而增大種子。
12.權利要求11的方法，包含將編碼AGL8相關基因產物的外源性核酸分子導入所說的種子植物中。
13.用於產生其特徵在於產生增大種子的轉基因種子植物的試劑盒，包含編碼AGL8相關基因產物的核酸分子和種子選擇性調節元件。
14.權利要求13的試劑盒，其中所說的AGL8相關基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
15.權利要求14的試劑盒，進一步包含含有有效連接到所說的種子選擇性調節元件上的編碼AGL8相關基因產物的所述核酸分子的植物表達載體。
16.一種非天然存在的種子植物，其中AGL8相關基因產物的表達受到抑制，所說的種子植物特徵在於產生減小的種子。
17.權利要求16的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8相關基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
18.權利要求16的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8相關基因產物的表達在種子組織中受到選擇性抑制。
19.來自權利要求16的非天然存在的種子植物的組織。
20.權利要求19的組織，它是種子。
21.一種非天然存在的種子植物，包含異位表達的編碼AGL8家族基因產物的核酸分子，所說的種子植物的特徵在於產生增大的果實。
22.權利要求21的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
23.權利要求22的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8家族基因產物具有擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID No2)。
24.權利要求21的非天然存在的種子植物，它是含有外源性異位表達的編碼AGL8家族基因產物的核酸分子的轉基因種子植物。
25.權利要求24的轉基因種子植物，其中所說的外源性異位表達的編碼AGL8家族基因產物的核酸分子有效連接到外源性調節元件上。
26.權利要求25的轉基因種子植物，其中所說調節元件是組成型調節元件。
27.權利要求26的轉基因種子植物，其中所說的調節元件是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
28.權利要求25的轉基因種子植物，其中所說的調節元件是心皮瓣選擇性調節元件。
29.來自權利要求21的非天然存在的種子植物的組織。
30.權利要求29的組織，它是果實。
31.產生權利要求21的非天然存在的種子植物的方法，包含在所說的種子植物中異位表達編碼AGL8家族基因產物的核酸分子，其中由於異位表達所說的核酸分子而增大果實。
32.權利要求31的方法，包含將編碼AGL8家族基因產物的外源性核酸分子導入所說的種子植物中。
33.用於產生其特徵在於產生增大果實的轉基因種子植物的試劑盒，包含編碼AGL8家族基因產物的核酸分子和心皮瓣選擇性調節元件。
34.權利要求33的試劑盒，其中所說的AGL8家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
35.權利要求33的試劑盒，進一步包含含有有效連接到所說的心皮瓣選擇性調節元件上的編碼AGL8家族基因產物的所說的核酸分子的植物表達載體。
36.一種非天然存在的種子植物，其中AGL8家族基因產物的表達受抑制，所說的種子植物特徵在於產生減小的果實。
37.權利要求36的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列。
38.權利要求36的非天然存在的種子植物，其中所說的AGL8家族基因產物的表達在心皮瓣組織中被選擇性地抑制。
39.來自權利要求36的非天然存在的種子植物的組織。
40.權利要求39的組織，它是果實。
全文摘要
本發明提供了一種非天然存在的種子植物,其特徵在於由於異位表達編碼AGL8－相關基因產物的核酸分子而產生增大的種子。AGL8－相關基因產物基本上具有例如AGL8定向進化同源物,如擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。本發明進一步提供了非天然存在的種子植物,其特徵在於由於異位表達編碼AGL8－家族基因產物的核酸分子而產生增大的果實。AGL8－家族基因產物基本上具有AGL8定向進化同源物的胺基酸序列,例如,擬南芥屬AGL8的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。還提供了有關的方法和試劑盒。
文檔編號C12N15/29GK1272885SQ98808590
公開日2000年11月8日 申請日期1998年6月26日 優先權日1997年6月27日
發明者馬丁·F·亞諾夫斯基, 羅伯特·馬丁森, 克裡斯蒂娜·費蘭迪斯, 顧青 申請人:加利福尼亞大學董事會, 冷泉港實驗室