結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法

2023-06-25 09:43:36

專利名稱：結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種結合藻紅膽素(PEB)'的藻紅藍 蛋白類螢光蛋白質的製備方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光複合物的功能組分。根據其吸收 光譜和螢光光譜特徵，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白
(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白
(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含apha和beta亞基，每個亞基中 藻膽色素(phycobiin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸 殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽 色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發射約 580nm的螢光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的螢光；CPC吸收約620nm的 可見光，發射約640nm的焚光；APC吸收約650 660nm的可見光，發射約660~670nm的 螢光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結 合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結合的輔基色素為 藻藍膽素(phycocyanobUin，簡稱PCB); CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671 )。與前人的方法不同，我 們發現Z"aZwe"。 sp. PCC7120中基因編碼betal55裂合酶，在其它藍藻中也存在同源 的betal55裂合酶。這類betal55裂合酶不僅能催化藻藍膽素PCB與PEC的beta亞基及其同 源蛋白質的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成藻紅藍蛋白類螢光 蛋白質，還能催化藻紅膽素PEB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質的155位半胱氨酸巰基
(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成一種新型的結合了PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。 藻紅膽素PEB可由HOl、 PebA、 PebB協同催化生成(Alvey，R.M.,Karty,J.A.etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)，
2448-2463 (2003))。在絕大部分的藍藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏 PE而具有異形胞的藍藻中存在PEC;隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基因。
藻膽蛋白類螢光蛋白質可以應用於食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。目前使用的藻 膽蛋白類螢光蛋白質主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723， 2002.04.17。 一種水華藍藻製備藻藍蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用 藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產新型的藻紅藍蛋白。藻紅藍蛋白類螢光蛋白質具 有優良的螢光性質，這種結合PEB的新型藻紅藍蛋白，為開發新型炎光探針提供了更多的選 擇。本方法為藻紅藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用於食品、化妝品、醫藥和生物工程領域 奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種結合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的方法，它 是應用betal55裂合酶催化PEB與藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白共價結合，從而製備新型藻紅藍 蛋白類螢光蛋白質(天然狀態下藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白是與PCB結合)。將含有betal55裂 合酶基因、藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表達質粒依次轉入宿主菌， 得到相應的工程菌，通過如此設計的基因工程菌生產新型藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。
本發明的技術方案是這樣的 一種結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法， 包括下述歩驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆於表達載體中，得到 betal55裂合酶表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達 載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因/w/和pe力5或其同源基因克隆於第 三個表達載體中，得到力o/和peZ^表達質粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆於第四個表 達載體中，得到表達質粒；
(5) 將betal55裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、力o7和pe6A表達質粒和pe^ 表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應 用此工程菌通過發酵工程生產結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質 提純技術，提純得到相應的結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。
本發明的技術方案也可以是這樣的 一種結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的制
備方法，包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白 基因或其同源基因同時克隆於表達載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o/和pe/^或其同源基因克隆於第 三個表達載體中，得到力W和/ eM表達質粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe/W或其同源基因克隆於第四個表 達載體中，得到/ e力/f表達質粒；
(4) 將betal55裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、力o7和pe/^表達質粒和 表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應 用此工程菌通過發酵工程生產結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質 提純技術，提純得到相應的結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。
上述結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法中，所述的宿主菌為大腸桿菌； 所述的betal55裂合酶基因是指與//朋6a6v a sp. PCC7120中s^^^P基因同源的基因；所述 的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因是指與如a6ae朋sp. PCC7120或7a/w770s"s sp. PCC7603 中pe"基因同源的基因。
本發明與現有技術相比，具有以下優點-
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質，大腸桿菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；
3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結合PEB的新型藻紅藍蛋白，具有與天然藻紅藍蛋白不同的光譜特性，為發展熒 光藻膽蛋白類色素蛋白質功能材料提供更多選擇。


圖1為本發明中A115339催化下生成的結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的吸收與熒 光光譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為螢光光譜。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的說明，但不構成對本發明的任何限制。 實施例1
(1)從GeneBank中可以査到，藻種Z朋6ae/7a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， # 7柳i/70S〃s sp. PCC7603和Ca7"/ r/;r sp. PCC7601部分序列已經測定。/l"atee朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(拜A s〃5息/(/. 7認V o， sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec^); Ca7ot力rix sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工程方法，將/f朋tee朋 sp.PCC7120中的a^5, 朋基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-3W5JW，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋力se朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec5克隆於Novagen 公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-/7ecA在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍 蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o/-pe65，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe/vl，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^在pET30中是在5boRV和/力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因 3L^3J9在pETDuet-l中，處於第二個多克隆位點5^ II和I之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶pe/W和/ ei^)， Zw7和peZ^在同一個載體pCDFDuet-1中，/w/在第一個多克隆位 點/Vco I和/^t I之間，peiW在第二個多克隆位點AWe I和/力o I之間，peM在pACYCDuet-l 中第二個多克隆位點《WII和Wol之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-ai75M久pET30-pec5、 pCDFDuet-/ o卜/ eZ^和pACYCDuet-peM轉入大 腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌將此工程菌接種於pH 7.0的 LB培養基中，37。C振蕩培養至ODw,n為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破
6碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白 質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。其吸收與螢光光譜見圖1所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為 螢光光譜。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下
從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mLLB培養基，37°C 振蕩培養過夜；取100|aL飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37'C振蕩培養至0Dfi(,。=0. 3~ 0.4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4'C)棄去 上清，收集沉澱菌體；用lmL預冷的O. lmol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (10000g, 4°C) 去上清，菌體沉澱用100pL預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置於冰上，加入一定量的構建好 的質粒，混勻後冰浴放置30min， 42r熱休克90s，冰浴5min後加入300jiL LB培養基，37°C 低速振蕩培養45min，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基平板上，倒置於37'C培養箱至 形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽和；分 別從中取100pL轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37'C振蕩培養至0DTO=0. 5-0. 7時， 冰浴約30min，加入IPTG誘導表達；避光、2CTC、 150轉/分，表達約12小時。離心收集細 胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株進行大量表 達。
實施例2
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/l"a6ae/ a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 傲7柳jV os"s sp. PCC7603和Ca7ot/ ri'xsp. PCC7601部分序列已經測定。/!/736犯朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(/ eM、 a275"息力o/); 脫7細-膨"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(; ec5); Ca7ot力r/, sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和pe65)。通過基因工程方法，將力/ a力ae/ 3 sp. PCC7120中的a775"JJ9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a775JJ見在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將力/7ste6v s sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec5(C84A)克隆於 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-pecZ (C84A)，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ eW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-; eM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^(C84A)在pET30中是在fcoRV和J/w I兩個酶切位點之間；裂合 酶基因a"53J9在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點和/力o I之間；PEB合成酶基 因是3個(力o厶/ e^和pe65)，力o7和pe幼在同一個載體pCDFDuet-1中，/ W在第一個多 克隆位點/VcoI禾B Atl之間，peM在第二個多克隆位點/Votel禾Q Wol之間，/ e^在 pACYCDuet-l中第二個多克隆位點勘7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-aWMJA pET30-pec^(C84A) 、 pCDFDuet-/ o7-peZ^和pACYCDuet-pe6力 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l ol/L， 2(TC至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例3
(1)從GeneBank中可以査到，藻種/1/7a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， #. 7柳i/7os""5" sp. PCC7603和Ca^t/ r/,sp. PCC7601部分序列己經測定。力朋tee朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為隨0019'可從所査到序列中找到所需基因(pec5、 a775息力o7); 必7編V o雄sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(pec^); CWot/ ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將力ra6ae/7asp. PCC7120中的a775JJ9基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec^克隆於Novagen公司的 pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-/ ec^"S^M教在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白類脫輔 基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ eM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-pe6i9，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-/7eW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^和裂合酶基因a^5^M在pETDuet-1中，pec^處於第一個多克 隆位點，酶切位點是化dU和At I ， a"5^39處於第二個多克隆位點免^n和/力oI之間； PEB合成酶基因是3個(/ 。/、 peM和pe6《)，/;oi和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o/ 在第一個多克隆位點/Vco I和屍W I之間，/ e^在第二個多克隆位點We I和J/ o I之間，pe6/1 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點餘7II和// oI之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec^a775"M久pCDFDuet-力o卜/ e/by9和pACYCDuet-; e力/1轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基 中，37'C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破 碎細胞後，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白 質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例4
(1)從GeneBank中可以査到，藻種/I朋tee朋sp.PCC7120的全序列已經測定完成,7a肌'/7os〃ssp. PCC7603和Ca7ot/ 門'xsp. PCC7601部分序列己經測定。/I朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因a"5，、力o"; yK7層'/7。，sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(y! eM); Ca7otArj> sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。通過基因工程方法，將^(朋Z^e/7a sp. PCC7120中的a775J朋基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec5 (C84A)克隆於Novagen 公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecS (C84A) -a^5^J^，在大腸桿菌中能表達藻 紅藍蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-Pe6/I，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因； ec5 (C84A)和裂合酶基因a77^M在pETDuet-1中，pec^處於第 一個多克隆位點，酶切位點是￡boR I和/^t I ， aW5M9處於第二個多克隆位點5g/II和Wo I之間；PEB合成酶基因是3個(力。厶/ e歸力o/和; eM在同一個載體pCDFDuet-l 中，力o/在第一個多克隆位點/Vco I和屍W I之間，/7e65在第二個多克隆位點We I和J/w I 之間，/ e^在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點和Z/w I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec" (C84A) -a"MW、 pCDFDuet-力o7-pe6S和pACYCDuet-轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於PH 7. 0的 LB培養基中，37'C振蕩培養至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-[3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37'C振蕩表達約12小時， 生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白 質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種/1/ a&era sp. PCC7120的全序列已經測定完成， #. 7a/7;i/70S"s sp. PCC7603禾。Ca7otAr/xsp. PCC7601部分序列已經測定。/f朋6se朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(/ ec5、 W75JJ義力o7): 脫7柳i/7o願sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pecZ ); Ca7ot/ /^ sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將Z朋6ae朋 sp. PCC7120中的sL 5JW基因克隆於Novagen公司的pETDuet-l中，所得質粒叫 pETDuet-W75JJ義在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將/l朋&e/7a sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec^5克隆於Novagen 公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質粒叫pC0LADuet-pecA在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-Z o7-peM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫p八CYCDuet-peZvl，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^在pCOLADuet-l第一個多克隆位點^coR I和Pst I兩個酶切位點 之間；裂合酶基因a775^J9在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點《《/II和X力o I之間 PEB合成酶基因是3個(力o厶peW和peM)，力o/和pe65在同一個載體pCDFDuet-l中，力o/ 在第一個多克隆位點〃co I和屍"I之間，pe/^在第二個多克隆位點We I和J力o I之間，/7e6/J 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點^HI和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
11T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-s^5JJ久pCOLADuet-pecA pCDFDuet-力W-/ e/^和pACYCDuet—peM轉 入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至OD,為0.5至0.8,加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例6
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力/ atee朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 必7柳i"o幼ssp. PCC7603和Cs7"力r"sp. PCC7601部分序列已經測定。/^a6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(/^、 aU脫力W);
柳i'/ os〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(pec^): Ca7oWri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和pe/ 5)。通過基因工程方法，將/)朋6ae朋 sp. PCC7120中的sWMW基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a775^J義在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將/1/7s&e朋sp. PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec5(C84A)克隆於 Novagen公司的表達載體pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-/ ec^(C84A),在大腸桿菌 中能表達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe^)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o/-peM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-Pe/M，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec5(C84A)在pCOLADuet-1第一個多克隆位點J coR I和I兩個酶 切位點之間；裂合酶基因aW5^^在pETDuet-1中的第二個多克隆位點處/II和Wol之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶pe6/f禾Qpe65)，力o/和peM在同一個載體pCDFDuet-l中，力o/ 在第一個多克隆位點〃co I和/^t I之間，/ eM在第二個多克隆位點AWe I和Wo I之間，peM 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點化7II和J/w I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別
帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aWMW 、 pC0LADuet-pec5(C84A) 、 pCDFDuet-力o7-pe6Z 禾口 pACYCDuet-peM轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D^為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-J3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37 'C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌 體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過N廣親和層析，可提純得到相應 的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例7
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經測定完成， # sp. PCC7603和Ca7o^r/義sp. PCC7601部分序列已經測定。/4朋力ae/ ssp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(，A、 a/"息力o/); y(/.7細./7。願sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec5); Ca7ot/ /7> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(/ e^和peM)。通過基因工程方法，將力/7a力se/7s sp. PCC7120中的a775JJ^基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-W75^J"在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將脫7aw7josiAS sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec^克隆於Novagen 公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-pecA在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同吋表達H0和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-PeW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec5在pET30中是在fcoRV和A7 o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因 a775"9在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點餘7II和/力o1之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶peM和peZ^),力o/和/^力萬在同一個載體pCDFDLiet-l中，力o/在第一個多克隆位 點Abo I和I之間，pe65在第二個多克隆位點/We I和/力o I之間，在pACYCDuet-l 中第二個多克隆位點^71I和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同
樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-aL/5M義pET30-pec厭pCDFDuet-力o/-pe65和pACYCDuet-pe6/1轉入大 腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的 LB培養基中，37'C振蕩培養至0DM。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1陽1/L， 2(TC至37"C振蕩表達約12小時， 生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破 碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白 質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例8
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ atee朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， yK 7柳y"o幼s sp. PCC7603和&"t/ rj> sp. PCC7601部分序列已經測定。如a6ae"a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pecZ 、 a"5紙
7a/MVjost^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec5): Ca7ot力h;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將^7a6ae"a
14sp. PCC7120中的s775JJ9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a^MW，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將脫7a肌'/70s"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pe乙v (C84A)克隆 於Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-pec^(C84A)，在大腸桿菌中能表達 脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/ o/-/ eZ^，在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW,在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec爪C84A)在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間；裂合 酶基因s77MW在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點^71I和/力oI之間；PEB合成酶基 因是3個(/ o/、 peZvf和；;e6Z )，力W和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力W在第一個多 克隆位點〃coI和屍"I之間，peM在第二個多克隆位點M/el和A7 oI之間，peM在 pACYCDuet-l中第二個多克隆位點處7II和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-a7753J義pET30-peCi9(C84A) 、 口00「0^1:-/70/-/ "/ 和pACYCDuet—/ eZ /J 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2(TC至37'C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
15實施例9
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種Z/7atee朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， Ja瓜/; a9w sp. PCC7603和Ca7"力r"sp. PCC7601部分序列已經測定。/I朋6ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(第S、 a"5纖力o7);
7層'雄""p. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(;jec5); CaA^力ri;f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工程方法，將^a6se朋 sp. PCC7120中的3"5.".9基因和必h/wVms〃s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基 因pecS克隆於Novagen公司的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-/ ec/9-aWMW，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe/^)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/ o/-peM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因/;ec5和裂合酶基因s775JJ9在pETDuet-l中，/ ec^處於第一個多克 隆位點，酶切位點是fcoR I和P" I ， a"M朋處於第二個多克隆位點S^HI和/力o I之間； PEB合成酶基因是3個PeM和pe亂Z oJ和pe^在同一個載體pCDFDuet-1中,力" 在第一個多克隆位點tVco I禾n I之間，peM在第二個多克隆位點/Vc/e I和/力o I之間，peM 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點處7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec^"aW5M9、 pCDFDuet-/ W-peM 和pACYCDuet-peM轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的LB培養基 中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時, 生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B:離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破 碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白 質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例10
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋&e朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7a啦'〃^〃s sp. PCC7603和CsJot/ /v>sp. PCC7601部分序列已經測定。力朋tee/ a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(pec5、 a775J脫力o/); 必7層V 。，sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254，可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec^); Ca7otAri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和wM)。通過基因工程方法，將/1/7a6ae朋 sp. PCC7120中的a77MJ9基因和M 7柳/z7os"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基 因pec5 (C84A)克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-pecS (C84A) -37/^^9，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和/ eM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-; eM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^ (C84A)和裂合酶基因a^5J^在pETDuet-l中，pec^處於第 一個多克隆位點，酶切位點是I和At I ， W75J，效處於第二個多克隆位點/5^/1I和/力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o人peM和peM)， Zw7和/ eZ^在同一個載體pCDFDuet-1 中，力o/在第一個多克隆位點Abo I和Z5" I之間，/ eM在第二個多克隆位點AWe I和J/w I 之間，pe6/1在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點和A7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pETDuet-pec" (C84A) -aWMJA pCDFDuet-力o/-/ e/^和pACYCDuet-/ e/M轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH7.0的 LB培養基中，37'C振蕩培養至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-{5-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破 碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni'2'親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類螢光蛋白 質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7s/77//7as">9 sp. PCC7603禾卩Ca7"力W,sp. PCC7601部分序列已經測定。/J朋tee朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec5、 s775息Z o7); # h則'/;asi^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec)9); Ca"t/ r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將/J朋6ae朋 sp. PCC7120中的a77MJ9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a775^^義在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將#. 7a/w'/7os"ssp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因/7ec^克隆於Novagen 公司的表達載體pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-pecA在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe/ A在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所捐 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pe"在pC0LADuet-1第一個多克隆位點￡coR I和Pst I兩個酶切位g 之間；裂合酶基因aL/5J^在pETDuet-l中，處於第二個多克隆位點^71I和A77oI之間；PEB合成酶基因是3個(y oA peM和pe6S)，力oJ和pe65在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7 在第一個多克隆位點/Vco I和戶W I之間，pe6yS在第二個多克隆位點AWe I和J力o I之間，pe^ 在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點處7II和//w I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DN八作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-a775JJ久pC0LADuet-/ e^、 pCDFDuet-Zw卜/ e/^和pACYCDuet-peM轉 入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8,加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B:離心收集菌體細胞， 加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例12
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經測定完成， y(/. 7柳j'/ osiAS sp. PCC7603和Ca7"/ r"sp. PCC7601部分序列已經測定。/J/ a6se/7s sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(拜A a〃5息副; 脫7柳j./70馬印.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為:M34254.可從所査到序 列中找到所需基因(peci ); Ca7ot力Wx sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pW5)。通過基因工程方法，將力朋6ae/7a sp. PCC7120中的sW5"9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a775JM，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將抓7a則'/7os"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec^(C8M)克隆 於Novagen公司的表達載體pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-/ ec^(C8AA)，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W禾口 一Z0克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-/w/-/ eM，在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(;^Zvl)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec飢C84A)在pCOLADuet-1第一個多克隆位點AcoR I和Pst I兩個酶 切位點之間；裂合酶基因a7J5^59在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點《g"/II和J/w I 之間PEB合成酶基因是3個(AW、 peM和pe65)， / o7和pe6y 在同一個載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和/^t I之間，peZ^在第二個多克隆位點We I和Wo I 之間，pe6/J在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點和/力o I之間。
基因插入載體的歩驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-a^5^^^ 、 pC0LADuet-pecS(C84A) 、 pCDFDuet-Zw卜peZ^和 pACYCDuet-轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D,為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20'C至37 'C振蕩表達約12小時，生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌 體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應 的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 上述製備方法適用於採用各種藍藻中的betal55裂合酶、藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白、藻 紅膽素生物合成酶基因或其同源基因來製備藻紅藍蛋白類螢光蛋白質，但涉及到微生物菌種 公開的問題，本發明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍藻^ a6ae朋sp. PCC7120和已經 部分測序的必^肌'/ o犯ssp. PCC7603和CsA t力ri,sp. PCC7601為例對本發明方法加以說明， 本領域的技術人員可以根據上述公開的內容採用其它原料實施本發明。
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權利要求
1. 一種結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，其特徵在於包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta155裂合酶基因或其同源基因克隆於表達載體中，得到beta155裂合酶表達質粒；(2)用基因工程方法，將藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆於第三個表達載體中，得到hol和pebB表達質粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆於第四個表達載體中，得到pebA表達質粒；(5)將beta155裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、hol和pebB表達質粒和pebA表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。
2. —種結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，其特徵在於包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白 基因或其同源基因同時克隆於表達載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達質粒；(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o/和pe/^或其同源基因克隆於第 三個表達載體中，得到/ o/和pe^表達質粒；G)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆於第四個表 達載體中，得到peM表達質粒；(4)將betal55裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、力W和peM表達質粒和peM 表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應 用此工程菌通過發酵工程生產結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質發酵後，按常規蛋白質 提純技術，提純得到相應的結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的betal55裂合酶基因是指與 /!朋6ae朋sp. PCC7120中a7J5^J9基因同源的基因。
5. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因 是指與/!/^tee/7a sp. PCC7120或〗柳i/70s"s sp. PCC7603中pec^基因同源的基因。
全文摘要
本發明公開了一種結合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，是通過應用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻紅膽素與藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白共價結合，製備結合PEB的藻紅藍蛋白類螢光蛋白質。本發明的方法應用生物過程生產藻紅藍蛋白類螢光蛋白質，是一種環境友好的生產方法。藻紅藍蛋白類螢光蛋白質能應用於食品、保健與醫藥功能材料領域，特別是應用為生物和醫學分子監測領域的螢光探針。
文檔編號C12N15/60GK101481701SQ200810025758
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月11日 優先權日2008年1月11日
發明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司