一種用於診斷2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的...的製作方法

2023-06-10 02:58:01 3

專利名稱：：一種用於診斷2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性的方法。發明背景捕獲並修飾內膜的蛋白聚糖層中的LDL(低密度脂蛋白)顆粒看來似乎是動脈粥樣硬化形成中的關鍵初始步驟。LDL與其他大分子和細胞(包括導致動脈粥樣硬化形成的那些大分子和細胞)的大部分相互作用受到暴露在所述顆粒表面的不可交換性apoB100的區段的控制(ChanL,./歷o/C7zew1992;267:25621-25624;CamejoG,etal,屍"Ao/og,ca/wgm/,c"wce1998;139;205-222)。當可交換性載脂蛋白與蛋白吸附在LDL表面上時，它們看來能夠調節一部分上述的相互作用。有效定義的密度為1.019-1.063的脂蛋白類是一群大小、脂質和載脂蛋白組成各異的顆粒(AlaupoviocP，M"/zoA￡"z>wo/1996;263:32-60)。小而密LDL(sdLDL)子類的水平升高與冠心病的進展關係密切，已經被提議作為胰島素抵抗與2型糖尿病的動脈粥樣硬化性血脂障礙的標誌(KmussRM，,Wto胸rD/"1997;80:22-43;TaskinenMR，D/由油一，2003;46:733-749)。此外，sdLDL的致病率在臨床前股動脈和頸動脈粥樣硬化受試對象中4交高(HultheJ.etal，爿/YeA7'oyc/eras"7Tz/"ow6cw^^wcw/wS/o/ogy2000;20:2140-2147)。已經提出了一些假說來解釋sdLDL所致的動脈粥樣硬化。這些顆粒在體外增大了對動脈蛋白聚糖(PG)的親和力，並且一旦與其聯合則所迷顆粒比更大的、更輕的LDL變得更容易被酶法和氧化過程所修飾(CamejoG,etal,Pathologicalsignificance1998;139;205-222;Hurt-CamejoE,etal,JournalofLipidResearch1990;31:1387-1398)。從輕的LDL(大)到更密的LDL(小)，顆粒的脂質組成和表面性質均存在逐漸的變化。顆粒表面的磷脂與游離膽固醇的減少與apoB-100的區段的暴露情況的改變有關，所述區段可改變其與apoB/E受體的親和力。這樣的變化也可以部分解釋sdLDL對蛋白聚糖具有更大的親和力的原因是參與蛋白聚糖結合的序列3359-3369(B位)和3145-3157(A位)也參與受體結合(ChanL，J脂C7^w1992;267:25621-25624)。由此得出下述假說即sdLDL對PG具有更高的親和力是因為表面的這些陽性序列變得更為緊蜜且暴露得更多(CamejoG,etal,Paf/zo/og!'ca/w'gm/Zcawce1998;139;205-222;Hurt-CamejoE，etal，《/owna/o/Zj>z'dAe廳n^1990;31:1387-1398)。LDL中的高栽脂蛋白CIII(apoCIII)含量日益受到關注是因為具有該表型的受試對象比LDL中apoCIII含量較低的受試對象具有更高遭受心血管事件的風險，而所述心血管事件與LDL-膽固醇值無關(LeeS-J，etal，A,m維/er7Tz薩6K騰脂2003;23(5):853-858;LeeS-J,etal.,爿w/C"^//0/2003;92(2):121-124)。ApoCIII通過抑制極低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯的水解而引起高甘油三酯血症，但其增大LDL的致動脈粥樣硬化的原因仍然不明。近來，有證據顯示當與LDL結合時ApoCin增大了脂蛋白對於動脈蛋白聚糖的親和力(Olin-LewisK,etal,Z^WiRe杧"rc/z2002;43(11):1969-1977)。WO2004/085996披露了利用來自受試對象的血漿的高密度HDL與LDL的大小和水平來確定所述受試對象出現心血管相關疾病、代謝相關疾病或年齡相關疾病的可能性的方法。
發明內容本發明的目的是能夠容易地確定或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的可能性。上述目的得以解決在於提供了一種用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床症狀的敏感性的方法，所述方法包括檢測所述受試對象的血樣中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白並確定其量。根據本發明的另一方面，提供一種用於確定與sdLDL顆粒結合的蛋白的種類和數量的方法作為選擇用於臨床試驗的患者的生物標誌的用途。根據本發明的又一方面，提供一種用於確定受試對象中與sdLDL顆粒結合的蛋白的種類和數量的方法作為用於評價所述受試對象的藥物介入的結果的生物標誌的用途。根據本發明的再一方面，提供一種診斷用試劑盒，所述診斷用試劑盒用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性，所迷試劑盒包括能夠檢測與sdLDL顆粒結合的蛋白並對其進行定量的蛋白質晶片。根據本發明的另一方面，提供一種用於預測動脈內膜中層厚度的方法，所述方法包括檢測所述受試對象的血樣中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白並確定其量。本發明的方法可用於鑑定大約80%患有2型糖尿病的患者，而無需更多的信息。與來自2型糖尿病患者的小而密LDL結合的蛋白的前述具體情況除了提供由尺寸評價所提供的信息之外，還提供關於與所述疾病有關的致動脈粥樣硬化的LDL的生物化學特徵的其他信息。圖1.在預形成梯度的緩沖液(在D20與H20的混合物中、含有140mMNaCl)中分離的血清LDLApoB100分布圖。曲線A來自健康受試對象。曲線B來自患有2型糖尿病並具有LDLB表型的患者。圖2.在Q10蛋白質晶片陣列上分析得到的23名對照者中的10名對照者和22名糖尿病患者(研究2)中的10名患者的sdLDL的SELDI-TOF-MS蛋白質分布圖。圖3.在CM10蛋白質晶片陣列上分析得到的23名對照者中的10名對照者和22名糖尿病患者(研究2)中的10名患者的sdLDL的SELDI-TOF-MS蛋白質圖。圖4a和圖4b.在對照者(受試對象1~23)和患者(受試對象24~45)中，輕的LDL顆粒(Fr4)與(Fr5)sdLDL顆粒中的apoCIII/apoB(圖a)和apoCI/apoB(圖b)各值的比較。圖5.分別為來自23名對照者中的1名對照者和來自糖尿病(研究2)的22名患者中的1名患者的氘分級分離後的sdLDL以及PG-LDL複合物的SELDI-TOF-MS蛋白質分布圖的比較，所述結果在Q10蛋白質晶片陣列上進行分析得到。與對照者相比，患者的sdLDL中分子量分別為8920、9420和9720Da的三個條帶明顯增強(p<0.001),並且，與對照者的相比，患者的PG-LDL複合物中的這三個條帶也明顯增強(p<0.001)。圖6.2型糖尿病患者的sdLDL中的apoCIII的總含量與通過與主動脈多能蛋白聚糖體外結合而不溶的LDL膽固醇的量的相關性。具體實施方式本發明提供一種用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性的方法，所述方法包括檢測所述受試對象的血樣中小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白並確定其量。優選地，對從所述血樣分離得到的血清執行所述方法。任選地，在對結合蛋白進行檢測和定量前首先從血清中分離出包含sdLDL顆粒的級分。將小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白的量與從健康對照受試對象定量得到的量進行比較。這可以在對測試受試對象進行的同時對對照受試對象進行，也可以採用歷史對照數據。在一個實施方案中，提供了一種用於在受試對象中診斷2型糖尿病或預測患2型糖尿病、診斷代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、糖尿病的臨床表現或動脈粥樣硬化的臨床表現(即心肌梗死和中風)的方法，所述方法包括下列步驟a)採集所述受試對象的血樣並收集所述樣品的血清，b)分離含有小而密低密度脂蛋白(sdLDL顆粒)的級分，c)檢測由步驟b)獲得的在所述分離出的sdLDL顆粒上的結合蛋白並對其水平定量，d)識別所述蛋白，並e)與來自健康對照受試對象的水平進行比較。所述血樣可以在上述測定前即採，也可以是很久以前自所關注的受試對象採集並在上述測定前以適當方式存儲的血樣。使用本領域的技術人員所知的分離sdLDL顆粒與血液的其他組分的任何技術，可以分離包含小而密低密度脂蛋白(sdLDL顆粒)的級分。所述分離例如可以如下進行使用諸如在D2O中製備的那些緩沖液等適宜的緩沖液進行密度梯度超速離心，或者用動脈蛋白聚糖溶液使sdLDL顆粒從血清中沉澱出。所述分離還可可使用ID凝膠電泳可以進行檢測。檢測和定量可以通過免疫測定進行。優選地，利用表面增強雷射解吸離子化(SELDL)分析對sdLDL顆粒上的結合蛋白進行檢測和定量。此處使用的術語"結合"可以解釋為包含以任何一種非共價方式與sdLDL顆粒結合的蛋白質，所述非共價方式例如有氬鍵結合、疏水作用、範德華力、離子相互作用。所述蛋白質以不同的親和力保留在脂蛋白顆粒的表面上並與游離蛋白或與其他類別的脂蛋白結合的那些蛋白相平衡。與sdLDL顆粒結合的結合蛋白可以是選自由栽脂蛋白CIII(apoCIII)、載脂蛋白CI(apoCI)、栽脂蛋白(apoAI)或載脂蛋白(apoE)組成的組的一種或多種，其中，apoCIII以三個同種型的形式存在，apoCI以兩個同種型的形式存在(Pullingeretal.,1997)。對於上述方法中評價的與sdLDL顆粒結合的一些結合蛋白，與sdLDL顆粒結合的一種或多種結合蛋白相對於對照受試對象中的結合蛋白的升高的量是所述受試對象是否患有和/或存在出現下述疾病的風險的指標2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、糖尿病的臨床表現或動脈粥樣硬化的臨床表現(即心肌梗死和中風)。例如，與健康受試對象的相比，apoCIII的水平升高。對於上述方法中評價的與sdLDL顆粒結合的一些結合蛋白，與sdLDL顆粒結合的一種或多種結合蛋白相對於對照受試對象中的結合蛋白的降低的量是所述受試對象是否患有和/或存在出現下述疾病的風險的指示2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、糖尿病的臨床表現或動脈粥樣硬化的臨床表現(即心肌梗死和中風)。例如，與健康受試對象的相比，apoCI、apoAI和apoE的水平降低。在一個實施方案中，測定與sdLDL顆粒結合的apoCIII和apoCI的組合，結果顯示與sdLDL顆粒結合的一種或多種結合蛋白相對於對照受試對象中的結合蛋白的的升高的量是所述受試對象是否患有和/或存在出現下述疾病的風險的指標2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、糖尿病的臨床表現或動脈粥樣硬化的臨床表現(即心肌梗死和中風)。在另一個實施方案中，測定與sdLDL顆粒結合的apoCIII和/或apoAI和/或apoE和/或apoCI的組合，結果顯示，與健康對照受試對象相比，在具有和/或存在出現下述疾病的風險的受試對象中，與sdLDL顆粒結合的apoCI和/或apoAI和/或apoE的量降低，而與sdLDL顆粒結合的apoCIII的量升高，所述疾病包括2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、糖尿病的臨床表現或動脈粥樣硬化的臨床表現(即心肌梗死和中風)。通過使用本發明的方法，對與sdLDL顆粒結合的apoCm、apoCI、apoAI、apoE或者這些蛋白質的組合的檢測和定量可用作選擇臨床實驗患者的一種/多種生物標誌。生物標誌被定義為正常生物過程、發病過程的可測量和可評價指標，或者被定義為對於例如通過施用治療劑而進行的治療介入的藥理反應。因此，評估得到的與sdLDL顆粒結合的每一種所迷結合蛋白或所述蛋白的組合的水平將在血脂障礙和/或糖尿病和/或動脈粥樣硬化患者中用作生物標誌，並由此提供選擇I至III期研究的適宜受試對象的優異工具。評估得到的與sdLDL顆粒結合的上述蛋白的水平還可用於選擇評價所述受試對象的藥物介入結果的患者。因此，用於確定受試對象中與sdLDL顆粒結合的蛋白的種類和數量的方法可以用作選擇臨床試驗患者的生物標誌，或者用作評價所述受試對象的藥物介入結果的生物標誌。可以使用apoCI與apoCm的組合。在一個實施方案中，與健康對照受試對象相比，與sdLDL顆粒結合的apoCI的量減少，而與sdLDL顆粒結合的apoCIII的量增多。此外，可以使用apoCI和/或apoAI和/或apoE和/或apoCIII的組合。在一個實施方案中，與健康對照受試對象相比，與sdLDL顆粒結合的apoCI、apoAI和apoE的量減少，與sdLDL顆粒結合的apoCIII的量增多。本發明還涉及一種診斷試劑盒，所述診斷用試劑盒用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性，所述試劑盒包括能夠檢測與sdLDL顆粒結合的蛋白並對其進行定量的蛋白質晶片。所提供的晶片具有偶聯的動脈蛋白聚糖。所述晶片也可用於sdLDL結合蛋白的直接檢測。所述試劑盒將提供進行本發明的方法的簡單快捷的方式，從而由血樣獲取有關所述受試對象的狀態的信息。本發明還涉及預測受試對象的動脈內膜中層厚度的方法(參見實施例8),所述方法包括檢測所述受試對象的血樣中小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白並確定其量。利用超速離心法分離得到的密度為1.019g/ml~1.063g/ml的血漿或血清脂蛋白被有效定義為低密度脂蛋白(LDL)(deLalla,O.,andJ.Gofman，1954，459-478,inD.Glicked.,MethodsinBiochemicalAnalysis,vol1.Wiley,Interscience,NewYork)。1.019g/ml~1.063g/ml內的LDL可以在密度遞增的重疊亞類內再次分級。利用電泳、光散射、電子顯微鏡或核磁共振可評價出遞增的密度與遞減的尺寸之間緊密相關(Krauss,R.M.，2004,DiabetesCare27:1496-1504)。通常，密度為1.019g/m卜1.030g/ml的LDL顆粒被視為大而輕，而密度為1.030g/m卜1.063g/ml的LDL顆粒則被指定為小而密。在本發明的研究中，蛋白質組學法可用於在健康對照組與具有B表型的兩類患者之間比較與小而密LDL顆粒和大LDL顆粒結合的可交換性栽脂蛋白。一組患者具有外周動脈粥樣硬化的亞臨床跡象和代謝症候群的許多特徵。所研究的第二組具有2型糖尿病。蛋白質組學評估被應用至LDL亞類，所述LDL亞類通過在具有生理鹽分濃度的D20密度梯度中進行超速離心而分離得到。使用的蛋白質組學方法涉及使用表面增強雷射解吸/離子化飛行時間質譜(SELDITOFMS)確定與LDL亞類結合的結合蛋白，隨後利用質譜(MS)和免疫印跡識別發生改變的蛋白。所得結果薈定到與LDL密度亞類結合的栽脂蛋白apoCIII、apoCI、apoAI和apoE。該項研究的目的是探究具有亞臨床動脈粥樣硬化和LDL表型B的患者以及具有2型糖尿病和表型B的患者中的輕LDL亞類及密LDL亞類是否具有特定模式的結合栽脂蛋白,所述模式不同於配對健康對照者的模式。第一項研究中的患者除了具有LDLB表型外，還具有比對照者明顯更粗的腰圍、更高的空腹胰島素、更高空腹血糖、更高的甘油三酯和更低的HDL膽固醇(表1)。因此，他們共有代謝症候群的一些要素。所述代謝症候群可以根據Grundy，etal,，2004、ArteriosclerThrombVaseBiol,24:13e-18或Isomaa，B.,etal.，2001,DiabetesCare24:683-689定義。該項研究中的所有患者均表現出低度或中度頸動脈粥樣硬化，並且其中的3名患者還存在股動脈粥樣硬化斑塊。配對對照者中沒有人表現出B表型(表l)。第二項研究中的2型糖尿病患者除了具有B表型外，還具有比配對對照者更粗的腰圍、更#的HDL膽固醇、更高的甘油三酯以及高得多的頸動脈及股動脈粥樣斑塊的發病率(表2)。為分析與兩個LDL亞類結合的可交換性載脂蛋白，使用了將載脂蛋白維持在生理鹽濃度和pH的超速離心法。該方法將與循環中的LDL顆粒結合的可交換性蛋白及載脂蛋白的分布發生變化的可能性降至最低，正如以高鹽濃度進行超速離心所發生的那樣(MacConathyWM,KorenK,WielandHetal,Jow脂/o/C/^o膨啤m一1985;342:47-66)。另外，可以進行包括利用SELDI分析來確定兩個LDL亞類的結合蛋白的蛋白質組學方法，以及隨後利用MS和免疫印跡識別已改變的蛋白質峰。該方法可以可接受的變異係數(14~24%)定量評價並識別幾種載脂蛋白。結果顯示，與健康對照者的對應級分相比，具有亞臨床外周動脈粥樣硬化、B表型的患者以及具有2型糖尿病和B表型的患者中密度為1.040-1.060±0.005g/ml的sdLDL亞類富含apoCIII(三個同種型)缺乏叩oCI(兩個同種型)、apoAI和apoE。此外，具有高apoCIII和低apoCI的sdLDL顆粒形式可識別80%被研究的患者，而無需任何關於人體測量的或臨床化學參數的其他輔助信息。險因素的;強有力的預測因子，尤其是患代謝症候群的女性和男性中(OnatA，etal，/lAeTO化/em^2003/52003;168(1):81-89)。此外，在具有2型糖尿病和冠狀疾病的患者中，具有最高apoCIII含量的LDL的四分位數相對於具有最低apoCIII含量的四分位數將新冠狀事件的相對風險提高了6倍以上(LeeS-J，etal，爿"e〃'o"/er7V2mm6F"化5,W2003;23(5):853-858)。我們的結果說明在具有代謝症候群標誌和患有2型糖尿病的患者中，致動脈粥樣硬化sdLDL特別富含apoCII，缺乏apoCI、apoAI和apoE。小而密LDL亞類是大且富含甘油三酯的VLDL的主要代謝產物，並且近來的證據表明其apoCIII含量與其產率有關(MarcouxC，etal，iV/^^o/ww2001;50(1):112-119)。另外，對內臟肥大的受試對象的動力學研究顯示，富含甘油三酯的VLDL中的apoCIII的高含量與其聯合生產過剩及分解代謝下降有關(ChanDC，etal，A&m6ofe/7Z2002;51(8):1041-1046)。這些結果表明這樣一個機制通過該機制，在所研究的代謝症候群和2型糖尿病患者中可生成富含apoCIII的密LDL。在本研究中觀察到這些患者的密LDL亞類中apoCI、apoAI和apoE的含量下降，但無法對此作出解釋。一種可能是這反映出胰島素抵抗患者的血漿中這些載脂蛋白的可用性降低，且小而密LDL(富含apoCni的顆粒)表面對載脂蛋白的保留能力下降，正如已經在大VLDL中對於apoE顯示的那樣(BreyerED，etal，JZ^/W7^^"rc/n999:40(10):1875-1882)。然而，沿著相同的推理線索可以推測，在健康對照者的密LDL中，高含量的載脂蛋白即apoAI、apoE和apoCI取代了顆粒LDL表面的apoCIII。儘管為何sdLDL比輕顆粒更易致動脈粥樣硬化的原因仍然不明，但其對於動脈蛋白聚糖的高親和力可增大其在內膜中的保持力(動脈粥樣硬化中重要的第一步)(CamejoG，etal，屍"Ao/og/ca/■yz'gw/zca""1998;139;205-222)。我們的結果表明具有B表型的胰島素抵抗及2型糖尿病患者具有^f艮高的富含apoCin的sdLDL的循環水平，從而可增強其與動脈內膜的蛋白聚糖的相互作用，由此有助於其進行原位氧化和酶修飾。此外，我們的結果顯示這類顆粒缺乏apoAI，而這些顆粒已械j人為可保護動脈壁中的LDL免受致動脈粥樣硬化+爹飾(RohrerL，etal,C謂"f(9—,o"o"L^油/ogy2004;15(3):269-278)。基於這些考慮，可以推測胰島素抵抗的血脂障礙中共有的這類LDL可能是粥樣斑塊出現的原因之一。該作用可部分解釋LDL中apoCIII增多與胰島素抵抗及2型糖尿病中的心血管疾病風險增大之間存在明顯聯繫。實驗部分i-、、、''乂i、".、-'、、例中，利用雙尾Student，st檢驗對對照組與患者之間的差異進行評價，p<0.05碎見為差異顯著。實施例1受試對象的選擇在第一項研究中，將10名受試對象和10名年齡和性別相匹配的健康對照者進行比較，這10名受試對象具有sdLDL(B表型模式)，頸動脈中存在亞臨床動脈粥樣硬化，4旦未同時進行藥物治療，這10名對照者不具有代謝症候群的危險因子(NCEP定義，外加作為胰島素抵抗標誌的高胰島素血症)，總膽固醇<6.5mmo1/1，沒有臨床心血管疾病，沒有亞臨床動脈粥樣硬化(在頸動脈或股動脈中未出現粥樣硬化斑)，並且沒有進行藥物治療，在臨床上是健康的(表l)。在第二項研究中，將21名2型糖尿病患者與23名年齡和性別相匹配的健康對照者進行比較，這21名2型糖尿病患者隨機選自動脈粥樣硬化和胰島素抵抗研究(AtherosclerosisandInsulinResistancestudy,AIR)中的74名患者，這23名健康對照者不具有代謝症候群的危險因子，所述危險因子由NCEP指南所定義，外加作為胰島素抵抗標誌的高胰島素血症(表2)。所有受試對象均招募自進行為期3年的追蹤檢測的AIR研究。早先已經對該研究進行了非常細緻的描述(HultheJ.etal,y4AYerz'osc/ems7、77^ow6as^am/Fascw/orSz'o/ogy2000;20:2140-2147;SigurdardottirV,etal.，Z)z'a6"^Cwe2004:27(4):880-884)。如前人所述(HultheJ.etal，爿〃eWosc/emy,、7T^ow60^a"t/Kwcw/arS/o/ogy2000;20:2140-2147)，所有參加者的LDL表型均通過凝力交梯度電泳確定。Sahlgrenska大學醫院的倫理委員會批准了這些研究。表1tableseeoriginaldocumentpage13研究1中的受試對象的特徵，10名健康對照組和10名具有表型B及外周動脈粥樣硬化的患者。表2對照組表型BP值腰圍(cm)0.30HDL(mmol/L)1.551.10<0駕丁g(mmol/L)0.872.08<0細空腹血糖4.649.2<0.001血漿胰島素65.195.60廁HsCRP0.781.880.043頸動務;K粥樣硬化斑無155小06中等/大38股動脈粥樣硬化斑無1811小10中等/大39研究2中的受試對象的特徵，23名健康對照組和21名患有2型糖尿病、具有表型B及外周動脈粥樣硬化的患者。實施例2LDL級分如前人所迷(HallbergC,etal.,J<ww"/o/Z^'d尺，"rc/z1994;35:1-9)，利用在預形成梯度的緩沖液中進行超速離心自血清樣品(1.0-1.35ml)分離LDL密度亞類，所述預形成梯度的緩衝液含有140mMNaCl、10mMNa2EDTA、Hepes10mM,pH為7.2，並在不同量的氧化氘(D20)中製備得到。通過梯度的上移收集各級分。以牛血清白蛋白作為標準品，根據製造商的說明書，使用DC蛋白質含量測定(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)測定LDL級分的總蛋白含量。通過使用抗人apoB抗體(Dakopatts,Denmark)的比濁法測定LDL級分中的apoB。利用比色法(RocheDiagnostics,RmBH，Manheim，Germany)測定總月旦固醇。通過重量分析法(HallbergC，etal.，JournalofLipidResearch1994;35:1-9)確定所用溶液的密度和離心後的梯度溶液的密度。利用基本上由Krauss和Burke(KraussRM,etal.,JournalofLipidResearch1982;23:97-104)描述的梯度凝膠電泳評價LDL亞類的直徑。圖1中顯示了具有B表型的受試對象和健康對照者血清的D20緩沖液中的密度梯度分級分離分布圖。收集0.5ml級分獲得ApoB分布圖，然而對於蛋白質組學分析來說，使用l.Oml級分以使後續分析維持在易處理的數量內。如圖1中所示，通過該操作，級分4含有密度為1.030-1.040±0.005g/ml的LDL…研究1中來自全部對照受試對象的最豐富的LDL亞類。該級分在大小範圍上大概對應於Krauss的LDL2b-LDL3a範圍的大小範圍(KraussRM,Z),"6"^O^e2004;27(6):1496-1504)。級分5含有密度為1.040~1.060±0.005g/ml的LDL，它大概對應於Krauss的級分LDL3b至4b的大小範圍(KraussRM，Z),'"Z)"mCwe2004;27(6):1496-1504)(圖1)。在研究1中，10名具有B表型的研究受試對象中有8名中的該級分為豐富的類。在第二項研究中，23名對照者中有20名表現出最大量的級分4，21名2型糖尿病患者中有19名表現出最大量的級分5。這些結果表明，D20密度梯度與使用凝膠電泳方法確定的LDL表型有聯繫，且顯示出在兩種類型的患者中sdLDL都極為豐富(HultheJ.etal,^4"en.c^c/ems&,7T^om6cw'sa"c/「ascw/ar5/'o/ogy2000;20:2140-2147)。實施例3LDL結合蛋白的SELDI分析在兩項研究中，分別4吏用50mM醋酸餒(pH6.0)和50mMTris-HCL(pH9.0)在兩類蛋白質晶片(陽離子型(CM10)蛋白質晶片和陰離子型(Q10)蛋白質晶片)表面上對來自全部受試對象的LDL級分4(密度為1.020-1.040g/ml)和LDL級分5(密度為1.040~1.060g/ml)進行分析。使用經改進以利用蛋白質晶片陣列生物處理器(CiphergenBiosystems)的Biomerk實驗室工作站(Beckman-Coulter)對全部樣品進行處理。將20Ml各LDL級分與80/il結合緩沖液混合，並將混合物添加至晶片表面然後孵育30分鐘。接著分別用100Ml結合緩沖液將斑點洗滌3次，每次5min,以減少非特異性結合，最後用100pl去離子水洗滌兩次。使用包含芥子酸(SPA)(AldrichChemCo，Milw，WI)和ot-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)(BrukerDaltonics,Germany)的兩種不同類型的基質。將SPA(l:2v/v稀釋)或CHCA(l:5v/v稀釋)的飽和溶液與含有0.5。/。TFA的50%乙腈對各乾燥樣品斑點施用兩次以形成晶體0隨後在用於SELDI分析的蛋白質晶片讀取系統(PBSII，CiphergenBiosystems)中讀取各陣列。使用在SPA/CHCA基質中稀釋的全部蛋白(all-in-protein)/肽標準品對讀取器進行外部校準，然後將讀取器直接應用於親水(normalphase)的蛋白質晶片(NP-20蛋白質晶片陣列)的斑點。在對一個實驗中所收集的所有譜的全部離子流進行標準化之後，比較蛋白質分布圖。顯著閾值設定為p<0.05。通過SELDI在QIO(陰離子型)和CMIO(陽離子型)蛋白質晶片陣列上對與LDL亞類結合的結合蛋白進行分析，該分析平行進行兩次，變異係數介於14~24%之間。圖2給出對研究2中的患者和對照者的sdLDL分析得到的分子量介於4000-10000Da的代表性分布圖，所述分析使用SELDI在Q10蛋白質晶片陣列上進行。已觀察到與對照者比較，患者的質量為8920、9420和9720Da的sdLDL的條帶具有明顯更高的強度。所有這三個條帶均用1-D凝膠與電洗脫進行純化，隨後進行SELDI分析，再通過MS/MS分析由其相應的肽離子(peptideion)識別為人類apoCIII。這三種多晶型物質(polymorph)在分子量上的差異表明它們代表不同的sialidation狀態(Pullingeretal.，1997)。圖3描述了研究2中患者和對照者的分子量介於3000至8000Da的分布圖，所述數據是使用SELDI在CM10蛋白質晶片陣列分析得到的。對照者的sdLDL中6420與6620Da這兩個條帶明顯比患者的顯著。這兩個條帶也用l-D凝膠分析與電洗脫進行提純，隨後進行SELDI,再通過免疫印跡識別為apoCI。ApoCI的兩個條帶可能代表不同的糖化狀態。而且，10000~50000Da質量範圍內的SELDI分析可識別和評價兩個LDL亞類中的apoAI和apoE。與患者的相比，對照者的sdLDL中apoAI和apoE最顯著(數據未顯示)。表3顯示了在兩項研究中，在用apoB100的含量進行校正後sdLDL(級分5)中被識別的栽脂蛋白的相對含量。在研究1中，與配對對照者的等密度級分相比，患者的sdLDL的apoCIII的三個同種型的含量明16說明書第14/19頁顯更高。另一方面，患者在其sdLDL類中的apoCI、apoAI和apoE的含量明顯比對照者的低。在同樣對2型糖尿病患者和配對對照者的LDL亞類進行分析的研究2中，患者的sdLDL也明顯含有比配對對照者的等密度級分顯著更多的apoCIII的三種同種型以及更低含量的apoCI、apoAI和apoE。此外，在對照者中，sdLDL中的apoCIII和apoCI的含量明顯高於輕顆粒中的含量(圖4)。在患者中，sdLDL中也具有比輕LDL中更高含量的apoCIII，但沒有apoCI(圖4)。表3兩項研究中具有LDL表型B的患者及配對對照者的sdLDL(Fr5)中的可交換性栽脂蛋白tableseeoriginaldocumentpage17數值為平均值土標準偏差(強度任意單位)，由兩項研究的患者和對照者中的小而密LDL的apoB100的含量校正。括號裡的數值是分子量(Da)。密LDL類級分(fr5)和來自對照者的相同級分之間的載脂蛋白含量的差值的統計顯著水平(p)由t檢驗評價。顯著水平*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001實施例4差異表達的蛋白質峰的提純收集來自具有B表型的受試對象的LDL級分5的等分試樣並通過真空離心濃縮，溶解在200plNuPAGE樣品緩衝液(0.14MTris、0.10Mtris畫HCL、0.4mMEDTA，pH8.5,含有10%甘油、2%LDL和3%DTT)中，沸騰3分鐘，然後使用4-12%Bis-Tris凝膠(1well)通過NuPAGE體系(Novex(預製凝膠)，SanDiego,CA，USA)進4亍分離。NuPAGE(2-(N-嗎啉)乙磺酸)MES緩沖體系(1MMES、1Mtris、69mMSDS、20mMEDTA)用作電泳用緩衝液。按照製造商的說明書將小型全凝膠洗脫儀(Bio-Rad)用於電洗脫。4吏用洗脫用緩衝液(25mM組氨酸、30mM3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)，pH6.5)，並在100mA洗脫30分鐘。收集約0.5mL的十四個級分，並濃縮250p1等分試樣/級分，利用NuPAGE體系進行分析，隨後進行SYPRORuby染色，隨後利用MS對蛋白條帶進行識別。凝膠洗脫級分的殘留部分與冰冷的乙醇以1:4(v/v)的比率混合，在-2(TC沉澱2小時，在4'C以10000xg離心10分鐘，溶解在10iu125mM的NH4HC03中，然後在NP20蛋白質晶片陣列上進行分析，目的是利用SELDI分析實施提純方法。實施例5LDL結合蛋白(apoCm、apoAI、apoE)的MS分析對於後續的MS分析，如前人所述(BjC)rhallK,/Vo/eo/m"2004;5(1):307-317),將在1-凝膠中檢測到的條帶用胰蛋白酶消化，並利用MS進行分析。簡單地說，使用測序級經過修飾的胰蛋白酶(Promega,Madison，WI,USA)消化凝膠塊，並用曱酸和乙腈萃取肽。為增大MS模式中的肽離子的信號並能夠進行MS/MS分析，按照製造商的說明書，<吏用POROS20-樹月旨(PerseptiveBiosystems，Framingham，MA,USA)進行脫鹽和濃縮。用2jlU70。/。的ACN、0.1。/。TFA將肽直接洗脫至MALDI100位把板。使斑點乾燥，然後施用1.25pl基質溶液CHCA(AgilentTechnologies,Waldbronn，Germany,用50%乙腈、0.1%三氟乙酸和終濃度為0.2mg/ml的檸檬酸二銨1:1稀釋)。然後以反射模式在AppliedBiosystem4700ProteomicsAnalyzerMALDI-TOF-TOF質譜儀(AB,Framingham,MA，USA)上進行分析。使用GPSExplorer軟體(AppliedBiosystems，Framingham，MA,USA)分析MS和MS/MS數據，該軟體利用Mascot肽質量指紋分析和MS/MS離子搜尋庫欠件(Matrixsciences,London,UK)。置信水平為95%時可認為鑑定結果為陽性。用l-D凝膠和電洗脫進行提純後，質量為8920、9420和9720Da的峰識別為apoCIII,隨後用MS/MS分析識別其相應的肽離子。提純操作後進行SELDI分析。利用所迷的用於apoCIII的系列步驟將28130和33570Da處的峰被分別識別為apoAI和apoE。實施例6apoCI的免疫印跡分析在對電洗脫級分(含有分別由SEIDI分析得到的6420和6620Da條帶)進行l-D凝膠分析後，使用半乾印跡技術將蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜(Millipore,Bedford,MA，USA)上。用1:2000稀釋的抗apoCl抗體(Biosciences)(0.02Mg/mL)孵育所述膜。對於免疫印跡方法，使用WesternBreeze試劑盒(Invitrogen)。條帶顯示出apoCl具有免疫反應性。實施例7LDL與動脈蛋白聚糖的結合按照前人所述的方法(Lind6nT，etal,/C/z"/"額f1989;19:38_44)(對之略有改動)，使用從豬主動脈內膜中層中分離出的提純多能聚糖使血清LDL與蛋白聚糖結合。簡言之，將50ul血清加入1.0ml緩衝液A中，所述緩沖液A包含10jig/ml己糖醛酸(hexuronate)多能聚糖、20mMNaCl、10mMCaCl2、2mMMgCl2和5mMHEPES緩衝液，pH為7.0。還將血清加至裝有不含多能聚糖的緩衝液A的空白試管中。將各試管在4。C孵育1小時，並在4。C以12000xg離心10分鐘，然後用1.0ml緩沖液A洗滌沉澱並棄去上清液。將最終的沉澱溶解在100pl緩沖液B中，所述緩沖液B包含140mMNaCl、5mMNa2-EDTA和lOmMTris石成，pH為10.5。所述溶液的等分試樣用於膽固醇測定，並用於與通過蛋白聚糖從血清中沉澱出的LDL結合的可交換性載脂蛋白的SELDI分析。如前人所述(Lind6nT,etal,Ew〃C/,"/"vw1989;19:38-44)進行的動脈多能聚糖與血清的孵育導致沉澱出大部分LDL。當以apoB100差值進行校正時，如所預期的那樣，來自研究2的患者血清的與蛋白聚糖結合的LDL膽固醇(PG-LDL)的量比來自對照者血清的量高出約32%(115±15Mg與PG結合的膽固醇/mgapoB(患者)對80.0±9(對照者)，p<0.05)。此外，對PG-LDL複合物的SELDI分析表明，患者的不溶性LDL包含的apoCIII、apoCIII-2和apoCIII-3比對照者的複合物的分別多出57、65和58%,例如0.70±0.38任意單位的apoCIII-3(患者)對0.30土0.10(對照者)，p〈0.00I(圖5)。在患者與對照者之間apoCI和apoE的水平(p<0.05)分別顯著改變。在叩oAI水平上未發現在統計學上存在顯著差異。根據這些研究結果發現，研究2中的患者的sdLDL的總apoCIII含量與血清的利用PG複合的LDL膽固醇的量之間顯著相關(圖6)。在對照組的sdLDL中的apoCIII含量與利用動脈多能聚糖而不溶的LDL膽固醇之間不存在顯著相關。實施例8由apoB水平校正、與sdLDL結合的蛋白質和心血管危險因子及動脈粥樣硬化之間的關係在證實了sdLDL中的可交換性載脂蛋白間存在差異的假說後，本發明的目的是解釋是否蛋白質的該組成與心血管危險因子、炎症和亞臨床動脈粥樣硬化相關。通過使用SPSSforWindowsIO.O(SPSS,Inc.，Chicago,IL，USA)分析全部統計數據。結果表示為數字、(％)、平均值和SD。ApoC-III除了始終與血清中的炎症標誌和基質金屬蛋白酶-9正相關之外，還與傳統的危險因子正相關。ApoA-I和apoE以及apoC-I顯示出與上述標誌的反相關(表4)。ApoCIII與頸總動脈中的內膜中層厚度正相關(r-0.35，p=0.02)。apoCI、apoE和apoAI分別與股動脈(r=-0.34,p=0.03)、頸動樂;M求部(r=-0.43,p=0.01)和頸總動脈(r=-0.38，p=0.01)中的平均IMT反相關。ApoCIII/apoCI的比率與頸動脈球部和股動脈中的IMT顯著相關(分別為r=0.31,p=0.049;r-0.38,p=0.02)。另外，該比率也傾向於與頸總動脈(產0.29,p=0.06)中的IMT相關。表4由fr5中的apoB校正、與小而密LDL(fr5)結合的蛋白、與心血管危險因子之間的關係，以Spearman的相關係數表達。tableseeoriginaldocumentpage21實施例9利用sdLDL中的apoAI、apoCI、apoCIII或apoE以及血漿中的apo-Al和apoC-m的中值確定患糖尿病的比值比結合小而密LDL的蛋白濃度由級分5中的apoB校正。在單變量分析中，血漿中的apoA-I和apoC-III,以及級分5中的apoCIII、apoA-I和apoC-I均與成為3f唐尿病患者的的危險顯著相關(表5)。ApoE未顯示出在統計學上與糖尿病顯著相關。由於apoC-III的血漿水平與apoC-III的LDL結合水平均與患糖尿病的危險相關，因此在多元對數回歸分析中包括所述這兩個變量。該分析的結果顯示僅有sdLDL中的apoC-III是獨立的糖尿病預測因子(表6)。當在同一多元對數回歸模型中包含所有與sdLDL結合的蛋白質(在單變量分析中，這些蛋白質均與患糖尿病的危險相關)時，apoC-III與apoC-I(情況相反)故證明是獨立的糖尿病預測因子(表7)。無需任何關於患者及對照者的臨床特徵的更多信息，中值以上和以下的與sdLDL結合的apoC-III可分別將76%的患者和74%的對照組準確地分類為患有糖尿病或未患糖尿病。對於低apoC-I及高apoC-I還可獲得類似的數字(數據未示出)。表5高水平及低水平(分別在中值以上和以下)的受試對象患糖尿病的單變量比值比。小而密LDL結合蛋白(fr5)的數值由fr5中的apoB校正。__比值比_P值ApoCin血漿3.80,038ApoCIIIfr59.00.002ApoAl血漿0.160.009ApoAlfr50.270頻ApoEfr50.400.135ApoClfr50.110麓表6血漿及小而密LDL中高及低(分別在中值以上和以下)apoCIII值的受試對象患糖尿病的多變量比值比。小而密LDL結合apoCIII(fr5)的數值由fr5中的apoB校正。__比值比__ApoCIII血漿2.20.270ApoCIIIfr57.30.006表7在具有小而密LDL結合蛋白高及低(分別在中值以上和以下)值的受試對象患糖尿病的多變量比值比。小而密LDL結合蛋白(fr5)的數值由fr5中的apoB調整。__比值比_P值ApoCIIIfr510.40，ApoAlfr50.772〉0.300ApoClfr50.090.008ApoEfr50.603〉0.300權利要求1.一種用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性的方法，所述方法包括檢測所述受試對象的血樣中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白並確定其量。2.如權利要求1所述的方法，其中，所述受試對象的所述疾病狀態根據與sdLDL結合的蛋白質的數量和類型來確定。3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述方法針對由所述血樣分離出的血清進行。4.如權利要求3所述的方法，其中，包含sdLDL顆粒的級分自所迷血清分離得到。5.如前述權利要求任一項所述的方法，其中，將所述sdLDL顆粒上的結合蛋白的量與對來自健康的對照受試對象定量得到的量相比較。6.如前述權利要求任一項所述的方法，其中，所述sdLDL顆粒上的結合蛋白的量的檢測和定量利用表面增強雷射解吸離子化(SELDL)分析進行。7.如前述權利要求任一項所述的方法，其中，所述sdLDL顆粒通過運行密度梯度超速離心自血液或血清分離。8.如權利要求7所述的方法，其中，所述密度梯度超速離心利用在D20中製備的緩沖液進行。9.如權利要求3~6中任一項所述的方法，其中，所迷sdLDL顆粒通過用動脈蛋白聚糖溶液使所述sdLDL顆粒從所述血清中沉澱出來進行分離。10.如前述權利要求任一項所述的方法，其中，所述結合蛋白選自由栽脂蛋白CIII、栽脂蛋白CI、栽脂蛋白Al和栽脂蛋白E組成的組。11.如權利要求5~10中任一項所述的方法，其中，與sdLDL顆粒結合的一種或多種結合蛋白相對於對照受試對象中的結合蛋白的升高的量是所述受試對象是否患有2型糖尿病的指標。12.如權利要求5~10中任一項所迷的方法，其中，與sdLDL顆粒結合的一種或多種結合蛋白相對於對照受試對象中的結合蛋白的降低的量是所述受試對象是否患有2型糖尿病的指標。13.如前述權利要求任一項所述的方法，其中，與健康的對照受試對象相比，與sdLDL顆粒結合的載脂蛋白CI和/或載脂蛋白Al和/或栽脂蛋白E的量降低，與sdLDL顆粒結合的apoCin的量升高。14.一種用於確定與sdLDL顆粒結合的蛋白的類型和數量的方法作為選擇用於臨床試驗的患者的生物標誌的用途。15.—種用於確定受試對象中與sdLDL顆粒結合的蛋白的類型和數量的方法作為用於評價所述受試對象的藥物介入的結果的生物標誌的用途。16.如權利要求14或15所迷的用途，其中，使用栽脂蛋白CI與栽脂蛋白cm的組合。17.如權利要求14或15所迷的用途，其中，使用栽脂蛋白CI、栽脂蛋白A1、栽脂蛋白E與栽脂蛋白cm的組合。18.如權利要求14~15任一項所述的用途，其中，與健康的對照受試對象相比，與sdLDL顆粒結合的apoCI的量降低，與sdLDL顆粒結合的apoCIII的量增多。19.如權利要求18所述的用途，其中，與健康的對照受試對象相比，與sdLDL顆粒結合的栽脂蛋白CI和/或栽脂蛋白Al和/或栽脂蛋白E的量降低，與sdLDL顆粒結合的apoCIIl的量增多。20.—種診斷用試劑盒，所迷診斷用試劑盒用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性，所迷試劑盒包括能夠檢測與sdLDL顆粒結合的蛋白並對其進行定量的蛋白質晶片。21.如權利要求20所述的試劑盒，其中，所述晶片具有偶聯的動脈蛋白聚糖。22.如權利要求20~21所述的試劑盒，其中，所述晶片用於sdLDL結合蛋白的直接檢測。23.—種用於預測動脈內膜中層厚度的方法，所述方法包括檢測所迷受試對象的血樣中的小而密低密度脂蛋白(sdLDL)顆粒上的結合蛋白並確定其量。全文摘要一種方法和試劑盒，用於診斷或預測受試對象出現2型糖尿病、代謝症候群、亞臨床動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風或糖尿病的臨床表現的敏感性。文檔編號G01N33/92GK101166981SQ200680014452公開日2008年4月23日申請日期2006年4月10日優先權日2005年4月11日發明者G·卡梅喬,J·赫爾塞,P·戴維森申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司