對β-澱粉樣肽的初原纖維形式特異性的人源化抗體的製作方法

2023-06-09 19:08:01 1

專利名稱：對β-澱粉樣肽的初原纖維形式特異性的人源化抗體的製作方法
CN 102459336 A說明書1/10 頁
對β -澱粉樣肽的初原纖維形式特異性的人源化抗體本發明涉及對β -澱粉樣肽的初原纖維形式特異性的人源化抗體。本發明還涉及這些抗體的治療性、診斷性和/或預防性用途，特別地與神經變性性病症和/或與澱粉樣斑沉積有關的疾病，且值得注意地阿耳茨海默氏病(Alzheimer』 s disease)的誘導和進展有關。阿耳茨海默氏病(AD)是一種影響高比例的老年群體的進行性神經變性性疾病。 此疾病以記憶喪失和認知功能下降為臨床特徵，而以腦中存在胞內神經原纖維沉積物和形成澱粉樣斑的β-澱粉樣肽(Α-β)的胞外沉積物為神經病理學特徵。(Yanker等Nature Med.第2卷第8期(1996))。在這些體徵外，存在著許多其它異常的變化，包括免疫和炎性系統的惡化及線粒體功能的惡化，這可以導致氧化應激的升高、凋亡機制的活化，且最終導致細胞死亡。澱粉樣斑主要由具有40或42個殘基的Α-β肽構成，所述Α_β肽是在β -澱粉樣肽前體(APP)蛋白的蛋白水解過程期間生成的。Α-β肽的胞外沉積物代表AD的所有形式，包括家族性形式(FAD)的不變早期特徵性特徵。FAD出現得相對較早(在40和60歲之間)，並且是由於具有6種單一或雙重錯義突變的5% FAD病例(大於20種家族)中的APP 基因；具有迄今鑑定的超過80種不同突變的50至70% FAD病例(大於200種家族)中的早老蛋白1 (PS 1)基因；和具有8種家族中所描述的2種錯義突變的較少FAD病例中的早老蛋白2(PS 2)基因的突變所致。已經顯示了這三種基因的突變誘導對APP蛋白酶解的變化，這導致Α-β的過度生成，而且導致與AD的偶發形式的病理學和症狀相似的病理學和症狀的早期出現。澱粉樣斑的神經元毒性可能在於通過可溶性A-β肽以原纖維形式聚集而形成的高分子量原纖維，所述原纖維形式最初是可溶性的(又稱作初原纖維形式)，然後轉化成摻入澱粉樣斑中的不溶性形式。實際上，在體外顯示了，可溶性Α-β肽逐漸聚集成高分子量 (大於200kDa)，但仍可溶的原纖維形式(即，其可以用識別肽/蛋白質的片層三級結構的藥劑諸如剛果紅或硫黃素S來標記)。因為此形式是可溶的，它經常稱作初原纖維形式，而原纖維源自甚至更大的聚集，導致溶解性損失。一般認為初原纖維過渡形式是澱粉樣纖維的前體，並且可能負責阿耳茨海默氏病和與蛋白質聚集有關的其它疾病中的細胞功能障礙和神經元損失。已經顯示了，與也廣泛存在於不受影響的患者中的A-β肽的彌散性沉積物形成對比，衰老澱粉樣斑(即聚集的，又稱作成熟斑)與阿耳茨海默氏患者的認知狀態關聯。 (Duyckaerts 等，Neurobiol. Aging 1997 ；18 :33_42 及 Jellinger 等，1998 ；54 :77_95)。特別地，通過靶向這些衰老澱粉樣斑，因此有可能更特異性且有效地治療阿耳茨海默氏病。已經嘗試了許多治療以阻止Α-β肽的形成，例如APP的蛋白水解過程的抑制劑。已經測試了免疫治療性策略諸如施用抗A-β抗體(以減少澱粉樣沉積物)或者用A-β肽抗原免疫接種(以促進體液應答)以降低斑的大小和密度。例如，已經描述了針對阿耳茨海默氏病的治療方法(US 7 179 463)，其包括施用針對在編碼A-β肽的區域中呈現北極型突變(Arctic mutation)的初原纖維的抗體。
實際上尚未描述抗體的例子。此外，尚未實施抗體對肽的親和力作為這些肽的分子量的函數的比較。其它專利(US 6 761 888和US 6 750 324)已經提及識別沿著肽A-β 42 的胺基酸序列的各個表位的抗體。已經提交了關注對初原纖維特異性的抗體的國際申請 (102007/108756)，但是所描述的抗體識別高分子量々-0肽和中等重量寡聚物兩者。此外， 沒有提及相對於抗體對彌散斑的親和力其對成熟斑的親和力。儘管關注阿耳茨海默氏病的知識目前有進展，仍需要以最大程度限制副作用的治療和/或預防此病理學的組合物和方法。諸如本申請中所描述的、人源化的且對Α-β肽的初原纖維形式特異性的抗體旨在解決此問題。容許識別衰老澱粉樣斑而非彌散斑，依照本發明的抗體比識別Α-β的所有形式的抗體(其會主要附著彌散性沉積物或附著單體或低分子量A-β肽的可溶性形式)有效得多地識別病理性斑。此外，僅識別A-β肽的初原纖維形式，而非與阿耳茨海默氏病無關的其它蛋白質的初原纖維形式的實情避免可降低對疾病有效的抗體濃度的無用結合。已經人源化的鼠抗體遍及本申請會稱作抗體13C3。表2中顯示了可以編碼或構成依照本發明的人源化抗體的序列。本發明涉及特異性結合A-β肽的初原纖維形式，即高分子量肽的人源化抗體。在一個更有利的實施方案中，抗體結合具有大於200、300、400或500kDa的分子量的A-β肽。依照一個實施方案，依照本發明的抗體結合聚集成老年斑的A-β肽，而不結合 A-β肽的彌散性沉積物。在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體特異性結合A-β肽的初原纖維形式，但不結合澱粉樣結構的其它蛋白質(例如，ΙΑΡΡ、胰島澱粉樣多肽)。本發明還涉及具有降低的效應器功能的人源化抗體，使得有可能限制不利效應， 諸如微出血(microhaemorrhage)禾口血管性水月中(vasogenic oedema)的形成。在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體不再擁有效應器功能。在一個甚至更有利的實施方案中，抗體是免疫球蛋白G4，其Fc域已經經歷降低半分子(half-molecule)生成的突變。在一個甚至更有利的實施方案中，抗體是免疫球蛋白G4，其Fc域已經經歷降低效應器活性的突變。本發明涉及一種人源化抗體，其包含至少一種由與序列SEQ ID NO :9、11、13、15、 17和19之一具有相同序列的核苷酸序列，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。本發明還涉及一種人源化抗體，其包含至少一種與序列SEQ ID NO :10、12、14、16、 18和20之一具有相同序列的⑶R。在另一個實施方案中，依照本發明的抗體包含至少一種其序列相對於序列SEQ ID NO 10、12、14、16,18,20和32之一相差1至2個胺基酸的⑶R，只要所述抗體維持其結合特異性。在一個有利的實施方案中，抗體包含由核苷酸序列SEQ ID NO :9、11、13、15、17和 19，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。在另一個有利的實施方案中，抗體包含序列SEQ ID NO 10、12、14、16、18和20的
6CDR。依照本發明的抗體還可以包含由核苷酸序列SEQ ID NO :9、11、13、31、17和19，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體包含序列SEQ ID NO :10、12、14、32、 18 和 20 的 CDR0本發明的一個目的是人源化抗體，其包含由核苷酸序列SEQ ID NO :9、11、29、31、 17和19，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。本發明還涉及包含序列SEQ ID NO 10、12、30、32、18和20的CDR的人源化抗體。在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體包含由與序列SEQ ID NO 5或序列 SEQ ID NO 27具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列編碼的其重鏈可變部分 (VH)0在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體含有包含與序列SEQ ID NO 6或序列SEQ ID NO 28具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列的其重鏈可變部分 (VH)0在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體包含由與序列SEQ ID NO 7或序列 SEQ ID NO 23具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列編碼的其輕鏈可變部分 (VL)。在一個有利的實施方案中，依照本發明的抗體含有包含與序列SEQ ID NO 8或序列SEQ ID NO 24具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列的其輕鏈可變部分 (VL)。在一個甚至更有利的實施方案中，抗體含有包含由核苷酸序列SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 27之一編碼的可變部分(VH)的重鏈。在一個甚至更有利的實施方案中，抗體含有包含多肽序列SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 28的可變部分(VH)的重鏈。在另一個實施方案中，抗體含有包含由核苷酸序列SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 23 之一編碼的可變部分(VL)的輕鏈。在另一個實施方案中，抗體含有包含多肽序列SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 24的可變部分(VL)的輕鏈。在一個有利的實施方案中，抗體包含由核苷酸序列SEQ ID NO :5和7編碼的序列。在一個有利的實施方案中，抗體包含多肽序列SEQ ID NO :6和8。在另一個實施方案中，抗體包含由核苷酸序列SEQ ID NO 5和23編碼的序列。在另一個實施方案中，抗體包含多肽序列SEQ ID NO 6和24。在另一個實施方案中，抗體包含由核苷酸序列SEQ ID NO ,21和23編碼的序列。在另一個實施方案中，抗體包含多肽序列SEQ ID NO 28和24。本發明還涉及包含由與核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 25之一具有至少 80 %、85 %、90 %、95 %或99 %同一性的序列編碼的重鏈的抗體。本發明還涉及包含與多肽序列SEQ ID NO 2或與多肽序列SEQ ID NO 26具有至少80 %、85 %、90 %、95 %或99 %同一性的重鏈的抗體。在一個有利的實施方案中，抗體包含由與核苷酸序列SEQ ID NO 3和SEQ ID NO21之一具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列編碼的輕鏈。在另一個實施方案中，抗體含有包含與多肽序列SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 22之一具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列的輕鏈。本發明的一個目的是包含由核苷酸序列SEQ ID NO :1和3編碼的序列的抗體。本發明的另一個目的是其序列包含多肽序列SEQ ID N0:2和4的抗體。本發明的一個目的是包含由核苷酸序列SEQ ID NO 1和21編碼的序列的抗體。本發明的另一個目的是其序列包含多肽序列SEQ ID NO :2和22的抗體。本發明的一個目的是包含由核苷酸序列SEQ ID NO :25和21編碼的序列的抗體。本發明的另一個目的是其序列包含多肽序列SEQ ID NO :26和22的抗體。本發明的另一個目的是一種人源化抗肽Αβ抗體，所述人源化抗肽Αβ抗體具有比其對肽Αβ的其它形式的親和力大至少100倍的對此肽的初原纖維形式的親和力。本發明的另一個目的是一種抗體，其特徵在於它誘導澱粉樣斑的縮小。本發明的另一個目的是人源化抗肽Αβ抗體在治療與神經變性性病症有關的疾病，且特別是在治療阿耳茨海默氏病中的用途。本發明的另一個目的是藥物組合物，其包含人源化抗肽Αβ抗體和賦形劑。本發明的另一個目的是治療阿耳茨海默氏病的方法，包括對患者施用人源化抗肽 Aβ抗體。本發明的另一個目的是生成人源化抗肽Αβ抗體的細胞，及生成此抗體的方法， 包括培養這些細胞。所述細胞是自一種細胞系有利地衍生的。本發明的一個目的是包含人源化抗肽A β抗體的醫學產品。本發明的一個目的是編碼與序列SEQ ID NO :2、4、6、8、22、24、26或28之一具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的多肽的多核苷酸。本發明的另一個目的是具有與序列SEQ ID NO :1、3、5、7、21、23、25、或27之一具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列的多核苷酸。本發明的另一個目的是包含具有序列SEQ ID NO 1、3、5、7、21、23、25、或27之一的核酸的重組載體，及包含此載體的宿主細胞。定義特異性結合理解為對一種受體相對於對另一種的結合強度間，在這裡對A-β肽的初原纖維形式的結合與對肽的其它形式的結合間相差至少約10、20、30、40、50、或100倍。「表位」意指抗原中抗體結合的位點。若抗原是聚合物，諸如蛋白質或多糖，則表位可以由連續的或不連續的殘基形成。在這裡，表位是構象性的，即與初原纖維Α-β肽的三維結構有關。「初原纖維形式」意指在體外可溶的，並且可以以大於200kDa、300kDa、400kDa或 500kDa的分子量的實體分離，而且可以固定諸如硫黃素-S或剛果紅等藥劑的Α-β肽的寡聚形式。「老年斑」意指由被營養不良性神經突和神經膠質細胞反應圍繞的澱粉樣核心(固定硫黃素S或剛果紅)構成的斑。與數目多得多但與阿耳茨海默氏病無關的彌散性澱粉樣沉積物(其不固定硫黃素S或剛果紅)形成對比，特別地在阿耳茨海默氏病患者中找到老年斑。抗體(又稱作免疫球蛋白)由通過二硫橋連接的兩個相同的重鏈(「CH」)和兩個相同的輕鏈(「CL」)構成。每條鏈含有恆定區和可變區。每個可變區包含三個稱作「互補決定區」(「CDR」)或「高變區」的區段，其主要負責結合抗原的表位。術語「VH」指抗體的免疫球蛋白的重鏈可變區，包括片段FV、SCFV、dSFV、Fab、Fab， 或F(ab)，的重鏈。術語「VL」指抗體的免疫球蛋白的輕鏈可變區，包括片段FV、SCFV、dSFV、Fab、Fab， 或F(ab)，的輕鏈。「抗體」還意指抗體的任何功能性片段Fab(抗原結合片段)、Fv、scFv(單鏈 Fv)、Fc (可結晶片段)。優選地，這些功能性片段會是類型FV、SCFV、Fab、F(ab，)2、Fab，、 scFv-Fc、雙抗體、多特異性抗體(值得注意地雙特異性)、含有一種或多種CDR序列的合成多肽的片段，其一般與衍生它們的人源化抗體擁有相同的固定特異性。依照本發明，本發明的抗體片段可以通過諸如酶諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化和/或通過化學反應還原切割二硫橋等方法自人源化抗體獲得。納米抗體(nanobody)也歸入此定義。「⑶R」意指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區，如由Kabat等(Kabat等， Sequences of proteins of immunological interest,第 5版U. S. Department of Health and Human Services，NIH，1991，及後來的版本)所定義的。存在著3個重鏈⑶R和3個輕鏈⑶R。如可適用的，術語⑶R在本文用於指一個或多個，或者甚至所有這些含有大多數負責抗體對其識別的抗原或表位的親和結合的胺基酸的區域。可變域的最保守區域稱作FR 區或序列，代表「框架區」。本發明涉及人源化抗體。「人源化抗體」意指主要含有人免疫球蛋白序列的抗體。此術語一般指已經通過摻入人序列或人序列中找到的殘基修飾的非人免疫球蛋白。一般地，人源化抗體包含一個或通常兩個如下的可變域，其中整個或部分⑶R區對應於自非人親本序列衍生的部分，且其中整個或部分FR區自人免疫球蛋白序列衍生。然後，人源化的抗體可以包含免疫球蛋白恆定區的至少一部分(Fe)，特別是選定的參照人免疫球蛋白的。如此，我們嘗試獲得在人中最小免疫原性的抗體。如此，有可能的是，在不實質性降低抗體對高分子量的Α-β肽的結合特異性的情況中，通過對人宿主免疫原性較小的胺基酸修飾一個或多個CDR的一個或兩個胺基酸。此外，框架區的殘基不需要是人的，並且有可能的是，不修飾它們，因為它們不促成抗體的免疫原性潛力。數種人源化方法是本領域技術人員已知的，其用於將非人親本抗體修飾成在人中免疫原性較小的抗體。與人抗體的完全序列同一性是不必要的。實際上，完全序列同一性並非必然是降低的免疫原性的預測性指標，並且對有限數目的殘基的修飾可以導致在人中呈現非常減弱的免疫原性潛力的人源化抗體(Molecular Immunology (2007) 44,1986-1998)。例如，一些方法是納入CDR(嫁接)(EP0 0 239 400 ；WO 91/09967 ；及美國專利 No. 5，530，101 和 5，585，089)、表面重建(ΕΡ0 0 592 106 ；EPO 0 519 596 ；Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5) :489_498 ;Studnicka等，1994，Prot Eng7(6) :805_814 ；及Roguska等，1994，PNAS 91 :969_973)或鏈混合(美國專利 No. 5，565，332)。特別地，本發明涉及人源化抗體，其可變部分依照國際專利申請W02009/032661 中解釋的技術來修飾。值得注意地，此技術使用基於抗體的三維模型的動力學分子模擬，所述模型是通過同源性構建的。本發明還涉及具有降低的效應器功能的任何形式的抗體，諸如攜帶降低其對免疫系統的受體的親和力的Fc域突變的免疫球蛋白或諸如納米抗體。「效應器功能」意指抗體Fc域對誘導免疫應答的受體或蛋白質的任何固定。降低這些效應器功能使得有可能降低不利的效應諸如誘導微出血(Racke等J Neurosci 2005， 25 629)。可以通過本領域技術人員已知的任何技術來測量親和力。有利地，它通過基於 Ratkovsk DA 和 Reedy TJ(Biometrics，1986，42，575-82)所描述的算法開發的 Biostat Speed技術來測量。為了容許表達依照本發明的抗體的重鏈和/或輕鏈，將編碼所述鏈的多核苷酸在表達載體中插入。這些表達載體可以是質粒、YAC、粘粒、逆轉錄病毒、自EBV衍生的附加體、 和本領域技術人員可以判定為適合於所述鍊表達的所有載體。可以使用這些載體來轉化自一種細胞系有利地衍生的細胞。甚至更有利地，所述細胞系是自哺乳動物衍生的。有利地，它是CHO系或自此系衍生的系，或HEK293系或自此系衍生的系。可以通過本領域技術人員已知的用於將多核苷酸導入宿主細胞中的任何方法來實施細胞的轉化。所述方法可以是依靠右旋糖苷的轉化、通過磷酸鈣的沉澱、依靠 Polybrene的轉染、原生質體融合、電穿孔、脂質體中的多核苷酸包囊、生物射彈注射和DNA 進入細胞核的直接顯微注射。為了通過表面、口服、胃腸外、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下、眼內或其它路徑施用， 依照本發明的抗體可以包含在藥物組合物中。優選地，藥物組合物含有用於可注射配製劑的藥學可接受媒介物。這些可以特別是無菌的、等張的鹽水溶液(磷酸一鈉或二鈉、氯化鈉、鉀、鈣或鎂，等等，或所述鹽的混合物)、或乾燥的組合物，值得注意地凍幹的，其通過在適當時添加無菌水或生理學血清而容許構成可注射溶質。舉例而言，藥物組合物包含(I)Dulbecc0磷酸鹽緩衝液(pH約7. 4)，其任選地含有lmg/ml至25mg/ml的人血清清蛋白、(2)0. 9% w/v氯化鈉(NaCl)、和(3)5% (w/v)右旋糖。它還可以包含抗氧化劑諸如色胺和穩定劑諸如Tween20。所討論的病理學可以是與澱粉樣斑沉積有關的任何疾病。特別地，所討論的病理學是阿耳茨海默氏病。劑量取決於期望的效果、治療的持續時間和所使用的施用路徑；它們一般是對於成人的每天5mg-1000mg抗體。一般地，醫生會決定與疾病的階段、患者的年齡和重量、或必須考慮的任何其它患者相關因素有關的合適劑量。本發明通過下文給出的實施例例示，而非限制。附圖簡述圖IA 容許抗A β抗體13C3-VH1VL1的輕鏈LCl表達的質粒pXL4973的圖。
圖IB 容許抗A β抗體13C3-VH1VL1的重鏈HCl表達的質粒pXL4979的圖。圖2A和2B 通過在Superdex 75上的凝膠過濾分離初原纖維和低分子量寡聚物 (分別在t = 0禾Π t = 16小時時)。圖3 初原纖維的分子量的測定。圖4A、4B和4C 人源化抗體(分別為抗體LP09027 (4A)、LP09026 (4B)和 LP09028(4C))對初原纖維的親和力的測定(來自3次實驗的均值數值士sem)。圖5 人源化抗體LP09027對於A β原纖維的特異性。圖6Α和6Β 人源化抗體(LP09027)分別對小鼠額皮質(6Α)和海馬(6Β)的成熟老年斑的特異性。箭標示老年斑。
實施例實施例1 獲得人源化抗體將鼠抗體13C3人源化。此實施例描述了人源化抗肽A β抗體VHlVLl (LP09027)的序列和生成，其通過在稱作FreeStyle 293-F的哺乳動物系HEK293中瞬時表達的生成來進行。分別將編碼人源化可變鏈VLl和VHl的cDNA與編碼人恆定區C κ和IgG4的cDNA 融合。恆定區IgG4的序列是具有Kabat命名中的替代S241P和L248E的變體的，以顯著降低半分子的生成(Angla等，1993,Mol. Immunol. ,30 105-108)和效應器功能(W0 97/09351)。分別將編碼CHl (SEQ ID NO 1)和CLl (SEQ ID NO 3)的核酸序列在表達載體中獨立克隆以生成質粒pXL4973(

圖1A)和pXL4979 (圖1B)。依照由Invitrogen(產品目錄參照K9000-01)所描述的方案在共轉染質粒 PXL4973和pXL4979後通過在系FreeStyle 293-F(Invitrogen)中瞬時表達的生成來生成一批抗體。然後，將此批(LP09027)通過在MabSelect凝膠(Amersham)柱上依照供應商的推薦的親和層析來純化，然後在PBS緩衝液(參照Dulbeccol4190-094)中配製，並進行無菌過濾(0.2μπι)。自IL培養物開始，通過變性條件中的SDS-PAGE及通過空間排阻層析以 97%的純度獲得33mg抗體。通過變性條件中的SDS-PAGE及通過LC/MS獲得的質量與一級胺基酸序列和Fc域上N-聚糖的存在一致，即對於LCl為23969Da的質量，而考慮GOF形式的N-聚糖，對於HCl為49650Da。通過非變性條件中的SDS-PAGE及通過大小排阻層析獲得的質量與150kDa的抗體的異四聚體結構一致(圖4A)。依照相同的方法，自對於LP09026的核苷酸序列SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 21 (圖4B)，及對於LP09028的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 21 (圖4C)開始，生成人源化抗體LP09026和LP09028的批次。實施例2 自肽Αβ (1-42)製備初原纖維依照由Johansson 等(FEBS，2006，2618-2630)所描述的方法自合成肽 A β (1-42) 製備初原纖維。將凍幹的肽(Anaspec參照24224)在IOmM NaOH中以100 μ M的濃度溶解， 然後攪拌1分鐘，並在冰上溫育10分鐘。然後，將肽的溶液在IOOmM磷酸鈉，200mM NaCl pH =7. 4的緩衝液中稀釋至50 μ M濃度，然後攪拌1分鐘。將製備物於37°C溫育過夜以形成初原纖維，然後以17900g於16°C離心15分鐘以除去不溶性聚集物。為了分離初原纖維與低分子量的寡聚形式的A β，將上清液在50mM乙酸銨緩衝液pH = 8. 5中平衡的Superdex75凝膠過濾柱上加載。將與初原纖維和低分子量寡聚物對應的級分收集，並於4°C貯存。圖 2顯示了分離初原纖維的典型譜。使用Biorad校正試劑盒(參照150-1901)作為分子量標誌物通過SuperdeX200凝膠過濾測定初原纖維的分子量。圖3顯示了初原纖維的分子量大於 200kDa。實施例3 人源化抗體對於初原纖維的特異性和親和力將50 μ 1在PBS (Gibco，參照70011)中的濃度1 μ g/ml的初原纖維和低分子量寡聚物在ELISA板(Nunc，參照442404)的孔中沉積，並於4°C溫育過夜。除去過量的抗原後， 將200 μ 1緩衝液PBS+5%奶粉(重量/體積)在每孔中沉積以除去非特異性吸附，並於室溫溫育2小時。然後，用300 μ 1緩衝液PBSTween 0. 02%將孔清洗4次。將50 μ 1 —抗溶液(對於寡聚物自100 μ g/ml的濃度開始，而對於初原纖維自25 μ g/ml濃度開始，在PBS Tween中3倍3倍稀釋)添加至每孔，並於室溫溫育1小時。用300 μ 1緩衝液PBS Tween 將孔清洗4次。將在緩衝液PBS Tween中以1/10000稀釋的與過氧化物酶偶聯的抗人Fc 二抗(山羊抗人IgG (Fe)，過氧化物酶綴合的，Pierce，參照31413)添加至每孔，並於室溫溫育 1 小時。用 300 μ 1 PBS Tween 清洗 4 次後，將 100 μ 1 TMB (Interchim,參照 UP664782)添加至每孔，並溫育約10分鐘，然後用IM HCl溶液(Interchim，參照UPS29590)停止反應，並於以450nm波長測量的OD讀板。通過BioStat Speed測定EC50值。表1和圖4中呈現了獲得的結果，並且顯示了相對於低分子量寡聚物，抗體對初原纖維的非常高的特異性(184 倍)。表1:
權利要求
1.對A-β肽的初原纖維形式特異性的人源化抗體。
2.依照權利要求1的抗體，其特徵在於它結合老年斑中聚集的所述A-β肽，而不結合 A-β肽的彌散性沉積物。
3.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含至少一種由與序列SEQID NO 9、11、13、15、17和19之一具有相同序列的核苷酸序列，或由與這些序列分別相差1、2、 3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。
4.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含至少一種與序列SEQID NO10、12、14、16、18和20之一具有相同序列的CDR0
5.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含至少一種其序列相對於序列 SEQ ID NO 10、12、14、16、18和20之一相差1至2個胺基酸的⑶R，只要所述抗體維持其結合特異性。
6.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID NO :9、11、13、15、17和19，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。
7.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含序列SEQID N0:10、12、14、 16、18 和 20 的 CDR0
8.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID NO :9、 11、13、31、17和19，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。
9.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含序列SEQID N0:10、12、14、 32、18 和 20 的 CDR0
10.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID NO 9、11、29、31、17和19，或由與這些序列分別相差1、2、3、4或5個核苷酸的序列編碼的⑶R。
11.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含序列SEQID N0:10、12、30、 32、18 和 20 的 CDR0
12.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其重鏈的可變部分由與序列SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 27之一具有至少80%同一性的序列編碼。
13.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其重鏈的可變部分包含與序列SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 28之一具有至少80%同一性的序列。
14.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其輕鏈的可變部分由與序列SEQ ID NO :7和SEQ ID NO 23之一具有至少80%同一性的序列編碼。
15.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其輕鏈的可變部分包含與序列SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 24之一具有至少80%同一性的序列。
16.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它含有包含由核苷酸序列SEQID NO 5和SEQ ID NO 27之一編碼的可變部分的重鏈。
17.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它含有包含多肽序列SEQID NO 6 或SEQ ID NO 28的可變部分的重鏈。
18.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它含有包含由核苷酸序列SEQID NO 7和SEQ ID NO 23之一編碼的可變部分的輕鏈。
19.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它含有包含多肽序列SEQID NO 8 或SEQ ID NO 24的可變部分的輕鏈。
20.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID NO 5和7編碼的序列。
21.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其序列包含多肽序列SEQID NO 6 禾口 8。
22.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由與核苷酸序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 25之一具有至少80%同一性的序列編碼的重鏈。
23.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含與多肽序列SEQID NO 2和 SEQ ID NO 26之一具有至少80%同一性的重鏈。
24.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由與核苷酸序列SEQID NO 3和SEQ ID NO 21之一具有至少80%同一性的序列編碼的輕鏈。
25.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含與多肽序列SEQID NO 4和 SEQ ID NO 22之一具有至少80%同一性的輕鏈。
26.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID NO 1和3編碼的序列。
27.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其序列包含多肽序列SEQID NO 2 禾口 4。
28.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID NO 5和23編碼的序列。
29.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其序列包含多肽序列SEQID N0 6 禾P 24。
30.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它包含由核苷酸序列SEQID N0 27和23編碼的序列。
31.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其序列包含多肽序列SEQID N0 28 禾口 24。
32.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於它誘導澱粉樣斑的縮小。
33.依照前述權利要求中任一項的抗體，其特徵在於其對所述肽Αβ的初原纖維形式的親和力比其對此肽的其它形式的親和力大至少100倍。
34.依照前述權利要求中任一項的抗體在治療與神經變性性病症有關的疾病中的用途。
35.依照前述權利要求中任一項的抗體在治療阿耳茨海默氏病中的用途。
36.藥物組合物，其包含依照權利要求1至34中任一項的抗體和賦形劑。
37.治療阿耳茨海默氏病的方法，其特徵在於它包括對患者施用權利要求1至34中任一項的抗體。
38.生成依照權利要求1至34中任一項的抗體的細胞。
39.生成依照權利要求1至34中任一項的抗體的方法，其特徵在於它包括培養依照權利要求38的細胞。
40.包含依照權利要求1至34中任一項的抗體的醫學產品。
41.編碼與序列SEQID NO :2、4、6、8、22、24、26或28之一具有至少80%同一性的多肽的多核苷酸。
42.多核苷酸，其特徵在於它具有與序列SEQID N0:l、3、5、7、21、23、25、或27之一具有至少80%同一性的序列。
43.包含依照權利要求41和42中任一項的核酸的重組載體。
44.包含依照權利要求43的載體的宿主細胞。
全文摘要
本申請涉及對β-澱粉樣肽的初原纖維形式特異性的人源化抗體及所述抗體在阿耳茨海默氏病領域中的用途。
文檔編號G01N33/68GK102459336SQ201080030434
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月11日 優先權日2009年5月12日
發明者B.卡梅倫, F.布蘭奇, L.普拉迪爾, M.杜切斯恩, N.鮑林, S.奈米, V.米科爾, Y.史 申請人:賽諾菲