層粘連蛋白、衍生物和包含它們的組合物以及它們的治療性應用方法

2023-06-09 14:43:46

專利名稱：層粘連蛋白、衍生物和包含它們的組合物以及它們的治療性應用方法
技術領域：
本公開涉及通過向對象施用層粘連蛋白或包含層粘連蛋白的組合物，向對象提供 治療性益處的方法。在具體實施方案中，本公開提供了通過施用層粘連蛋白或層粘連蛋白 組合物，在對象中增強肌肉再生、例如治療肌營養不良症的方法。
背景技術：
成年骨骼肌在外傷或受損後顯示出顯著的修復和再生能力。骨骼肌的再生能力是 由於位於基底層下並與肌纖維膜緊密接近的衛星細胞池。這些細胞在健康的未受損肌肉中 保持靜止，但是對肌肉損傷、運動或疾病作出響應而快速活化。活化後，衛星細胞增殖並沿著肌源性途徑分化，能夠修復損傷的肌肉。模型表明， 衛星細胞的一個亞群保留為幹細胞，以取代已經沿著肌源性譜系途徑進化的活化的細胞。 在活化期間，衛星細胞當它們通過發育程序向肌肉修復進化時，表達轉錄因子Pax3、Pax7、 MyoD、成肌蛋白和MRF4。肌營養不良症是用於指稱一組導致進行性肌肉虛弱的遺傳病症的術語。肌營養不 良症可以引起骨骼肌虛弱和骨骼肌蛋白的缺陷，導致各種不同的受損的生理功能。肌營養 不良症不存在令人滿意的治療方法。現有的治療方法典型地集中在通過例如物理療法或通 過提供整形外科裝置來緩解疾病的作用和改進患者的生活質量。與肌營養不良症相關的突變基因負責編碼許多與肋節蛋白(costameric protein)網絡相關的蛋白。這樣的蛋白包括層粘連蛋白_2，膠原蛋白，肌營養不良蛋白聚 糖，整合蛋白，小窩蛋白-3，錨蛋白，肌養蛋白，α -小肌營養蛋白，紐蛋白，網蛋白，BPAGlb， 肌肉LIM蛋白，結蛋白，輔肌動蛋白相關的LIM蛋白，α-肌動蛋白，肌聯蛋白，視鬆蛋白， cypher，肌節蛋白和肌聚糖/肌長蛋白複合物。肌營養不良症的最常見形式杜興氏(Ducherme)肌營養不良症，由負責產生肌養 蛋白的基因中的突變引起。肌養蛋白是參與細胞與細胞外基質、包括基底膜結合的蛋白。先天性肌營養不良症由影響其他肋節蛋白產生的基因突變引起。例如，在歐洲裔人群中，最流行的先天性肌營養不良症由導致α 7β 1整合蛋白表達缺失的突變引起。與肌養蛋白相似， α 7 β 1整合蛋白參與細胞與細胞外基質的結合。在某種程度上，編碼肌養蛋白或α 7β1整合蛋白之一的基因的缺陷，通常通過增 強其他或另一種肋節蛋白、例如肌養相關蛋白(utrophin)(肌養蛋白的類似物)的表達來 補償。肌養蛋白、α 7β1整合蛋白和肌養相關蛋白都用作層粘連蛋白的受體，層粘連蛋白 用作與細胞外基質的連接。層粘連蛋白_2本身的生產缺陷導致分區蛋白缺陷性先天性肌 營養不良症(MCMD)或IA型先天性肌營養不良症(MDClA)。層粘連蛋白是基底膜的主要成分。已經鑑定到至少15種層粘連蛋白蛋白三體，每 個異源三體包含α、β和Υ鏈。層粘連蛋白與許多生理功能相關，包括細胞附著、基因表 達、蛋白的酪氨酸磷酸化、細胞分化以及細胞形狀和移動。已知層粘連蛋白通過整合蛋白受 體與細胞膜結合。此外，層粘連蛋白_2與作為肌養蛋白-糖蛋白複合物的一部分的α-肌 營養不良蛋白聚糖結合。α 7β 1整合蛋白是骨骼肌中表達的主要層粘連蛋白受體。α 7β 1整合蛋白在神 經-肌肉和肌-腱連接的發育中發揮重要重用。在成年人中，α 7β1整合蛋白在連接位點 處集中，並發現它在連接外區域中介導肌肉纖維與細胞外基質的黏附。缺乏α7鏈的小鼠 發展出影響肌-腱連接的肌營養不良症。缺乏α7整合蛋白導致在肌-腱連接處基質沉積 缺陷。在Y-肌聚糖小鼠中喪失α 7整合蛋白導致嚴重的肌肉病。在mdx小鼠中缺乏α 7 整合蛋白也引起嚴重的肌營養不良症，證實了 α 7β1整合蛋白作為杜興氏和其他肌營養 不良症的主要遺傳修飾物。在人類中，α 7基因的突變造成肌營養不良症。篩查患有未確定的肌肉疾病的患 者的117個肌肉活檢組織，發現了 3份缺乏α 7整合蛋白鏈，並具有降低的β ID整合蛋白 鏈水平。這些患者表現出發育重要事件的延遲和活動受損，與α 7β1整合蛋白在神經-肌 肉和肌_腱連接發育和功能中的作用相一致。幾條線路的證據表明，α 7整合蛋白對於肌肉再生可能是重要的。例如，在胚胎髮 育過程中，α 7β1整合蛋白調控成肌細胞向肌纖維形成區域的遷移。已經發現，MyoD(肌源 性決定蛋白)在體外反式激活α 7整合蛋白的基因表達，這將增加活化的衛星細胞中α 7 整合蛋白的水平。源自於衛星細胞的人類、小鼠和大鼠成肌細胞系表達高水平的α 7整合 蛋白。在5周齡mdx小鼠的骨骼肌中檢測到升高的α 7整合蛋白mRNA和蛋白，其與肌肉的 最大退化和再生時間相關聯。此外，α 7β1整合蛋白與肌肉特異性α -整合蛋白結合蛋 白(MIBP)結合，調節層粘連蛋白在C2C12成肌細胞中的沉積。層粘連蛋白提供了支持成肌 細胞遷移和增殖的環境。最後，α 7整合蛋白在營養不良的骨骼肌中增加的表達，導致了衛 星細胞的數量增加。到目前為止，許多治癒或緩解肌營養不良症的努力包括增強肋節網絡的各種不同 成分的表達。但是，這些方法儘管在體外或轉基因動物中顯示出某些希望，但通常不能證實 在人類中的有效結果，也不能提供能夠在人類中實現治療的方法。這樣的治療途徑眾所周 知難以實施。但是，也已公知，蛋白、特別是大蛋白的直接施用是非常困難的。例如，尺寸大、電 荷高、半衰期短、穩定性差、免疫原性高以及膜通透性差，可能限制所施用蛋白的生物利用度。此外，取決於施用途徑，對象的天然生理過程可能攻擊並降解所施用的蛋白。例如，盡 管層粘連蛋白已知在細胞外基質中發揮重用，但它是特別大(典型> 600kD)、高度帶電荷 的分子，因此將可以預料到它施用於患者的難度。因此，到目前為止的努力集中於更精細的 治療，而不是治療性物質的直接施用。發明概述 在各種不同的實施方案中，本公開提供了用層粘連蛋白或含有層粘連蛋白的組合 物治療對象的方法。例如，某些實施方案提供了通過向對象施用有效量的層粘連蛋白或含 有層粘連蛋白、包括其片段、衍生物或類似物的組合物，在對象中改善肌肉健康，例如增強 肌肉的再生、維持或修復的方法。在具體實施例中，層粘連蛋白是完整的層粘連蛋白。在其 他實施例中，層粘連蛋白選自層粘連蛋白-1、層粘連蛋白-2、層粘連蛋白_4及其組合。在 其他實施例中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物包含至少基本上與層粘連蛋白-1、層粘連 蛋白_2或層粘連蛋白_4同源的物質。在其他實施方案中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合 物包含至少基本上與層粘連蛋白α 鏈同源的多肽。在其他例子中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物由層粘連蛋白-1、層粘連蛋 白_2、層粘連蛋白_4及其組合構成。在其他例子中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物由至 少基本上與層粘連蛋白-1、層粘連蛋白_2或層粘連蛋白-4同源的物質構成。在其他實施 方案中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物由至少基本上與層粘連蛋白α 1鏈同源的多肽構 成。在具體實施例中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物不包括層粘連蛋白片段，例如只包括 完整的層粘連蛋白。在另一個例子中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物基本上由層粘連蛋白-1、層粘 連蛋白_2、層粘連蛋白_4及其組合構成。在其他例子中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物 基本上由至少基本上與層粘連蛋白-1、層粘連蛋白_2或層粘連蛋白_4同源的物質構成。 在其他實施中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物基本上由至少基本上與層粘連蛋白α 1鏈 同源的多肽構成。在具體實施例中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物不包括層粘連蛋白片 段，例如基本上只包括完整的層粘連蛋白。公開的方法的其他實施包括診斷對象為患有可以通過施用層粘連蛋白或含有層 粘連蛋白的組合物治療的病症。在一個例子中，對象被診斷為患有肌營養不良症，例如先天 性肌營養不良症，杜興氏肌營養不良症或肢帶型肌營養不良症。在其他情況下，病症的特點 為對象不能表達一種或多種與細胞外基質的形成和維持有關的蛋白，或對象表達這些蛋白 的能力降低，例如層粘連蛋白、整合蛋白、肌養蛋白、肌養相關蛋白或肌營養不良蛋白聚糖 的生產受損或不能生產。在具體實施方案中，本公開還提供了在對象中增加肌肉再生的方法。例如，老年對 象，患有肌肉病症的對象，以及患有肌肉受損、包括活動誘導的肌肉受損例如運動引起的受 損的對象，可以從本實施方案獲益。在公開的方法的其他實施方案中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物以預防性的方 式施用，例如預防或減少肌肉損傷或受損(例如活動或運動誘導的受損)。例如，老年對象， 易於肌肉損傷的對象，或具有肌肉受損風險的對象例如運動員，可以進行治療以消除或緩 解肌肉損傷、受損或疾病。本公開的實施也可用於促進傷口癒合。在某些例子中，將層粘連蛋白或包含層粘連蛋白的組合物施用到傷口中或附近。在其他例子中，該物質全身性施用。儘管該物質典 型在創傷發生後施加，但在某些例子中可以前瞻性施加所述物質。在其他實施方案中，本公開的方法包括將層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物與一種或多種附加的藥理性物質、例如治療性藥劑一起施用。在某些情況下，附加的治療性藥劑增 強了層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物的治療效果。在其他情況下，治療性藥劑為所治療的 病症提供獨立的治療益處。在各種不同的例子中，附加的治療性藥劑是細胞外基質的成分， 例如整合蛋白、肌養蛋白、肌營養不良蛋白聚糖、肌養相關蛋白或生長因子。在其他例子中， 治療性藥劑降低或增加能夠增強細胞外基質的形成或維持的物質的表達。在某些例子中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物被施加到待治療對象的特定區域 上。例如，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物可以注射到待治療的特定區域中，例如肌肉中。 在其他例子中，施用層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物使得它分布到對象的多個區域，例如 全身性施用或區域性施用。層粘連蛋白或包含層粘連蛋白的組合物可以通過任何適合的方法施用，例如表面 (topical)、腸胃外(例如靜脈內或腹膜內)、或口服。在具體實施例中，層粘連蛋白或層粘 連蛋白組合物全身性施用，例如通過腸胃外施用，例如胃注射或腹膜注射。儘管已經針對肌肉再生對所公開的方法進行了一般性描述，但本公開的方法也可 用於增強其他組織或器官的修復或維持，或防止它們的損傷。例如，本公開的方法可用於治 療由於骨骼肌之外的細胞或組織的效應，例如腦功能、平滑肌或心肌的受損或改變，而引起 的肌營養不良症的症狀。本公開的各種實施方案還具有其他特點和優點。從下面的公開中，它們將變得明
Mo就此而言，應該理解，這是本文描述的各種實施方案的簡要概述。本公開的任何給 定的實施方案不需要提供所有上面提到的特點，也不必須解決上面提到的現有技術中的所 有難題或應對所有問題。附圖簡述

圖1是使用抗α 7整合蛋白單克隆抗體，從巢蛋白-GFP轉基因小鼠分離到的肌纖 維的免疫螢光照片。圖2是心臟毒素誘導的損傷後4、10和28天時，野生型和α 7整合蛋白缺失型小 鼠(intergrin null mice)的脛骨前肌的照片。圖3提供的圖顯示了野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠攝取的伊文思藍染料。圖4是來自野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠的組織切片的蘇木精和曙紅染色的 顯微照片。圖5提供的圖顯示了野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠中位於中心的核的百分率。圖6提供的圖顯示野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠中胚胎肌球蛋白重鏈的表 達。圖7提供了野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠肌纖維的橫截面圖。圖8提供的圖顯示了 BrdU摻入到野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠中。圖9提供的圖顯示了在野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠中的Pax7表達。
圖10提供的圖顯示了在野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠中的MyoD表達。圖11是從用層粘連蛋白-1處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠分離到的肌 纖維的免疫螢光照片。圖12是心臟毒素誘導的損傷後4、10和28天時，用層粘連蛋白_1處理的野生型 和a7整合蛋白缺失型小鼠的脛骨前肌的照片。圖13提供的圖顯示了用層粘連蛋白-1處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠 攝取的伊文思藍染料。圖14是來自用層粘連蛋白-1處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠的組織切 片的蘇木精和曙紅染色的顯微照片。圖15提供的圖顯示了在用層粘連蛋白-1處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小 鼠中位於中心的核的百分率。圖16提供了在用層粘連蛋白-1處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠中胚胎 肌球蛋白重鏈的表達的圖。圖17提供了用層粘連蛋白-1處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠肌纖維的 橫截面圖。圖18提供的圖顯示了 BrdU摻入到用層粘連蛋白_1處理的野生型和a 7整合蛋 白缺失型小鼠中。圖19提供的圖顯示了 Pax7在用整合蛋白處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小 鼠中的表達。圖20提供的圖顯示了在用層粘連蛋白處理的野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠 中的MyoD表達。圖21是X-gal染色照片，證明了 a 7 0 galv_成肌細胞表達0 -半乳糖苷酶(左 圖)，該表達在分化成肌管後增加了(右圖)。圖22是在從0-72小時分化的a 7 ^ gal+/_細胞中，a 7整合蛋白和0 -半乳糖苷 酶表達的Western分析的照片。圖23是螢光激活的分揀(FACS)圖(側向散射的對數對FITC染色(強度))，證明 了 a 7 0 galv_成肌細胞在lOOnM LAM-111處理後表現出增加的0 -半乳糖苷酶表達。圖24是在層粘連蛋白-111和磷酸緩衝鹽水處理的C2C12和杜興氏肌營養不良症 成肌細胞中，a 7B整合蛋白和Cox-1表達的Western分析的照片。圖25提供了在層粘連蛋白-111和磷酸緩衝鹽水處理的C2C12和杜興氏肌營養不 良症成肌細胞中，a 7B整合蛋白的表達圖(像素對平方毫米)。圖26是對照、磷酸緩衝鹽水處理的和層粘連蛋白-111處理的肌肉的脛骨前肌 的免疫螢光照片(比例尺=10 ym)，顯示了在用層粘連蛋白-111或磷酸緩衝鹽水處理的 mdx肌肉中沒有肌養蛋白，並且儘管野生型和磷酸緩衝鹽水注射的mdx肌肉缺乏層粘連蛋 白-111，但在層粘連蛋白-111注射的mdx肌肉的細胞外基質中檢測到了層粘連蛋白-111。圖27是野生型、磷酸緩衝鹽水注射的mdx肌肉和層粘連蛋白_111注射的mdx肌 肉的蘇木精和曙紅(上圖)染色和伊文思藍染料(EBD)攝取(下圖)的顯微照片(比例尺 =10 ym)，顯示出層粘連蛋白-111注射的肌肉與磷酸緩衝鹽水注射的mdx肌肉相比，表現 出位於中心的核和EBD攝取減少。
圖28提供了野生型、用磷酸緩衝鹽水注射的mdx肌肉和用層粘連蛋白_111處理 的mdx肌肉的伊文思藍染料攝取(左圖，陽性纖維的百分率)和位於中心的核(右圖，核中 心定位陽性的纖維的百分率)的圖。圖29是野生型肌肉、磷酸緩衝鹽水處理的mdx肌肉和層粘連蛋白-111處理的mdx 肌肉的免疫螢光照片(比例尺=10 μ m)，顯示了 α 7整合蛋白、肌養相關蛋白和α-金環蛇 毒素的存在或不存在。圖30是野生型肌肉、磷酸緩衝鹽水處理的mdx肌肉和層粘連蛋白-111處理的mdx 肌肉中肌 養蛋白、肌養相關蛋白、α 7Α整合蛋白、α 7Β整合蛋白、β ID整合蛋白和Cox-I表 達的Western分析的照片。圖31提供了野生型肌肉、磷酸緩衝鹽水處理的mdx肌肉和層粘連蛋白_111處理 的mdx肌肉的α 7Α整合蛋白/Cox-I (上圖)、α 7Β整合蛋白/Cox-I (中圖)和肌養相關蛋 白/Cox-I (下圖)的比率的圖。圖32是野生型肌肉、磷酸緩衝鹽水處理的mdx肌肉和層粘連蛋白-111處理的mdx 肌肉的免疫螢光照片(比例尺=10 μ m)，顯示出在mdx小鼠中腹膜內單次投送lmg/kg劑量 的層粘連蛋白-111，導致向心臟、橫膈膜和腓腸肌的局部化。圖33是用磷酸緩衝鹽水(左邊照片)或層粘連蛋白-111 (右邊照片)處理的 mdx小鼠的橫膈膜的免疫螢光照片，顯示出在用層粘連蛋白-111腹膜內注射後，層粘連蛋 白-111遍布於mdx小鼠的橫膈膜。圖34提供了野生型肌肉、用磷酸緩衝鹽水注射的mdx肌肉和用層粘連蛋白-111 處理的mdx肌肉的肌酸(mg/dl)和血液尿素氮(mg/dl)水平的圖。詳細描述縮寫PBS-磷酸緩衝鹽水 LAM-Hl-層粘連蛋白_1，其包括鏈α 1 β 1 γ 1NaCl-氯化鈉NaOH-氫氧化鈉HCl-鹽酸MCMD, MDClA-分區蛋白缺陷型先天性肌營養不良症DMSO-二甲基亞碸EDTA-乙二胺四乙酸eMyHC-胚胎肌球蛋白重鏈BrdU-溴代脫氧尿苷TA-脛骨前肌H&E-蘇木精和曙紅GFP-綠色螢光蛋白WT-野生型EBD-伊文思藍染料DMD-杜興氏肌營養不良症CLN-中心定位的核
nmol-納摩爾nM-納摩爾濃度MyoD-肌源性決定蛋白MIBP-肌肉特異性a r整合蛋白結合蛋白
FACS-螢光激活的分揀FITC-螢光素異硫氰酸酯Pax7-配對框基因7Pax3-配對框基因3Cox-1-環力口氧酶-1MRF4-肌源性因子6術語為了便於理解提出的實施方案，提供了下面的解釋。除非另有解釋，否則所有本文中使用的技術和科學術語，具有與本公開所屬技術 領域中普通專業人員所通常理解的相同的意義。在有衝突的情況下，以本說明書、包括術語 的解釋為準。不帶數量指示的名詞形式包括複數的指稱物，除非上下文明確表明不是這樣。 同樣地，單詞「或」意指包括「和」，除非上下文明確表明不是這樣。術語「包含」意味著「包 括」，因此，「包含A或B」意味著包括A或B，或包括A和B。所有本文中給出的數值範圍，包 括了端點之間的所有值，包括端點(除非專門排除)，以及任何和所有的中間範圍。儘管與本文描述的相似或等價的方法和材料可用於實踐或試驗本公開，但在本文 中仍描述了適合的方法和材料。公開的材料、方法和例子僅僅是說明性的，不打算是限制性 的。「肌肉」是指任何成肌細胞、肌細胞、肌纖維、肌管或其他由肌肉細胞構成的結構。 肌肉或肌細胞可以是骨骼肌、平滑肌或心肌。在本公開的具體實施中，肌肉也可以是指能夠 形成肌細胞的細胞或其他材料，例如幹細胞和衛星細胞。「細胞外基質」是指組織的細胞外結構或其層，包括一種或多種基質成分的排列、 組成和形成，這些成分例如蛋白，包括結構蛋白如膠原蛋白和彈性蛋白，蛋白例如纖連蛋白 和層粘連蛋白，以及蛋白聚糖。基質可以含有纖維膠原蛋白，具有纖維的網絡。在某些例子 中，細胞外基質通過肋節蛋白網絡與細胞相連。「組織」是指細胞、通常為特定種類的，與它們的細胞間物質一起的聚集體，形成了 動物中的一種結構性材料，在動物中包括結締組織、上皮組織、肌肉組織和神經組織。「對象」是指對其的處理是施用的生物體，例如動物。對象包括哺乳動物，例如人 類、豬、大鼠、奶牛、小鼠、狗、貓和靈長動物。「層粘連蛋白」是指通常參與細胞外基質的形成和維持的糖蛋白家族的任何一種。 層粘連蛋白是由a鏈、0鏈和Y鏈形成的異源三體。具體的層粘連蛋白的各種鏈可以影 響分子的性質。在本公開的某些情況下，可以使用各種不同層粘連蛋白的片段、衍生物或類 似物，例如至少一部分與層粘連蛋白a 1鏈至少基本上同源的層粘連蛋白。在本公開中使用的「至少基本上同源」，是指同源性程度足以產生參照物質在肌肉 再生、維持或修復或傷口癒合中的至少一部分活性。在某些實施例中，當物質與參照物質至 少大約95 %、至少大約98 %或至少大約99 %同源時，它們是至少基本上同源的。
本文中使用的「片段」是指物質例如層粘連蛋白的一部分。在某些實施例中，片段 可以是蛋白的特定結構域或鏈。例如，本公開的具體實施方案包括施用層粘連蛋白-1的片 段，它對應於層粘連蛋白al鏈的至少一部分(或全部)。片段可以是合成的，或可以源自 於較大的母體物質。本文中使用的「衍生物」是指物質例如層粘連蛋白或其部分的一種形式，它與母體 化合物相比具有至少一個改變、添加或移除的官能團。「官能團」是指向物質添加物理或化學性質的烴類基團之外的基團。本文中使用的「類似物」是指與一種化合物足夠同源，使得其具有與原始化合物相 似的用於所需目的的功能活性的化合物。類似物包括與特定物質相比具有一個或多個氨基 酸取代的多肽。在某些情況下，層粘連蛋白可以作為層粘連蛋白的混合物來施用，所述層粘連蛋 白包括其片段、類似物和衍生物。用於製備層粘連蛋白結構域類似物的適合方法公開在美 國專利No. 6，933，280，在此以其不與本公開衝突的程度引為參考。本公開的層粘連蛋白物質或組合物可以單獨作為分子投送，或者可以與另一種物 質複合或結合投送。例如，層粘連蛋白可以與載體組合，例如以幫助將層粘連蛋白投送到目 標位點，或增加層粘連蛋白的生理攝取或摻入。在具體實施方案中，施用的層粘連蛋白包括層粘連蛋白-l(LAM-lll)或由其構 成，所述層粘連蛋白-1包含鏈a 1 0 1 Y 1。在其他實施例中，施用的層粘連蛋白包括層粘連 蛋白-2或由其構成，所述層粘連蛋白-2包含鏈CI201Y1。在其他實施例中，施用的層粘 連蛋白包含層粘連蛋白_4或由其構成，所述層粘連蛋白_4包含鏈a 2 0 2 Y 1。層粘連蛋白可以從任何適合的來源獲得。例如，層粘連蛋白-1可以從胎盤組織或 從Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤獲得。分離各種不同層粘連蛋白的適合的方法，公開在 美國專利No. 5，444，158中，在此以其不與本公開衝突的程度引為參考。「生物學來源」是指可以從其獲得生物學材料的生物體，例如動物，例如哺乳動物 或其一部分。這樣的材料的例子包括組織樣品，例如胎盤材料或肉瘤；細胞，例如衛星細胞； 細胞外材料，包括層粘連蛋白或其其他成分；或在生物體中發現的其他有機或無機材料。「改進肌肉健康」是指與現有狀態相比或與不治療情況下會發生的狀態相比，肌肉 健康的改善。例如，改進肌肉健康可以包括增強肌肉再生、維持或修復。改進肌肉健康還可 以包括前瞻性治療對象，以預防或降低肌肉損傷或受損。「再生」是指細胞或組織，例如肌肉細胞或包含肌肉細胞的組織(或器官)，在受損 或損傷後的修復，以將肌肉或組織至少部分恢復到與在發生受損或損傷之前細胞或組織存 在的相似的狀態。再生也指在患有影響這些細胞或組織的疾病的對象中促進細胞或組織的 修復，以消除或緩解疾病的影響。在更具體的實施例中，再生將細胞或組織置於與受損或損 傷發生之前相同的狀態或改進的生理狀態下，或在不發生疾病的情況下將存在的狀態下細胞或組織，例如肌肉細胞或包含肌肉細胞的組織(或器官)的「維持」，是指將細 胞或組織維持在至少基本上相同的生理狀態下，例如即使在存在一般將引起損傷、受損或 疾病的刺激物的情況下維持這樣的狀態。細胞或組織，例如肌肉細胞或包含肌肉細胞的組織(或器官)的「修復」，是指在損 傷或其他創傷後治癒細胞或組織的損傷的生理過程。
「施用」是指向對象提供一種或多種物質，使得對象可以從該物質獲得治療性益 處。層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性物質，一般表面、經鼻、靜脈內、經口、顱 內、肌肉內、腸胃外或作為植入物施用，但是原則上甚至直腸或陰道使用也是可能的。層粘 連蛋白或其組合物也可以使用這些技術的組合施用於對象。適合的固體或液體藥物製劑形式是例如氣溶膠，(微)膠囊，霜劑，滴液，安瓿形式 的滴液或可注射溶液，乳液，顆粒，粉末，栓劑，懸液，糖漿，片劑，包衣片，以及具有活性化合 物的延長釋放的製劑，在所述製劑中，如上所述慣常使用賦形劑和添加劑和/或輔助劑，例 如粘合劑，包衣劑，崩解劑，調味劑，潤滑劑，助溶劑，甜味劑或溶脹劑。藥物組合物適合用於 各種不同的藥物投送系統。對於藥物投送的各種不同方法的簡要綜述，參見Langer，「藥物 投送的新方法」(NewMethods of Drug Delivery), Science 249 :1527-1533 (1990)，在此以 其不與本公開衝突的程度引為參考。本公開的層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑，可以配製成能夠腸 胃外或口服施用於對象的治療活性藥物組合物。腸胃外施用途徑包括但不限於表皮，動脈 內，肌肉內(IM和埋置IM)，腹膜內(IP)，靜脈內(IV)，胸骨內注射或輸注技術，鼻內(吸 入)，鞘內，注射到胃中，皮下注射(皮下(SQ和埋置SQ)，透皮，表面和眼部。層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療藥劑可以與適合的可藥用賦形劑混合 或組合，以製備藥物組合物。可藥用賦形劑包括但不限於，例如氧化鋁，硬脂酸鋁，緩衝劑 (例如磷酸鹽)，甘氨酸，離子交換劑(以例如幫助帶電荷物質的受控釋放)，卵磷脂，飽和植 物脂肪酸的偏甘油酯混合物，山梨酸鉀，血清蛋白(例如人血清白蛋白)，山梨酸，水，鹽或 電解質例如基於纖維素的物質，膠體二氧化矽，磷酸氫二鈉，三矽酸鎂，聚丙烯酸酯，聚亞烷 基二醇例如聚乙二醇，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙烯吡咯烷酮，磷酸氫鉀，硫酸魚 精蛋白，1族滷化物鹽例如氯化鈉，羧甲基纖維素鈉，蠟，羊毛脂和鋅鹽。脂質體懸液也可以 適用作可藥用載體。在混合或添加層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑後，所得到的混 合物可以是固體、溶液、懸液、乳液等。它們可以按照本技術領域的普通專業人員已知的方 法來製備。所獲得的混合物的形式取決於多種因素，包括計劃的施用方式和藥劑在選擇的 載體中的溶解性。適合於層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑施用的藥物載體，包括 已知的任何這類適合於具體施用方式的載體。此外，層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他 治療性物質，也可以與其他不損害所需作用的無活性或活性物質混合，或與補充所需作用 或具有其他作用的物質混合。當藥劑在載體中表現出溶解性不足時，可以使用增溶方法。這樣的方法是已知的， 包括但不限於在碳酸氫鈉水溶液中溶解，使用助溶劑例如二甲基亞碸(DMS0)，以及使用表 面活性劑例如TWEEN (ICIAmericas, Inc.，Wilmington, DE)。層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑，可以與保護它們免於從身體 中快速消除的載體製備在一起，例如包衣或延時釋放製劑。這樣的載體包括受控釋放製劑， 例如但不限於微包囊投送系統。層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑以足以 在被治療的對象上執行治療有用效果的量，典型以避免不想要的副作用的量，包含在可藥 用載體中。治療有效濃度可以通過在用於被治療病症的已知體外和體內模型系統中測試化合物而憑經驗進行確定。例如，可以使用肌營養不良症的小鼠模型來確定有效量或濃度，然 後可針對其他對象例如人類加以轉換，這是本技術領域已知的。可注射溶液或懸液可以使用適合的無毒性、腸胃外可用的稀釋劑或溶劑進行配製，例如1，3_ 丁二醇，等張氯化鈉溶液，甘露糖醇，林格氏(Ringer' s)溶液，鹽水溶液或 水；或適合的分散或潤溼和懸浮劑，例如無菌的、溫和的、不揮發性油，包括合成的甘油單酯 或甘油二脂，以及脂肪酸，包括油酸；天然存在的植物油例如椰子油、棉籽油、花生油、芝麻 油等；甘油；聚乙二醇；丙二醇；或其他合成溶劑；抗微生物劑例如苯甲醇和對-羥基苯甲 酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉；緩衝劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽；螯 合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)；用於調節張力性的藥劑例如氯化鈉和右旋糖；及其組合。 腸胃外製劑可以封裝在由玻璃、塑料或其它適合材料製成的安瓿、一次性注射器或多劑量 小瓶中。可以根據需要摻入緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑等。當靜脈內施用時，適合的載體包 括生理鹽水，磷酸緩衝鹽水(PBS)，以及含有增稠劑和助溶劑例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二 醇及其混合物的溶液。脂質體懸液，包括組織定向脂質體，也可以適合用作可藥用載體。對於表面應用來說，層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑可以製成 在適合的水性或非水性載體中的霜劑、洗液、油膏、溶液或懸液。表面應用也可以通過包含 治療性物質的透皮貼片或繃帶來進行。也可以包含添加劑，例如緩衝劑如偏亞硫酸氫鈉或 依地二鈉；防腐劑例如殺細菌劑和殺真菌劑，包括乙酸苯汞或硝酸苯汞，苯扎氯銨或氯已 定；以及增稠劑例如羧丙基甲基纖維素。如果層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑作為懸液口服施用，藥物 組合物可以按照藥物製劑技術領域中公知的技術來製備，並可以包含懸浮劑，例如藻酸或 藻酸鈉，增量劑例如微晶體纖維素，增粘劑例如甲基纖維素，以及甜味劑/調味劑。口服液 體製劑可以包含常規添加劑，例如懸浮劑，例如明膠，葡萄糖菜，氫化可食用脂肪，甲基纖維 素，山梨糖醇和糖漿；乳化劑，例如阿拉伯樹膠，卵磷脂或失水山梨糖醇單油酸酯；非水性 載體(包括食用油)，例如杏仁油，分餾的椰子油，油狀酯例如甘油、丙二醇或乙醇；防腐劑 例如對羥基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯；以及，如果需要的話，常規的調味劑或著色劑。當 配製成立即釋放片劑時，這些組合物可以包含磷酸二鈣，乳糖，硬脂酸鎂，微晶纖維素，以及 澱粉和/或其他粘合劑、稀釋劑、崩解劑、賦形劑、膨脹劑和潤滑劑。如果需要口服施用，層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性物質可以提供 在能夠保護它抵抗胃的酸性環境的組合物中。例如，層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他 治療性藥劑可以用能夠在胃中維持其完整性並在腸中釋放出活性化合物的腸溶包衣配製。 層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑也可以與抗酸劑或其他這樣的成分組合 配製。口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用載體，並可以壓縮成片劑或包封在明膠 膠囊中。出於口服治療性施用的目的，層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性物質可 以與賦形劑摻在一起，以膠囊、片劑或錠劑的形式使用。可以包含藥物相容的佐劑材料或粘 合劑作為組合物的一部分。膠囊、丸劑、片劑、錠劑等可以包含任何下述成分或性質相似的化合物粘合劑例 如但不限於阿拉伯樹膠，玉米澱粉，明膠，黃蓍膠，聚乙烯吡咯烷酮或山梨糖醇；填充劑例如 磷酸鈣，甘氨酸，乳糖，微晶體纖維素或澱粉；崩解劑例如但不限於藻酸和玉米澱粉；潤滑劑例如但不限於硬脂酸鎂，聚乙二醇，二氧化矽或滑石；助流劑(gildant)例如但不限於膠 體二氧化矽；甜味劑例如蔗糖或糖精；崩解劑例如土豆澱粉；分散或潤溼劑例如月桂基硫 酸鈉；以及調味劑例如胡椒薄荷，水楊酸甲酯或水果香料。當劑量單位形式是膠囊時，它除了上面類型的材料之外，還可以包括液體載體，例 如脂肪油。此外，劑量單位形式可以包含各種其他能夠修飾劑量單位的物理形式的材料，例 如糖衣和其他腸溶劑。層粘連蛋白、層粘連蛋白組合物或其他治療性藥劑也可以作為酏劑、 懸液、糖漿、威化餅乾、茶、口香糖等的成分施用。糖漿除了活性化合物之外，還可以包含蔗 糖或甘油作為甜味劑，以及某些防腐劑、染料和著色劑，和香料。當口服施用時，化合物可以以常用於口服施用的劑型施用。這些劑型包括常用的 片劑和膠囊的固體單位劑型，以及液體劑型例如溶液，懸液和酏劑。當使用固體劑型時，它 們可以是緩釋類型的，以便化合物需要較不頻繁地施用。正如在本公開的別處解釋的，出人意料並與先前的預期相反，已經確定層粘連蛋 白容易被對象吸收並可以生理利用。例如，已經證實，注射到對象胃中的層粘連蛋白在對 象中全身性摻入，例如在各種肌肉類群中。腹膜內注射也產生層粘連蛋白的全身性分布， 包括層粘連蛋白在橫膈肌、腓腸肌和心肌中的分布。在其他例子中，當通過肌肉內注射進 行施用時，已經發現層粘連蛋白滲透到附近的肌肉類群中。因此認為，層粘連蛋白的施用 可能不遭受困擾其他蛋白、特別是大蛋白的某些嚴重投送問題。用於施用包含蛋白的藥 治療性物質的方法和組合物的例子，包括在下列文獻中討論的Banga，《治療性肽和蛋白 配製、力口工禾口投送系統》(第二版)(Therapeutic Peptides and Proteins :Formulation, Processing, and Delivery Systems 2ed. (2005)) ;Mahato，《用於蛋白和核酸的投送 禾口 定向的生物材料〉〉(Biomaterials for Deliveryand Targeting of Proteins and Nucleic Acids (2004)) ；McNally，《蛋白配製和投送》(第二版)(Protein Formulation and Delivery, 2ed. (2007))；以及Kumar等，「蛋白和肽治療藥物的新投送技術」(Novel DeliveryTechnologies for Protein and Peptide Therapeutics)， Current Pharm. Biotech. ,7 =261-276(2006)；它們每個在此以其不與本公開衝突的程度引為參考。「抑制」疾病或病症是指在例如具有疾病風險或患有特定疾病的對象中，抑制疾病 或病症的發展。本公開的具體方法提供了用於抑制肌營養不良症的方法。「治療」是指在 疾病或病症開始發展後，緩解其徵兆或症狀的治療性幹預。正如本文中使用的，術語「緩解 「對於疾病或病症來說，是指任何可觀察到的治療有益效應。有益效應可以顯示為例如在易 感性對象中延遲疾病或病症的臨床症狀的發作，降低疾病或病症的某些或所有臨床症狀的 嚴重性，疾病或病症的較慢進展，疾病或病症復發的次數降低，對象的總體健康或良好狀態 的改進，顯示為本技術領域中公知的其他對特定疾病或病症特異性的參數，以及這些因素 的組合。「治療有效量「是指對於減輕、緩解、消除、預防或抑制所治療的疾病、病症或病況 的至少一種症狀有效的量，可以根據經驗確定。在本公開的各種不同實施方案中，「治療有 效量」是「促進肌肉再生的量」，即足以獲得與對照相比組織或細胞再生、例如肌肉細胞再生 的統計學顯著的促進的量。具體來說，肌肉健康，例如肌肉細胞再生、維持或修復的指標，可以通過各種不同 手段進行評估，包括監測肌肉再生的標誌物，例如轉錄因子，例如Pax7、Pax3、MyoD、MRF4和成肌蛋白。例如，這些標誌物的增加的表達可以表明肌肉再生正在發生或最近發生過。肌肉再生的標誌物，例如胚胎肌球蛋白重鏈(eMyHC)的表達，也可用于衡量肌肉再生、維護或 修復的程度。例如，eMyHC的存在可以表明肌肉再生最近在對象中發生過。肌肉細胞再生、維持或修復也可以通過測定肌肉細胞的圍長或平均橫截面積或肌 肉纖維的密度來監測。肌肉狀況的其他指標包括肌肉重量和肌肉蛋白含量。有絲分裂指數 (例如通過測量BrdU的摻入)和肌生成也可用於評估肌肉再生的程度。在具體實施例中，肌肉狀況的改進例如再生，與對照相比為至少大約10%，例如至 少大約30%，或至少大約50%或以上。在某些實施中，有效量的層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物在每個時間期間，例如 每3或4個月、每月、每周或每天，作為單劑施用，或它可以在一段時間內分成至少兩個單位 劑量施用。治療可以持續長達獲得所需結果所必需的長度。例如，治療可以持續大約3或 4周，直到大約12-24個月或更長，包括進行性治療。化合物也可以間歇地以幾劑施用，例 如每幾天(例如至少大約每2、3、4、5或10天)或每幾周(例如至少大約每2、3、4、5或10 周)。具體的劑量方案可以根據具體的對象、待治療的病症或所需的結果來定製。例如， 當使用本公開的方法來治療肌營養不良症或類似病症時，可以使用起始治療方案來遏制病 症。這樣的起始治療方案可以包括施用較高劑量的層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物，或較 頻繁，例如每日施用這樣的物質。在獲得所需的治療結果，例如所需水平的肌肉再生後，可 以施行第二種治療方案，例如施用較低劑量的層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物，或以較低 頻率，例如每月、每兩月、每季度或每半年施用這些物質。在這種情況下，第二種治療方案可 以用作「加強劑」，以恢復或維持所需的肌肉再生水平。同樣的治療方案可用於其他具有降 低的或受損的肌肉再生能力的對象，例如老年對象。當本公開的具體方法被用於預防或減輕肌肉損傷，例如由用力或受損引起的損傷 時，對象在用力或受損之前典型地治療了足夠長的時間，以便提供治療效果。例如，對象在 預計的活動或可能的受損之前可以治療至少大約24小時，例如之前至少大約48小時，大約 72小時，大約1周，大約2周，大約3周或大約4周。當本公開的方法的實施方案被用於促進傷口癒合時，層粘連蛋白、層粘連蛋白組 合物或其他治療性物質可以直接施加到待治療的區域或其附近。例如，物質可以注射到區 域中或附近。在其他實施例中，物質可以表面施加到待治療區域。治療典型情況下在受損 之前到受損後幾周開始。在更具體的實施方案中，治療在受損後大約12小時到大約72小 時之間開始，例如在受損後大約24到大約48小時之間開始。在某些情況下，單次施用所述 物質有效地提供了所需的治療效果。在其他例子中，提供了附加的施用以便獲得所需治療 效果。當然，對於本公開的各種不同的治療性療法來說，有效量可能依賴於疾病的嚴重 性和對象的體重和總體狀態，以及治療活性化合物或成分的吸收、失活和排洩速度，劑量日 程安排和施用量，以及本技術領域的普通專業人員公知的其他因素。對於本技術領域的普 通專業人員來說，顯然，施用的準確劑量和頻率將取決於施用的具體層粘連蛋白、層粘連蛋 白組合物或其他治療性物質，所治療的具體病症，所治療病症的嚴重性，具體對象的年齡、 體重、總體身體狀況，以及對象可能正在服用的其他藥物。典型地，體外使用的劑量可以為藥物組合物的體內施用的有效量提供有用的指導，動物模型可用於確定具體病症治療的有 效劑量。例如，肌營養不良症的小鼠模型可用於確定有效劑量，然後按照本技術領域所知， 轉變成其他對象、例如人類的劑量。在劑量確定中的各種考慮，描述在例如Gilman等主編 的《Goodman和Gilman' s 治療藥物的藥理學基礎》(第八版)(Goodman And Gilman' s The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed. , Pergamon Press (1990))；以及 《Remington' s 藥物學》(第 17 版)(Remington' sPharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co.，Easton，Pa. (1990))，它們每個在此以其不與本公開衝突的程度引 為參考。在具體實施例中，施用於對象的層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物的量，足以提供 劑量在大約lOfmol/g到大約500nmol/g之間的層粘連蛋白，例如大約2nmol/g到大約 20nmol/g之間，或大約2nmol/g到大約lOnmol/g之間。在其他實施例中，施用於對象的層 粘連蛋白或層粘連蛋白組合物的量，足以提供劑量在大約0. 01 μ g/kg到大約1000mg/kg之 間，或大約0. lmg/kg到大約1000mg/kg之間的層粘 連蛋白，在具體實施例中，該量每天或每 周提供。在另一個實施例中，施用於對象的層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物的量，足以提 供劑量在大約0. 2mg/kg到大約2mg/kg之間的層粘連蛋白。在其他實施例中，施用於對象 的層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物的量，足以在施用的材料中提供濃度在大約5nM到大約 500nM之間的層粘連蛋白，例如在大約50nM到大約200nm之間，或大約100nM。提供上面的術語說明僅僅是為了幫助讀者，而不應該被解釋為具有小於本技術領 域的普通專業人員所理解的範圍，或作為對隨附的權利要求書的範圍的限制。描述總的來說，本公開提供了用於增強細胞或組織修復、再生或維持，包括針對隨後的 受損、損傷或疾病的前瞻性治療的方法和組合物的實施方案。在各種不同實施方案中，本公 開提供了治療肌營養不良症，加強受損或損傷後肌肉修復，或降低肌肉受損或損傷的嚴重 性的方法。其他的實施方案提供了增強傷口癒合的方法。 在某些實施方案中，方法包括施用有效量的層粘連蛋白或包含有效量層粘連蛋白 的組合物。在方法的具體實施中，層粘連蛋白是層粘連蛋白-1。在方法的其他具體實施中， 層粘連蛋白是層粘連蛋白_2或層粘連蛋白_4。不打算受限於特定的作用機制，層粘連蛋白被認為通過活化衛星細胞以增殖和分 化成新的肌肉細胞和肌管來幫助肌肉再生。因此，與對象的天然狀態相比，可以增強肌肉修
Μ. ο具體來說，當方法用於治療肌營養不良症時，同樣也不受作用理論的束縛，層粘連 蛋白也可以幫助結合細胞外基質的成分，例如結合肌養蛋白或α7β1整合蛋白。例如，在 杜興氏肌營養不良症中，增加量的層粘連蛋白可以通過結合α 7β1整合蛋白或另一種受 體，例如與肌養蛋白同源的肌養相關蛋白，來幫助與基底膜的連接。層粘連蛋白的施用也可 以上調肋節網絡的一種或多種成分的表達，例如肌養相關蛋白或α 7β 1整合蛋白，潛在地 在細胞外基質與剩餘的肋節之間提供附加的聯繫點。層粘連蛋白也可以提供增加組織完整 性的結構環境。在其他實施方案中，本公開提供了用於促進肌肉再生的方法。肌肉再生可以有益 於例如老年人或肌肉修復能力降低的其他患者群體，或簡單地加速本來生理無損傷的患者的肌肉修復過程。在具體實施方案中，施用層粘連蛋白可以在運動員或其他具有活動誘導 的肌肉受損或損傷的人中幫助肌肉修復，或減少肌肉損傷。在其他實施中，在患有例如由意 外或受損引起的肌肉損傷的患者中，可以通過施用層粘連蛋白來增加肌肉修復。在本公開的實施方案的各種不同例子中，層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物與一種 或多種其他成分，例如細胞外基質的成分一起施用。例如，附加的物質可以包括聚集蛋白聚 糖，制管張素，鈣粘著蛋白，膠原蛋白(包括膠原蛋白I、膠原蛋白III或膠原蛋白IV)，飾膠 蛋白聚糖，彈性蛋白，議定菌素，內皮抑制素，纖維蛋白，纖連蛋白，骨橋蛋白，肌腱蛋白，血 小板反應蛋白，玻璃體結合蛋白及其組合。也可以施用雙糖鏈蛋白聚糖，糖胺聚糖(例如肝 素)，糖蛋白(例如肌營養不良蛋白聚糖)，蛋白聚糖(例如硫酸乙醯肝素)及其組合。特 定的層粘連蛋白可以與其他形式的層粘連蛋白、層粘連蛋白類似物、層粘連蛋白衍生物或 任何上述物質的片段一起施用。生長刺激物可以與層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物一起加入。生長刺激物的例 子包括細胞因子，多肽和生長因子，例如腦源性神經營養因子(BDNF)，CNF(纖毛神經營養 因子)，EGF(表皮生長因子)，FGF(成纖維細胞生長因子)，神經膠質細胞生長因子(GGF)， 神經膠質細胞成熟因子(GMF)，神經膠質細胞源神經營養因子(GDNF)，肝細胞生長因子 (HGF)，胰島素，胰島素樣生長因子，角質細胞生長因子(KGF)，神經生長因子(NGF)，神經營 養因子_3和_4，PDGF (血小板衍生的生長因子)，血管內皮生長因子(VEGF)，以及它們的組
口 O可以添加其他的治療性藥劑以增強層粘連蛋白或層粘連蛋白組合物的治療效果。 例如，可以添加肌肉細胞源以幫助肌肉再生和修復。在本公開的某些情況下，與層粘連蛋白 療法相組合向對象施用衛星細胞。美國專利出版物2006/0014287，在此以其不與本公開衝 突的程度引為參考，提供了在肌源性細胞中富集細胞集合體，以及向對象施用那些細胞的 方法。在其他情況下，向對象施用幹細胞，例如脂肪源幹細胞。製備和施用脂肪源幹細胞 的適合方法，公開在美國專利公布2007/0025972中，在此以其不與本公開衝突的程度引為 參考。在某些實施例中，也可以施用其他細胞材料，例如成纖維細胞。提供了下面的實施例來說明某些具體的特點和/或實施方案。這些實施例不應該 被解釋為將本發明局限於所描述的具體特點或實施方案。實施例1材料與方法_在這些研究中使用的野生型(C57BL/6)、a 7整合蛋白缺失型(C57BL/6背景)和 巢蛋白"GFP小鼠(C57BL/6背景)，按照內華達大學(University of Nevada, Reno)、華盛 頓大學(University offfashington, Seattle)動物護理和使用管理委員會(Institutional AnimalCare and Use Committees)批准的方案進行安樂死。組織學將脛骨前肌(TA)包埋在Optimal Cutting Temperature (OCT)中(Tissue-Tek ； Sakura Finetek, Torrance, California, United States),使用 Leica CM1850 低溫恆溫 器，切出10 ii m的冷凍切片(分隔彡50 u m),放置在Surgipath顯微鏡玻片上(SurgipathMedical Industries, Richmond, IL)。按照以前在 Rooney 等，「缺乏肌養蛋白和 α 7 整合蛋白的小鼠的嚴重肌營養不良症」(Severe muscular dystrophy in mice that lackdystrophin and alpha7 intergrin), J. Cell Sci. 119 :2185_2195 (2006)所述，將組 織切片用蘇木精和曙紅(H&E)染色，該文獻在此以其不與本公開衝突的程度引為參考。再 生肌肉中的中央肌核通過亮視野顯微鏡以630X放大倍數進行計數。每個肌纖維的中央核 數量通過對每個動物計數最少1000個肌纖維來確定。每種基因型至少分析了 5隻動物。此 夕卜，在每個時間點，在每個組的至少5000個肌纖維中檢測了橫截面積。結果被報告為平均 纖維橫截面積。
免疫螢光將TA肌肉包埋在Tissue-TEK的Optimal Cutting Temperature化合物中(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance, CA)。使用 Leica CM1850 低溫恆溫器切出 IOym 的切片，放 置在 Surgipath 顯微鏡玻片上(SurgipathMedical Industries, Richmond, IL)。層粘連蛋 白-α 2鏈使用1 500稀釋的兔抗層粘連蛋白_ α 2 (2G)多克隆抗體(來自Robert Wood JohnsonMedical School, Department of Pathology, Piscataway, NJ 的 PeterYurchenco 的好意饋贈)進行檢測。層粘連蛋白_α 1鏈使用抗層粘連蛋白- α 1抗體(sc-5582，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)進行檢測。兔第一抗體使用1 500稀釋的螢光素 異硫氰酸酯(FITC)偶聯的抗兔第二抗體進行檢測。對於小鼠單克隆抗體來說，使用小鼠_小鼠試劑盒(mouse-on-mouse (MOM) kit) (Vector Laboratories,Burlingame, CA)阻斷內源小鼠免疫球蛋白。MyoD和Pax7的表達使 用 5 μ g/ml 抗 MyoD 抗體禾口抗 Pax7 抗體(Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), Iowa City, ΙΑ)進行檢測。eMyHC按照以前的描述進行檢測(Rooney等，2006)。使用1 μ g/ ml濃度的四甲基羅丹明偶聯的麥胚凝集素(WGA) (Mo 1 ecu 1 arProbes,Eugene,0R)來確定肌 纖維。螢光使用Zeiss Axioskop 2 Plus螢光顯微鏡來觀察，圖像使用Zeiss AxioCam HRc 數字相機和Axiovision4. 1 軟體來捕獲(都可以從Carl Zeiss Microimaging,Thornwood, NY獲得)。對於每隻動物，以630X放大倍數在20個隨機的、不重疊的顯微鏡視野中分析多 個相鄰的切片。按照以前的描述，從10周齡巢蛋白-GFP轉基因小鼠的趾長伸肌用膠原蛋白酶消 化後分離了單個肌纖維，並在Matrigel包被的孔中單獨培養(Shefer等，「骨骼肌衛星細胞 可以自發進入可選間充質途徑，，(Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternativemesenchymal pathway), J. Cell Sci. 117 :5393_5404(2004)； Shefer等，「分離和培養骨骼肌肌纖維作為分析衛星細胞的工具」(Isolation andculture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells), Methods Mol. Biol. 290 =281-304(2005)；它們每個在此以其不與本公開衝突的程度引為參考)。將 黏附性單個肌纖維固定在4%聚甲醛中，與1 1000稀釋的抗α 7整合蛋白大鼠單克隆抗 體(CA5. 5) (SierraBioSource, Morgan Hill, CA)溫育。抗α 7整合蛋白大鼠抗體使用羅 丹明標記的抗大鼠第二抗體進行檢測。GFP和羅丹明的螢光使用倒置螢光顯微鏡(Nikon eclipse, TE2000-S，Nikon Instruments, Inc.，Melville, NY)檢測，圖像使用 MetaVue 成 像系統(Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA)CooISNAPes CCD 相機(Princetonlnstruments Inc. , Trenton, NJ)獲取。
伊文思藍染料分析對於小鼠，每10g體重腹膜內注射50 u 1 10mg/ml的無菌伊文思藍染料(EBD)溶 液。3小時後，收穫TA肌肉，在液氮中速凍。將10 ym的冷凍切片放置在顯微鏡玻片上， 在4%聚甲醛中固定。通過將組織切片與俄勒岡綠-488偶聯的麥胚凝集素(2i!g/ml， Molecular Probes, Eugene, OR)溫育來顯示肌纖維的輪廓。對每隻動物計數至少1000個 纖維，以確定對EBD陽性的肌纖維的百分率。每種基因型至少分析4隻動物。以630X放大 倍數捕獲圖像並進行計數。溴脫氧尿苷(BrdU)的摻入在收穫肌肉前72小時、48小時和24小時，腹膜內注射BrdU (500mg/kg)。將肌肉冷 凍切片在95%乙醇中固定1分鐘。然後將切片在磷酸緩衝鹽水(PBS)中清洗，並用2N鹽酸 (HC1)處理20分鐘。將切片在50mM氯化鈉(NaCl)中中和20分鐘，然後在100mM Tris-HCl 中溫育20分鐘，在PBS中清洗。將組織在抗BrdU抗體(G3G4，1 1000, Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB), Iowa City, IA)中溫育 1 小時，在 PBS 中清洗，並固定在 Vectashield 中(Vector Labs, Burlingame, CA)。心臟毒素誘導的肌肉警損將小鼠用阿佛丁(0. 25 u 1/g體重)麻醉，將100 ill 10 um的心臟毒素在PBS中 的溶液(C3987，Sigma, St. Louis, M0)注射到5周齡雄性野生型和a Th小鼠的左側TA肌 肉中。右側TA肌肉用lOOiU PBS注射，並用作對照。在心臟毒素注射後第4、7、10和28 天，將小鼠安樂死並收穫肌肉用於分析。層粘連蛋白-111注射在注射心臟毒素之前3天，將在PBS中的lOOnM天然小鼠層粘連蛋白 (Invitrogen, Carlsbad, CA)注射到麻醉的野生型和a 7+小鼠的左側TA肌肉中。右側TA 肌肉用lOOyl PBS注射，並用作對照。在心臟毒素注射後第0、4、7、10和28天，收穫肌肉 用於分析。統計學分析所有平均的數據均被報告為平均值士標準偏差。多個組之間的比較，對於參數型 數據通過單因素方差分析(AN0VA)進行，或對於非參數型數據通過Kruskal-Wallis組間行 單因素方差分析進行，使用了 SigmaStat 1.0軟體(Jandel Corporation, San Rafael, CA) P < 0. 05被認為是統計學顯著的。整合蛋白在靜止衛星細胞中的表達為了證實a 7整合蛋白在衛星細胞中表達，使用抗a 7整合蛋白單克隆抗體，對來 自巢蛋白-GFP轉基因小鼠的分離的肌纖維進行了免疫螢光(圖1)。巢蛋白-GFP在靜止衛 星細胞中特異性表達。所有肌纖維表面上的巢蛋白-GFP陽性細胞對於a 7整合蛋白也是 陽性的(圖1)。圖像分析顯示出a 7整合蛋白在衛星細胞的基底表面上定位更強。這些數 據證實，靜止的衛星細胞表達a 7整合蛋白，而定位集中在朝向肌纖維的基底表面上。整合蛋白缺失型小鼠中的肌肉修復最近的研究表明，a 7整合蛋白在衛星細胞活化和/或增殖中發揮作用。為了檢 驗a 70 1整合蛋白是否為肌肉修復所需，對野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠的脛骨前肌 (TA)肌肉進行了心臟毒素誘導的損傷，並在4、10和28天後進行檢查(圖2)。心臟毒素損傷後4天，野生型TA肌肉外觀健康，這種外觀持續了 28天。相反，α 7整合蛋白缺陷的肌 肉在受損後第4和10天表現出損傷肌肉的大的白色區域。在28天時，在ci7整合蛋白缺 陷的肌肉中，肌肉損傷區域仍然非常明顯。這些數據表明，在骨骼肌中失去α 7整合蛋白導 致肌肉再生的顯著延遲。α 7 ■☆舶白特媽致■■低牛為了研究心臟毒素處理後膜的完整性，用伊文思藍染料(EBD)對野生型和α 7整 合蛋白缺失型小鼠進行注射。在心臟毒素注射前兩個組中都不存在EBD攝入(圖3)。盡 管在心臟毒素注射前α 7整合蛋白缺陷肌肉對於EBD攝入是陰性的，但是與野生型相比，在 第4天時EBD陽性的肌纖維高7倍。在受損後第4天，8.5%的野生型和66%的α 7整合蛋 白缺陷的肌纖維是EBD陽性的。10天後，不到4%的野生型肌纖維對EBD攝入是陽性的，而 40%的α 7整合蛋白缺陷肌纖維是EBD陽性的。在心臟毒素注射後28天時，17%的α7整 合蛋白缺陷肌肉纖維仍然是EBD陽性的，而在野生型肌肉中沒有觀察到EBD(P < 0. 05)(圖 3)。這些結果表明，α 7整合蛋白的喪失導致心臟毒素誘導的損傷後肌膜脆性增加。在α 7整合蛋白缺失型小鼠中肌肉修復降低蘇木精和曙紅(Η&Ε)染色被用於檢測心臟毒素誘導的損傷後單核細胞的浸潤和中央定位的核(圖4，比例尺表示10 μ m)。在心臟毒素損傷後4天，野生型肌肉表現出單核 細胞浸潤和含有中央定位的核的肌纖維(圖4)。到第10天，野生型肌肉表現出很少的單核 細胞浸潤和大多數肌纖維包含中央定位的核。到28天，在野生型肌肉中，修復完成，明顯是 大多數肌纖維包含中央定位的核，很少的單核細胞浸潤。相反，在心臟毒素誘導的損傷後4 天，α7整合蛋白缺陷的肌肉表現出廣泛的單核細胞浸潤和營養不良的肌纖維，這持續到心 髒毒素損傷後10天(圖4)。到28天，α 7整合蛋白缺陷肌肉表現出含有中央定位的核的 營養不良的肌纖維，以及單核細胞浸潤。為了對肌肉修復進行定量，計算了具有中央定位的核的肌纖維的百分率(圖5)。 在野生型小鼠中，在心臟毒素損傷後4天，81. 8%的肌纖維含有中央定位的核。相反，在α 7 整合蛋白缺陷肌肉中，只有28. 的肌纖維對中央定位的核是陽性的(Ρ<0. 05)。到第10 和28天時，在野生型小鼠中，分別有95. 5%和97. 5%的肌纖維顯示出中央定位的核。到第 10和28天時，在α 7整合蛋白缺陷肌肉中，分別有82%和95. 5%的肌纖維顯示出中央定位 的核，低於野生型(P <0.05)。這些結果表明，喪失α 7整合蛋白導致延遲的肌肉再生。胚胎肌球蛋白重鏈(eMyHC)在肌肉修復後短暫表達，被用作最近肌肉再生的標誌 物。在第0天，在野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠中都不存在eMyHC(圖6)。在心臟毒素 處理後第4和10天時，在超過99%的野生型肌纖維中檢測到了 eMyHC的表達(圖6)。形 成鮮明對照的是，在心臟毒素損傷後第4和10天時，分別只有2. 2%和9. 9%的α 7整合蛋 白缺陷肌纖維表達eMyHC(圖6)。到第28天，只有11. 3%的α 7整合蛋白缺陷的肌纖維是 eMyHC陽性的，而18. 5%的野生型肌肉是eMyHC陽性的ΓΡ < 0. 001)。這些結果證實了，通 過eMyHC的暫時表達進行度量，α 7整合蛋白的喪失導致了肌肉修復的缺陷。心臟毒素損傷在α 7整合蛋白缺失型小鼠中導致營養不良的肌纖維為了確定α 7整合蛋白的喪失是否影響損傷後肌肉的修復，測量了肌纖維的橫截 面積(圖7)。在心臟毒素損傷後4天，野生型小鼠中再生性肌纖維比α7整合蛋白缺陷的 肌纖維大31% (圖7)。在第10天，再生性野生型肌纖維與α7整合蛋白缺陷的肌纖維相比大45. (圖7)。到第28天，野生型肌肉顯示出肌纖維尺寸的變化。而這與a 7整合 蛋白缺陷肌肉形成對比，後者繼續顯示出小的橫截面積，其中絕大部分纖維在100-600 ym2 的範圍內。這些結果表明，a 7整合蛋白的喪失導致再生能力降低，產生營養不良的肌纖維。a 7 ■☆舶細_幾腫下屋■■低,為了確定在a 7整合蛋白缺失型小鼠中衛星細胞的增殖是否降低，對摻入到衛星 細胞的核中的BrdU進行了定量(圖8)。在損傷後第4天，a7整合蛋白缺陷肌肉含有的 BrdU陽性的核與野生型動物相比少3倍(圖8)。但是，在第10天和28天，a 7整合蛋白 缺失型小鼠中的BrdU陽性的核與野生型相比增加了(圖8)。這些結果顯示，在心臟毒素誘 導的損傷後，a 7整合蛋白缺陷肌肉中衛星細胞的增殖延遲了。為了檢測調控肌肉修復的發育程序是否受到a 70 1整合蛋白喪失的影響，檢測 了 Pax7和MyoD的表達(圖9和10)。Pax7在靜止和活化的衛星細胞中都表達，而MyoD只 在分化的成肌細胞中表達。與野生型肌肉相比，在心臟毒素損傷後第4和10天時，ci7整 合蛋白缺失型小鼠顯示出比野生型少2到3倍的Pax7陽性細胞(圖9)。到第28天時，在 野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠中觀察到了相似數量的Pax7陽性細胞。MyoD表達的分析顯示，在心臟毒素誘導的損傷後第4和10天時，a 7整合蛋白缺 陷肌肉與野生型肌肉相比，分別含有少28和50倍的MyoD陽性成肌細胞(圖10)。到第28 天，在野生型和a 7整合蛋白缺失型小鼠中觀察到了類似數量的MyoD陽性細胞。這些結果合在一起，表明a 7整合蛋白的喪失導致損傷的骨骼肌中較少的活化衛 星細胞，以及調控肌源性分化的發育程序中的延遲響應。a 7整合蛋白缺失型小鼠的層粘連蛋白處理層粘連蛋白-111處理在a 7整合蛋白缺失型小鼠中恢復了肌膜完整性最近的研究顯示，a 7整合蛋白的喪失導致層粘連蛋白表達降低。為了研究層粘 連蛋白沉積的減少是否能夠解釋在a 7整合蛋白缺失型小鼠中觀察到的缺陷性肌肉再生 表型，在心臟毒素損傷之前3天，用層粘連蛋白-111注射TA肌肉。將層粘連蛋白-111注射到2周齡野生型和a 7整合蛋白缺陷的幼仔的TA肌肉 中，使用抗層粘連蛋白1抗體通過免疫螢光對組織進行分析。肌肉也用不含層粘連蛋 白-111的單獨的PBS注射。到第4天時，層粘連蛋白-111富集在肌纖維周圍的細胞外基 質中，並堅持到28天以上。在培養的肌纖維中層粘連蛋白-111的滴度，在濃度為200nM及 以上時顯示出增加的毒性(數據未顯示)。 令人吃驚的是，注射的層粘連蛋白-111在24-72小時內快速滲透整個TA肌肉(圖 11和補充數據)，並在整個肌肉中維持至少31天(圖11)。在心臟毒素損傷後所有時間點 處，用層粘連蛋白-111處理的a 7整合蛋白缺陷肌肉外觀表現與野生型肌肉相同(圖12)。心臟毒素誘導的損傷後EBD攝入的分析顯示，在所有時間點處，在層粘連蛋白處 理的野生型或a 7整合蛋白缺陷肌肉之間EBD陽性肌纖維的百分率沒有差別(圖13)。這 些結果證實，在心臟毒素誘導的損傷之前注射層粘連蛋白-111，恢復了 a 7整合蛋白缺陷 肌肉的肌膜完整性。m^mM^M^m&^m^ii^^mmn^為了研究層粘連蛋白-111增強肌肉再生的能力，用層粘連蛋白注射5周齡野生型 和a 7整合蛋白缺陷的TA肌肉，並進行心臟毒素誘導的損傷。將肌肉切片用H&E染色，並檢查了單核細胞浸潤和中央定位的核(圖14)。在損傷後第4、10或28天，在用層粘連蛋 白-111處理的野生型和α 7整合蛋白缺陷肌肉中沒有觀察到肌纖維尺寸、中央定位的核或 單核細胞浸潤的差異(圖14)。中央定位的核的定量，證實了層粘連蛋白-111處理將肌肉再生恢復到野生型水 平(圖15)。在所有時間點處，在層粘連蛋白處理的野生型和α 7整合蛋白缺失型小鼠中分 析到的中央定位的核的百分率，彼此之間沒有顯著差異。這些結果表明，在α 7整合蛋白缺 陷肌肉中，層粘連蛋白-111將肌肉修復恢復到野生型水平。通過測量eMyHC表達，檢測了層粘連蛋白-111恢復α 7整合蛋白缺陷肌肉的再 生能力的能力(圖16)。在第0天，作為用層粘連蛋白注射的結果，7. 3%的野生型纖維和 9.7%的α 7整合蛋白缺陷纖維是eMyHC陽性的(圖16)。在心臟毒素處理後第4和10 天， 野生型和α 7整合蛋白缺陷肌肉顯示出相似的eMyHC表達水平(圖16)。在損傷後第28天， 在野生型肌肉中只存在可忽略量的eMyHC，而在α 7整合蛋白缺陷肌肉中，34. 4%的肌纖維 是eMyHC陽性的(圖16)。這些結果證明了注射層粘連蛋白_111極大地增強了 α 7整合蛋 白缺陷肌肉的再生能力。譜佔連舶衍姚α 7 ■輔丨、鼠制灰訂朋纖麗只在心臟毒素誘導的損傷之前和之後，測量了層粘連蛋白處理的野生型和α 7整合 蛋白缺失型小鼠中肌纖維的橫截面積(圖17)。在損傷後第4天，發現野生型小鼠中肌肉的 肌纖維橫截面積只比α 7整合蛋白缺陷肌肉的大13% (圖17)。到心臟毒素損傷後第10 和28天時，α 7整合蛋白缺陷肌肉中肌纖維的橫截面積與野生型動物相似(圖17)。這些 數據合在一起，表明用層粘連蛋白-111處理在α 7整合蛋白缺陷肌肉中恢復了肌肉修復和 肌纖維尺寸。譜佔連舶& α 7 ■☆舶細__腫麵下屋_漏為了研究層粘連蛋白處理是否提高衛星細胞的增殖，測量了肌肉損傷後BrdU的 摻入(圖18)。在心臟毒素損傷後第0、4和10天，在野生型和α 7整合蛋白缺陷肌肉中沒 有觀察到BrdU陽性衛星細胞數量的差異(圖18)。在損傷後第28天，在α7整合蛋白缺陷 肌肉中，與野生型相比存在明顯更多的BrdU陽性衛星細胞(圖18)。這些結果表明，用層粘 連蛋白處理將衛星細胞的增殖恢復到野生型水平。Hl米佔連g白處理'恢gT α 7白缺陷肌肉的幾細朐ZzHt為了研究用層粘連蛋白-111處理是否在α 7整合蛋白缺陷肌肉中恢復肌源性修 復程序，檢測了 Pax7和MyoD的表達(圖19和20)。在心臟毒素損傷之前，野生型和α 7整 合蛋白缺陷肌肉顯示出少量Pax7陽性細胞，這可以歸因於來自層粘連蛋白注射的小量損 傷(圖19)。在心臟毒素損傷後第4天，在層粘連蛋白處理的α7整合蛋白缺陷肌肉中，與 野生型相比，Pax7陽性細胞少20% (圖19)。在心臟毒素損傷後第10和28天，在α 7整 合蛋白缺陷肌肉中Pax7陽性細胞的水平與野生型肌肉相似(圖19)。MyoD的分析顯示，在第0天時，在層粘連蛋白處理的野生型和α 7整合蛋白缺陷 的TA肌肉中有少量陽性細胞(圖20)。在心臟毒素損傷後第4和10天時，在層粘連蛋白處 理的α 7整合蛋白缺陷肌肉中MyoD陽性細胞的數量比野生型低大約20-25% (圖20)。但 是，到第28天時，野生型和α 7整合蛋白缺陷肌肉具有相似數量的MyoD陽性細胞(圖20)。 這些數據表明，層粘連蛋白處理在α 7整合蛋白缺陷肌肉中基本上恢復了肌源性細胞的數量，並促進了參與肌肉修復的肌源性程序的活化。討論本實施例證明了 a 7整合蛋白缺失型小鼠在心臟毒素誘導的損傷後表現出缺陷 的骨骼肌再生。用層粘連蛋白處理校正了缺陷的修復表型。儘管在骨骼肌再生過程中肌源 性發育程序的某些方面已經被闡明，但總的來說，細胞外基質和整合蛋白細胞表面受體參 與肌源性修復的機制還沒有被很好地了解。肌肉損傷後，衛星細胞快速活化。在活化後，這些細胞增殖並激活肌源性發育程 序，以修復損傷的肌肉。模型表明，衛星細胞的亞群體保持作為幹細胞，以代替已經沿著肌 源性譜系途徑進化的細胞。在活化過程中，衛星細胞表達轉錄因子Pax3、Pax7、MyoD、成肌 蛋白禾口 MRF4。本實施例證明了 a 7整合蛋白的喪失導致了衛星細胞增殖的降低，正如通過在心 髒毒素處理的a 7整合蛋白缺陷肌肉中減少的BrdU摻入和Pax7表達所確定的。此外，在 損傷的a 7整合蛋白缺陷肌肉中，成肌細胞的分化明顯降低，正如通過MyoD表達所測量的。 這些數據表明，a 70 1整合蛋白調控肌肉再生早期的關鍵過渡時期，其中衛星細胞被活化 以增殖和分化成能夠修復肌肉的肌源性細胞。本實施例中顯示的結果，證明了在損傷的a 7整合蛋白缺陷的肌纖維中，中央定 位的核的存在顯著減少，並且eMyHC的表達延遲。中央定位的核的存在和eMyHC的表達表 明a7整合蛋白缺陷的成肌細胞能夠在體內融合。這些觀察支持了體外研究，在體外研究 中證明了原代a7整合蛋白缺陷的成肌細胞在細胞培養中能夠融合以形成肌管。這些觀察 合在一起，表明在體內肌肉修復的延遲，主要是由於成肌細胞增殖和分化的缺陷，致使能夠 修復受損肌肉的肌源性細胞較少。因為骨骼肌的再生能力取決於衛星細胞與細胞外基質之間錯綜複雜的相互作用， 因此a 7整合蛋白缺乏可能導致肌源性修復所需的最適的富含層粘連蛋白的微環境的喪 失。為了確定層粘連蛋白沉積的降低是否造成了在a7整合蛋白缺失型小鼠中觀察到的肌 肉再生表型的減少，在損傷前將層粘連蛋白-111注射到小鼠肌肉中。正常情況下，層粘連 蛋白由骨骼肌細胞產生，並分泌到周圍的基底層中。有趣的是，在48-72小時內，注射的層 粘連蛋白-111擴散到整個TA肌肉中，並在基底膜中保持了 31天以上。在心臟毒素誘導的 損傷之前用層粘連蛋白-111注射肌肉，在a 7整合蛋白缺失型小鼠中將肌肉再生恢復到野 生型水平。這些數據證明，在a 7整合蛋白缺陷的骨骼肌中喪失層粘連蛋白微環境，是在這 些動物中觀察到的肌肉修復缺陷的潛在原因。儘管層粘連蛋白-211和層粘連蛋白-221表達在成年肌肉中，但層粘連蛋白-111 只出現在胚胎骨骼肌中。對層粘連蛋白處理的a7整合蛋白缺陷肌肉中肌肉再生改善的一 種可能的解釋，是注射層粘連蛋白-111可能在成年骨骼肌中重演了胚胎肌源性程序。這種 胚胎程序的活化，可以導致增加的成肌細胞活化和增殖，以及改進的肌肉修復。但是，將層 粘連蛋白-111注射到野生型骨骼肌中沒有增加再生能力，表明層粘連蛋白-111發揮作用 以代替a 7整合蛋白缺陷的骨骼肌中的層粘連蛋白-211/221的作用。這些結果表明，在衛 星細胞中表達有其他層粘連蛋白受體，它們與層粘連蛋白正常相互作用，促進了肌源性修 復，或可發揮作用以補償成肌細胞中a7整合蛋白的喪失。本實施例表明，帶有a 7整合蛋白突變的對象患有先天性肌肉病，是由於減少的層粘連蛋白-211/221沉積而引起的肌肉再生能力降低的結果。這些數據還證明，直接注射 純化的層粘連蛋白-111，可以用作α 7整合蛋白先天性肌肉病患者的可能療法。因為再生 能力的喪失涉及許多不同的肌營養不良症，包括MDC IA和DMD，因此層粘連蛋白-111蛋白 療法可能在其它類型的肌營養不良症中也是有益的。實施例2
材料與方法動物在這些研究中，C57BL/10ScSn(野生型)和C57BL/10ScSn_Dmdmdx/J(mdx)種系 小鼠(Jackson Laboratories, BarHarbor, ΜΕ),按照內華達大學(University of Nevada, Reno)動物護理和使用委員會(Animal Care and Use Committee)批准的動物方案使用。α 7 β Ral^成肌細胞的分離從10日齡α 7 β gal+小鼠取出腓腸肌肌肉，將組織用剪刀切碎。細胞用1. 25mg/ ml II 型膠原蛋白(Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)在 37°C酶法解 離1小時。將漿液輕柔研磨，通過尼龍篩網過濾。通過差速離心將細胞與肌纖維片段分離， 鋪於IOOmm組織培養板上。成肌細胞在增殖培養基(添加有10%胎牛血清(FBS)，0.5%雞 胚提取物，L-穀氨醯胺和青黴素/鏈黴素的Dulbecco' s修改的Eagle' s培養基 (DMEM))中維持。β -半乳糖苷酶染餼將成肌細胞或肌管在4%聚甲醛中固定5分鐘，用IX PBS洗滌，用去氧膽酸鈉/ ΝΡ40混合物通透化30分鐘。向板中加入X-gal (50mM亞鐵氰化鉀，50mM鐵氰化鉀，IM MgCl2 和100mg/ml X-gal)，在37°C溫育2小時。將板在PBS中清洗。圖像使用解剖顯微鏡和Spot 數字相機捕獲。螢光活化的流式分揀(FACS)將大約IxlO6個α 7 β gal+成肌細胞接種到IOOmm包被有0. 1 %明膠的細胞培養 板上，在37°C溫育過夜。除去生長培養基，將細胞用PBS中的IOOnM LAM-Ill處理16-24 小時。將細胞用胰蛋白酶處理，計數，沉澱，並加入30 μ 1含有20% FBS的DMEM生長培養 基。向細胞中加入 30 μ 1 200ηΜ 的 FDG (Molecular Probes, Eugene, OR)，在 37°C溫育 1 分 鍾。為了停止反應，向每個樣品加入600μ1冰冷的生長培養基，在冰上溫育20分鐘。樣品 在Beckman Coulter XL/MCI流式細胞儀上運行，使用FlowJo軟體分析。層粘連蛋白-111的注射將在PBS中的IOOnM天然小鼠層粘連蛋白(Invitrogen)注射到10日齡mdx小鼠 的左側脛骨前肌(TA)肌肉中。對側的右側TA肌肉用100 μ 1 PBS注射，並用作對照。在5 周齡時，將小鼠處死，收穫肌肉。對於全身性投送來說，在10日齡時腹膜內注射PBS中的 lmg/kg層粘連蛋白-111，在5周齡時收穫組織用於分析。對照mdx小鼠用同樣體積的PBS注射。伊文思藍染料攝入對於小鼠，每IOg體重腹膜內注射50 μ 1無菌伊文思藍染料溶液(10mg/ml)。3 小時後，收穫TA肌肉，在液氮中速凍。將10 μ m的冷凍切片放置在顯微鏡玻片上，在4%聚 甲醛中固定。將組織切片與2μ g/ml俄勒岡綠-488偶聯的麥胚凝集素(WGA) (MolecularProbes, Eugene, OR)溫育，來顯示肌纖維的輪廓。對每隻動物計數至少1000個纖維，以確 定對伊文思藍染料攝入陽性的肌纖維的百分率。每種基因型至少分析5隻動物。以630X 放大倍數捕獲圖像並進行計數。血液化學在5周齡時收集血液，允許其在室溫凝結最少30分鐘。以3000rpm離心後，收集 血清。將血清送往戴維斯的加利福尼亞大學比較病理學實驗室(Comparative Pathology Laboratory at the University of California, Davis)，分析肌酸激酶、肌酸禾口血液尿素 氮(BUN)。免疫螢光將組織包埋在 Tissue-TEK 的 Optimal Cutting Temperature 化合物中(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)。使用 Leica CM1850 低溫恆溫器(Leica Microsystems, ffetzlar, DE)，將 10 ii m 的切片放置在 Surgipath 顯微鏡玻片上(Surgipath Medical Industries, Richmond, IL)o a 7整合蛋白使用1 1000稀釋的抗CA5. 5大鼠單克隆抗體 (SierraBiosource,Morgan Hill，CA)，然後使用1 1000稀釋的FITC偶聯的抗大鼠第二抗 體進行檢測。0 1D整合蛋白使用1 500稀釋的兔多克隆抗體，然後使用1 500稀釋的 FITC偶聯的抗兔抗體進行檢測。層粘連蛋白-a 1使用1 500稀釋的MAB 1903 (Chemicon International, Temecula, CA)檢測。肌養蛋白使用小鼠單克隆Dys2抗體(Novacastra Laboratories, Ltd, Newcastle upon Tyne，UK)檢測，肌養相關蛋白使用針對肌養相關 蛋白的 MANCH07 7F3 單克隆抗體(Glenn Morris, Center for InheritedNeuromuscular Disease, Shropshire, UK) 1 200稀釋檢測。將小鼠單克隆抗體與用於阻斷小鼠免疫 球蛋白的小鼠-小鼠(mouse-on-mouse (M0M))免疫檢測試劑盒(Vector Laboratories, Burlingame,CA)、和1 500稀釋的FITC偶聯的抗小鼠第二抗體組合使用。乙醯膽鹼受體 使用1 1000的羅丹明標記的a-金環蛇毒素(Molecular Probes, Eugene, OR)檢測。熒 光使用Zeiss Axioskop 2 Plus螢光顯微鏡觀察，圖像用Zeiss AxioCam HRc數字相機和 Axiovision 4. 1 軟體捕獲(都可以從 CarlZeiss Microimaging, Thornwood, NY 獲得)。組織學將組織切片在冰冷的95%乙醇中固定2分鐘，然後用70%乙醇固定2分鐘，然後 在流水中重新水合5分鐘。將切片用Gill' s蘇木精(FisherScientific，Fair Lawn,NJ) 染色，在水中清洗5分鐘。將切片放置在Scott' s溶液(0. 024M NaHC03，0. 17M MgS04)中 3分鐘，在水中清洗5分鐘。然後將切片用曙紅(Sigma-Aldrich, St Louis, M0)染色2分 鍾。將切片在冰冷的70%和95%乙醇中各30秒，然後在100%乙醇中2分鐘，進行逐次脫 水，並在二甲苯中清潔5分鐘，然後用DePeX固定介質(Electron Microscopy Sciences, Washington, PA)固定。再生肌肉中的中央肌核通過亮視野顯微術以630X放大倍數計數。 通過對每隻動物計數最少1000個肌纖維來確定每個肌纖維的中央核的數量。分析了來自 每種基因型的至少5隻動物。免疫印跡為了分析a 7整合蛋白，使用200mM辛基-3 _D_吡喃葡萄糖苷(Sigma Aldrich, St Louis, M0) ,50mM Tris-HCl pH 7. 4,150mMNaCl, ImM CaCl2, ImM MgCl2,2mM PMSF 和 1 200稀釋的蛋白酶抑制劑混合物套裝III (Protease Inhibitor Cocktail Set III)(Calbiochem，EMD Biosciences, San Diego，CA)，提取了蛋白。收集裂解液，以 10，OOOxg 離 心15分鐘，將上清液轉移到新的管中。蛋白通過Bradford分析定量，將總共40 μ g蛋白在 非還原條件下在7. 5% SDS-PAGE凝膠上分離，並轉移到硝酸纖維素膜上。將膜在用磷酸緩 衝鹽水(PBS) 1 1 稀釋的 Odyssey 阻斷緩衝液(LiCor Biosciences, Lincoln, NE)中阻 斷。α 7整合蛋白使用1 500稀釋的兔抗α7Β(Β2347)多克隆抗體進行檢測。將印跡與 1 5000 稀釋的 Alexa Fluor 680 偶聯的山羊抗兔 IgG 抗體(Molecular Probes, Eugene, OR)溫育，以檢測第一抗體。為了檢測肌養相關蛋白的表達，從注射PBS和LAM-111的mdx和野生型脛骨前肌，使用 RIPA 緩衝液(50mM Hepes pH 7. 4,150mMNaCl, ImM Na3VO4, IOmM NaF, 0. 5% Triton 父-100，0.5%肥40，10%甘油，21111 PMSF和1 200稀釋的蛋白酶抑制劑混合物套裝III)提 取了蛋白，通過Bradford分析方法(BioRad Laboratories Inc. ,Hercules,CA)定量。將總 共80yg蛋白在7. 5% SDS-PAGE凝膠上分離，並轉移到硝酸纖維素膜上。將印跡與1 200 稀釋的抗肌養相關蛋白小鼠單克隆抗體(MANCH03 8A4，來自Center for Inherited NeuromuscularDisease, Shropshire, UK 白勺 Glenn Morris 白勺女子;t；㈣貝曾)iUB % 1 50，000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠第二抗體溫育。395kDa的肌 養相關蛋白條帶通過化學發光檢測，通過使用抗Cox-I抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA)探測同樣印跡，對蛋白載量進行歸一化。條帶強度使用ImageQuant TL軟 件(AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)定量。統計學分析所有平均的數據被報告為平均值士標準偏差。多個組之間的比較，對於參數型數 據通過單因素方差分析(ANOVA)進行，或者對於非參數型數據通過Kruskal-Wallis組間行 單因素方差分析進行，使用了 SigmaStat 1.0軟體(Jandel Corporation, San Rafael, CA) P < 0. 05被認為是統計學顯著的。_杜興氏肌營養不良症(DMD)是由編碼肌養蛋白的基因中的突變引起的破壞性神 經肌肉疾病。α 7β 1整合蛋白和肌養相關蛋白是在DMD患者和mdx小鼠模型的肌肉中上調 的層粘連蛋白結合蛋白。肌養相關蛋白或α7整合蛋白在營養不良小鼠中的轉基因過表達 緩解了肌肉疾病，使得這些基因成為藥物幹預的靶。為了確定層粘連蛋白是否調節α7整 合蛋白的表達，將培養的小鼠和人類成肌細胞用層粘連蛋白進行處理，並分析了 α 7整合 蛋白的表達。本實施例證明了層粘連蛋白-111，一種在胚胎發育過程中高度表達的層粘連 蛋白形式，增加了來自小鼠和DMD患者的培養的成肌細胞中α 7整合蛋白的表達。將層粘連 蛋白-111肌肉內注射到mdx小鼠中，增加了 β 7整合蛋白和肌養相關蛋白的表達，穩定了 肌膜，防止了肌肉疾病。全身性層粘連蛋白-111蛋白療法，將mdx小鼠中血清肌酸激酶水 平恢復到正常範圍內。這些發現證明了層粘連蛋白-111對於DMD的小鼠模型來說是高度 有力的新的蛋白治療物，代表了全身性投送細胞外基質蛋白作為遺傳疾病療法的新範例。杜興氏肌營養不良症(DMD)是最常見的X染色體連鎖疾病，在每3，500個男性中 有1人患病。DMD患者表現出嚴重的、進行性的肌肉消瘦，症狀在2到5歲首次出現。隨著 疾病發展，患者被限制於輪椅上，需要呼吸器幫助，在它們生命的第二個或第三個十年中死 亡。到目前為止，對於這種破壞性的神經肌肉疾病，沒有有效的治療或治癒方法。
DMD患者和mdx小鼠(DMD的小鼠模型)在編碼肌養蛋白的基因中具有突變，導致 肌養蛋白的喪失。肌養蛋白是位於肌纖維細胞質內膜上的427kDa的蛋白。通過其N-末端 棒狀結構域重複序列，肌養蛋白可以與細胞骨架的F-肌動蛋白相互作用。肌養蛋白的C-末 端區域與由α-和β-肌營養不良蛋白聚糖、小肌營養蛋白、α-和肌養蛋白結合蛋白 (syntrophin)和肌聚糖構成的跨膜複合物相互作用。肌養蛋白糖蛋白複合物在肌肉的細胞 外基質中細胞骨架和層粘連蛋白之間提供跨膜連接。肌養蛋白的喪失導致不能形成這種關 鍵的層粘連蛋白結合複合物，引起損傷和進行性的肌肉虛弱。在缺少肌養蛋白的情況下，在DMD患者和mdx小鼠的骨骼肌中兩種其他的層粘連 蛋白結合複合物，α 7β1整合蛋白和肌養相關蛋白糖蛋白複合物，上調了。在骨骼肌中轉 基因增加肌養相關蛋白或α 7整合蛋白，在營養不良的小鼠中緩解了肌肉疾病。另一方面， 在mdx小鼠中喪失肌養相關蛋白或α 7整合蛋白導致了更嚴重的表型和降低的生存力。這 些結果合在一起，表明肌養相關蛋白和α 7β1整合蛋白是疾病發展的遺傳調節物，並且是 用於增加它們表達的基於藥物的療法的靶。
為了特定分子是否增加α 7整合蛋白的表達，開發了基於肌肉細胞的分析方法。 產生了 α 7整合蛋白缺陷小鼠，其中編碼α 7整合蛋白的基因的外顯子1被LacZ報告基 因取代。在這些小鼠中，所有轉錄調節元件被保留，允許通過半乳糖苷酶報告α7整 合蛋白啟動子活性。從10日齡α 7+幼仔分離了原代成肌細胞(命名為α 7β gal+勺。 α 7 β gal+/-成肌細胞表達的β -半乳糖苷酶在分化後增加(圖21和22)，與成肌細胞和肌 管中α7整合蛋白的表達樣式一致。通過半乳糖苷酶將不發螢光的化合物螢光素二 β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)切割成螢光素，測量了 α 7整合蛋白啟動子的活性。幾條線路的證據表明了在層粘連蛋白和α 7整合蛋白表達的調控中的正反饋。編 碼層粘連蛋白-α 2的基因中的突變，導致了 IA型先天性肌營養不良症(MDC1A)。MDClA患 者和層粘連蛋白-α 2缺陷小鼠都具有急劇降低的α 7整合蛋白水平，這可能造成了嚴重的 肌肉疾病。此外，在α 7整合蛋白缺陷的骨骼肌中，層粘連蛋白-α 2降低了。為了確定層粘 連蛋白與α 7整合蛋白表達之間的關係，將a7i3galv_成肌細胞在0-200ηΜ的各種層粘連 蛋白-111濃度中暴露24小時。研究表明，層粘連蛋白-111在功能上類似層粘連蛋白-211， 與α 7β 1整合蛋白相互作用。螢光激活的細胞分揀(FACS)分析表明，在IOOnM層粘連蛋 白-111時，α 7整合蛋白啟動子的活性最高(圖23)。對層粘連蛋白-111處理的C2C12小鼠成肌細胞和DMD原代成肌細胞中的a 7整 合蛋白進行了定量。對來自層粘連蛋白處理的成肌細胞的蛋白提取物進行了 Western分析 以檢測a 7B整合蛋白。層粘連蛋白-111在C2C12和DMD成肌細胞中產生了 2倍增加的 a7B整合蛋白(圖24和25)。這些數據表明，層粘連蛋白_111增加了人類和小鼠肌肉細 胞中a 7整合蛋白的表達。然後確定了是否上述使用層粘連蛋白-111的體外結果可以適用於體內，以增 加骨骼肌中整合蛋白的表達。將10日齡的mdx小鼠的左側脛骨前肌(TA)肌肉用 100 μ IlOOnM層粘連蛋白-111進行注射，而右側TA肌肉用100 μ 1 PBS注射，並用作對側對 照。在5周齡時，將小鼠處死，收穫TA肌肉。層粘連蛋白-111 一般不在成年肌肉中表達， 注射的蛋白用抗層粘連蛋白-a 1抗體檢測。免疫螢光顯示，注射的層粘連蛋白-111蛋白 沉積在5周齡mdx小鼠的TA肌肉的整個基底層中(圖26)。照片也證實肌養蛋白存在於野生型肌肉中，但是在PBS和層粘連蛋白-111處理的mdx肌肉中都不存在。為了確定層粘連蛋白-111是否在mdx小鼠中預防肌肉疾病，在來自PBS和層粘連 蛋白-111注射的TA肌肉的冷凍切片上進行了伊文思藍染料(EBD)攝入和蘇木精與曙紅 (H&E)染色(圖27)。分析顯示，用層粘連蛋白-111注射的mdx肌肉與對側對照相比，EBD 陽性的纖維的百分率降低了 12倍(圖28，*P < 0. 05，**P < 0. 001，η = 5隻小鼠/組)。 此外，用層粘連蛋白-111注射的mdx肌肉顯示出具有中央定位的核的肌肉纖維的百分率降 低了 4倍(圖28，*P < 0. 05，**P < 0. 001，η = 5隻小鼠/組)。這些結果表明，層粘連蛋 白-111蛋白療法極大增加了肌膜的完整性，降低了對肌肉修復的需要。為了確定層粘連蛋白-111蛋白療法保護肌養蛋白缺陷肌肉免於損傷的機制，進 行了肌養相關蛋白和α 7整合蛋白的免疫螢光分析。結果顯示出在層粘連蛋白-111處理 的mdx小鼠的肌肉中，與對照相比，α 7整合蛋白和肌養相關蛋白的表達和接頭外定位增加 (圖 29)。為了驗證和定量這些觀察，對PBS和層粘連蛋白-111處理的mdx肌肉進行了 Western分析(圖30)。在層粘連蛋白-111處理的mdx肌肉中，與對照相比，觀察到α 7A 和α 7Β整合蛋白同工型分別增加了 1.6和2. 6倍(圖31，= < 0. 05，"P = < 0. 001，η =5隻小鼠/組)。蛋白載量被歸一化為環加氧酶-I(COX-I)。此外，在層粘連蛋白-111 處理的肌肉中，觀察到肌養相關蛋白增加了 1.3倍(圖31，*Ρ =< 0. 05，**Ρ =< 0. 001，η =5隻小鼠/組)。沒有觀察到β ID整合蛋白水平的顯著變化，與在α 7整合蛋白轉基因 小鼠中報導的結果一致。這些結果顯示，層粘連蛋白-111增加了 α 7整合蛋白和肌養相關 蛋白二者的表達，這兩種蛋白當在營養不良肌肉中轉基因過表達時，已知能減輕肌肉疾病。DMD患者遭受普遍化的肌肉消瘦。因此，有效的療法應該靶向所有肌肉，包括心臟 和橫膈膜。然後，確定了層粘連蛋白-111是否能夠全身性投送到這些肌肉。以lmg/kg對 10日齡mdx幼仔腹膜內注射一劑層粘連蛋白-111，在5周齡時對組織進行分析。免疫螢光 分析顯示，在層粘連蛋白-111注射的小鼠的橫膈肌和腓腸肌的整個基底層中存在層粘連 蛋白-α 1，而對照是陰性的(圖32和33)。心肌的分析顯示出層粘連蛋白_111圍繞著心 肌細胞(圖32)。為了確定層粘連蛋白-111的全身性投送是否是治療性的，在層粘連蛋白-111注 射後3周收集血清，並測量肌酸激酶水平。在DMD患者中，由於肌肉損傷，血清肌酸激酶極大 升高，肌酸激酶的水平被用於診斷和預後目的。該實施例證明了層粘連蛋白-111療法導致 與PBS對照相比血清肌酸激酶水平降低了 2. 6倍(圖34，*Ρ < 0. 05，η = 5隻小鼠/組)。 這些水平與野生型小鼠中肌酸激酶水平沒有統計學差異。這些結果證明了層粘連蛋白-111 可以全身性投送到mdx小鼠的主要肌肉系統中，以預防營養不良疾病。因為層粘連蛋白-111相對大，可能對腎功能有不利影響，因此測量了血清肌酸和 血液尿素氮(BUN)。分析顯示，在層粘連蛋白-111處理的mdx和對照小鼠之間，肌酸和BUN 沒有統計學差異(圖34ZP < 0. 0 5，η =只小鼠/組)。這些數據表明，層粘連蛋白-111蛋 白療法對腎功能沒有不利影響。本實施例第一次證明了單次全身性層粘連蛋白-111給藥，在遺傳上註定要發生 肌營養不良症的小鼠中，將肌肉疾病的發作阻止了至少3周。這些發現合在一起，證明了 層粘連蛋白-111可能是用於杜興氏肌營養不良症的高度有力的、新的蛋白治療物。此外，層粘連蛋白-111蛋白療法在其他肌肉疾病的治療中可能也被證明是有效地，這些疾病包括IA型先天性肌營養不良症、肢帶型肌營養不良症和α 7整合蛋白先天性肌病。層粘連蛋 白-111注射在營養不良小鼠中的有效性代表了一種新的範例，證明了全身性投送細胞外 基質蛋白可以被開發成用於遺傳病的療法。 應該理解，上面的討論提供了各種不同實施方案的詳細描述。上面的描述將使本 技術領域的專業人員能夠作出與上面描述的具體實施例的許多偏離，以提供按照本公開構 建的裝置。實施方案是說明性的，不打算限制本公開的範圍。相反，本公開的範圍由發布的 權利要求書及其等價物的範圍所決定。
權利要求
在對象中增強肌肉再生、修復或維持的方法，包括向所述對象施用治療有效量的層粘連蛋白的至少一部分。
2.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白-1的至少一部分。
3.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白-1。
4.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白_2的至少一部分。
5.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白_2。
6.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白_4的至少一部分。
7.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白_4。
8.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白-1、層粘連蛋白_2、層粘連蛋 白_4或其組合的全部或一部分。
9.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白的α1鏈。
10.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白包含層粘連蛋白α 鏈的至少一部分。
11.權利要求1的方法，還包含在向對象施用治療有效量的層粘連蛋白的至少一部分 之前，對患有特徵為肌肉再生受損的病症的對象進行診斷。
12.權利要求1的方法，其中對象患有特徵為肋節成分的產生受損的病症。
13.權利要求1的方法，其中對象患有肌養蛋白的產生受損。
14.權利要求1的方法，其中對象患有層粘連蛋白的產生受損。
15.權利要求1的方法，其中對象患有α7β 1整合蛋白的產生受損。
16.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白與附加的治療性藥劑一起施用。
17.權利要求1的方法，其中附加的治療性藥劑選自肋節蛋白、生長因子、衛星細胞、幹 細胞和肌細胞。
18.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白在對象經歷肌肉損傷或疾病之前施用。
19.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白全身性施用於對象。
20.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白通過注射到胃中施用於對象。
21.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白腸胃外施用於對象。
22.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白通過肌肉內注射施用。
23.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白通過腹膜內注射施用。
24.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白選自層粘連蛋白的衍生物、類似物或片段。
25.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白以大約50ηΜ到大約200nm之間的濃度施用。
26.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白以大約IOOnM的濃度施用。
27.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白以大約lnmol/g到大約50nmol/g對象體重之 間的量施用。
28.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白以大約2nmol/g到大約20nmol/g對象體重之 間的量施用。
29.權利要求1的方法，其中層粘連蛋白以大約2nmol/g到大約lOnmol/g對象體重之 間的量施用。
30.在對象中促進傷口癒合的方法，包括向對象施用有效量的層粘連蛋白。
31.在對象中前瞻性預防或減輕肌肉受損或損傷的方法，包括向對象施用有效量的層 粘連蛋白。
32.在對象中增強傷口癒合的方法，包括向對象施用治療有效量的層粘連蛋白的至少 一部分。
33.治療對象的方法，包括向對象施用治療有效量的層粘連蛋白的至少一部分。
全文摘要
在各種不同的實施方案中，本公開提供了使用層粘連蛋白或包含層粘連蛋白的組合物治療對象的方法。在一個實施方案中，方法被用於在對象中增強肌肉的再生、維持或修復。在另一個實施方案中，方法被用於促進創傷癒合。在另一個實施方案中，方法被用於防止或減輕肌肉損傷或受損。在這些方法的具體實施中，以治療有效的量施用層粘連蛋白或包含層粘連蛋白的組合物。在某些實施中，層粘連蛋白是完整的層粘連蛋白。在其他實施中，層粘連蛋白是層粘連蛋白片段、層粘連蛋白衍生物或層粘連蛋白類似物。
文檔編號A61K31/195GK101873854SQ200880117577
公開日2010年10月27日 申請日期2008年10月1日 優先權日2007年10月9日
發明者加欽塔·E·魯尼, 迪安·J·布爾津 申請人:內華達高等教育系統董事會,代表內華達大學雷諾校區