一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法

2023-06-05 18:48:46 2

專利名稱：一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法
技術領域：
本發明目的是提供一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法。 背景技術：
隨著科學技術的快速進步和工業化的飛速發展，人民的生活水平日益提高，但同 時大量產生含氮廢水，帶來了一系列的環境問題。國內外目前處理含氮廢水的處理方法，主要有吹脫法、氣提回收法、化學沉澱法、 離子交換法、電化學氧化法和折點加氯法等。各種方法都存在一些問題，諸如處理效果不 佳，工藝複雜，工況難以掌握和處理成本偏高。相比之下，生物脫氮法較為經濟有效。生物脫 氮劑是專門用於出去水中氨氮的一種生物強化製劑，為了能降低生產成本，提高生產效率， 該專利突破性的將高密度發酵技術應用於混合脫氮微生物，達到良好的效果。自然環境或者生物處理體系中，微生物通過自身的生命活動降解汙染物，將有害 物質分解為穩定無害的小分子物質，如CO2和H2O。隨著工業的發展，一些有毒有害物質的 排放會對環境微生物產生一定的毒害作用，使得生物降解體系中缺乏足夠的微生物降解相 應的汙染物，或抑制具有降解複雜汙染物性能的微生物生長，需要很長一段時間才能通過 酶的誘導、遺傳物質轉移等方式使微生物逐漸適應。有效微生物的數量化技術是向傳統的 生物處理系統中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的濃度，增強對難降解汙染 物的降解能力，提高其降解速率，並改善原有生物處理體系對目標汙染物的去除效能。目前採用的比較傳統的脫氮技術，有一個技術瓶頸，硝化菌群增殖速度慢且難以 維持較高的生物濃度，造成總水力停留時間較長，有機負荷較低，從而增加了投資和運行成 本。而且，生物脫氮技術抗衝擊能力弱，高濃度氨氮和亞硝酸鹽進水會抑制硝化菌的生長。專利號CN200510094737. 5的中國發明專利提供一種高密度細胞培養方法及其生 物反應裝置，描述了一種細胞培養方法及其生物反應裝置，尤其涉及一種細胞高密度循環 式或連續式培養方法及其生物反應裝置，其特徵是在生物反應器上加裝無機膜過濾組件及 補料罐，並通過一定的控制迴路將三者連接為一個可用於細胞循環式高密度培養或高密度 連續式培養的生物反應器系統。但是結構過於複雜，且關鍵的培養基差異，而且其運轉工藝 流程並不適用於本發明中針對混合培養脫氮微生物的培育。專利申請號為CN200610039750. 5中國專利申請提供一種泡菜用乳酸菌的高密度 培養方法，提及了採用常規植物乳酸菌為菌種，經常規方法活化、擴大培養，接種於按常規 配方配置的發酵培養基，其特徵在於將發酵培養基用含0. 2% 0. 3%檸檬酸鈉、0. 2% 0.3%磷酸氫二鈉、0. 0.2%磷酸二氫鈉的緩衝鹽溶液調pH值為6. 3 6.6 ；在整個培 養過程中，流加氨水以保持PH值穩定在5. 8 6. 2 ；菌液培養20h後，補加500ml 700ml 新鮮培養基；菌液培養結束後離心，加入由10% 15%脫脂乳、5% 7%穀氨酸鈉、2% 3%甘油和7% 8%麥芽糖組成的複合保護劑，真空冷凍乾燥。雖然也是採用高密度培養 方法，但是與培養脫氮微生物的各項技術指標都由明顯差異。《混合脫氮微生物菌群的高密度培養》(耿金菊劉登如等)等相關文獻中提到了高密度發酵培養混合脫氮微生物，利用微生物的混合培養技術，研究了好氧條件下同時硝 化_反硝化的生物脫氮過程。混合脫氮微生物菌群生長的適宜pH範圍為7 10，在5L 發酵罐上探索了實現混合脫氮微生物菌群高密度培養的pH控制策略發酵前期補酸控制 PH ^ 8,發酵中後期不控制pH值，可縮短菌體的生長周期，提高菌體的氨氮降解速率，細胞 質量濃度達3. 9g/L，比自然pH條件下提高了 62. 5%。並在IOL發酵罐上作進一步的培養， 驗證了其PH控制策略的可行性。通過分批補加(NH4)2SO4使菌濃進一步提高了 15.4%，最 終細胞乾重為4. 5g/L。但其菌體濃度仍然較低，遠達不到高濃度培養的要求。

發明內容
本發明目的是一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法，通過連續流加硫酸 銨、琥珀酸鈉，並維持磷酸緩衝液PH值為8，菌群培養時間24小時後，得到的脫氮菌群的細 胞乾重即可達到20g/L。本發明採用的技術方案是一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法，所述培養為好氧脫氮微生物菌群的 混合培養，本發明要點在於培養過程中維持PH為7. 0 8. 5，並在培養第5 10小時起 (優選從第5 7小時起)開始連續流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，維持培養基中葡萄糖 濃度為10 30g/L、硫酸銨濃度為5 25g/L、琥珀酸鈉濃度為0. 5 5g/L，於28 32°C 下進行好氧培養獲得混合脫氮微生物菌群。補料分批培養(又稱流加培養)是根據菌株生長和初始培養基的特點，在分批培 養的某些階段以某種方式間歇或連續補加新鮮培養基，使菌體及其代謝產物的生產時間延 長的培養方式。補料方式可分為反饋補料和非反饋補料兩類反饋補料包括pH-stat法、 DO-stat法、菌體濃度反饋法、呼吸商法等，非反饋補料可分為恆速流加培養、變速流加培養 和指數流加培養。由於硝化微生物在硝化過程中產生酸，而反硝化微生物進行反硝化作用時則產生 鹼，而且硝化微生物和反硝化微生物的最適生長PH值亦不同，此外混合菌群對一定範圍的 初始PH具有強大的自我調節功能。因此，必須將培養過程中的pH控制在合理範圍才能實 現混合菌群的協調生長，共同維持較高的菌體生長速率和氨氮降解速率。高密度培養是一個相對概念，用以描述的單位是幹細胞重/升(DCW/L)。廣義來 說，凡是細胞密度比較高，以至接近其理論值的培養均可成為高密度培養。高密度培養有提 高菌體的發酵密度或單位體積培養液中菌體的濃度，進而提高體積產率；縮小生物反應器 體積，減少生產設備投資；強化下遊分離提取，並減少廢水量等優點。其綜合效果達到提高 比生產率(單位體積、單位時間內產物的產量)，降低生產成本，加速產品的商品化進程，提 高產品在市場上的競爭力。高密度發酵過程中，營養控制是關鍵，發酵培養基中碳源、氮源和無機鹽會造成溶 液滲透壓過高，細胞脫水死亡，往往會抑制菌體的生長，使目的產物得率下降，而且過量的 碳源會使細胞迅速生長，導致溶解氧急劇下降。高密度培養通常採用補料培養，使各種培養 基成分低於抑制濃度。廣義來講，凡是細胞密度比較高，以至接近其理論值的培養均可稱為高密度培養， 一般認為其上限值為150 200g(DCW/L)，下限值為20 30g(DCW/L)。由於本發明中的硝酸菌與亞硝酸菌作為生長較緩慢的細菌，因此在48小時菌體乾重能夠達到20g/L已經可以 將其定義為高密度發酵。用於培養所述好氧脫氮微生物菌群的培養基可按本領域常規進行配置，比如參 照《混合脫氮微生物菌群的高密度培養》中的培養基組成，優選的，本發明所述培養基初 始濃度組成如下=NaHCO3L 0 5. Og/L,琥珀酸鈉 0. 5 2. Og/L, (NH4)2SO4O. 5 2. Og/L, KH2PO4O. 01 0. 15g/L, K2HPO4O. 5 2. Og/L, NaCl 0. 1 1. Og/L, FeSO4O. 1 1. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 5g/L, MnSO4O. 01 0. 2g/L，溶劑為水，ρΗ7· 0 8. 5。更為優選的，所述培養基初始濃度組成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸鈉0. 954g/L， (NH4)2SO4L 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L 0g/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L，溶劑為水，pH8. 0。優選的，所述培養在pH8. 0、30°C下進行，總培養時間為24 48h。所述好氧脫氮微生物菌群可為本領域常規菌群，比如硝化菌、反硝化菌、亞硝化菌 等，可從土壤或水中按常規方法篩選獲得，也可採用市購複合菌粉。優選的，所述好氧脫氮 微生物菌群為硝化菌和亞硝化菌的混合，例如本發明申請人在在先申請CN201010107453. 6 中篩選獲得的硝化菌CCTCC No =M 2010001和亞硝化菌CCTCC No =M 2010002的組合。硝化 菌和亞硝化菌的混合比例可不受限制，實際上，由於不同微生物菌群之間的相互影響和制 約，在汙水處理系統中初始投入的硝化菌和亞硝化菌比值不確定的情況下，經過馴化培養， 最終處理系統中兩種菌群會達到一定的平衡。優選的，硝化菌和亞硝化菌初始接種菌體比 例為0. 5 2 1。優選的，所述培養第5小時起開始連續流加開始連續流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀 酸鈉，維持培養基中葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃度為15g/L、琥珀酸鈉濃度為2. 2g/L，於 30°C下進行好氧培養，總培養時間24h，即可獲得所述混合脫氮微生物菌群。本發明的有益效果主要體現在本發明通過連續流加硫酸銨、琥珀酸鈉，使得脫氮 菌群得率顯著提高，脫氮菌群的細胞乾重可達到20g/L及其以上；在保證菌體質量的前提 下，維持磷酸緩衝液PH為8，將菌群培養時間從48小時縮短為24小時，大大提高了效率。


圖1為實施例1混合菌生長曲線圖；圖2為實施例2不同pH值下混合菌生長曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此實施例1 培養基初始濃度組成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸鈉0. 954g/L，(NH4) 2S041. 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L Og/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶劑 為水，ρΗ8· 0。上述培養基250mL/瓶接種市購硝化菌和反硝化菌複合菌粉IOg (滄州旺發生物技 術研究所生產，活菌總數> 80億個/克)，一瓶在培養開始第10小時起流加葡萄糖、硫酸
5銨和琥珀酸鈉，使培養基中維持葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃度為15g/L、琥珀酸鈉濃度 為2. 2g/L，30°C、250r/min、通氣量Ivvm空氣條件下培養48h ；另一瓶培養過程中不添加任 何物質，在相同條件下培養，測得混合菌生長曲線如圖1所示。由圖1可知，混合菌群在未流加任何營養物質時，48h後僅能達到13g/L的菌體幹 重，而連續補料維持2%葡萄糖、1.5%硫酸銨、0. 22%琥珀酸鈉(培養過程中未控制pH值) 後，菌體濃度能在48h後達到20g/L。實施例2 培養基初始濃度組成如下:NaHC032. Og/L,琥珀酸鈉0. 8g/L，(NH4)2SO4L 2g/L， KH2PO4O. 05g/L, K2HPO4L 2g/L, NaCl 0. 8g/L, FeSO4O. 5g/L, MgSO4O. lg/L, MnSO4O. 1/L,溶劑為 水，ρΗ7· 0 9· 0。上述不同pH值(ρΗ6. 0、ρΗ7. 0、ρΗ8. 0、ρΗ9. 0)的培養基250mL/瓶接種市購硝化 細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌的混合菌液12g(河北益微生物技術有限公司，型號XH01)， 在培養開始第5小時起均流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，使培養基中維持葡萄糖濃度為 18g/L、硫酸銨濃度為16g/L、琥珀酸鈉濃度為2. 5g/L，30°C、250r/min、通氣量Ivvm空氣條 件下培養24h，獲得混合菌生長曲線見圖2。由圖2可知，pH為8時，菌體的淨生長速率，在培養時間僅為24h時就能達到 18. 5g/L的效果。實施例3 培養基初始濃度組成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸鈉0. 954g/L，(NH4) 2S041. Og/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L Og/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶劑 為水，ρΗ8· 0。上述培養基接種適量硝化菌CCTCC No =M 2010001和亞硝化菌CCTCC No =M 2010002，菌體初始比例為1 1，培養條件發酵過程控制溫度30°C，攪拌轉速為350r/ min,通氣量為lvvm。結果參數菌群培養時間為24小時，細胞乾重達到20. 7g/L。汙泥馴化過程將上述發酵得到的微生物發酵液按照5% (ν/ν)(每IOOml的待處理汙水中加入 5ml的微生物發酵混合液)的投加量加入生化池，維持7天，得到馴化後的活性汙泥。實施例4 按照實施例3方案進行高密度發酵混合脫氮微生物培養後，製成生物脫氮劑該生物脫氮劑其工藝流程為
種子液培養-發酵罐培養-離心-稀釋-噴淋-乾燥 生物脫氮劑製作工藝流程首先將硝酸菌與亞硝酸菌混合接種於搖瓶中種子培養 基進行種子培養24小時獲得種子液；種子液以10%體積比接種發酵培養基，培養第5小時 開始中流加葡萄糖、硫酸銨和和琥珀酸鈉，使培養基中維持葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃 度為15g/L、琥珀酸鈉濃度為2. 2g/L，在30°C、250r/min、通空氣量Ivvm條件下培養24h。離 心收集菌體，然後將菌體稀釋至固體製劑的最終含水量控制在8%左右，加入適量的脫脂乳作保護劑，均勻噴霧於麩皮載體上，自然密閉保藏或冷藏。該生物脫氮劑經第三方檢測，得出結果如下表 實施例5 燕京啤酒(浙江仙都)有限公司，使用本發明高密度發酵混合脫氮微生物，能夠 保持穩定達標。原水水質為BOD5 (五日生物耗氧量BiologyOxygen Demmand) 155mg/L, COD 310mg/L，總氮33mg/L，氨氮13mg/L各取1000ml，置於玻璃容器中，分別用該汙水處理站汙 泥與按實施例3方法馴化後的汙泥進行好氧階段處理，曝氣量均為lvvm。反應18h後，原汙 水站汙泥處理的水樣水質B0D515mg/L，COD 20mg/L,總氮16mg/L，氨氮5mg/L ；利用本發明 馴化汙泥處理的水樣水質為B0D550mg/L，COD 17mg/L,總氮4mg/L，氨氮2mg/L ；因此採用本 發明技術發酵的混合菌劑，總體效率可提高約50%。實施例6 紹興汙水處理發展有限公司，使用本專利技術高密度發酵混合脫氮微生物， COD (化學耗氧量，chemical oxygen demand) 400mg/L,總氮 30mg/L，氨氮 10mg/L 各取 1000ml，置於玻璃容器中，分別用該公司汙水處理站汙泥與按實施例3方法馴化後的汙 泥進行好氧階段處理，曝氣量均為lvvm。反應18h後，原汙水站汙泥處理的水樣水質 B0D520mg/L, COD 40mg/L,總氮20mg/L，氨氮6mg/L ；利用本專利馴化汙泥處理的水樣水質為 B0D56mg/L,C0D 20mg/L，總氮7mg/L，氨氮3mg/L ；因此採用本發明技術高密度發酵的混合菌 劑，總體效率可提高約50%。
權利要求
一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法，所述培養為好氧脫氮微生物菌群的混合培養，其特徵在於所述培養過程中維持pH為7.0～8.5，並在培養第5～10小時起開始連續流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，維持培養基中葡萄糖濃度為10～30g/L、硫酸銨濃度為5～25g/L、琥珀酸鈉濃度為0.5～5g/L，於28～32℃下進行好氧培養獲得混合脫氮微生物菌群。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述培養基初始濃度組成如下=NaHCO3L0 5. Og/L,琥珀酸鈉 0. 5 2. Og/L, (NH4)2SO4O. 5 2. Og/L, KH2PO4O. 01 0. 15g/L, K2HPO4O. 5 2. Og/L, NaCl 0. 1 1. Og/L, FeSO4O. 1 1. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 5g/L, MnSO4O. 01 0. 2g/L，溶劑為水，pH7. 0 8. 5。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述培養基初始濃度組成如下 NaHCO3L 85g/L,琥珀酸鈉 0. 954g/L, (NH4)2SO4L 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L 0g/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶劑為水，pH8. 0。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述培養在pH8.0、30°C下進行，總培養時間 為24 48h。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述好氧脫氮微生物菌群為硝化菌和亞硝化 菌的混合。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述培養第5小時起開始連續流加葡萄糖、硫 酸銨和琥珀酸鈉，維持培養基中葡萄糖濃度為20g/L、硫酸銨濃度為15g/L、琥珀酸鈉濃度 為2. 2g/L，於30°C下進行好氧培養，總培養時間24h，即可獲得所述混合脫氮微生物菌群。
全文摘要
本發明提供了一種混合脫氮微生物菌群的高密度培養方法，所述培養為好氧脫氮微生物菌群的混合培養，本發明要點在於培養過程中維持pH為7.0～8.5，並在培養過程開始第5～10小時起連續流加葡萄糖、硫酸銨和琥珀酸鈉，維持培養基中葡萄糖濃度為10～30g/L、硫酸銨濃度為5～25g/L、琥珀酸鈉濃度為0.5～5g/L，於28～32℃下進行好氧培養獲得混合脫氮微生物菌群。本發明通過連續流加硫酸銨、琥珀酸鈉，使得脫氮菌群得率顯著提高，脫氮菌群的細胞乾重可達到20g/L及其以上；在保證菌體質量的前提下，維持磷酸緩衝液pH為8，將菌群培養時間從48小時縮短為24小時，大大提高了效率。
文檔編號C12N1/00GK101921708SQ20101024494
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月4日 優先權日2010年8月4日
發明者丁青松, 何志明, 何歡, 周黎明, 堵國成, 鄭展望, 陳堅 申請人:浙江商達水務有限公司