用於在含油酵母中生產多不飽和脂肪酸的密碼子優化的基因的製作方法

2023-06-05 14:51:51

專利名稱：用於在含油酵母中生產多不飽和脂肪酸的密碼子優化的基因的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。更具體地講，本發明涉及編碼可用於在含油酵母中生產長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的酶的核酸片段的合成。
背景技術：
很久以來就已經認識到，某些多不飽和脂肪酸，或PUFAs，是健康細胞的重要的生物學成分。例如，這樣的PUFAs被認為是·″必需″脂肪酸，它不能夠在哺乳動物體內從頭合成，相反，必須從飲食中獲得或者通過亞油酸(LA)或α-亞麻酸(ALA)的進一步去飽和及延伸產生；·細胞質膜的成分，其中，它們能夠以諸如磷脂或甘油三酯的形式存在；·為正常發育所必需，特別是為嬰兒腦發育和組織形成和修復所必需；和，·在哺乳動物體內起著重要作用的若干種生物學活性類二十烷酸的前體，包括前列環素，類二十烷酸，白三烯和前列腺素。
在二十世紀70年代，發現格陵蘭島愛斯基摩人的心臟病的低發病率和大量攝入長鏈ω-3PUFAs相關(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin Nutr.28958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet 2(8081)117-119(July 15，1978))。更近一些的研究業已證實了ω-3 PUFAs的心血管保護作用(Shimokawa，H.，World Rev Nutr Diet，88100-108(2001)；von Schacky，C.，和Dyerberg，J.，World Rev Nutr Diet，8890-99(2001))。另外，業已發現，某些病症對用ω-3脂肪酸治療有反應，如在血管成形術之後的再狹窄率，炎症症狀和類風溼性關節炎，哮喘，牛皮癬和溼疹。業已證實γ-亞麻酸(GLA，一種ω-6PUFA)能降低與應激相關的血壓升高，並且改善算術測驗的表現。業已證實GLA和二高-γ-亞麻酸(DGLA，另一種ω-6PUFA)能抑制血小板聚集，導致血管舒張，降低膽固醇含量，並且抑制血管壁平滑肌和纖維組織的增殖(Brenner等，Adv.Exp.Med.Viol.8385-101(1976))。施用單獨的或者與二十碳五烯酸(EPA，ω-3PUFA)組合的GLA或DGLA，業已表現出能減輕或防止胃腸出血，和由非甾體類抗炎藥物導致的其他副作用(U.S.4,666,701)。另外，業已證實GLA和DGLA能預防或治療子宮內膜異位和經前症候群(U.S.4,758,592)，並且治療肌痛性腦脊髓炎和在病毒感染之後的慢性疲勞(U.S.5,116,871)。其他證據表明，PUFAs可能與鈣代謝的調控有關，表明了它們可用於治療或預防骨質疏鬆症和腎或尿道結石。最後，PUFAs可用於治療癌症和糖尿病(U.S.4,826,877；Horrobin等，Am.J.Clin.Nutr.57(Suppl.)732S-737S(1993))。
PUFAs通常被劃分成兩種主要類型(由ω-6和ω-3脂肪酸組成)，它們是分別通過必需脂肪酸，LA和ALA的去飽和和延伸產生的(

圖1)。儘管PUFAs的多種商業來源來自天然來源(例如，月見草，琉璃苣和黑醋慄的種子；絲狀真菌(Mortierella)，Porphyridium(紅藻)，魚油和海洋浮遊生物(Cyclotella，Nitzschia，Crypthecodinium))，但是存在與所述生產方法相關的若干缺陷。首先，諸如魚和植物的天然來源傾向於具有高度的不一致的油類組成。因此，從這些來源獲得的油，可能需要高度純化，以便分離或者富集一種或多種需要的PUFAs。天然來源同樣會出現可利用性的無法控制的波動(例如，由於天氣，疾病，或者對於魚類資源來說的過度捕撈)；和產生PUFAs的作物通常在經濟上無法與為了食物生產而培育的雜交作物競爭。能天然產生PUFAs的某些生物(例如，Porphyridium，被孢黴)的大規模發酵同樣可能是昂貴的，和/或難以以商業化規模培養。
上述限制的結果是，為了達到以下目的必須進行大量的研究1.)開發便於商業化生產的PUFAs的重組資源；和2.)修飾脂肪酸生物合成途徑，以便能夠生產需要的PUFAs。例如，在過去若干年中在從各種生物中分離，克隆並且操作脂肪酸去飽和酶和延伸酶基因方面取得了進展。對這些基因序列的了解，提供了在不能天然產生PUFAs的新的宿主生物中生產需要的脂肪酸和/或脂肪酸組合物的前景。以下文獻披露了在釀酒酵母中的多種例子，如1.Domergue，F.，et al.(Eur.J.Biochem.2694105-4113(2002))，其中海洋硅藻三角褐指藻來源的兩種去飽和酶被克隆進釀酒酵母內，導致生成了EPA；2.Beaudoin F.，et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12)6421-6426(2000))，其中利用了秀麗新杆線蟲來源的基因在釀酒酵母內重構了ω-3和ω-6 PUFA生物合成途徑；3.Dyer，J.M.et al.(Appl.Eniv.Microbiol.，59224-230(2002))，其中在釀酒酵母內表達了植物脂肪酸去飽和酶(FAD2和FAD3)，導致生成了ALA；以及4.U.S.6,136,574(Knutzon et al.，Abbott Laboratories)，其中將甘藍型油菜來源的一種去飽和酶和真菌高山被孢黴來源的兩種去飽和酶克隆進釀酒酵母內，導致生成了LA、GLA、ALA和STA。
不過，仍然需要合適的微生物系統，其中，上述類型的基因可以表達，以便提供商業化數量的一種或多種PUFAs的經濟生產。另外，需要富集了特殊PUFAs，特別是EPA和DHA的油。
以前尚未作為PUFAs的生產平臺檢驗的一種類型的微生物是含油酵母。這種微生物能夠積累最多佔它們的幹細胞重量80％的油類。業已完善了用於生長具有高油含量的含油酵母的技術(例如，參見EP 0005 277 B1；Ratledge，C.，Prog.Ind.Microbiol.16119-206(1982))，並且可以提供與生產ω-3或ω-6PUFAs的商業化微藻發酵相比的成本優勢。完整的酵母細胞可能還體現了對ω-3或ω-6PUFA-富集的油進行包囊以便用於功能性食品和動物飼料添加劑的方便途徑。
儘管具有上述優點，含油酵母天然上是ω-6和ω-3PUFAs缺陷型的，因為在這種微生物中天然產生的PUFAs局限於18:2脂肪酸(以及更不常見的是18:3脂肪酸)。因此，要解決的問題是，開發能積累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油類的含油酵母。為此，必須導入去飽和酶和延伸酶，這兩種酶能夠在含油酵母中合成和積累ω-3和/或ω-6脂肪酸。儘管可以利用來自多種來源的多種去飽和酶和延伸酶基因，但是，這些基因不能在諸如含油酵母的其他宿主中以最佳效率表達，因為這些基因的密碼子不能體現所述其他宿主生物的典型的密碼子選擇。因此，必須克服與密碼子選擇相關的問題，以便優化PUFAs基因在含油酵母中的表達，以便能夠在這些特殊宿主生物中高水平生產和積累ω-3和/或ω-6脂肪酸。
申請人通過開發對適合在油質宿主，即解脂耶氏酵母(YarrowiaLipolytica)中表達的去飽和酶和延伸酶基因進行密碼子優化的方式解決了上述問題。本發明優化的典型基因是編碼Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶的基因，其中，在解脂耶氏酵母中，密碼子優化將從LA到GLA(Δ6去飽和酶)的底物轉化百分比提高了大約40％，從ARA到EPA(Δ17去飽和酶)的底物轉化百分比提高大約2倍，而從GLA到DGLA(延伸酶)的底物轉化百分比提高了大約57％。
發明概述本發明涉及優化ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑上的各種基因，以便優化在耶氏酵母菌種中的表達。因此，本發明提供了選自下組的分離的核酸分子a)如SEQ ID NO25所示的分離的核酸分子，它編碼Δ6去飽和酶；或b)完全互補於(a)的分離的核酸分子。
類似地，本發明提供了分離的核酸分子，它編碼如SEQ ID NO2所示的Δ6去飽和酶，其中，至少144個密碼子是密碼子優化的，以便在耶氏酵母菌種中表達。
在另一種實施方案中，本發明提供了選自下組的分離的核酸分子a)編碼如SEQ ID NO62所示Δ17去飽和酶的分離的核酸分子；或b)完全互補於(a)的分離的核酸分子。
在另一種實施方案中，本發明提供了分離的核酸分子，它編碼如SEQ ID NO4所示的Δ17去飽和酶，其中，至少117個密碼子是密碼子優化的，以便在耶氏酵母菌種中表達。
類似地，本發明提供了選自下組的分離的核酸分子a)編碼如SEQ ID NO91所示延伸酶的分離的核酸分子；或b)完全互補於(a)的分離的核酸分子。
另外，本發明提供了分離的核酸分子，它編碼如SEQ ID NO6所示的延伸酶，其中，至少85個密碼子是密碼子優化的，以便在耶氏酵母菌種中表達。
另外，本發明提供了本發明基因的遺傳學嵌合體，以及用所述嵌合體轉化過的宿主細胞。
在具體實施方案中，本發明提供了用於生產特殊ω-3和ω-6脂肪酸，如γ-亞麻酸(GLA)，二高-γ-亞油酸(DGLA)，十八碳四烯酸(STA)，二十碳四烯酸(ETA)，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳五烯酸(DPA)的方法，包括採用單個步驟的酶促反應，利用本發明的密碼子優化的基因在耶氏酵母菌中由合適的前體生產。
在另一種實施方案中，本發明提供了優化基因以便在含油酵母中表達的方法，包括以下步驟a)獲得含油酵母菌種的核苷酸編碼區和相應的多肽的序列，以便形成密碼子資料庫；b)分析所述密碼子資料庫，以便確定優先編碼每一種胺基酸的密碼子；c)獲得基因的序列，以便在含油酵母菌種中表達；d)用步驟(b)的優選的密碼子取代步驟(c)的序列上的非優選的密碼子，其中，所述基因是密碼子優化的，以便在含油酵母菌種中表達。
在另一種實施方案中，本發明提供了分離的核酸分子，它包括如SEQ ID NO122所示的耶氏酵母屬翻譯起始位點。另外，提供了優化基因在耶氏酵母屬宿主中表達的方法，它包括a)提供要在耶氏酵母屬中表達的外源基因；b)將步驟(a)的基因可操作地與SEQ ID NO122所示的耶氏酵母屬翻譯起始位點可操作地連接，其中，所述外源基因是優化的，以便在耶氏酵母屬中表達。
附圖和序列描述的簡要說明圖1表示ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途徑。
圖2表示用於解脂耶氏酵母中的質粒載體pY5的構建。
圖3表示用於在解脂耶氏酵母中進行基因表達的質粒載體pY5-13和pY5-4的構建。
圖4表示在解脂耶氏酵母中位於翻譯起始密碼子′ATG′周圍的優選的共有序列。
圖5表示高山被孢黴Δ6去飽和酶基因和密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成基因的DNA序列的比較。
圖6表示用於體外合成密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的方法。
圖7表示用於在解脂耶氏酵母中表達密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的質粒。
圖8表示異絲水黴Δ17去飽和酶基因和密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成基因的DNA序列的比較。
圖9表示用於體外合成密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的方法。
圖10表示用於在解脂耶氏酵母中表達密碼子優化的和野生型Δ17去飽和酶基因的質粒。
圖11表示高山被孢黴延伸酶基因和密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成基因的DNA序列的比較。
圖12表示用於體外合成密碼子優化的延伸酶基因的方法。
圖13表示用於在解脂耶氏酵母中表達密碼子優化的和野生型延伸酶基因的質粒。
圖14A表示用密碼子優化的和野生型Δ6去飽和酶基因轉化過的解脂耶氏酵母生產的脂肪酸的氣相層析分析，表現出大約30％的底物LA→GLA的轉化百分比；而圖14B表示用密碼子優化的和野生型Δ6去飽和酶基因轉化過的解脂耶氏酵母生產的脂肪酸的氣相層析分析結果，表現出大約42％的LA→GLA的轉化百分比。
圖15表示用密碼子優化的和野生型Δ17去飽和酶基因轉化的解脂耶氏酵母生產的脂肪酸的氣相層析分析結果，表現出大約23％的細胞內ARA→EPA的轉化百分比；而圖15B表示用密碼子優化的和野生型Δ17去飽和酶基因轉化的解脂耶氏酵母生產的脂肪酸的氣相層析分析結果，表現出大約45％的細胞內ARA→EPA的轉化百分比。
圖16表示用密碼子優化的和野生型延伸酶基因轉化的解脂耶氏酵母生產的脂肪酸的氣相層析分析結果，表現出大約30％的底物GLA→DGLA的轉化百分比；而圖16B表示用密碼子優化的和野生型延伸酶基因轉化過的解脂耶氏酵母生產的脂肪酸的氣相層析分析結果，表現出大約47％的GLA→DGLA的轉化百分比。
通過以下的詳細說明和所附的序列說明能夠更全面地理解本發明，這些內容構成了本發明的一部分。
以下序列符合37C.F.R.§1.821-1.825的規定(″Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules″)，並且，符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2 and 49.5(a-bis)，and Section 208and Annex C of theAdministrative Instructions)。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式符合37C.F.R.§1.822的規定。
SEQ ID NO1表示高山被孢黴Δ6去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO2表示高山被孢黴Δ6去飽和酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO3表示異絲水黴Δ17去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO4表示異絲水黴Δ17去飽和酶的相應的胺基酸序列。
SEQ ID NO5表示高山被孢黴高親和力延伸酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO6表示高山被孢黴高親和力延伸酶的胺基酸序列。
SEQ ID NOs7和8分別相當於用於分離TEF啟動子的引物TEF5′和TEF3′。
SEQ ID NOs9和10分別相當於用於分離XPR2轉錄終止子的引物XPR5′和XPR3′。
SEQ ID NOs11-24分別相當於用於質粒構建的引物YL1，YL2，YL3，YL4，YL23，YL24，YL5，YL6，YL9，YL10，YL7，YL8，YL61和YL62。
SEQ ID NO25表示密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成的Δ6去飽和酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs26-53相當於14對寡核苷酸，它們一起組成了高山被孢黴Δ6去飽和酶基因的完整的密碼子優化的編碼區(例如，分別為D6-1A，D6-1B，D6-2A，D6-2B，D6-3A，D6-3B，D6-4A，D6-4B，D6-5A，D6-5B，D6-6A，D6-6B，D6-7A，D6-7B，D6-8A，D6-8B，D6-9A，D6-9B，D6-10A，D6-10B，D6-11A，D6-11B，D6-12A，D6-12B，D6-13A，D6-13B，D6-14A和D6-14B)。
SEQ ID NOs54-61分別相當於引物D6-1，D6-4R，D6-5，D6-7R，D6-8，D6-10R，D6-11和D6-14R，用於在合成密碼子優化的Δ6去飽和酶基因期間進行PCR擴增。
SEQ ID NO62表示密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成的Δ17去飽和酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs63-84相當於11對寡核苷酸，它們共同組成了異絲水黴Δ17去飽和酶基因的完整的密碼子優化的編碼區(例如，分別為D17-1A，D17-1B，D17-2A，D17-2B，D17-3A，D17-3B，D17-4A，D17-4B，D17-5A，D17-5B，D17-6A，D17-6B，D17-7A，D17-7B，D17-8A，D17-8B，D17-9A，D17-9B，D17-10A，D17-10B，D17-11A和D17-11B)。
SEQ ID NOs85-90分別相當於引物D17-1，D17-4R，D17-5，D17-8D，D17-8U和D17-11，用於在合成密碼子優化的Δ17去飽和酶基因期間進行PCR擴增。
SEQ ID NO91表示密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成的高親和力延伸酶基因的DNA序列。
SEQ ID NOs92-111相當於10對寡核苷酸，它們共同構成了高山被孢黴高親和力延伸酶基因的完整的密碼子優化的編碼區(例如，分別為EL-1A，EL-1B，EL-2A，EL-2B，EL-3A，EL-3B，EL-4A，EL-4B，EL-5A，EL-5B，EL-6A，EL-6B，EL-7A，EL-7B，EL-8A，EL-8B，EL-9A，EL-9B，EL-10A和EL-10B)。
SEQ ID NOs112-115分別相當於引物EL-1，EL-5R，EL-6和EL-10R，用於在合成密碼子優化的延伸酶基因期間進行PCR擴增。
SEQ ID NOs116和117相當於引物EL-M1和EL-M2，用於定點誘變，以便產生pELS。
SEQ ID NOs118和119相當於引物YL21A和YL22，用於從質粒pRSP19擴增異絲水黴的野生型Δ17去飽和酶基因。
SEQ ID NOs120和121分別相當於引物YL53和YL54，用於定點誘變，以便產生pYSD17M。
SEQ ID NO122相當於用於在耶氏酵母菌中優化表達的基因的密碼子優化的翻譯起始位點。
發明的詳細說明根據本發明，申請人業已確定了含油酵母-解脂耶氏酵母中結構基因的密碼子選擇。提供了編碼Δ6去飽和酶(SEQ ID NO25)，Δ17去飽和酶(SEQ ID NO62)和高親和力延伸酶(SEQ ID NO91)的密碼子優化的基因，以及用於在解脂耶氏酵母的宿主中表達所述基因的DNA盒。另外，提供了能夠改變含油酵母，如解脂耶氏酵母的長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)含量的方法和組合物。
本發明具有多種用途。通過本文所披露的方法製備的PUFAs，或它的衍生物可被用作飲食代用品，或補充物，特別是嬰兒配方，用於靜脈內餵飼的患者或用於預防或治療營養不良。另外，可以將純化的PUFAs(或它的衍生物)摻入烹飪油，脂肪，或配製的人造奶油中，以便在正常使用時，受體能接受到所需數量的飲食補充。還可將PUFAs摻入嬰兒配方，營養補充物或其他食品中，並且可以用作抗炎劑或降膽固醇劑。可任選將所述組合物用於藥物學用途(人或獸醫)。在這種場合下，PUFAs通常是口服的，不過，可以通過能夠成功地吸收它們的任何途徑施用，例如，腸胃外(例如皮下，肌內或靜脈內)，直腸內，陰道內或局部(例如，作為皮膚油膏或洗液)。
給人或動物補充通過重組方法生產的PUFAs，可以導致水平增加的添加的PUFAs，以及它們的代謝產物。例如，用花生四烯酸(ARA)治療，不僅能夠產生水平增加的ARA，而且還能產生ARA的下遊產物，如前列腺素。複雜的調控機制，可能需要組合各種PUFAs，或者添加PUFAs的不同的綴合物，以便預防，控制或克服這樣的機制，以便在個體內獲得理想水平的特定的PUFAs。
定義在本說明書中，使用了多種術語和縮寫。提供了以下定義。
″開放讀框″被縮寫為ORF。
″聚合酶鏈反應″被縮寫為PCR。
″美國典型培養物保藏中心″被縮寫為ATCC。
″多不飽和脂肪酸″被縮寫為PUFA(s)。
術語″脂肪酸″表示具有各種鏈長的長鏈脂族酸(鏈烷酸)，從大約C12-C22(不過已知可以採用更長和更短鏈長的酸)。主要的鏈長為C16至C22。脂肪酸的結構是通過簡單的符號系統″X:Y″表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的總數，而Y是雙鍵的數量。
一般，脂肪酸被劃分成飽和的或不飽和的。術語″飽和脂肪酸″表示在它們的碳主鏈之間沒有″雙鍵″的脂肪酸。相反，″不飽和脂肪酸″是沿它們的碳主鏈具有″雙鍵″的順式異構體。″單不飽和脂肪酸″沿碳主鏈只有一個″雙鍵″(例如，對於棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)來說通常位於第9和第10個碳原子之間)，而″多不飽和脂肪酸″(或″PUFAs″)沿碳主鏈具有至少兩個雙鍵(例如，對於亞油酸(18:2)來說位於第9和第10和第12和第13個碳原子之間；對於α-亞麻酸(18:3)來說位於第9和第10，第12和第13，和第15和第16個碳原子之間)。
″PUFAs″可以劃分成兩種主要類型(根據最靠近脂肪酸碳鏈的甲基末端的第一個雙鍵的位置(n))。因此，″ω-6脂肪酸″(ω-6或n-6)的第一不飽和的雙鍵距離該分子的ω(甲基)末端六個碳原子，並且一共還具有兩個或兩個以上雙鍵，每一個隨後的不飽和出現在朝向該分子羧基末端的三個額外的碳原子。相反，″ω-3脂肪酸″(ω-3或n-3)的第一不飽和的雙鍵距離該分子的ω末端三個碳原子，並且一共還具有三個或三個以上雙鍵，每一個隨後的不飽和出現在朝向該分子羧基末端的三個額外的碳原子。
在本說明書中，將利用ω-參考系統表示碳原子的編號，雙鍵的編號，和最接近ω碳原子的雙鍵的位置，從ω碳原子開始計數(它是用於這種目的的第1號)。在下面的表1中示出了這種命名方法，表示在標題為″簡化符號″的欄目中。該表的其餘部分歸納了ω-3和ω-6脂肪酸的常用名，在說明書中將要使用的縮寫，以及每一種化合物的化學名稱。
表1多不飽和脂肪酸的命名
術語″必需脂肪酸″表示個體為了生存必須攝入的PUFA，因為所述個體不能從頭合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳動物不能合成必需脂肪酸亞油酸(18:2，ω-6)。其他必需脂肪酸包括GLA(ω-6)，DGLA(ω-6)，ARA(ω-6)，EPA(ω-3)和DHA(ω-3)。
術語″脂肪″表示脂類物質，它在25℃下是固體，並且通常是飽和的。
術語″油″表示在25℃下是液體並且通常是多不飽和的脂類。PUFAs存在於某些藻類，含油酵母和絲狀真菌的油中。″微生物油″或″單細胞油″是由微生物在它們的生命過程中天然產生的油類。這種油類可能包括長鏈PUFAs。
術語″PUFA生物合成途徑酶″表示與PUFA的生物合成相關的以下任何酶(以及編碼所述酶的基因)，包括Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶。
術語″ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑″表示一組基因，當它們在合適的條件下表達時，編碼能催化ω-3和/或ω-6脂肪酸生產的酶。通常，與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑相關的基因編碼某些或所有以下的酶Δ12去飽和酶，Δ6去飽和酶，延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ9去飽和酶和Δ4去飽和酶。在圖1中示出了典型的途徑，它可以通過各種空間產物將油酸轉化成DHA，並且證實了如何由普通來源生產ω-3和ω-6脂肪酸。
術語″去飽和酶″表示能夠對一種或多種脂肪酸去飽和以便產生單-或多不飽和脂肪酸或感興趣的前體的多種酶複合物的多肽成分。儘管在本說明書中ω-參考系統被用於表示特殊的脂肪酸，更常見的是，利用Δ-系統從底物的羧基末端開始計數以表示去飽和酶的活性。本發明特別感興趣的是1.)Δ17去飽和酶，它能使脂肪酸的位於從該分子的羧基末端開始計數的第17和第18個碳原子之間去飽和，並且，例如，催化ARA轉化成EPA和/或DGLA轉化成ETA；2.)Δ6去飽和酶，它能催化LA轉化成GLA和/或ALA轉化成STA；3.)Δ5去飽和酶，它能催化DGLA轉化成ARA和/或ETA轉化成EPA；4.)Δ4去飽和酶，它能催化DPA轉化成DHA；5.)Δ12去飽和酶，它能催化油酸轉化成LA；6.)Δ15去飽和酶，它能催化LA轉化成ALA；和7.)Δ9去飽和酶，它能催化棕櫚酸酯或鹽轉化成棕櫚油酸(16:1)和/或硬脂酸酯或鹽轉化成油酸(18:1)。
術語″延伸酶″表示能夠延伸脂肪酸碳鏈，以便產生比延伸酶作用的脂肪酸底物長2個碳原子的單或多不飽和脂肪酸的多酶複合物的多肽成分。這種延伸過程是通過與脂肪酸合成酶相關的多步驟機制發生的，其中，CoA是醯基載體(Lassner等，The Plant Cell 8281-292(1996))。簡單地講，丙二醯-CoA與長鏈醯基-CoA縮合，以便產生CO2和β-酮醯基-CoA(其中，醯基部分業已延長了兩個碳原子)。隨後的反應包括還原成β-羥醯基-CoA，脫水形成烯醯基-CoA，並且第二次還原，以便產生延長的醯基-CoA。由延伸酶催化的反應的例子是將GLA轉化成DGLA，STA轉化成ETA和將EPA轉化成DPA。因此，延伸酶可以具有不同的特異性(例如，C16/18延伸酶優選C16底物，C8/20延伸酶優選Ci8底物，而C20/22延伸酶優選C20底物)。
術語″高親和力延伸酶″表示它的底物特異性優選GLA的延伸酶(DGLA是延伸酶反應的產物)。在WO 00/12720中披露了一種這樣的延伸酶。
術語″轉化效率″和″底物轉化百分比″表示特定的酶(例如，去飽和酶或延伸酶)可以將底物轉化成產物的效率。轉化效率是按照以下公式計算的([產物]/[底物+產物])*100，其中′產物′包括產生它的途徑上的中間產物和所有產物。
術語″含油的″表示傾向於以脂類形式儲存它們的能源的生物(Weete，InFungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。一般，所述微生物的細胞PUFA含量遵循S形曲線，其中，脂類的濃度增加，直到在後對數期或早期靜止生長期的最大值，然後在晚期靜止期和死亡期逐漸減少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ，Microbiol.57419-25(1991))。
術語″含油酵母″表示被分類為酵母的微生物，它們能夠積累佔幹細胞重量至少25％的油。含油酵母的例子包括，但不局限於以下屬耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
術語″可發酵的碳源″表示微生物能夠代謝以便產生能量的碳源。本發明的典型的碳源包括，但不局限於單糖，寡糖，多糖，鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸鹽或酯以及含碳的胺。
術語″密碼子優化的″表示用於轉化各種宿主的核酸分子的基因或編碼區時，表示在所述核酸分子的基因或編碼區中的密碼子的改變，以便體現宿主生物的典型的密碼子選擇，而又不改變由所述DNA所編碼的多肽。在本發明的範圍內，基因和DNA編碼區是利用在表4中收集的信息進行密碼子優化的，以便在耶氏酵母菌中進行最佳表達。
在本文中，″分離的核酸片段″是單鏈或雙鏈RNA或DNA，它任選包括合成的，非天然的或改變了的核酸鹼基。DNA聚合物形式的分離的多核酸片段可能由一個或多個cDNA，基因組DNA或合成DNA的片段組成。
胺基酸或核苷酸序列的″主要部分″是包括多肽的一定數目的胺基酸序列或基因的核苷酸序列的部分，所述數目足夠通過本領域技術人員對所述序列進行的人工評估，或通過計算機自動化的序列比較，以及使用諸如BLAST的算法的鑑定(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215403-410(1993)而推測性地鑑定該多肽或基因。一般，核苷酸序列的″主要部分″包括足夠的序列(例如，20-30個連續的核苷酸)，以便特異性地鑑定和/或分離包括所述序列的核酸片段。本說明書披露了編碼一種或多種特定蛋白的部分或全部核苷酸序列。技術人員利用本文所提供的序列，可以將所披露序列的全部或主要部分用於本領域技術人員所公知的目的。因此，本發明包括在所附序列表中所提供的完整的序列，以及如上文所定義的這些序列的主要部分。
術語″互補的″被用於表示能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的相互關係。例如，對於DNA來說，腺嘌呤互補於胸腺嘧啶，而胞嘧啶互補於鳥嘌呤。因此，本發明還包括分離的核酸片段，它互補於在所附序列表中提供的完整序列，以及基本上類似的核酸序列。
″密碼子簡併性″表示遺傳密碼的性質，它允許改變核苷酸序列，而又不影響所編碼的多肽的胺基酸序列。技術人員在用核苷酸密碼子表示特定胺基酸時充分理解由特定宿主細胞所表現出來的″密碼子偏倚″。因此，在合成用於改善在宿主細胞中的表達的基因時，需要設計所述基因，以便它的密碼子選擇的頻率接近宿主細胞的優選密碼子選擇的頻率。
表示DNA序列的″化學合成的″表示組成核苷酸是在體外組裝的。DNA的人工化學合成，可以通過使用業已建立的方法完成；或可以利用多種商業化儀器中的一種進行自動化的化學合成。″合成基因″可以由寡核苷酸基本單位組裝，它們是利用本領域技術人員所公知的方法化學合成的。將這些基本單位連接在一起並且退火，以便形成基因片段，然後酶促組裝，以便構建完整的基因。因此，可以對基因進行修飾，以便根據核苷酸序列的優化優化基因表達，以便體現宿主細胞的密碼子偏倚。如果密碼子選擇偏向宿主優選的密碼子，技術人員可以理解成功的基因表達的可能性。優選密碼子的確定可以根據對來自宿主細胞的基因的檢查，其中，可以獲得序列信息。
″基因″表示能表達特定蛋白的核酸片段，包括位於編碼序列前面(5′非編碼序列)和後面(3′非編碼序列)的調控序列。″天然基因″表示天然與它自身的調控序列一起出現的基因。″嵌合基因″表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的調控和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來自不同來源的調控序列和編碼序列，或來自相同的來源，但是以不同於天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。″內源基因″表示存在於生物基因組上的天然位置上的天然基因。″外源″基因表示正常情況下不存在於宿主生物中，而是通過基因轉移導入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。″轉基因″是業已通過轉化方法導入所述基因組的基因。″密碼子優化的基因″是具有經過設計以便模擬宿主細胞的優選的密碼子選擇頻率的密碼子選擇頻率的基因。
″編碼序列″表示編碼特定胺基酸序列的DNA序列。″合適的調控序列″表示位於編碼序列上遊(5′非編碼序列)，序列內，或下遊(3′非編碼序列)的核苷酸序列，並且，它能影響相關編碼序列的轉錄，RNA加工或穩定性，或翻譯。調控序列可以包括啟動子，翻譯前導序列，內含子，聚腺苷酸化識別序列，RNA加工位點，效應物結合位點和莖-環結構。
″啟動子″表示能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般，編碼序列位於啟動子序列的3′側。啟動子可能完全來自天然基因，或者由來自天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領域技術人員可以理解的是，不同的啟動子能夠指導基因在不同的組織或細胞類型中的表達，或者在發育的不同階段的表達，或者對不同的環境或生理學條件作出反應的表達。能導致基因在大多數細胞類型中在大多數時間表達的啟動子通常被稱作″組成型啟動子″。還應當理解的是，由於在大多數場合下，調控序列的確切邊界未能完全確定，不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。
術語″3′非編碼序列″或″轉錄終止子″表示位於編碼序列下遊的DNA序列。它包括聚腺苷酸化識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調控信號的其他序列。聚腺苷酸化信號通常以影響聚腺苷酸添加在mRNA前體的3′末端為特徵。所述3′區能夠影響相關編碼序列的轉錄，RNA加工或穩定性，或翻譯。
″RNA轉錄物″表示由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄而得到的產物。當RNA轉錄物是所述DNA序列的完整的互補拷貝時，它被稱作初級轉錄物，或者它可以是來自初級轉錄物的轉錄後加工的RNA序列，並且被稱作成熟的RNA。″信使RNA″或″mRNA″表示沒有內含子，並且能夠由細胞翻譯成蛋白的RNA。″cDNA″表示雙鏈DNA，它是互補於mRNA並且由mRNA衍生的。″有義″RNA表示包括mRNA，並能夠由細胞翻譯成蛋白的RNA轉錄物。″反義″RNA表示互補於靶初級轉錄物或mRNA的全部或部分的RNA，並且它能抑制靶基因的表達(U.S.5,107,065；WO 99/28508)。反義RNA的互補性可以是與特定基因轉錄物的任何部分，即，位於5′非編碼序列，3′非編碼序列，或編碼序列互補的。″功能性RNA″表示反義RNA，核酶RNA，或不能翻譯，但仍然能影響細胞加工的其他RNA。
術語″可操作地連接的″表示核酸序列締合在一個核酸片段上，以便其中一個的功能受到另一個的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時，它就是與該編碼序列可操作地連接的(即，所述編碼序列受所述啟動子的轉錄控制)。編碼序列能夠沿有義或反義方向可操作地與調控序列連接。
在本文中，術語″表達″表示來自本發明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定積累。表達還可以表示mRNA翻譯成多肽。
″成熟″蛋白表示翻譯後加工的多肽；即，業已除去了存在於初級翻譯產物中的所有前肽或原肽的蛋白。″前體″蛋白表示mRNA翻譯的初級產物；即，仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是(但不局限於)細胞內定位信號。
″轉化″表示將核酸分子轉入宿主生物，導致了遺傳學穩定的遺傳性。例如，核酸分子可以是能自主複製的質粒；或者它可以整合到宿主生物的基因組中。包括轉化的核酸片段的宿主生物被稱作″轉基因″或″重組″或″轉化過的″生物。
術語″質粒″，″載體″和″盒″表示染色體外元件，它通常攜帶有不是細胞的中央代謝部分的基因，並且通常是環狀雙鏈DNA片段形式的。所述基因可以是自主複製的序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環狀的單或雙鏈DNA或RNA，可以來自任何來源，其中，多個核苷酸序列業已連接或重組成獨特的結構，它能夠將啟動子片段和選定的基因產物的DNA序列，以及合適的3′非翻譯序列導入細胞。
″轉化盒″表示包括外源基因，並且除了外源基因之外還具有能促進在特定宿主細胞中轉化的元件的特定載體。″表達盒″表示包括外源基因，並且除了外源基因之外，還具有能夠增強基因在外源宿主中表達的元件的特定載體。
術語″改變了的生物學活性″表示與由核苷酸序列編碼的蛋白相關的活性，它可以通過測定方法測定，其中，所述活性大於或小於與天然序列相關的活性。″增強了的生物學活性″表示大於與天然序列相關的活性的改變了的活性。″減弱了的生物學活性″是小於與天然序列相關的活性的改變了的活性。
術語″序列分析軟體″表示可用於分析核苷酸或胺基酸序列的任何計算機算法或軟體程序。″序列分析軟體″可以是通過商業渠道獲得的或者獨立開發的。典型的序列分析軟體包括，但不局限於1.)GCG程序組(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4.)採用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PlenumNew York，NY)。在本申請的範圍內應當理解的是，在將序列分析軟體用於分析時，分析的結果是基於有關程序的″預設值″的，除非另有說明。在本文中，″預設值″表示任何組的值或參數，它是在初次初始化時最初隨所述軟體加載的。
本發明所使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的，並且披露於以下文獻中Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)(此後稱作″Maniatis″)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor LaboratoryColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等，Current ProtocolsinMolecular Bioloqy，由Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)出版。
脂肪酸的微生物生物合成一般，在含油微生物中的脂類的積累是反應於存在於生長培養基中的總的碳與氮的比例引發的。當細胞耗盡了可利用的氮源時(例如，當碳與氮的比例超過大約40時)，細胞一磷酸腺苷(AMP)的消耗，導致了線粒體中AMP-依賴型異檸檬酸脫氫酶活性的終止和檸檬酸的積累，並且將檸檬酸轉移到細胞質，並且隨後通過ATP-檸檬酸裂解酶裂解，產生乙醯-CoA。乙醯-CoA是脂肪酸從頭合成的主要基本單位。儘管任何能夠有效代謝產生乙醯-CoA的化合物都可用作脂肪酸的前體，葡萄糖是這種類型反應中的主要碳源。通過糖酵解將葡萄糖轉化成丙酮酸，並且然後將丙酮酸轉入線粒體，在這裡，它能夠通過丙酮酸脫氫酶轉化成乙醯-CoA。由於乙醯-CoA不能直接通過線粒體膜轉入細胞質，乙醯-CoA上的兩個碳與草醯乙酸縮合，以便產生檸檬酸(通過檸檬酸合酶催化)。檸檬酸被直接轉入細胞質，在這裡，它被ATP-檸檬酸酶裂解，以便再生乙醯-CoA和草醯乙酸。草醯乙酸通過轉化成蘋果酸重新進入三羧酸循環。
丙二醯-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一個關鍵步驟，它是在細胞質中進行的。丙二醯-CoA是通過乙醯-CoA羧化酶催化由乙醯-CoA的羧化產生的。脂肪酸合成是通過多種酶脂肪酸合酶複合物(″FAS″)催化的，並且通過八種二碳片段(來自乙醯-CoA的乙醯基團)的縮合進行，以便形成16-碳飽和脂肪酸棕櫚酸。更具體地講，FAS催化一系列的7個反應，該系列包括以下反應(Smith，S.FASEB J，8(15)1248-59(1994))1.乙醯-CoA和丙二醯-CoA被轉移到FAS的醯基載體肽(ACP)上。所述乙醯基團然後被轉移到丙二醯基團上，形成β-酮丁醯基-ACP，並且釋放CO2。
2.所述β-酮丁醯基-ACP發生還原(通過β-酮醯基還原酶)和脫水(通過β-羥醯基脫水酶)，以便形成反式-單不飽和的脂肪醯基。
3.通過NADPH還原雙鍵，產生比最初的基團長兩個碳原子的飽和脂肪醯基。然後再生了丁醯基-基團與新的丙二醯基團縮合，並且重複所述延伸過程的能力。
4.當脂肪醯基變成16個碳原子長時，硫酯酶活性水解它，釋放游離的棕櫚酸。
棕櫚酸(16:0)是長鏈飽和和不飽和脂肪酸(例如，硬脂酸(18:0)，棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1))的前體，通過存在於內質網膜中的延伸酶和去飽和酶的作用產生棕櫚酸。通過Δ9去飽和酶的作用分別將棕櫚酸和硬脂酸轉化成它們的不飽和衍生物，即棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)。
三醯基甘油(脂肪酸的主要儲存單位)是通過將兩個分子的醯基-CoA酯化成甘油-3-磷酸產生1，2-磷酸二醯基甘油的(通常被稱為磷脂酸)。然後通過磷脂酸磷酸酶除去磷酸，以便得到1，2-二醯基甘油。三醯基甘油是通過二醯基甘油-醯基轉移酶的作用添加第三個脂肪酸形成的。
Ω脂肪酸的生物合成簡單地講，將LA轉化成GLA，DGLA和ARA(ω-6途徑)和ALA轉化成STA，ETA，EPA，DPA和DHA(ω-3途徑)的代謝過程涉及通過添加碳原子延長碳鏈，和通過添加雙鍵使分子去飽和(圖1)。這需要存在於內質網膜中的一系列特殊去飽和和延伸酶。
ω-6脂肪酸通過Δ12去飽和酶的作用將油酸轉化成LA(18:2)，它是ω-6脂肪酸的第一個。按以下方法產生後續的ω-6脂肪酸1.)通過Δ6去飽和酶的活性將LA轉化成GLA；2.)通過延伸酶的作用將GLA轉化成DGLA；和3.)通過Δ5去飽和酶的作用將DGLA轉化成ARA。
ω-3脂肪酸通過Δ15去飽和酶的作用將亞油酸(LA)轉化成ALA，即ω-3脂肪酸的第一個。通過一系列類似於ω-6脂肪酸的步驟產生後續的ω-3脂肪酸。具體地講1.)通過Δ6去飽和酶的活性將ALA轉化成STA；2.)通過延伸酶的活性將STA轉化成ETA；和3.)通過Δ5去飽和酶的活性將ETA轉化成EPA。另外，ETA和EPA可以通過Δ17去飽和酶的活性分別由DGLA和ARA產生。還可以通過延伸酶和Δ4去飽和酶的活性進一步將EPA轉化成DHA。
與Ω脂肪酸生產相關的基因很多微生物，包括藻類，細菌，黴菌和酵母都可以通過正常細胞代謝過程合成PUFAs和ω脂肪酸。進行過充分研究的是包括Schizochytrium aggregatm，破囊壺菌屬的種和高山被孢菌在內的真菌。很多溝鞭藻類(Dinophyceaae)都能天然產生高濃度的PUFAs。因此，業已通過遺傳學方法鑑定了與油類產生相關的多個基因，並且某些基因的DNA序列可以公開獲得(非限定性例子如下面的表2所示)表2某些可公開獲得的與PUFA生產相關的基因
另外，專利文獻提供了與PUFA生產相關的很多其他基因的DNA序列(和/或與上述若干基因相關的細節以及它們的分離方法)。例如，參見U.S.5,968,809(Δ6去飽和酶)；U.S.2003/0196217A1(Δ17去飽和酶)；U.S.5,972,664和U.S.6,075,183(Δ5去飽和酶)；WO 91/13972和U.S.5,057,419(Δ9去飽和酶)；WO 93/11245(Δ15去飽和酶)；WO 94/11516，U.S.5,443,974和WO 03/099216(Δ12去飽和酶)；WO 02/090493(Δ4去飽和酶)；和WO 00/12720和U.S.2002/0139974A1(延伸酶)。上述每一份專利和專利申請都以它們的全文形式收作本文參考。
正如本領域技術人員所了解的，導入用於生產特定的PUFA最終產物的宿主生物所需要的特殊功能，取決於宿主細胞(以及它的天然PUFA譜和/或去飽和酶譜)，底物的可利用性和需要的最終產物。正如在共同未決的美國臨時申請60/467677(被以全文形式收作本文參考)所披露的以及在圖1中所示出的，LA，GLA，DGLA，ARA，ALA，STA，ETA，EPA，DPA和DHA都可以在含油酵母中生產，這是通過導入以下PUFA酶功能的各種組合Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶。根據可公開獲得的文獻(例如，GenBank)，專利文獻，以及對具有生產PUFAs的能力的微生物進行的實驗分析，本領域技術人員能夠鑑定編碼上述每一種酶的各種候選基因。所述序列可來自任何來源，例如，從天然來源中分離(從細菌，藻類，真菌，植物，動物等中分離)，通過半合成途徑生產，或從頭合成。不過，正如本領域技術人員所了解的，異源基因能夠以不同的效率在不同的宿主中表達。因此，因此選擇特定的去飽和酶或延伸酶能夠優化ω-3和/或ω-6PUFA生產，它在異源宿主中的表達水平優選與其他去飽和酶或延伸酶在感興趣的宿主生物中的表達水平相關。
儘管導入宿主的去飽和酶和延伸酶基因的特定來源並不重要，選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的考慮因素包括1.)所述多肽的底物特異性；2.)所述多肽或它的成分是否是限速酶；3.)所述去飽和酶或延伸酶是否是合成需要的PUFA所必需的；和/或4.)所述多肽所需要的輔助因子。所表達的多肽優選具有與它在宿主細胞中的部位的生物化學環境相容的參數。例如，所述多肽可能必須與宿主細胞中的其他酶競爭底物。因此，在確定特定多肽修飾PUFA在特定宿主細胞中的生產的合適性時，需要考慮KM和所述多肽比活性的分析。用於特定宿主細胞中的多肽是這樣的多肽，它能在存在於預期宿主細胞中的生物化學條件下起作用，但原本可以是具有能夠修飾需要的PUFA的具有去飽和酶或延伸酶活性的任何多肽。
不過，對於本發明的研究來說，其中，最終目的是培育能積累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油類的含油酵母，需要鑑定具有去飽和酶和延伸酶活性的能夠在含油酵母中相對有效地起作用的多肽。因此，在含油酵母中表達各種去飽和酶和延伸酶，並且在底物-補給實驗中篩選它們產生ω-3和/或ω-6脂肪酸的能力。一旦鑑定了合適的酶(根據底物轉化的總百分比)，就對這些基因進行下文所述的密碼子優化技術，以便進一步優化每一種酶在其他含油酵母宿主中的表達。這能夠使ω-3和/或ω-6脂肪酸的產量最大化。
本領域技術人員了可以理解的是，在本文中被選擇用於密碼子優化的特殊的PUFA基因僅僅是代表性的，而不是要限定本發明的範圍；可以對來自各種來源的多種其他異源去飽和酶(具有Δ4，Δ5，Δ6，Δ9，Δ12，Δ15和/或Δ17去飽和酶活性)和延伸酶可以進行密碼子優化，以便增強它們在含油酵母宿主中的表達。
對Ω脂肪酸基因進行密碼子優化以便在含油酵母中表達正如本領域技術人員所公知的，使用宿主優選的密碼子能夠顯著增強編碼多肽的外源基因的表達。一般，可以在特定的感興趣的宿主物種中確定宿主優選的密碼子，包括檢查蛋白中的密碼子選擇(優選大量表達的蛋白)，並且確定哪些密碼子是以最高頻率使用的。然後，可以使用在所述宿主物種中優選的密碼子完成或部分合成具有去飽和酶或延伸酶活性的感興趣的多肽的編碼序列。因此，優化在感興趣的特定宿主生物中表達的基因的方法通常需要以下步驟a)獲得感興趣的特定宿主生物的核苷酸編碼區和相應的多肽的序列，以便形成密碼子資料庫；b)分析所述密碼子資料庫，以便確定哪些密碼子優先編碼每一種胺基酸；c)獲得要在感興趣的特定宿主生物中表達的基因的序列(例如，去飽和酶或延伸酶)；d)用步驟(b)的優選的密碼子取代步驟(c)的序列中的非優選密碼子，其中，所述基因是密碼子優化的，以便在感興趣的特定宿主生物中表達。
也可以合成所述DNA的全部(或部分)，以便除去可能出現在轉錄的mRNA上的任何去穩定化序列或二級結構區。還可以合成所述DNA的全部(或部分)，以便改變將鹼基組成改變成在需要的宿主細胞中更優選形式。
對於本發明來說，需要修飾編碼具有PUFA去飽和酶和延伸酶活性的要在外源宿主中表達的特定多肽的密碼子的一部分，以便修飾過的多肽使用替代宿主(即，含油酵母)所優選的密碼子。具體地講，需要修飾編碼具有Δ17去飽和酶活性，Δ6去飽和酶活性和延伸酶活性的多肽的密碼子的一部分，以便增強基因在解脂耶氏酵母中的表達。因此，確定了解脂耶氏酵母的密碼子選擇譜，參見表4(實施例3)。另外，業已發現，翻譯起始密碼子′ATG′周圍的核苷酸序列能影響在酵母細胞中的表達。如果多肽在酵母中的表達較差，就可以修飾外源基因的核苷酸序列，以便包括有效的酵母翻譯起始序列，以便獲得最佳基因表達。因此，為了進一步優化在解脂耶氏酵母中的基因表達，還確定了′ATG′起始密碼子周圍的共有序列(圖4；SEQ ID NO122)。
根據解脂耶氏酵母密碼子選擇譜和′ATG′起始密碼子周圍的共有序列，修飾了Δ17去飽和酶基因，Δ6去飽和酶基因和延伸酶基因的核酸序列，以便使用宿主優選的密碼子。更具體地講，選擇高山被孢黴(ATCC#16266)Δ6去飽和酶(GenBank登錄號AF465281；U.S.5,968,809)導入將LA轉化成GLA和/或將ALA轉化成STA的酶促活性。這種野生型去飽和酶具有457個胺基酸(SEQ ID NO2)，並且推測的分子量為51.8kD；在本發明產生的密碼子優化的基因上，對1374bp編碼區(相當於144個密碼子)上的152bp進行密碼子優化，並且修飾翻譯起始位點。用類似方法，選擇野生型異絲水黴(ATCC#56851)Δ17去飽和酶(SEQ ID NO4；U.S.2003/0196217A1)，以便導入將DGLA轉化成ETA和/或將ARA轉化成EPA的酶促活性；不過，修飾翻譯起始位點，並且對1077bp編碼區(包括117個密碼子)的127bp進行密碼子優化。最後，選擇野生型高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶(GenBank登錄號AX464731；WO 00/12720)，具有318個胺基酸(SEQ ID NO6)，並且推測的分子量為40.5kD，優化它在含油酵母中的表達，以便將GLA轉化成DGLA，將STA轉化成ETA和/或將EPA轉化成DPA。具體地講，對957bp編碼區(相當於85個密碼子)的94bp進行密碼子優化，並且修飾翻譯起始位點。因此，本發明包括合成的密碼子優化的基因的完整序列，正如在所附序列表中所示出的，這些完整序列的互補序列，以及這些序列的主要部分。
技術人員了可以理解的是，本文所披露的優化方法同樣可應用於其他基因(例如，在ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的基因)，並且對異絲水黴Δ17去飽和酶和高山被孢黴Δ6去飽和酶和高山被孢黴延伸酶的調節僅僅是示例的。
通過基因突變優化密碼子優化的基因儘管密碼子優化是體內生產分別具有去飽和酶或延伸酶活性，在體內具有在含油酵母中起作用的更理想的物理和動物學參數的多肽的有用方法，還可利用其他方法進一步增強多肽在宿主細胞中的活性。具體地講，用於合成序列並且將這些序列組合在一起的方法在文獻中業已完善。例如，體外誘變和選擇，定點誘變，易錯PCR(Melnikov等，Nucleic Acids Research，27(4)1056-1062(February 15，1999))，″基因改組″或其他方法可用於獲得天然存在的或密碼子優化的去飽和酶或延伸酶基因的突變。這樣使得能夠生產去飽和酶或延伸酶多肽，它們分別具有，例如更長的半衰期或需要的PUFA在體內生產的更高速度。
如果需要，對酶促活性重要的密碼子優化的去飽和酶或延伸酶多肽的區可以通過常規誘變，所得到的突變多肽的表達以及確定它們的活性而確定。突變體可以包括缺失，插入或點突變，或它們的組合。典型的功能性分析始於缺失誘變，以便確定功能所需要的蛋白的N-末端和C-末端限制，然後進行內部缺失，進行插入或點突變，以便進一步確定功能所需要的區。還可以使用其他技術，如盒誘變或完全合成。例如，缺失誘變是通過使用核酸外切酶依次去掉5′或3′編碼區實現的。可以獲得用於這種技術的試劑盒。在缺失之後，在5′或3′缺失之後通過將包括起始或終止密碼子的寡核苷酸分別連接在缺失的編碼區上獲得所述編碼區。另外，通過各種方法將編碼起始或終止密碼子的寡核苷酸插入所述編碼區，包括定點誘變，誘變PCR或通過連接到在現有限制位點上消化過的DNA上。內部缺失同樣可以通過多種方法實現，包括使用DNA上的現有限制位點，通過使用誘變引物進行定點誘變或誘變PCR。插入是通過諸如接頭-掃描誘變，定點誘變或誘變PCR的方法完成的。點突變是通過諸如定點誘變或誘變PCR的技術完成的。
還可將化學誘變用於鑑定對活性重要的去飽和酶或延伸酶多肽區。表達突變的構建體，並且測定所得到的改變了的蛋白作為去飽和酶或延伸酶的能力。這種結構-功能分析，可以確定哪些區可以缺失，哪些區能夠承受插入，以及哪些點突變使得突變的蛋白能夠以基本上與天然(或密碼子優化的)的去飽和酶或延伸酶相同的方式起作用。
ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產與從諸如魚或植物的天然來源中純化相比具有若干優點。例如1.)已知與高等生物相比，很多微生物具有大大簡化了的油類組成，使得對需要成分的純化更容易；2.)微生物生產不容易出現由外部因素導致的波動，如天氣和食物供應；3.)微生物生產的油基本上不會受到環境汙染物的汙染；4.)微生物能夠以可能具有特殊用途的特定形式提供PUFAs；和，5.)微生物油類生產可以通過控制培養條件操縱，特別是通過提供用於微生物表達的酶的特定底物，或通過添加化合物或通過遺傳工程手段抑制不希望的生物化學途徑。
除了上述優點之外，用重組微生物生產ω-3和/或ω-6脂肪酸，提供了通過在宿主中提供新的生物合成途徑或通過抑制不希望的途徑而改變天然存在的微生物脂肪酸特性的能力，從而提高需要的PUFAs，或它的綴合形式的水平，以及降低不需要的PUFAs的水平。例如，可以改變所生產的ω-3與ω-6脂肪酸的比例，專門生產ω-3或ω-6脂肪酸，同時消除其他ω脂肪酸的生產，或工程生產特定PUFA，而又沒有其他PUFA下遊或上遊產物的大量積累。
表達系統，盒和載體本發明所披露的序列的密碼子優化的基因和基因產物可以在異源微生物宿主細胞中生產，特別是在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)的細胞中生產。在重組微生物宿主中的表達，可用於生產各種PUFA途徑中間產物，或用於調控業已存在於宿主中的PUFA途徑，以便利用所述宿主合成迄今為止不可能的新的產物。
包括能指導外源蛋白高水平表達的調控序列的微生物表達系統和表達載體是本領域技術人員所熟知的。它們都可用於構建嵌合基因，以便生產本發明密碼子優化的序列的任何基因產物。然後可以通過轉化將所述嵌合基因導入合適的微生物，以便提供所編碼酶的高水平表達。
因此，預計導入受合適啟動子控制的編碼PUFA生物合成途徑(例如，本文所披露的密碼子優化的Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶，和延伸酶)的嵌合基因，會導致ω-3和/或ω-6脂肪酸產量的增加。預計，可將它用於在宿主微生物中表達本發明密碼子優化的基因的各種組合。
另外，預計除了本文所披露的一種或多種密碼子優化的基因之外，所述載體還可以包括編碼其他酶的一種或多種基因。例如，可能需要構建的表達盒包括編碼下列一種或多種酶促活性的基因Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶(其中，上述任何基因可任選進行密碼子優化，以便增強在特定生物宿主中的表達)。正如本領域所公知的，在特定表達盒中所包含的特定基因取決於宿主細胞(以及它的PUFA譜和/或去飽和酶譜)，底物的可利用性和需要的最終產物。
這樣，本發明涉及生產PUFAs的方法，包括讓脂肪酸底物與本文所披露的PUFA酶接觸，以便將所述底物轉化成需要的脂肪酸產物。因此，可以將本文所披露的每一種PUFAs基因和相應的酶產物直接或間接用於生產PUFAs。PUFAs的直接生產是這樣進行的，將脂肪酸底物直接轉化成需要的脂肪酸產物，而沒有任何中間步驟或中間途徑。例如，EPA能夠在能產生或提供了ARA的宿主細胞中進行，包括向所述細胞中添加或導入能提供Δ17去飽和酶活性的表達盒。
相反，編碼PUFA生物合成途徑的多個基因可以組合使用，以便發生一系列反應，以便產生需要的PUFA。例如，編碼延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶和Δ4去飽和酶活性(其中每一種基因任選進行密碼子優化，以便在宿主細胞中表達)的表達盒使得宿主細胞天然產生GLA，而不是產生DHA(以便通過延伸酶將GLA轉化成DGLA；然後可以通過Δ5去飽和酶將DGLA轉化成ARA；然後通過Δ17去飽和酶將ARA轉化成EPA，再通過延伸酶將後者轉化成DPA；和通過Δ4去飽和酶將DPA轉化成DHA)。在優選實施方案中，其中，宿主細胞是含油酵母，編碼PUFA生物合成所必需的每一種酶的表達盒都需要導入所述生物，因為在這些生物中天然產生的PUFAs局限於18:2脂肪酸(即，LA)，並且更不常見的是18:3脂肪酸(即，ALA)。另外，可能需要底物補給。
用於轉化合適的宿主細胞的載體或DNA盒為本領域所公知。存在於所述構建體中的序列的具體選擇取決於需要的表達產物(同上)、宿主細胞的性質以及推薦的分離轉化細胞與未轉化細胞的方式。不過，通常，所述載體或盒包括指導相關基因轉錄和翻譯的序列，選擇標記，和使得它能夠自主複製或染色體整合的序列。合適的載體包括所述基因的5′區，它控制轉錄起始，和DNA片段的3′區，它控制轉錄終止。最優選的是，當兩個控制區都來自轉化過的宿主細胞的基因時是最優選的，不過，可以理解的是，所述控制區不一定來自被選擇用作生產宿主的特定物種的天然基因。
可用於在需要的宿主細胞中驅動去飽和酶和/或延伸酶ORFs表達的起始控制區或啟動子是多種多樣的，並且為本領域技術人員所熟知。實際上，能夠指導這些基因在選定的宿主細胞中表達的任何啟動子都適合本發明。在宿主細胞中的表達能夠以瞬時或穩定的方式進行。瞬時表達可以通過誘導可操作地連接在感興趣的基因上的可調控啟動子的活性而實現。穩定表達可以通過使用可操作地與感興趣的基因連接的組成型啟動子而實現。例如，當宿主細胞是酵母時，提供能夠在酵母細胞中起作用的轉錄和翻譯區，特別是來自宿主物種的那些。例如，轉錄起始調控區可以從以下渠道獲得1.)糖酵解途徑上的基因，如醇脫氫酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(參見美國專利申請號60/482263)，磷酸甘油變位酶(參見美國專利申請號60/482263)，果糖二磷酸醛縮酶(參見美國專利申請號60/519971)，磷酸葡萄糖異構酶，磷酸甘油酸激酶等；或2.)可調控的基因，如酸性磷酸酶，乳糖酶，金屬硫蛋白，葡糖澱粉酶，翻譯延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)，核糖體蛋白S7(U.S.6,265,185)等。可以使用多種調控序列中的任意一種，這取決於是需要組成型轉錄還是誘導型轉錄，啟動子在表達感興趣的ORF方面的效率，以及構建的方便性等。
通過修飾外源基因的翻譯起始密碼子′ATG′周圍的核苷酸序列，以便它們包括有效的酵母翻譯起始序列可以在酵母中獲得最佳基因表達。具體地講，可以通過定點誘變增加低效表達的基因的表達，其中，所述低效表達的基因與內源酵母基因框內融合，優選與高表達的基因融合。另外，正如本發明中在解脂耶氏酵母中所證實的，可以確定宿主中的共有翻譯起始序列，並且通過工程手段將該序列結合到異源基因上，以便它們在感興趣的宿主中實現最佳表達。
終止區可源於所述基因的3′區，所述起始區是從該基因上獲得的或者從不同的基因上獲得的。大量終止區是已知的，並且能在多種宿主中發揮令人滿意的作用(當在與產生它們的相同和不同的屬和種中使用時)。終止區通常在更大程度上是根據方便性選擇的，而不是因為任何特殊特性。優選的是，終止區源於酵母基因，特別是糖酵母屬，裂殖酵母屬，假絲酵母屬，耶氏酵母屬或克羅維酵母屬。同樣已知編碼γ-幹擾素和α-2幹擾素的哺乳動物基因的3′-區在酵母中起作用。終止控制區還可以來自優選宿主天然具有的各種基因。終止位點可以任選是必需的；不過，如果具有，它是最優選的。
正如技術人員所了解的，僅僅將基因插入克隆載體，不能確保它能夠在需要的水平上成功地表達。根據對高表達速度的需要，業已通過操縱多種不同的遺傳因子產生了多種特化的表達載體，這些遺傳因子能控制來自宿主細胞的轉錄，翻譯，蛋白穩定性，含氧極限，以及從宿主的分泌。更具體地講，業已對某些分子特徵進行了操作，以便控制基因表達，包括1.)相關轉錄啟動子和終止子序列的性質；2.)克隆基因的拷貝數量以及所述基因是質粒攜帶的或者是整合到宿主細胞的基因組上的；3.)合成的外源蛋白的最終細胞定位；4.)宿主生物的翻譯效率；和5.)克隆的基因蛋白在宿主細胞中的內在穩定性。上述每一種類型的修飾包括在本發明中，作為進一步優化密碼子優化的PUFA生物合成途徑酶表達的手段。
微生物宿主的轉化一旦獲得了適合在含油酵母中表達的編碼密碼子優化的去飽和酶或延伸酶多肽的DNA，將它放入能夠在宿主細胞中自主複製的質粒載體上，或者將它直接整合到宿主細胞的基因組上。表達盒的整合可以在宿主基因組中隨機地進行，或者可以通過使用含有與宿主基因組具有足夠同源性以靶定宿主基因座內的重組的區域的構建體靶定。當所述構建體被靶定於內源基因座時，轉錄和翻譯調控區的全部或某些可以通過內源基因座提供。
當兩個或兩個以上的基因由獨立的複製載體表達時，希望每一個載體具有不同的選擇方式，並且應當缺少與其他構建體的同源性，以便保持穩定表達，並且防止構建體之間的元件的重新分類。對調控區，選擇方式和導入的構建體的繁殖方法的明智的選擇，可以通過實驗確定，以便所有導入的基因在需要的水平上表達，以便提供需要產物的合成。
可以通過任何標準技術將包括感興趣的基因的構建體導入宿主細胞。所述技術包括轉化(例如，乙酸鋰轉化[Methods in Enzymology，194186-187(1991)])，原生質體融合，bolistic衝擊，電穿孔，顯微注射，或能夠將感興趣的基因導入宿主細胞的任何其他方法。可用於含油酵母(即，解脂耶氏酵母)的更具體的技術包括美國專利號4,880,741和5,071,764和Chen，D.C.等(Appl MicrobiolBiotechnol.48(2)232-235(1997))。
為了方便起見，業已通過任何方法操作以攝入DNA序列(例如，表達盒)的宿主細胞在本文中被稱作″轉化過的″或″重組的″。轉化過的宿主具有至少一個拷貝的表達構建體，並且可以具有兩個或兩個以上拷貝，這取決於所述基因是整合在所述基因組上，擴增的，或者存在於具有多個拷貝的染色體外元件上。轉化過的宿主細胞可以通過選擇包含在導入的構建體上的標記而鑑定。另外，可以將獨立的標記構建體與需要的構建體共同轉化，因為很多轉化技術能將很多DNA分子導入宿主細胞。通常，選擇轉化過的宿主在選擇性培養基上生長的能力。選擇性培養基可以摻入抗生素或缺少未轉化的宿主生長所需要的因子，如養分或生長因子。導入的標記基因可以產生抗生素抗性，或者編碼必須的生長因子或酶，以便當它在轉化過的宿主中表達時能夠在選擇培養基上生長。當所表達的標記蛋白可以直接或間接檢測時，還可以進行轉化宿主的選擇。所述標記蛋白可以單獨表達，或者作為與另一種蛋白的融合體形式表達。標記蛋白可以通過以下方法檢測1.)它的酶促活性(例如，β-半乳糖苷酶可以將底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚基--D-半乳吡喃糖苷]轉化成有顏色的產物；螢光素酶可以將螢光素轉化成發光產物)；或2.)它的產生光或修飾特徵(例如，Aequoreavictoria的綠色螢光蛋白在用蘭色光線照射時會發出螢光)。另外，例如，可將抗生素用於檢測存在於感興趣的蛋白上的標記蛋白或分子量標記。例如，能表達標記蛋白或標記的細胞可以肉眼篩選，或者通過諸如FACS的技術或使用抗生素淘選。為了選擇酵母轉化體，可以使用能夠在酵母中起作用的任何標記。理想的是，對卡那黴素，潮黴素和氨基糖苷G418的抗性是感興趣的，以及在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培養基上生產的能力。
在轉化之後，將適合本發明的密碼子優化的序列的基因產物(並且任選包括在宿主細胞中表達的其他PUFA酶)可以由所述宿主天然地或轉基因地生產，或者它們可以外源提供。
ω-3和/或ω-6脂肪酸在微生物中的生物合成的代謝工程對本發明基因的密碼子優化的序列以及優化其他PUFA基因以便在含油酵母中表達的方法的了解，可用於操作在含油酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成；特別是在解脂耶氏酵母中。這可能需要在PUFA生物合成途徑上的直接的代謝工程或途徑的其他操作，這些操作可以將碳貢獻給PUFA生物合成途徑。可用於操作生物化學途徑的方法為本領域技術人員所公知。
上調需要的生物合成途徑的技術可以將額外拷貝的去飽和酶和延伸酶基因導入宿主，以便提高ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑的產量。去飽和酶或延伸酶基因的表達還可以通過使用較強的啟動子(調控型的或組成型的)而在轉錄水平上加強，以便導致增強了的表達，包括從mRNA或編碼的蛋白上去掉/缺失去穩定化序列，或者向mRNA增加穩定化序列(U.S.4,910,141)。正如本發明所證實的，增強去飽和酶或延伸酶基因表達的另一個途徑是提高所編碼的mRNAs的翻譯效率，包括用能在選定的宿主中優化基因表達的密碼子取代天然基因上的密碼子。
下調不希望的生物合成途徑的技術相反，可以通過基因破壞消除或通過其他方式(例如，反義mRNA)下調與ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑競爭能量或碳的生物化學途徑，或幹擾特定PUFA最終產物產生的天然PUFA生物合成途徑酶。為了進行基因破壞，將外源DNA片段(通常是選擇標記基因)插入要破壞的結構基因，以便破壞它的編碼序列，並因此功能性滅活所述基因。將所述破壞盒轉化入宿主細胞，導致了非通過同源重組用無功能的破壞的基因替代功能性天然基因(例如，參見Hamilton等J.Bacteriol.1714617-4622(1989)；Balbas等Gene 136211-213(1993)；Gueldener等Nucleic Acids Res.242519-2524(1996)；和Smith等Methods Mol.Cell.Biol.5270-277(1996))。
當靶基因的序列已知時，反義是下調基因的另一種方法。為了實現這一目的，克隆了來自所需基因的核酸片段，並且可操作地與啟動子連接，以便RNA的反義鏈能夠轉錄。然後將該構建體導入宿主細胞，並且生產RNA的反義鏈。反義RNA能通過抑制編碼感興趣的蛋白的mRNA的積累，抑制基因表達。本領域技術人員可以理解的是，特殊考慮與使用反義技術相關，以便減弱特定基因的表達。例如，反義基因的適當水平的表達可能需要使用不同的嵌合基因，其中採用本領域技術人員所公知的不同的調控元件。
儘管當序列已知時，定向基因破壞和反義技術提供了下調基因的有效方法，業已開發了不是基於序列的其他特異性更低的方法，例如，細胞可以暴露於UV輻射，然後篩選需要的表型。用化學試劑進行的誘變同樣能有效產生突變體，並且通常使用的物質包括能影響非複製DNA的化學物質(例如，HNO2和NH2OH)，以及能影響複製DNA的試劑(例如，吖啶染料，特別是導致移碼突變)。使用輻射或化學試劑產生突變體的特定方法在現有技術有大量報導。例如，參見Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，2nd ed.(1989)Sinauer AssociatesSunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)。
基因破壞的另一種非特異性方法是使用可轉座元件或轉座子。轉座子是遺傳元件，它能隨機地插入DNA，但是隨後可以根據序列回收，以便確定是否發生了插入。體內和體外轉座轉座方法是公知的。這兩種方法涉及組合使用可轉座元件和轉座酶。當可轉座元件或轉座子在存在轉座酶的條件下與核酸片段接觸時，可轉座元件能隨機地插入所述核酸片段。這種技術可用於隨機誘變，並且用於基因分離，因為受到破壞的基因可以根據可轉座元件的序列鑑定。用於體外轉座的試劑盒可以通過商業渠道獲得[例如，參見1.)The Primer IslandTransposition Kit，可以從Perkin Elmer Applied Biosystems獲得，Branchburg，NJ，基於酵母Ty1元件；2.)The Genome Priming System，可以從New England Biolabs獲得，Beverly，MA，基於細菌轉座子Tn7；和3.)EZTN轉座子插入系統，可以從Epicentre Technologies獲得，Madison，WI，基於Tn5細菌轉座因子]。
在本發明的範圍內，可以通過上述另一種方法將它用於調控脂肪酸生物合成途徑的表達。例如，本發明提供了編碼導致產生ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成途徑上的關鍵酶的密碼子優化的基因。所述密碼子優化的基因包括Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和PUFA延伸酶。特別適用於在含油酵母中表達這些基因，所述酵母天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑，並且調控這些和其他PUFA生物合成基因的表達，以便使用各種方法使優選的PUFA產物的產量最大化，用於宿主生物的代謝工程。同樣，為了用這些基因使PUFA產量最大化，可能需要破壞競爭通向PUFA生物合成的碳流量的途徑。
用於重組表達密碼子優化的基因的優選的細菌宿主用於表達本發明的密碼子優化的基因和核酸片段的宿主細胞可以包括在大範圍的溫度和pH值下，在多種飼料上生長的微生物宿主，所述飼料包括簡單的或複雜的碳水化合物，有機酸和醇，和/或烴。儘管在本發明中所披露的基因是密碼子優化的，以便在含油酵母中表達，特別是在解脂耶氏酵母中表達，預計，由於轉錄，翻譯和蛋白生物合成細胞器是高度保守的，任何細菌，酵母和/或絲狀真菌都是適合表達本發明的核酸片段的宿主。
優選的微生物宿主是含油酵母。這些生物可天然地進行油類合成和積累，所述油包括超過大約25％的細胞乾重，更優選超過大約30％的細胞乾重，最優選超過大約40％的細胞乾重。通常被確定為含油酵母的屬包括，但不局限於耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，典型的油類合成酵母包括類酵母紅冬孢，斯達氏油脂酵母，產油油脂酵母，拉可夫氏假絲酵母，鐵紅假絲酵母，熱帶假絲酵母，產朊假絲酵母，茁芽絲孢酵母，皮狀絲孢酵母，膠粘紅酵母，禾木科紅酵母，和解脂耶氏酵母(以前被劃分為解脂假絲酵母)。
最優選的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其他實施方案中，最優選的是解脂耶氏酵母菌株，被命名為ATCC#20362，ATCC#8862，ATCC#18944，ATCC#76982和/或LGAM S(7)1(Papanikolaou S.，和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)43-9(2002))。
PUFA生產的發酵方法轉化過的微生物宿主細胞是在能優化去飽和酶和延伸酶的活性並且產生最大的和最經濟的優選PUFAs的產量的條件下生長的。一般，可以優化的培養基條件包括碳源的類型和用量，氮源的類型和用量，碳-氮的比例，氧氣含量，生長溫度，pH，生物量生產期的長度，油積累期的長度，以及細胞收穫時間。感興趣的微生物，如含油酵母在複雜培養基(例如，酵母提取物-蛋白腖-葡萄糖培養液(YPD))或缺少生長所必需的成分，以便強制選擇需要的表達盒的特定基本培養基)(例如，Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生長。
本發明的發酵培養基必須包括合適的碳源。合適的碳源包括，但不局限於單糖(例如，葡萄糖，果糖)，二糖(例如，乳糖，蔗糖)，寡糖，多糖(例如，澱粉，纖維素或它們的混合物)，糖醇(例如，甘油)或可更新飼料的混合物(例如，乾酪乳清滲透物，玉米漿，甜菜糖漿，大麥芽)。另外，碳源可以包括鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂，和脂肪酸的各種商業來源，包括植物油(例如，大豆油)和動物脂肪。另外，碳源可以包括一-碳源(例如，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸和含碳胺)，業已證實了其轉化成關鍵生物化學中間產物的代謝轉化。因此，預計，用於本發明的碳源包括可以包括多種含碳源，並且僅僅局限於宿主生物的選擇。儘管上述所有碳源及其混合物預計都適合本發明，優選的碳源是糖和/或脂肪酸。最優選的是葡萄糖和/或含有10-22個碳的脂肪酸。
氮可以由無機(例如，(NH4)2SO4)或有機來源(例如，尿素或穀氨酸)提供。除了合適的碳和氮源之外，發酵培養基必須還包括合適的礦物質，鹽，輔因子，緩衝液，維生素，和本領域技術人員已知的適合微生物生長，並且促進PUFA生產所需要的酶促途徑的其他成分。特別關注若干金屬離子(例如，Mn+2，Co+2，Zn+2，Mg+2)，它們能促進脂類和PUFAs的合成(Nakahara，T.等，Ind.Appl.Single CellOils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本發明的優選的生長培養基是常見的商業製備的培養基，如酵母Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。其他確定的或合成的生長培養基也可以使用，並且適合特定微生物生長的培養基是微生物學或發酵科學領域的技術人員所公知的。用於發酵的合適的pH範圍通常為大約pH4.0-pH8.0，其中pH5.5-pH7.0是起始生長條件的優選範圍。發酵可以在需氧或厭氧條件下進行，其中，微需氧條件是優選的。
通常，高水平PUFAs在含油酵母細胞中的積累，需要兩個階段的過程，因為在脂肪的生長和合成/儲存之間的代謝狀態必須是″平衡的″。因此，最優選的是，需要兩個階段的發酵過程在含油酵母中生產PUFAs。在該方法中，發酵的第一階段被用於製備和積累細胞物質，並且以快速細胞生長和細胞分裂為特徵。在發酵的第二階段，優選在培養物中建立氮剝奪條件，以便促進高水平的脂類積累。這種氮剝奪的作用是降低細胞中AMP的有效濃度，以便減弱線粒體的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶的活性。當出現這種情況時，將積累檸檬酸，因此在細胞質中形成了乙醯-CoA的豐富的資源，並且啟動了脂肪酸合成。因此，這一階段以細胞分裂終止，隨後是脂肪酸的合成和油的積累為特徵。
儘管細胞通常是在大約30℃下生長的，某些研究業已在較低溫度下增加了不飽和脂肪酸的合成(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.57419-25(1991))。根據工藝的經濟學，這種溫度偏移可能在兩個階段的發酵的第一階段之後發生，此時，業已出現了大量的微生物生長。
預計，可以採用多種發酵工藝設計，其中，使用本發明的密碼子優化的基因商業化生產ω脂肪酸是理想的。例如，用重組微生物宿主商業生產PUFAs，可以通過分批發酵，補料-分批發酵活連續發酵工藝生產。
分批發酵工藝是封閉的系統，其中，培養基組成是在工藝開始時確定的，並且不再進行超出在工藝過程中維持pH和氧氣含量需要的進一步補充。因此，在培養過程開始時，用需要的微生物接種所述培養基，並且可以在不向培養基中添加其他來源(即，碳和氮源)條件下具有生長或代謝活性。在分批發酵工藝中，該系統的代謝物和生物量組成經常地改變，直到培養終止。在典型的分批發酵工藝中，細胞從停滯階段發展到高速生長的對數期，並最終達到靜止期，在這裡，生長速度減弱或終止。在不處理的條件下，靜止階段的細胞會最終死亡。標準的分批發酵工藝的變化是補料-分批發酵工藝，其中，在發酵過程中將碳源連續地添加到發酵罐中。補料-分批發酵工藝同樣適用於本發明。當代謝物抑制傾向於抑制細胞代謝或希望在任何時間在培養基中具有有限數量的來源時，補料-分批工藝是有用的。測定補料-分批系統中的碳源是困難的，因此，可以根據可測定因子的變化估算，如pH，溶解氧和廢氣(例如，CO2)的分壓。分批和補料-分批培養方法是本領域技術人員所公知的和熟悉的，並且其例子可以參見以下文獻Thomas D.Brock，BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology.2nd ed.，(1989)Sinauer AssociatesSunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)，在此收作本文參考。
利用本發明的密碼子優化的基因商業化生產ω脂肪酸的方法還可以通過連續發酵工藝實現，其中，將確定成分的培養基連續添加到生物反應器中，同時取出等量的培養物體積，用於產物回收。連續培養通常將細胞保持在恆定細胞密度的對數生長期。連續或半連續培養方法能夠調節會影響細胞生長或最終產物濃度的一種因素或多種因素中的任意一種。例如，一種方法可以限制碳源，並且允許所有其他參數適當地代謝。在其他系統中，可以連續地改變影響生長的多種因素，同時保持通過培養基濁度測定的細胞濃度恆定。連續系統試圖保持穩態生長，因此，細胞生長速度必須與由於將培養基從培養物中排出而導致的細胞減少。調節連續培養工藝的營養成分和生長因子的方法，以及用於增加生產形成速度的技術為工業微生物學領域所熟知，並且上文提到的Brock詳細披露了多種方法。
PUFAs的純化PUFAs可以作為游離脂肪酸形式出現在宿主微生物中，或者以諸如醯基甘油，磷脂，硫脂或醣脂的脂化形式出現，並且可以通過本領域所熟知的多種方法從宿主細胞中提取。酵母脂類的提取技術，品質分析和可接受性標準的一種概述是以下文獻Z.Jacobs(CriticalReviews in Biotechnology 12(5/6)463-491(1992))。有關下遊加工的簡單概述還可以參見A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45271-312(1997))。
一般，純化PUFAs的方法可以包括用有機溶劑萃取，超聲波處理，超臨界流體萃取(例如，使用二氧化碳)，皂化和物理方法，如壓力，或它們的組合。特別感興趣的是用甲醇和氯仿在存在水的條件下萃取(E.G.，Bligh W.J.Dyer，Can.J.Biochem.Physiol。37911-917(1959))。如果需要，可以將含水層酸化，以便使帶負電荷的部分質子化，並因此增加了想得到的產物向有機層中的分配。在萃取之後，可以通過在氮氣流下蒸發除去有機溶劑。當以綴合形式分離時，可以對所述產物進行酶促或化學裂解，以便釋放游離的脂肪酸或感興趣的更低複雜性的綴合物，並且然後可以進行進一步的操作，以便生產需要的最終產物。理想的是，用氫氧化鉀裂解脂肪酸的綴合形式。
如果需要進一步純化，可以採用標準方法。所述方法可以包括萃取，用尿素處理，分級結晶化，HPLC，分級蒸餾，矽膠層析，高速離心或蒸餾，或這些技術的組合。對諸如酸或烯基的活性基團的保護，可以在任何步驟通過已知技術(例如，烷基化，離子化)完成。所使用的方法包括脂肪酸甲基化，以便產生甲酯。類似地，可以在任何步驟除去保護基團。理想的是，純化含有GLA，STA，ARA，DHA和EPA的級份可以通過用尿素處理和/或分級蒸餾實現。
優選實施方案的說明本文所披露的研究工作的最終目的是開發含油酵母，它能積累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油類。為此，必須鑑定ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑的去飽和酶和延伸酶，它能夠在含油酵母中有效地起作用，以便能夠在這些宿主中合成並且積累ω脂肪酸。
在本發明中，申請人證明了適合對去飽和酶和延伸酶基因進行密碼子優化的技術，其中，所得到的合成的密碼子優化的基因能夠以較高的轉化效率在諸如解脂耶氏酵母的含油酵母中起作用。這些方法在本發明的教導中實施，特別是涉及密碼子優化的Δ6去飽和酶(它具有將LA轉化成GLA和/或將ALA轉化成STA的酶促能力)，密碼子優化的Δ17去飽和酶(負責將DGLA轉化成ETA和/或將ARA轉化成EPA)和密碼子優化的高親和力PUFA延伸酶(能夠將GLA轉化成DGLA，將STA轉化成ETA和/或將EPA轉化成DPA)的合成。本領域技術人員能夠方便地將本文所披露的技術用於優化ω-3和/或ω-6生物合成的脂肪酸途徑上的其他基因，以便形成預計在耶氏酵母屬中表達時轉化效率增加的合成基因。因此，本發明的教導具有用於開發能積累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油類的含油酵母的重大用途。
申請人選擇了三種典型的野生型基因用於在模型含油酵母即解脂耶氏酵母中進行密碼子優化。野生型基因中的每一個是從來自Ross產品(Columbus，OH)的質粒中獲得的，參見下面的表3。
表3從Ross產品中獲得的基因和源質粒
在微生物宿主中證實了每一種野生型酶的活性之後(通過底物-補料實驗)，對每一個基因進行密碼子優化(其中，將至少9％的天然密碼子修飾成使用宿主優選的密碼子)。
Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因的密碼子優化首先需要在解脂耶氏酵母中確定密碼子選擇和結構基因標誌。然後設計並且體外合成密碼子優化的基因，使用能顯著縮短合成完整長度的基因序列所需時間量的方法。該方法並不局限於本發明合成的特定基因，因此，應當能廣泛地應用於多種普通用途。與體外基因合成相關的基本步驟由以下步驟組成1.合成多對寡核苷酸(各自的長度為大約100bp)，每一個寡核苷酸序列相當於要合成的完整長度的基因序列的一部分；並且，每一個有義鏈寡核苷酸序列與相應的反義鏈寡核苷酸在該序列的5′末端具有大約4bp的重疊。
2.通過激酶反應將所有寡核苷酸的5′和3′末端磷酸化，然後對每一個對有義和反義鏈寡核苷酸進行各個退火反應，以便生產短的(大約100bp)雙鏈DNA片段。
3.然後將短的(大約100bp)的雙鏈DNA片段的合併物連接在一起，其中使用所述大約4bp的重疊，該重疊部分是根據寡核苷酸的合成設計的，以便得到較長的(大約300-400bp)的DNA片段。
4.在連接之後通過PCR擴增較長的片段，將其產物克隆到合適的載體上，並且轉化入宿主細胞。
5.從宿主細胞中純化含有每一種PCR產物的質粒DNA，然後進行限制酶消化，以便分離相當於要合成的基因的每一個大約300-400bp片段的PCR產物。
6.將要合成的大約300-400bp的基因片段連接在一起，然後進行PCR擴增，以便生產完整長度的合成序列。
在合成密碼子優化的Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因基因之後，各自被分別轉化入解脂耶氏酵母。補料實驗(使用合適的底物)確定了密碼子優化的基因與相應的天然野生型基因相比能夠更有效地在解脂耶氏酵母中表達。具體地講，密碼子優化的Δ6去飽和酶能將比它的野生型對應體多出大約40％的LA轉化成GLA，密碼子優化的Δ17去飽和酶與野生型酶相比能將多出大約2倍的ARA轉化成EPA，並且密碼子優化的高親和力PUFA延伸酶能將多出大約57％的GLA轉化成DGLA，所述酶是在解脂耶氏酵母中在相同的生物學條件下表達的。
實施例本發明還確定了以下實施例。應當理解的是，在這些實施方案中，儘管指明了是本發明的優選實施方案，但是，是以說明形式提供的。通過上述討論和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的實質性特徵，並且，在不超出本發明的構思和範圍的前提下，可以對本發明進行各種改變和改進，以便適應各種用途和條件。
一般方法用於實施例中的標準重組DNA和分子克隆技術為本領域所熟知的，並且披露於以下文獻中1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold SpringHarbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments withGene Fusions；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F.M.等，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-interscience(1987)。
適合微生物培養物維持和生長的材料和方法為本領域所公知。適合在以下實施例中使用的技術可以參見以下文獻Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Philips，Eds)，American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994))；或參見Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbookof Industrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)。用於生長和保持微生物細胞的所有試劑，限制酶和材料都是從Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)獲得的，除非另有說明。
大腸桿菌TOP10細胞和大腸桿菌electromax DH10B細胞是從Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得的。大腸桿菌DH5α的最大效率感受態細胞是從GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)獲得的。大腸桿菌(XL1-Blue)感受態細胞是從Stratagene公司(San Diego，CA)購買的。大腸桿菌菌株通常是在37℃下在Luria Bertani(LB)平板上生長的。
解脂耶氏酵母的亮氨酸營養缺陷型菌株是從美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD；ATCC #76982)購買的，並且用於功能分析。解脂耶氏酵母菌株通常是在28℃下，在YPD瓊脂(1％酵母提取物，2％細菌蛋白腖，2％葡萄糖，2％瓊脂)上生長。為了選擇轉化體，使用基本培養基(0.17％酵母氮基質(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，沒有硫酸銨或胺基酸，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH6.1)。以0.01％的最終濃度添加腺嘌呤，亮氨酸，賴氨酸和/或尿嘧啶的補充物。
按照標準方法(Sambrook等，同上)進行一般分子克隆。寡核苷酸是由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成的。用Stratagene′sQuickChangeTM定點誘變試劑盒進行定點誘變，按照生產商的說明進行。當聚合酶鏈反應(PCR)或定點誘變與亞克隆相關時，對所述構建體進行測序，以便證實沒有將誤差導入所述序列。將PCR產物克隆到Promega′s pGEM-T-easy載體(Madison，WI)上。
遺傳序列的操作是使用可以從Genetics Computer Group Inc.(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)獲得的程序組進行的。使用了所述GCG程序″Pileup″，空位形成預設值為12，空位延伸預設值為4。使用了GCG″Gap″或″Bestfit″程序，預設的空位形成罰分為50，預設的空位延伸罰分為3。除非另有說明，在所有其他場合下，都使用GCG程序的預設參數。
縮寫的含義如下″sec″表示秒，″min″表示分鐘，″h″表示小時，″d″表示天，″μL″表示微升，″mL″表示毫升，″L″表示升，″μM″表示微摩爾，″mM″表示毫摩爾，″M″表示摩爾，″mmol″毫摩爾，″μmole″表示微摩爾，″g″表示克，″μg″表示微克，″ng″表示納克，″U″表示單位，″bp″表示鹼基對，而″kB″表示千鹼基。
實施例1構建適合在解脂耶氏酵母中表達異源基因的質粒構建了質粒pY5，即pINA532(由Dr.Claude Gaillardin饋贈，Insitut National Agronomics，Centre de biotechnologie Agro-Industrielle，laboratoire de Genetique Moleculaire et Cellularie INRA-CNRS，F-78850Thiverval-Grignon，France)衍生物，用於在解脂耶氏酵母中表達異源基因，如圖2所示。
首先，將包括pINA532的ARS18序列和LEU2基因的部分消化的3598bp EcoRl片段亞克隆到pBluescript(Strategene，San Diego，CA)的EcoRl位點上，以便製備pY2。
通過PCR擴增來自解脂耶氏酵母基因組DNA的TEF啟動子(Muller S.，等，Yeast，141267-1283(1998))，用TEF5′(SEQID NO7)和TEF3′(SEQ ID NO8)作引物。PCR擴增是在50μl的總體積中進行的，它包括100ng耶氏酵母屬基因組DNA，含有10mM KCl的PCR緩衝液，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.75)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，100μg/mL BSA(最終濃度)，200μM每一種脫氧核糖核苷三磷酸，10皮摩爾每一種引物和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴增是按以下方法進行的首先在95℃下變性3分鐘，然後進行35輪以下循環95℃1分鐘，56℃30秒，72℃1分鐘。在72℃下進行了10分鐘的最終延伸，然後在4℃下終止反應。將418的PCR產物連接到pCR-Blunt上，以便製備pIP-tef。將pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亞克隆到pY2的BamHI/Smal位點上，以便製備pY4。
使用pINA532作模板，用XPR5′(SEQ ID NO9)和XPR3′(SEQID NO10)作引物，通過PCR擴增XPR2轉錄終止子。PCR擴增是在50μl的總體積中進行的，使用上述成分和條件。用SacII消化179bp的PCR產物，然後連接到pY4的SacII位點上，以便製備pY5。因此，pY5(參見圖2和3)可用作耶氏酵母屬-大腸桿菌穿梭質粒，它包括1.)耶氏酵母屬自主複製序列(ARS18)；2.)ColE1質粒複製起點；3.)氨苄青黴素-抗性基因(AmpR)，用於在大腸桿菌中選擇；4.)耶氏酵母屬LEU2基因，用於在耶氏酵母屬中選擇；5.)翻譯延伸啟動子(TEFP)，用於在耶氏酵母屬中表達異源基因；和6.)細胞外蛋白酶基因終止子(XPR2)，用於在耶氏酵母屬中表達的異源基因的轉錄終止。
作為pY5的衍生物構建了pY5-4和pY5-13(圖3)，以便促進在解脂耶氏酵母中的亞克隆和異源基因表達。
具體地講，用pY5作模板，通過三輪定點誘變構建了pY5-4。用寡核苷酸YL1和YL2(SEQ ID NOs11和12)將位於LEU2報導基因上的NcoI位點位點從pY5除去，以便製備pY5-1。通過用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs13和14)進行定點誘變將NcoI位點導入pY5-1的TEF啟動子和XPR2轉錄終止子之間，以便製備pY5-2。然後使用寡核苷酸YL23和YL24(SEQ ID NOs15和16)將PacI位點導入pY5-2的TEF啟動子和XPR2轉錄終止子之間，以便製備pY5-4。
用pY5作模板，通過6輪定點誘變構建pY5-13。通過用寡核苷酸YL5和YL6(SEQ ID NOs17和18)進行定點誘變將SaII和ClaI位點從pY5上消除，以便製備pY5-5。通過用寡核苷酸YL9和YL10(SEQID NOs19和20)進行定點誘變將SaII位點導入pY5-5的LEU2基因和TEF啟動子之間，以便製備pY5-6。用寡核苷酸YL7和YL8(SEQID NOs21和22)將PacI位點導入pY5-6的LEU2基因和ARS18之間，以便製備pY5-8。使用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NOs13和14)將NcoI位點導入pY5-8的TEF啟動子的翻譯起始密碼子周圍，以便製備pY5-9。使用YL1和YL2寡核苷酸(SEQ ID NOs11和12)將pY5-9的LEU2基因的NcoI位點消除，以便製備pY5-12。最後，用寡核苷酸YL61和YL62(SEQ ID NOs23和24)將BsiWI位點導入pY5-12的ColEl和XPR2區之間，以便製備pY5-13。
實施例2在解脂耶氏酵母中分析野生型Δ6和Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶的轉化效率為了確保野生型Δ6去飽和酶，延伸酶和Δ17去飽和酶在解脂耶氏酵母中的功能(在密碼子優化之前)，測定了每一種野生型蛋白的轉化效率。具體地講，高山被孢黴Δ6去飽和酶，異絲水黴Δ17去飽和酶和高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶是在其他宿主中表達的，並且在底物補料實驗中篩選活性。發現每一種酶都能夠將至少23％的底物轉化成產物。
野生型高山被孢黴(登錄號#AF465281)Δ6去飽和酶將包括高山被孢黴Δ6去飽和酶基因(SEQ ID NO1)的1384bp的pCGR5的NcoI/NotI片段(U.S.5,968,809)插入pY5-2的NcoI/NotI位點(實施例1)上，以便製備pY54。
野生型異絲水黴(ATCC#56851)Δ17去飽和酶通過PCR，用寡核苷酸YL21A(SEQ ID NO118)和YL22(SEQID NO119)作引物，由質粒pRSP19(US2003/0196217A1)擴增異絲水黴的野生型Δ17去飽和酶基因。PCR擴增是在50μl的總體積中進行的，它包括PCR緩衝液，該緩衝液含有10ng模板，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.75)，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，100pg/mL BSA(最終濃度)，200μM每一種脫氧核糖核苷三磷酸，10pmole每一種引物，和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶。(Stratagene，San Diego，CA)。擴增是按以下方法進行的在95℃下初始變性3分鐘，然後進行35輪以下循環95℃，1分鐘，56℃，30秒，72℃，1分鐘。在72℃下進行10分鐘的最終延伸，然後在4℃下終止反應。用NcoI/PacI消化PCR產物，然後連接到NcoI/PacI-消化過的pY5-4上(圖3；參見實施例1)，以便製備pYSD17。
野生型高山被孢黴(登錄號#AX464731)高親和力延伸酶將包括高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶基因的編碼區(SEQ IDNO5)的pRPB2的973bp的NotI片段(WO00/12720)插入pY5的NotI位點(實施例1；圖2和3)，以便製備pY58(圖13B)。
解脂耶氏酵母的轉化按照Chen，D.C.等(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)232-235-(1997))的方法將質粒pY54，pYSD17和pY58分別轉化到解脂耶氏酵母ATCC#76982中。
簡單地講，將耶氏酵母屬的亮氨酸營養缺陷型在YPD平板上劃線，並且在30℃下生長大約18小時。將幾個大環的細胞從平板上刮下來，並且重新懸浮在1mL的轉化緩衝液中，該緩衝液包括·2.25mL的50％PEG，平均分子量3350；·0.125mL的2M乙酸鋰，pH6.0；·0.125mL的2M DTT；和·50μg的剪切的鮭魚精子DNA。
在100μl的重新懸浮的細胞中溫育大約500ng的質粒DNA，並且在39℃下保持1小時，以15分鐘的間隔進行渦旋混合。將細胞鋪平板到缺少亮氨酸的基本培養基平板上，並且在30℃下保持2-3天。
底物轉化百分比的測定含有pY54，pYSD17或pY58的轉化解脂耶氏酵母的單個菌落分別在3mL基本培養基(20g/L葡萄糖，1.7g/L酵母氮基質，不含胺基酸，1g/L L-脯氨酸，0.1g/L L-腺嘌呤，0.1g/L L-賴氨酸，pH6.1)中，在30℃下生長到OD600大約為1.0。為了進行底物補料，將100μl的細胞放在含有10μg底物的3mL基本培養基中在30℃下繼代培養大約24小時。然後通過離心收集細胞，並且按照披露於以下文獻中的方法提取脂類Bligh，E.G. Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))。脂肪酸甲酯是通過酯類提取物與甲醇鈉的脂交換反應製備的(Roughan，G.，and Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)38-46(1990))，並且隨後用裝有30-m×0.25mm(內徑)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890GC進行分析。烘箱溫度以3.5℃/分鐘的速度從170℃(25分鐘保持時間)提高到185℃。底物轉化百分比按以下公式測定([產物]/[底物+產物])*100)。
野生型高山被孢黴Δ6去飽和酶的底物轉化百分比高山被孢黴Δ6去飽和酶能將LA轉化成GLA和/或將ALA轉化成STA。含有pY54的解脂耶氏酵母菌株按上述方法生長(不需要補充底物)，並且分析脂類。結果表明，具有pY54的耶氏酵母屬菌株能將大約30％LA轉化成GLA。
野生型異絲水黴Δ17去飽和酶的底物轉化百分比異絲水黴Δ17去飽和酶能將ARA轉化成EPA和/或將DGLA轉化成ETA。含有pYSD17的解脂耶氏酵母菌株是從單菌落生長的，在含有10μg的ARA的基本培養基中繼代培養，並且按上述方法進行脂類分析。ARA補料實驗的結果表明具有PYSD17的耶氏酵母屬菌株能將大約23％的細胞內ARA轉化成EPA。
野生型高山被孢黴高親和力延伸酶的底物轉化百分比高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶能將GLA轉化成DGLA，將STA轉化成ETA和/或將EPA轉化成DPA。包括pY58的解脂耶氏酵母菌株是從單菌落生長的，在含有10μg的GLA基本培養基中繼代培養，並且按上述方法進行脂類分析。GLA補料實驗的結果表明，具有pY58的耶氏酵母屬菌株能將大約30％的細胞內GLA轉化成DGLA。
實施例3在解脂耶氏酵母中測定優選的密碼子選擇在National Center for Biotechnology Information公共資料庫中發現了大約100個解脂耶氏酵母的基因。通過DNAStar的Editseq程序將包括121,167bp的這些基因的編碼區翻譯成相應的40,389個胺基酸，並且製成表格，以便確定由表4所示的解脂耶氏酵母密碼子選擇譜。標題為″No.″的欄表示編碼特定胺基酸的特定密碼子在40,389個胺基酸的樣品中出現的次數。標題為″％″的欄表示編碼特定胺基酸的特定胺基酸的頻率。用粗體字符表示的代碼表示解脂耶氏酵母中優選的密碼子。
表4解脂耶氏酵母的密碼子選擇
為了進一步優化在解脂耶氏酵母中的基因表達，檢查了79個基因的′ATG′起始密碼子周圍的共有序列。在圖4中，加下劃線的ATG翻譯起始密碼子的第一個′A′被設為+1。分析過的基因的77％在-3號位置上出現″A″，表明了″A″在該位置上的強烈偏好。還存在′A′或′C′在-4，-2和-1號位置上的偏好，′A′，′C′或′T′在+5號位置上的偏好，以及′G′或′C′在+6號位置上的偏好。因此，用於基因在解脂耶氏酵母中優化表達的密碼子優化的翻譯起始位點的優選的共有序列是′MAMMATGNHS′(SEQ ID NO122)，其中使用了如下的核酸簡併性密碼M＝A/C；S＝C/G；H＝A/C/T；和N＝A/C/G/T。
實施例4密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的合成來自高山被孢黴的Δ6去飽和酶基因(SEQ ID NO1)的長度為1374bp(U.S.5,968,809；GenBank #AF465281)。根據高山被孢黴DNA序列，按照耶氏酵母屬密碼子選擇方式，ATG翻譯起始密碼子周圍的共有序列，以及RNA穩定性的一般性規則，設計了密碼子優化的Δ6去飽和酶基因(Guhaniyogi，G.and J.Brewer，Gene 265(1-2)11-23(2001))。除了修飾翻譯起始位點之外，還對1374bp編碼區(相當於144個密碼子)的152bp進行了密碼子優化。在圖5中示出了密碼子優化的基因(SEQ ID NO25)和來自高山被孢黴的完整長度的野生型序列(SEQ ID NO1)進行了比較，其中，用粗體字符表示的核苷酸相當於在密碼子優化的基因上修飾過的核苷酸。對密碼子優化的基因的修飾，不會改變所編碼蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
在圖6中示出了用於合成密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的方法。首先，設計了14對寡核苷酸，以便延長高山被孢黴Δ6去飽和酶基因(例如，D6-1A，D6-1B，D6-2A，D6-2B，D6-3A，D6-3B，D6-4A，D6-4B，D6-5A，D6-5B，D6-6A，D6-6B，D6-7A，D6-7B，D6-8A，D6-8B，D6-9A，D6-9B，D6-10A，D6-10B，D6-11A，D6-11B，D6-12A，D6-12B，D6-13A，D6-13B，D6-14A和D6-14B，相當於SEQ ID NOs26-53)的密碼子優化的編碼區的完整長度(即，1374bp)。每一對有義(A)和反義(B)寡核苷酸是互補的，只有位於每一個5′-末端的4bp的突出部分例外。引物D6-1A在它的5′末端包括NcoI位點；引物D6-4B和D6-5A包括StuI位點；而引物D6-7B，D6-8A，和D6-10B各自包括BamHI位點，用於隨後的亞克隆。在37℃下對100ng的每一種寡核苷酸進行1小時的磷酸化，反應是在包括50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM亞精胺，0.5mM ATP和10單位的T4多核苷酸激酶的20μl的體積中進行的。混合每一對有義和反義寡核苷酸，並且在熱循環儀中退火，使用以下參數95℃(2min)，85℃(2min)，65℃(15min)，37℃(15min)，24℃(15min)，和4℃(15min)。因此，將D6-1A(SEQ ID NO26)與D6-1B(SEQID NO27)退火，以便產生雙鏈產物″D6-1AB″。類似地，將D6-2A(SEQ ID NO28)與D6-2B(SEQ ID NO29)退火，以便產生雙鏈產物″D6-2AB″等。
然後將四個獨立的退火的雙鏈寡核苷酸集合連接在一起，這些集合如下·集合1包括D6-1AB，D6-2AB，D6-3AB，和D6-4AB；·集合2包括D6-5AB，D6-6AB，和D6-7AB；·集合3包括D6-8AB，D6-9AB，和D6-10AB；和·集合4包括D6-11AB，D6-12AB，D6-13AB，和D6-14AB。
將每一個退火的寡核苷酸集合與10個單位的T4DNA連接酶在20μl的體積中混合，並且連接反應是在16℃下溫育過夜中的。
然後通過PCR擴增每一種連接反應的產物。具體地講，使用連接的″集合1″混合物(即，D6-1AB，D6-2AB，D6-3AB和D6-4AB)作模板，並且用寡核苷酸D6-1(SEQ ID NO54)和D6-4R(SEQ ID NO55)作引物，通過PCR擴增密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的第一部分。PCR擴增是在50μl的總體積中進行的，它包括PCR緩衝液，該緩衝液含有10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.75)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，100μg/mL BSA(最終濃度)，200μM每一種脫氧核糖核苷三磷酸，10pmole每一種引物和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴增是按如下方法進行的，在95℃初始變性3分鐘，然後進行35輪以下循環95℃，1min，56℃，30sec，72℃，40sec。在72℃下進行10分鐘的最終延伸，然後在4℃下終止反應。將380bp PCR片段亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega)上，以便製備pT6(1-4)。
用連接的″集合2″混合物(即，D6-5AB，D6-6AB和D6-7AB)作模板，並且用寡核苷酸D6-5(SEQ ID NO56)和D6-7R(SEQ ID NO57)作引物，通過PCR以類似方式擴增了密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的第二部分，並且克隆到pGEM-T-easy載體上，以便製備pT6(5-7)。用″集合3″連接混合物(即，D6-8AB，D6-9AB，和D6-1OAB)作模板，並且用寡核苷酸D6-8(SEQ ID NO58)和D6-10R(SEQ IDNO59)作引物，通過PCR以類似方式擴增了密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的第三部分，並且克隆到pGEM-T-easy載體上，以便製備pT6(8-10)。最後，使用″集合4″連接混合物(即，D6-11AB，D6-12AB，D6-13AB和D6-14AB)作模板，並且用寡核苷酸D6-11(SEQ ID NO60)和D6-14R(SEQ ID NO61)作引物，通過PCR以類似方式擴增了密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的第四部分，並且克隆到pGEM-T-easy載體上，以便製備pT6(11-14)。
分別用pT6(1-4)，pT6(5-7)，pT6(8-10)和pT6(11-14)轉化大腸桿菌，並且純化從氨苄青黴素-抗性轉化體中分離的質粒DNA，並且用合適的限制性內切核苷酸酶消化，以便釋放pT6(1-4)的380bpNcoI/StuI片段，pT6(5-7)的310bp StuI/BamHI片段，pT6(8-10)的320bp BamHI片段，和pT6(11-14)的410bp BamHI/NotI片段。然後合併這些片段，沿正確的方向連接在一起，並且插入pY5-13的NcoI/NotI位點，以便製備pYD6S(圖7)。
實施例5密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的合成來自異絲水黴(SEQ ID NO3)的Δ17去飽和酶基因的長度為1077bp。根據異絲水黴DNA序列，按照耶氏酵母屬密碼子選擇方式，ATG翻譯起始密碼子周圍的共有序列，以及RNA穩定性的一般規則(Guhaniyogi和Brewer，同上)設計了密碼子優化的Δ17去飽和酶基因。除了修飾翻譯起始位點之外，對1077bp編碼區(包括117個密碼子)的127bp密碼子優化。在圖8中示出了該密碼子優化的DNA序列(SEQ ID NO62)和異絲水黴Δ17去飽和酶基因DNA序列(SEQ IDNO3)之間的比較，其中，用粗體字符表示的核苷酸相當於在密碼子優化的基因上修飾過的核苷酸。對密碼子優化的基因的修飾不會改變所編碼蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO4)。
在圖9中示出了用於合成密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的方法。首先，設計了十一對寡核苷酸，以便延長異絲水黴Δ17去飽和酶基因(例如，D17-1A，D17-1B，D17-2A，D17-2B，D17-3A，D17-3B，D17-4A，D17-4B，D17-5A，D17-5B，D17-6A，D17-6B，D17-7A，D17-7B，D17-8A，D17-8B，D17-9A，D17-9B，D17-10A，D17-10B，D17-11A和D17-11B，相當於(SEQ ID NOs63-84)的密碼子優化的編碼區的完整長度。每一對有義(A)和反義(B)寡核苷酸是互補的，只有位於每一個5′-末端的4bp的突出部分例外。另外，引物D17-1A，D17-4B，D17-5A，D17-8A和D17-8B還導入了NcoI，BglIIH SalI限制位點以便隨後分別進行亞克隆。
採用在實施例4中所披露的方法，用T4多核苷酸激酶對100ng的每一種寡核苷酸進行磷酸化。然後混合每一對有義和反義寡核苷酸，並且退火。因此，D17-1A(SEQ ID NO63)與D17-1B(SEQ IDNO64)退火，以便產生雙鏈產物″D17-1AB″。類似地，D17-2A(SEQID NO65)與D17-2B(SEQ ID NO66)退火，以便產生雙鏈產物″D17-2AB″等。
然後將三個獨立的退火的，雙鏈寡核苷酸的集合連接在一起，如下文所述·集合1包括D17-1AB，D17-2AB，D17-3AB和D17-4AB；·集合2包括D17-5AB，D17-6AB，D17-7AB和D17-8AB；和·集合3包括D17-9AB，D17-10AB和D17-11AB。
每一個退火的寡核苷酸集合在16℃下在20μl的體積中連接過夜。
然後通過PCR擴增每一個連接反應的產物。具體地講，使用連接的″集合1″混合物(即，D17-1AB，D17-2AB，D17-3AB和D17-4AB)作模板，並且用寡核苷酸D17-1(SEQ ID NO85)和D17-4R(SEQ IDNO86)作引物，通過PCR擴增密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的第一部分。PCR擴增是在總體積為50μl的總體積中進行的，使用了實施例4中所使用的PCR條件和熱循環程序。將430bp PCR片段亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega)上，以便製備pT17(1-4)。
用連接的″集合2″混合物(即，D17-5AB，D17-6AB，D17-7AB和D17-8AB)作模板，並且用寡核苷酸D17-5(SEQ ID NO87)和D17-8D(SEQ ID NO88)作引物，通過PCR以類似方式擴增了密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的第二部分，並且克隆到pGEM-T-easy載體上，以便製備pT17(5-8)。最後，用″集合3″連接混合物(即，D17-9AB，D17-10AB和D17-11AB)作模板，並且用寡核苷酸D17-8U(SEQ IDNO89)和D17-11(SEQ ID NO90)作引物，通過PCR以類似方式擴增了密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的第三部分，並且克隆到pGEM-T-easy載體上，以便製備pT17(9-11)。
用pT17(1-4)，pT17(5-8)和pT17(9-11)分別轉化大腸桿菌，並且從氨苄青黴素-抗性轉化體中分離質粒DNA。純化質粒DNA，並且用合適的限制性內切核酸酶消化，以便釋放pT17(1-4)的420bpNcoI/BglII片段，pT17(5-8)的400bp BglII/SalI片段，和pT17(9-11)的300bp SalI/NotI片段。然後合併這些片段，連接在一起，並且用作模板擴增整個合成的Δ17去飽和酶基因，用D17-1(SEQ ID NO85)和D17-11(SEQ ID NO90)作引物。PCR擴增是在50μl的總體積中進行的，使用上述針對Δ17去飽和酶基因的每一部分描述的條件，以及以下的熱循環程序首先在95℃下變性3分鐘，然後進行35輪以下循環95℃，1min，56℃，30sec，72℃，1.1min。在72℃下進行10分鐘的最終的延伸循環，然後在4℃下終止反應。用NcoI/NotI消化1.1kB PCR產物，並且亞克隆到NcoI/NotI-消化過的pY5-13，以便製備pYSD17S(圖10A)。
作為用野生型和密碼子優化的Δ17去飽和酶進行的對照底物補料實驗中的額外的″對照″，通過定點誘變，用YL53(SEQ ID NO120)和YL54(SEQ ID NO121)作引物，除去pYSD17(參見實施例2)的富含AT-的PacI位點，以便製備pYSD17M(圖10B)。
實施例6密碼子優化的高親和力PUFA延伸酶基因的合成來自高山被孢黴的高親和力PUFA延伸酶基因(SEQ ID NO5)的長度為957bp(GenBank#AX464731；WO00/12720)。根據高山被孢黴DNA序列，按照耶氏酵母屬密碼子選擇方式，′ATG′翻譯起始密碼子周圍的共有序列，以及RNA穩定性的一般規則(Guhaniyogi和Brewer，同上)設計了密碼子優化的高親和力PUFA延伸酶基因。除了修飾翻譯起始位點之外，還對957bp編碼區(相當於85個密碼子)的94bp進行了密碼子優化。在圖11中示出了這種密碼子優化的基因(SEQ ID NO91)和來自高山被孢黴的完整長度的野生型序列(SEQ1D NO5)的比較，其中，用粗體字符表示的核苷酸相當於在密碼子優化的基因上修飾過的核苷酸。對密碼子優化的基因的修飾，不會改變所編碼蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO6)。
在圖12中示出了用於合成高親和力延伸酶基因的方法。具體地講，設計了十對寡核苷酸，以便延伸高山被孢黴高親和力延伸酶編碼區(即，EL-1A，EL-1B，EL-2A，EL-2B，EL-3A，EL-3B，EL-4A，EL-4B，EL-5A，EL-5B，EL-6A，EL-6B，EL-7A，EL-7B，EL-8A，EL-8B，EL-9A，EL-9B，EL-10A和EL-10B，相當於SEQ ID NOs92-111)的整個長度。每一對有義(A)和反義(B)寡核苷酸是互補的，只有位於5′-末端的4bp的突出部分例外。
按照實施例4的方法，用T4多核苷酸激酶對100ng每一種寡核苷酸進行磷酸化。然後混合每一對有義和反義寡核苷酸並且退火。因此，EL-1A(SEQ ID NO92)與EL1-1B(SEQ ID NO93)退火，以便產生雙鏈產物″EL-1AB″，EL-2A(SEQ ID NO94)與EL-2B(SEQ IDNO95)退火，以便產生雙鏈產物″EL-2AB″等。
然後將兩個獨立的退火的，雙鏈寡核苷酸的集合連接在一起，所述集合如下·集合1包括EL-1AB，EL-2AB，EL-3AB，EL-4AB和EL-5AB；和·集合2包括EL-6AB，EL-7AB，EL-8AB，EL-9AB和EL-10AB。
在16℃下，用10單位的T4DNA連接酶在20μl體積中連接每一個退火的寡核苷酸集合過夜。
然後通過PCR擴增每一種連接反應產物。具體地講，使用連接的″集合1″混合物(即，EL-1AB，EL-2AB，EL-3AB，EL-4AB和EL-5AB)作模板，並且用寡核苷酸EL-1(SEQ ID NO112)和EL-5R(SEQ IDNO113)作引物，通過PCR擴增密碼子優化的延伸酶基因的第一部分。PCR擴增是在50μl的反應混合物中按照實施例4所述方法進行的。擴增是按以下方法進行的在95℃下初始變性3分鐘，然後進行35輪以下循環95℃，1min，56℃，30sec，72℃，1min。在72℃下進行10分鐘的最終延伸循環，然後在4℃下終止反應。將500bp PCR片段亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega)上，以便製備pTEL(1-5)。
用連接的″集合2″混合物(即，EL-6AB，EL-7AB，EL-8AB，EL-9AB和EL-10AB)作模板，並且用寡核苷酸EL-6(SEQ ID NO114)和EL-10R(SEQ ID NO115)作引物，通過PCR以類似方法擴增密碼子優化的延伸酶基因的第二部分。並且亞克隆到pGEM-T easy載體上，以便製備pTEL(6-10)。
分別用pTEL(1-5)和pTEL(6-10)轉化大腸桿菌細胞，並且純化來自氨苄青黴素抗性轉化體的質粒DNA，並且用合適的限制性內切核酸酶消化，以便釋放pTEL(1-5)的500bp NcoI/SalI片段，和pTEL(6-10)的470bp SalI/NotI片段。混合所述片段，並且連接在NcoI/NotI消化過的pY5-13上，以便製備pELS-1。
對pELS-1插入片段進行的DNA序列分析，確定了在+65號位置(其中，將′ATG′翻譯密碼子的′A′確定為+1)上存在一個′C′→′T′鹼基取代，它導致了胺基酸從Thr(ACC)改變成Ser(AGC)。然後使用寡核苷酸EL-M1(SEQ ID NO116)和EL-M2(SEQ ID NO117)作引物，通過定點誘變糾正這種突變，以便製備pELS(圖13A)。
實施例7用密碼子優化的Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因轉化解脂耶氏酵母按照實施例2所述方法將包括野生型和密碼子優化的Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因的質粒分別轉化入解脂耶氏酵母ATCC#76982。使用該技術，獲得了包括以下質粒的轉化體
表5轉化體解脂耶氏酵母中質粒的概述
實施例8在解脂耶氏酵母中分析密碼子優化的Δ6和Δ17去飽和酶和高親和力延伸酶的轉化效率在分別比較野生型和密碼子優化的Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶和高親和力延伸酶的轉化效率之後，證實了在解脂耶氏酵母中密碼子優化將LA轉化成GLA(Δ6去飽和酶)的底物轉化百分比提高了大約40％，ARA轉化成EPA(Δ17去飽和酶)的底物轉化百分比提高了大約2倍，而GLA轉化成DGLA(延伸酶)的底物轉化百分比提高了大約57％。
使用密碼子優化的Δ6去飽和酶的底物轉化百分比Δ6去飽和酶能將LA轉化成GLA和/或ALA轉化成STA(參見圖1)。為了比較野生型和密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的轉化效率，在含有每一種替代的質粒構建體(即，pYSD6或pYD6S)的解脂耶氏酵母中測定底物轉化百分比([產物]/[底物+產物])*100)。具體地講，含有pYSD6或pYD6S的解脂耶氏酵母在3mL基本培養基中從單菌落生長，在含有10μg的LA的基本培養基中繼代培養，並且按實施例2所述進行脂類分析。
該實驗的結果表明，含有pYSD6的耶氏酵母屬菌株能將大約30％的底物LA轉化成GLA(圖14A)，而含有pYD6S的耶氏酵母屬菌株能將大約42％的LA轉化成GLA(圖14B)。根據這一發現，含有密碼子優化的Δ6去飽和酶基因的耶氏酵母屬在解脂耶氏酵母中能轉化的LA比野生型高山被孢黴Δ6去飽和酶基因多大約40％或以上。
使用密碼子優化的Δ17去飽和酶的底物轉化百分比Δ17去飽和酶能將DGLA轉化成ETA和/或將ARA轉化成EPA(參見圖1)。為了比較野生型和密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的轉化效率，在含有pYSD17，pYSD17M和pYSD17S的解脂耶氏酵母中測定了底物轉化百分比。每一種轉化體是在3mL的基本培養基中從單菌落生長的，在含有10μg的ARA的基本培養基中繼代培養，並且按實施例2所述方法進行脂類分析。
ARA補料實驗的結果表明，具有對照質粒pYSD17或pYSD17M的耶氏酵母屬菌株能將大約23％的細胞內ARA轉化成EPA(圖15A)，而在pYSD17S上包括密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的菌株能將大約45％的細胞內ARA轉化成EPA(圖15B)。因此，包括密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的耶氏酵母屬可以轉化的ARA比包括野生型異絲水黴基因的菌株多出大約2倍。
使用密碼子優化的延伸酶的底物轉化百分比高山被孢黴的高親和力PUFA延伸酶主要負責催化GLA轉化成DGLA(參見圖1；WO 00/12720)。為了比較野生型和密碼子優化的延伸酶基因的轉化效率，在含有pY58和pELS的解脂耶氏酵母中測定了底物轉化百分比。轉化體是在3mL的基本培養基中從單菌落生長的，在含有10μg的GLA的基本培養基中繼代培養，並且按實施例2所述方法進行脂類分析。
GLA補料實驗的結果表明，包括pY58的解脂耶氏酵母能將大約30％的底物GLA轉化成DGLA(圖16A)，而包括pELS的菌株能將大約47％的GLA轉化成DGLA(圖16B)。根據這一結果，在解脂耶氏酵母中，與野生型高山被孢黴延伸酶基因相比，密碼子優化的延伸酶基因能轉化多出大約57％的GLA。
序列表110E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc.
120用於在油質酵母中生產多不飽和脂肪酸的密碼子優化的基因130CL2234 PCT150US60/4687181512003-05-07150US60/4686771512003-05-07160122170PatentIn version 3.221012111374212DNA213高山被孢黴AF4652814001atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg aggttttgaa tgccgaggct60ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca cccttcttga tgatcatcga caacaaggtg120tacgatgtcc gcgagttcgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt180ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact tttcaccccg aggctgcttg ggagactctt240gccaactttt acgttggtga tattgacgag agcgaccgcg atatcaagaa tgatgacttt300gcggccgagg tccgcaagct gcgtaccttg ttccagtctc ttggttacta cgattcttcc360aaggcatact acgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggttt gtcgacggtc420attgtggcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgcttttg480ggtctgttct ggcagcagtg cggatggttg gctcacgact ttttgcatca ccaggtcttc540caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggcttc600tcgtcctcgt ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ccgcccccaa cgtccacggc660gaggatcccg acattgacac ccaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc gttggagatg720
ttctcggatg tcccagatga ggagctgacc cgcatgtggt cgcgtttcat ggtcctgaac780cagacctggt tttacttccc cattctctcg tttgcccgtc tctcctggtg cctccagtcc840attctctttg tgctgcctaa cggtcaggcc cacaagccct cgggcgcgcg tgtgcccatc900tcgttggtcg agcagctgtc gcttgcgatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc960ctgttcatca aggatcccgt caacatgctg gtgtactttt tggtgtcgca ggcggtgtgc1020ggaaacttgt tggcgatcgt gttctcgctc aaccacaacg gtatgcctgt gatctcgaag1080gaggaggcgg tcgatatgga tttcttcacg aagcagatca tcacgggtcg tgatgtccac1140ccgggtctat ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact atcagatcga gcaccacttg1200ttcccttcga tgcctcgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gaccctgtgc1260aaaaagtaca atgtccgata ccacaccacc ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt1320agccgtctga acgaggtctc caaggctacc tccaagatgg gtaaggcgca gtaa 13742102211457212PRT213高山被孢黴AF4652814002Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Val Leu1 5 10 15Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe20 25 30Leu Met Ile Ile Asp Asn Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro35 40 45Asp His Pro Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly50 55 60Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu65 70 75 80
Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp Ile Asp Glu Ser Asp Arg Asp Ile Lys85 90 95Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gln100 105 110Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Ala Phe Lys Val115 120 125Ser Phe Asn Leu Cys Ile Trp Gly Leu Ser Thr Val Ile Val Ala Lys130 135 140Trp Gly Gln Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu145 150 155 160Gly Leu Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His165 170 175His Gln Val Phe Gln Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Gln Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys195 200 205His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp210 215 220Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met225 230 235 240Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe245 250 255Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala260 265 270
Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn Gly275 280 285Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu290 295 300Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe305 310 315 320Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Leu Val Tyr Phe Leu Val Ser325 330 335Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His340 345 350Asn Gly Met Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe355 360 365Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe370 375 380Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu385 390 395 400Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val405 410 415Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Asn Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met420 425 430Ile Glu Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys435 440 445Ala Thr Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln450 455
21032111077212DNA213異絲水黴(ATCC #56851)4003atgactgagg ataagacgaa ggtcgagttc ccgacgctca cggagctcaa gcactcgatc60ccgaacgcgt gctttgagtc gaacctcggc ctctcgctct actacacggc ccgcgcgatc120ttcaacgcgt cggcctcggc ggcgctgctc tacgcggcgc gctcgacgcc gttcattgcc180gataacgttc tgctccacgc gctcgtttgc gccacctaca tctacgtgca gggcgtcatc240ttctggggct tcttcacggt cggccacgac tgcggccact cggccttctc gcgctaccac300agcgtcaact ttatcatcgg ctgcatcatg cactctgcga ttttgacgcc gttcgagagc360tggcgcgtga cgcaccgcca ccaccacaag aacacgggca acattgataa ggacgagatc420ttttacccgc accggtcggt caaggacctc caggacgtgc gccaatgggt ctacacgctc480ggcggtgcgt ggtttgtcta cttgaaggtc gggtatgccc cgcgcacgat gagccacttt540gacccgtggg acccgctcct ccttcgccgc gcgtcggccg tcatcgtgtc gctcggcgtc600tgggccgcct tcttcgccgc gtacgcgtac ctcacatact cgctcggctt tgccgtcatg660ggcctctact actatgcgcc gctctttgtc tttgcttcgt tcctcgtcat tacgaccttc720ttgcaccaca acgacgaagc gacgccgtgg tacggcgact cggagtggac gtacgtcaag780ggcaacctct cgagcgtcga ccgctcgtac ggcgcgttcg tggacaacct gagccaccac840attggcacgc accaggtcca ccacttgttc ccgatcattc cgcactacaa gctcaacgaa900gccaccaagc actttgcggc cgcgtacccg cacctcgtgc gcaggaacga cgagcccatc960atcacggcct tcttcaagac cgcgcacctc tttgtcaact acggcgctgt gcccgagacg1020gcgcagatct tcacgctcaa agagtcggcc gcggccgcca aggccaagtc ggactaa 10772104211358212PRT
213異絲水黴(ATCC #56851)4004Met Ala Glu Asp Lys Thr Lys Val Glu Phe Pro Thr Leu Thr Glu Leu1 5 10 15Lys His Ser Ile Pro Ash Ala Cys Phe Glu Ser Asn Leu Gly Leu Ser20 25 30Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Ala Ile Phe Asn Ala Ser Ala Ser Ala Ala35 40 45Leu Leu Tyr Ala Ala Arg Ser Thr Pro Phe Ile Ala Asp Asn Val Leu50 55 60Leu His Ala Leu Val Cys Ala Thr Tyr Ile Tyr Val Gln Gly Val Ile65 70 75 80Phe Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Cys Gly His Ser Ala Phe85 90 95Ser Arg Tyr His Ser Val Asn Phe Ile Ile Gly Cys Ile Met His Ser100 105 110Ala Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Arg Val Thr His Arg His His115 120 125His Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Lys Asp Glu Ile Phe Tyr Pro His130 135 140Arg Ser Val Lys Asp Leu Gln Asp Val Arg Gln Trp Val Tyr Thr Leu145 150 155 160Gly Gly Ala Trp Phe Val Tyr Leu Lys Val Gly Tyr Ala Pro Arg Thr165 170 175
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223引物D17-3A40067gccacctaca tctacgtgca gggtgtcatc ttctggggtt tctttaccgt cggtcacgac60tgtggtcact ctgccttctc ccgataccac tccgtcaact tcatc10521068211105212DNA213人工序列220
223引物D17-3B40068ccaatgatga agttgacgga gtggtatcgg gagaaggcag agtgaccaca gtcgtgaccg60acggtaaaga aaccccagaa gatgacaccc tgcacgtaga tgtag 105
21069211105212DNA213人工序列220
223引物D17-4A40069attggctgca tcatgcactc tgccattctg actcccttcg agtcctggcg agtgacccac60cgacaccatc acaagaacac tggcaacatt gataaggacg agatc10521070211105212DNA213人工序列220
223引物D17-4B40070tagaagatct cgtccttatc aatgttgcca gtgttcttgt gatggtgtcg gtgggtcact60cgccaggact cgaagggagt cagaatggca gagtgcatga tgcag10521071211105212DNA213人工序列220
223引物D17-5A40071acgagatctt ctaccctcat cggtccgtca aggacctcca ggacgtgcga caatgggtct60acaccctcgg aggtgcttgg tttgtctacc tgaaggtcgg atatg10521072211107212DNA213人工序列
220
223引物D17-5B40072aggagcatat ccgaccttca ggtagacaaa ccaagcacct ccgagggtgt agacccattg60tcgcacgtcc tggaggtcct tgacggaccg atgagggtag aagatct 10721073211105212DNA213人工序列220
223引物D17-6A40073ctcctcgaac catgtcccac tttgacccct gggaccctct cctgcttcga cgagcctccg60ctgtcatcgt gtccctcgga gtctgggctg ccttcttcgc tgcct10521074211106212DNA213人工序列220
223引物D17-6B40074aggcgtaggc agcgaagaag gcagcccaga ctccgaggga cacgatgaca gcggaggctc60gtcgaagcag gagagggtcc caggggtcaa agtgggacat ggttcg 10621075211104212DNA213人工序列220
223引物D17-7A40075acgcctacct cacatactcg ctcggctttg ccgtcatggg cctctactac tatgctcctc60
tctttgtctt tgcttcgttc ctcgtcatta ctaccttctt gcat 10421076211103212DNA213人工序列220
223引物D17-7B40076ttgtgatgca agaaggtagt aatgacgagg aacgaagcaa agacaaagag aggagcatag60tagtagaggc ccatgacggc aaagccgagc gagtatgtga ggt 10321077211106212DNA213人工序列220
223引物D17-8A40077cacaacgacg aagctactcc ctggtacggt gactcggagt ggacctacgt caagggcaac60ctgagctccg tcgaccgatc gtacggagct ttcgtggaca acctgt 10621078211106212DNA213人工序列220
223引物D17-8B40078gtgagacagg ttgtccacga aagctccgta cgatcggtcg acggagctca ggttgccctt60gacgtaggtc cactccgagt caccgtacca gggagtagct tcgtcg 10621079211102
212DNA213人工序列220
223引物D17-9A40079ctcaccacat tggcacccac caggtccatc acttgttccc tatcattccc cactacaagc60tcaacgaagc caccaagcac tttgctgccg cttaccctca cc 10221080211102212DNA213人工序列220
223引物D17-9B40080cacgaggtga gggtaagcgg cagcaaagtg cttggtggct tcgttgagct tgtagtgggg60aatgataggg aacaagtgat ggacctggtg ggtgccaatg tg 1022108121176212DNA213人工序列220
223引物D17-10A40081tcgtgagacg taacgacgag cccatcatta ctgccttctt caagaccgct cacctctttg60tcaactacgg agctgt762108221176212DNA213人工序列220
223引物D17-10B
40082cgggcacagc tccgtagttg acaaagaggt gagcggtctt gaagaaggca gtaatgatgg60gctcgtcgtt acgtct762108321167212DNA213人工序列220
223引物D17-11A40083gcccgagact gctcagattt tcaccctcaa agagtctgcc gctgcagcca aggccaagag60cgactaa 672108421162212DNA213人工序列220
223引物D17-11B40084ttagtcgctc ttggccttgg ctgcagcggc agactctttg agggtgaaaa tctgagcagt60ct 622108521132212DNA213人工序列220
223引物D17-140085tttccatggc tgaggataag accaaggtcg ag 322108621134
212DNA213人工序列220
223引物D17-4R40086ccctagaaga tctcgtcctt atcaatgttg ccag342108721127212DNA213人工序列220
223引物D17-540087cccacgagat cttctaccct catcggt272108821124212DNA213人工序列220
223引物D17-8D40088gaaagctccg tacgatcggt cgac 242108921124212DNA213人工序列220
223引物D17-8U40089gtcgaccgat cgtacggagc tttc 242109021134
212DNA213人工序列220
223引物D17-1140090aaagcggccg cttagtcgct cttggccttg gctg3421091211957212DNA213高山被孢黴40091atggagtcca ttgctccctt cctgccctcc aagatgcctc aggacctgtt catggacctc60gccaccgcta tcggtgtccg agctgctccc tacgtcgatc ccctggaggc tgccctggtt120gcccaggccg agaagtacat tcccaccatt gtccatcaca ctcgaggctt cctggttgcc180gtggagtctc ccctggctcg agagctgcct ctgatgaacc ccttccacgt gctcctgatc240gtgctcgcct acctggtcac cgtgtttgtg ggtatgcaga tcatgaagaa ctttgaacga300ttcgaggtca agaccttctc cctcctgcac aacttctgtc tggtctccat ctccgcctac360atgtgcggtg gcatcctgta cgaggcttat caggccaact atggactgtt tgagaacgct420gccgatcaca ccttcaaggg tctccctatg gctaagatga tctggctctt ctacttctcc480aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctca agaagaacaa ccgacagatt540tcctttctgc acgtgtacca ccactcttcc atcttcacca tctggtggct ggtcaccttc600gttgctccca acggtgaagc ctacttctct gctgccctga actccttcat ccacgtcatc660atgtacggct actactttct gtctgccctg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc720tacatcactc gatcccagat gacccagttc tgcatgatgt ctgtccagtc ttcctgggac780atgtacgcca tgaaggtcct tggccgacct ggatacccct tcttcatcac cgctctgctc840tggttctaca tgtggaccat gctcggtctc ttctacaact tttaccgaaa gaacgccaag900ctcgccaagc aggccaaggc tgacgctgcc aaggagaagg ccagaaagct ccagtaa 957
21092211100212DNA213人工序列220
223引物EL-1A40092ccatggagtc cattgctccc ttcctgccct ccaagatgcc tcaggacctg ttcatggacc60tcgccaccgc tatcggtgtc cgagctgctc cctacgtcga 10021093211103212DNA213人工序列220
223引物EL-1B40093ggggatcgac gtagggagca gctcggacac cgatagcggt ggcgaggtcc atgaacaggt60cctgaggcat cttggagggc aggaagggag caatggactc cat 10321094211101212DNA213人工序列220
223引物EL-2A40094cccctggagg ctgccctggt tgcccaggcc gagaagtaca ttcccaccat tgtccatcac60actcgaggct tcctggttgc cgtggagtct cccctggctc g10121095211101212DNA213人工序列
220
223引物EL-2B40095ctctcgagcc aggggagact ccacggcaac caggaagcct cgagtgtgat ggacaatggt60gggaatgtac ttctcggcct gggcaaccag ggcagcctcc a10121096211100212DNA213人工序列220
223引物EL-3A40096agagctgcct ctgatgaacc ccttccacgt gctcctgatc gtgctcgcct acctggtcac60cgtgtttgtg ggtatgcaga tcatgaagaa ctttgaacga 10021097211100212DNA213人工序列220
223引物EL-3B40097cgaatcgttc aaagttcttc atgatctgca tacccacaaa cacggtgacc aggtaggcga60gcacgatcag gagcacgtgg aaggggttca tcagaggcag 10021098211100212DNA213人工序列220
223引物EL-4A40098ttcgaggtca agaccttctc cctcctgcac aacttctgtc tggtctccat ctccgcctac60
atgtgcggtg gcatcctgta cgaggcttat caggccaact 10021099211100212DNA213人工序列220
223引物EL-4B40099ccatagttgg cctgataagc ctcgtacagg atgccaccgc acatgtaggc ggagatggag60accagacaga agttgtgcag gagggagaag gtcttgacct 100210100211101212DNA213人工序列220
223引物EL-5A400100atggactgtt tgagaacgct gccgatcaca ccttcaaggg tctccctatg gctaagatga60tctggctctt ctacttctcc aagatcatgg agtttgtcga c101210101211101212DNA213人工序列220
223引物EL-5B400101tggtgtcgac aaactccatg atcttggaga agtagaagag ccagatcatc ttagccatag60ggagaccctt gaaggtgtga tcggcagcgt tctcaaacag t10121010221189212DNA
213人工序列220
223引物EL-6A400102accatgatca tggtcctcaa gaagaacaac cgacagattt cctttctgca cgtgtaccac60cactcttcca tcttcaccat ctggtggct 8921010321189212DNA213人工序列220
223引物EL-6B400103gaccagccac cagatggtga agatggaaga gtggtggtac acgtgcagaa aggaaatctg60tcggttgttc ttcttgagga ccatgatca 8921010421189212DNA213人工序列220
223引物EL-7A400104ggtcaccttc gttgctccca acggtgaagc ctacttctct gctgccctga actccttcat60ccacgtcatc atgtacggct actactttc 8921010521189212DNA213人工序列220
223引物EL-7B400105
gacagaaagt agtagccgta catgatgacg tggatgaagg agttcagggc agcagagaag60taggcttcac cgttgggagc aacgaaggt 8921010621191212DNA213人工序列220
223引物EL-8A400106tgtctgccct gggcttcaag caggtgtcgt tcatcaagtt ctacatcact cgatcccaga60tgacccagtt ctgcatgatg tctgtccagt c 9121010721191212DNA213人工序列220
223引物EL-8B400107ggaagactgg acagacatca tgcagaactg ggtcatctgg gatcgagtga tgtagaactt60gatgaacgac acctgcttga agcccagggc a 9121010821190212DNA213人工序列220
223引物EL-9A400108ttcctgggac atgtacgcca tgaaggtcct tggccgacct ggatacccct tcttcatcac60cgctctgctc tggttctaca tgtggaccat 90210109
21190212DNA213人工序列220
223引物EL-9B400109gagcatggtc cacatgtaga accagagcag agcggtgatg aagaaggggt atccaggtcg60gccaaggacc ttcatggcgt acatgtccca 9021011021197212DNA213人工序列220
223引物EL-10A400110gctcggtctc ttctacaact tttaccgaaa gaacgccaag ctcgccaagc aggccaaggc60tgacgctgcc aaggagaagg ccagaaagct ccagtaa 9721011121194212DNA213人工序列220
223引物EL-10B400111cttactggag ctttctggcc ttctccttgg cagcgtcagc cttggcctgc ttggcgagct60tggcgttctt tcggtaaaag ttgtagaaga gacc9421011221127212DNA213人工序列220
223引物EL-1
400112tttccatgga gtccattgct cccttcc2721011321123212DNA213人工序列220
223引物EL-5R400113tggtgtcgac aaactccatg atc2321011421133212DNA213人工序列220
223引物EL-6400114tttgtcgaca ccatgatcat ggtcctcaag aag 3321011521135212DNA213人工序列220
223引物EL-10R400115aaagcggccg cttactggag ctttctggcc ttctc 3521011621130212DNA213人工序列220
223引物EL-M1
400116tcatggacct cgccaccgct atcggtgtcc 3021011721130212DNA213人工序列220
223引物EL-M2400117ggacaccgat agcggtggcg aggtccatga 3021011821133212DNA213人工序列220
223引物YL21A400118tttccatggc tgaggataag acgaaggtcg agt 3321011921136212DNA213人工序列220
223引物YL22400119cccttaatta attagtccga cttggccttg gcggcc 3621012021136212DNA213人工序列220
223引物YL53
400120gccaagtcgg actaagctgc taactagagc ggccgc 3621012121136212DNA213人工序列220
223引物YL54400121gcggccgctc tagttagcag cttagtccga cttggc 3621012221110212DNA213解脂耶氏酵母220
221綜合特徵222(8)..(8)223n是a，c，g，或t400122mammatgnhs 10
權利要求
1.選自下組的分離的核酸分子a)如SEQ ID NO25所示的分離的核酸分子，它編碼Δ6去飽和酶；或b)完全互補於(a)的分離的核酸分子。
2.編碼SEQ ID NO2所示Δ6去飽和酶的分離的核酸分子，其中，至少144個密碼子是密碼子優化的，以便在耶氏酵母屬中表達。
3.選自下組的分離的核酸分子a)編碼SEQ ID NO62所示Δ17去飽和酶的分離的核酸分子；或b)完全互補於(a)的分離的核酸分子。
4.編碼SEQ ID NO4所示Δ17去飽和酶的分離的核酸分子，其中，至少117個密碼子是密碼子優化的，以便在耶氏酵母屬中表達。
5.選自下組的分離的核酸分子a)編碼SEQ ID NO91所示的延伸酶的分離的核酸分子；或b)完全互補於(a)的分離的核酸分子。
6.編碼SEQ ID NO6所示延伸酶的分離的核酸分子，其中，至少85個密碼子是密碼子優化的，以便在耶氏酵母屬中表達。
7.一種嵌合基因，包括可操作地與合適的調控序列連接的如權利要求1-6中任意一項的分離的核酸分子。
8.一種轉化過的耶氏酵母菌種，包括權利要求7的嵌合基因。
9.如FLUZONE8的轉化過的耶氏酵母菌種，選自下組解脂耶氏酵母ATCC#20362，解脂耶氏酵母ATCC#8862，解脂耶氏酵母ATCC#18944，解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
10.一種生產γ-亞麻酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼Δ6去飽和酶多肽的如權利要求1或2的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由亞油酸組成的去飽和酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中表達權利要求1或2的核酸分子，並且將亞油酸轉化成γ-亞麻酸；和c)任選回收步驟(b)的γ-亞麻酸。
11.如權利要求10的方法，其中，所述去飽和酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
12.一種生產十八碳四烯酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼Δ6去飽和酶多肽的如權利要求1或2的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由α-亞油酸組成的去飽和酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中，表達如權利要求1或2的核酸分子，並且將α-亞油酸轉化成十八碳四烯酸；和c)任選回收步驟(b)的十八碳四烯酸。
13.如權利要求12的方法，其中，所述去飽和酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
14.一種生產二十碳四烯酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼Δ17去飽和多肽的如權利要求3或4的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由二高-γ-亞油酸組成的去飽和酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中，表達如權利要求3或4的核酸分子，並且將二高-γ-亞油酸轉化成二十碳四烯酸；和c)任選回收步驟(b)的二十碳四烯酸。
15.如權利要求14的方法，其中，所述去飽和酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
16.一種生產二十碳五烯酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼Δ17去飽和多肽的如權利要求3或4的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由花生四烯酸組成的去飽和酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中，表達如權利要求3或4的核酸分子，並且將花生四烯酸轉化成二十碳五烯酸；和c)任選回收步驟(b)的二十碳五烯酸。
17.如權利要求16的方法，其中，所述去飽和酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
18.一種生產二高-γ-亞油酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼延伸酶多肽的如權利要求5或6的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由γ-亞麻酸組成的延伸酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中，表達如權利要求5或6的核酸分子，並且將γ-亞麻酸轉化成二高-γ-亞油酸；和c)任選回收步驟(b)的二高-γ-亞油酸。
19.如權利要求18的方法，其中，所述延伸酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
20.一種生產二十碳四烯酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼延伸酶多肽的如權利要求5或6的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由十八碳四烯酸組成的延伸酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中，表達如權利要求5或6的核酸分子，並且將十八碳四烯酸轉化成二十碳四烯酸；和c)任選回收步驟(b)的二十碳四烯酸。
21.如權利要求20的方法，其中，所述延伸酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
22.一種生產二十二碳五烯酸的方法，包括a)提供耶氏酵母菌種，它包括(i)編碼延伸酶多肽的如權利要求5或6的核酸分子，該核酸分子受合適的調控序列的控制；和(ii)由二十碳五烯酸組成的延伸酶底物來源；b)在存在合適的可發酵碳源的條件下生長步驟(a)的耶氏酵母菌種，其中，表達如權利要求5或6的核酸分子，並且將二十碳五烯酸轉化成二十二碳五烯酸；和c)任選回收步驟(b)的二十二碳五烯酸。
23.如權利要求22的方法，其中，所述延伸酶底物來源對耶氏酵母菌種來說是內源的。
24.一種優化基因以便在含油酵母中表達的方法，包括以下步驟a)獲得含油酵母菌種的核苷酸編碼區和相應多肽的序列，以便形成密碼子資料庫；b)分析所述密碼子資料庫，以便確定優先編碼每一種胺基酸的密碼子；c)獲得要在含油酵母菌種中表達的基因的序列；d)用步驟(b)中的優選密碼子取代步驟(c)中的序列的非優選密碼子，其中，所述基因是密碼子優化的，以便在含油酵母菌種中表達。
25.如權利要求24的方法，其中，所述含油酵母選自下組耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
26.如權利要求25的方法，其中，所述宿主細胞選自下組解脂耶氏酵母ATCC#20362，解脂耶氏酵母ATCC#8862，解脂耶氏酵母ATCC#18944，解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
27.如權利要求24的方法，其中，要優化的基因編碼選自下組的酶Δ12去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ9去飽和酶，延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ4去飽和酶，Δ17去飽和酶和Δ12去飽和酶。
28.分離的核酸分子，包括如SEQ ID NO122所示的耶氏酵母屬翻譯起始位點。
29.一種用於優化基因在耶氏酵母屬宿主中表達的方法，包括a)提供要在耶氏酵母屬中表達的外源基因；b)將步驟(a)的基因可操作地與權利要求28的分離的核酸分子連接，其中，所述外源基因是優化過的，以便在耶氏酵母屬中表達。
30.如權利要求29的方法，其中，所述外源基因編碼選自下組的酶Δ12去飽和酶，Δ6去飽和酶，延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ9去飽和酶和Δ4去飽和酶。
31.通過權利要求10-27中任意一項的方法生產的微生物油。
全文摘要
本發明涉及脂肪酸去飽和酶和延伸酶，所述酶能夠催化亞油酸(LA)轉化成γ－亞麻酸(GLA)；α－亞油酸(ALA)轉化成十八碳四烯酸(STA)；GLA轉化成二高－γ－亞油酸(DGLA)；STA轉化成二十碳四烯酸(ETA)；DGLA轉化成ETA；二十碳五烯酸(EPA)轉化成二十二碳五烯酸(DPA)；以及將花生四烯酸(ARA)轉化成EPA。披露了編碼密碼子優化的去飽和酶和延伸酶的核酸序列，能與它雜交的核酸序列，包括密碼子優化的去飽和酶或延伸酶的DNA構建體，以及能表達增高水平的去飽和酶或延伸酶的重組宿主微生物。
文檔編號C12N9/04GK1816559SQ200480019354
公開日2006年8月9日 申請日期2004年5月7日 優先權日2003年5月7日
發明者S·K·皮卡塔吉奧, Q·Q·朱 申請人:納幕爾杜邦公司