一種mdm2拮抗劑的檢驗試劑盒及其製備方法

2023-06-05 07:02:41

一種mdm2拮抗劑的檢驗試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明針對現有MDM2拮抗劑檢驗方法繁瑣、耗時、不利於快速大量篩選的缺陷，發明了一種新的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒。所述檢驗試劑盒包含連接於載體的MDM2，結合於MDM2上的p53和連接於p53的報告蛋白。所述的蛋白質通過同一表達載體上共表達p53基因和MDM2基因的相關部分，其中MDM2基因中融合了可以表達用於結合載體的標籤，p53基因中融合了用於表達螢光蛋白的基因序列。通過使用所述新的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，直觀指示MDM2與p53之間的結合變化，同時，將MDM2拮抗劑的篩選工作大大簡化，以便快速確定新的候選MDM2拮抗劑。
【專利說明】一種MDM2拮抗劑的檢驗試劑盒及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學和生物【技術領域】，具體涉及一種MDM2拮抗劑檢驗方法，包括MDM2基因和p53基因共表達質粒的構建、共表達質粒表達的產物和用所述產物檢驗候選MDM2拮抗劑的方法。
【背景技術】
[0002]癌症威脅著人類的健康和生命。傳統放療、化療的嚴重毒副作用一直是抗癌研究與治療關注的焦點，近年來，抗癌藥物研究已從傳統的細胞毒類藥物逐漸轉向特異性的分子靶向治療藥物，發現選擇性作用於特定靶點的高效、低毒新型藥物已成為抗癌藥物研發的重要方向。
[0003]研究表明，p53基因是與人類癌症相關性最高的抑癌基因，其表達產物是細胞生長的重要調節子，結合在一定的DNA序列，能夠激活基因轉錄，抑制細胞生長。MDM2基因是1987年發現的癌基因，其表達產物MDM2蛋白可與p53結合，並抑制p53的正常生物學功能，從而可導致腫瘤的發生和發展。理論上，阻斷P53和MDM2之間的相互作用，能夠回復野生型P53活性，驅動癌細胞選擇性地進入程序性細胞死亡，因此，阻斷MDM2和p53相互作用被認為是抗癌藥物研究的重要靶點之一。
[0004]p53的15-29位胺基酸和MDM2的17-125位胺基酸是兩者結合的關鍵。本發明之前的現有技術中，MDM2拮抗劑主要是根據p53-MDM2複合物的結構數據設計，然後通過蛋白質表達體系得到蛋白質，利用ELISA方法測定其與MDM2結合的Kd值。這種方法較為繁瑣，時間消耗大，不利於快速大量篩選。

【發明內容】

[0005]為了克服現有技術中檢驗MDM2拮抗劑方法繁瑣、耗時、不利於快速大量篩選的缺陷，以快速有效的篩選天然的或人工設計的MDM2拮抗劑為目的，本發明提供一種MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，採用共表達P53和MDM2相關部分並使用螢光蛋白直觀、高效地對候選MDM2拮抗劑進行檢驗。
[0006]本發明包括以下各項內容:
[0007]1.一種MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，包含連接於載體的MDM2，結合於MDM2上的p53和連接於P53的報告蛋白。
[0008]2.根據I所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其中，所述p53和所述MDM2的結合通過蛋白質-蛋白質相互作用，所述報告蛋白與P53形成融合蛋白。
[0009]3.根據I所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其中，所述載體為樹脂，所述樹脂優選為親和樹脂，更優選為Ni親和樹脂，所述報告蛋白為螢光蛋白，優選綠色螢光蛋白(GFP)和紅色螢光蛋白(RFP)。
[0010]4.根據I所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其中，MDM2通過標籤連接於載體，所述標籤優選His標籤。[0011]5.一種共表達質粒，其特徵是MDM2基因和p53基因構建在一個載體中。
[0012]6.根據權利要求5所述的共表達質粒，其中所述MDM2基因和所述p53基因之間用調控元件間隔開，所述調控元件為終止子和核糖體結合位點。
[0013]7.根據權利要求5所述的共表達質粒，其中所述MDM2基因可以是全長基因或是包含編碼MDM2的17-125位胺基酸的基因，p53基因可以是全長基因或是包含編碼p53的15-29位胺基酸的基因。
[0014]8.根據5-7任一項所述的共表達質粒所表達的蛋白質。
[0015]9.一種MDM2拮抗劑的檢驗方法，其特徵為向如上述1-4任一項所示的檢驗試劑盒中加入候選拮抗劑，通過報告蛋白指示拮抗劑導致的MDM2與p53之間的結合變化。
[0016]10.根據1-4所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒和/或5_7所述的共表達質粒和/或8所述的蛋白質在檢驗MDM2拮抗劑中的用途。
[0017]具體而言，本發明提供MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其是以離心管為容器，裝入載體，然後MDM2通過標籤連接到載體上，p53通過蛋白質-蛋白質相互作用結合在MDM2上，報告蛋白融合表達在P53上。
[0018]其中，綠色螢光蛋白(GFP)是一種新型報告分子，自身即可產生螢光，性質穩定且沒有毒副作用。
[0019]本發明還提供MDM2和p53的共表達質粒，具體是MDM2基因和p53基因通過雙酶切共同構建在一個載體上，二者之間用調控元件間隔開。
[0020]本發明還提供利用上述載體表達的共表達蛋白，其是將獲得的重組載體轉化入大腸桿菌中，得到表達菌株，培養重組表達菌株，誘導表達，得到共表達蛋白。
[0021]通過上述方法獲得的本發明的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒和相應的MDM2拮抗劑檢驗方法相對於現有技術中已有的MDM2拮抗劑檢驗方法，優點在於:
[0022]I)將MDM2基因與p53基因構建在一個質粒上可以有效控制兩個蛋白表達量的比例；
[0023]2)GFP蛋白可以指示MDM2與p53之間的結合變化，直接可見，不需要添加顯色底物；
[0024]3)克服了現有技術中檢測方法的繁瑣過程，將MDM2拮抗劑的篩選工作大大簡化，能夠快速便捷的確定新的候選MDM2拮抗劑的效果。
[0025]發明詳沭
[0026]以下對本發明的技術方案做進一步詳細闡述。應當指出，本發明的各實施方案可以根據需要以任何方式組合。
[0027]本發明的一個實施方案中，拮抗劑的檢驗試劑盒為在離心管中裝入載體，MDM2連接於載體，p53通過蛋白質-蛋白質相互作用結合在MDM2上，p53連接報告蛋白。
[0028]應該注意的是，在該實施方案中，MDM2所連接的載體可以但不限於是親和樹脂，優選Ni親和樹脂，其還可以是任何穩定的可以用於生物分子間相互作用的固相介質；MDM2與載體的連接方式可以但不限於使用His標籤，還可以是本領域常用的其它標籤分子，如GST,或其它形式的連接方式，如範德華力，氫鍵，共價鍵等；報告蛋白可以但不限於是GFP和RFP，還可以是其它可以檢測或觀測到的標記分子；另外，所述報告蛋白與p53的連接方式可以但不限於是融合表達，只要是可以穩固連接所述報告蛋白與P53且不影響兩種蛋白本身性質的方式均包含在本發明的範圍內。
[0029]在本發明的另一個實施方案中，MDM2拮抗劑的檢驗試劑盒通過共表達質粒來獲得，所述共表達質粒為MDM2基因和p53基因構建在一個載體上，具體的，所述MDM2基因和P53基因之間用調控元件間隔開，所述調控元件可以但不限於為終止子和核糖體結合位點，只要所述調控元件能夠將兩個基因隔開，且能夠用於有效控制兩個基因表達的調控元件均包含在本發明的範圍內。
[0030]在本發明的另一個實施方案中，MDM2基因可以是全長或是包含編碼全長MDM2的17-125位胺基酸的基因，p53基因可以是全長或是包含編碼全長p53的15-29位胺基酸的基因。具體的，P53的15-29位胺基酸和MDM2的17-125位胺基酸是兩者結合的關鍵，因此，應該注意的是，本發明中共表達載體所表達的片段含有P53的15-29位胺基酸和MDM2的17-125位胺基酸片段時，可以形成有效的結合，相應的，本發明的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒可以藉此實現以檢驗候選MDM2拮抗劑。
[0031]在本發明的另一個實施方案中，共表達質粒表達的蛋白至少包含帶有標籤的MDM2，和連接有報告蛋白的p53。所述標籤可以但不限於是His標籤，還可以是本領域常用的其它標籤分子，如GST，或其它形式的連接方式，如範德華力，氫鍵，共價鍵等；所述報告蛋白可以但不限於是GFP，還可以是其它可以檢測或觀測到的標記分子；所述連接可以但不限於是融合表達，只要是可以穩固連接所述報告蛋白與P53且不影響兩種蛋白本身性質的方式均包含在本發明保護的範圍內。具體表達方法是將獲得的重組載體轉化大腸桿菌菌株中，得到表達菌株，培養重組表達菌株，加入誘導劑誘導蛋白表達，即可得到共表達蛋白。其中，所述表達使用的載體可以但不限於PET21，還可以是本領域常用的其它表達載體，同樣，所述表達使用的宿主細胞可以但不限於RP菌株，還可以是本領域常用的其它宿主細胞。進一步的，所述共表達質粒表達的蛋白至少可以用於檢驗MDM2拮抗劑的試劑盒。
[0032]在本發明的另一個實施方案中，MDM2拮抗劑的檢驗方法，為向所述的檢驗試劑盒中加入候選拮抗劑，通過報告蛋白指示拮抗劑導致的MDM2與p53之間的結合變化。在一個具體的實施方案中，加入候選MDM2拮抗劑，如果存在拮抗作用，p53將從MDM2上釋放，體系中的顏色分布發生改變，反之，如果不存在拮抗作用，P53和MDM2的結合將不會受到影響，體系中的顏色分布將不發生改變。其中候選拮抗劑可以是可能對MDM2結合p53具有拮抗作用的任何物質，如蛋白質，核酸，小分子化合物等。具體的，在本發明的一個實施例中，nutlin-3作為MDM2拮抗劑的陽性對照,所述nutlin_3是本領域中一種有效的、選擇性的MDM2拮抗劑。
[0033]在本發明的另一個實施方案中，提供MDM2拮抗劑的檢驗試劑盒和/或所述的共表達質粒和/或所述的蛋白在檢驗MDM2拮抗劑中的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1.構建的重組表達載體pET21_b(+)-coexpress示意圖。
[0035]載體的構建以pET21_b(+)為基礎，P53-GFP基因片段和MDM2a基因片段分別插入載體的XhoI/EcoRI和EcoRI/Ndel位點，兩個基因片段之間含有終止子和核糖體結合位點，從而構建獲得pET21_b (+) -coexpress共表達質粒。
[0036]圖2.共表達蛋白的Ni柱純化SDS-PAGE結果。[0037]其中，M =Marker ；1:MDM2a蛋白；2:p53_GFP融合蛋白；3:共表達蛋白複合物。條帶I和2為作為對照的純化的MDM2a蛋白和p53_GFP融合蛋白。
[0038]圖3.共表達體系未加入nutlin-3時檢測體系的顏色。
[0039]將重組菌株誘導表達後，超聲破碎，破碎的菌液16000rpm離心30min，收集上清，先後經過0.45微米和0.22微米微孔濾膜過濾後獲得還有共表達蛋白的上清。將上清加入Ni柱，震蕩結合30min後用含25mM咪唑的Tris緩衝液衝洗2_3次，以洗脫無關雜蛋白，然後用Tris緩衝液將樹脂重懸。
[0040]取Iml重懸液於1.5ml離心管中，12000rpm離心Imin,可以看到樹脂顯綠色突光，
上清無色。
[0041]圖4.共表達體系加入nutlin-3後檢測體系顏色的變化。
[0042]在重懸液中加入5倍於蛋白濃度的nutlin-3,混勻反應3_5min, 12000rpm離心lmin，可以看到樹脂上綠色螢光減弱，上清中出現綠色螢光，說明MDM2與p53之間的蛋白質-蛋白質相互作用被MDM2拮抗劑nutlin-3阻斷，將p53蛋白從MDM2蛋白上釋放出來。
[0043]圖5.紅色螢光蛋白標記的共表達體系未加入nutlin-3時檢測體系的顏色。
[0044]將重組菌株誘導表達後，超聲破碎，破碎的菌液16000rpm離心30min，收集上清，先後經過0.45微米和0.22微米微孔濾膜過濾後獲得還有共表達蛋白的上清。將上清加入Ni柱，震蕩結合30min後用含25mM咪唑的Tris緩衝液衝洗2_3次，以洗脫無關雜蛋白，然後用Tris緩衝液將樹脂重懸。
[0045]取Iml重懸液於1.5ml離心管中，12000rpm離心lmin，可以看到樹脂顯紅色螢光，
上清無色。
[0046]圖6.紅色螢光蛋白標記的共表達體系加入多肽類抑制劑I後檢測體系的顏色。
[0047]圖5中共表達體系中加入多肽類抑制劑1，序列為TSFAEYWALLSP，反應3min，可以看到樹脂上紅色螢光減弱，上清中出現紅色螢光，說明MDM2與p53之間的蛋白質-蛋白質相互作用被多肽類抑制劑I阻斷，將P53蛋白從MDM2蛋白上釋放出來。
[0048]圖7.nutlin-3滴定蛋白複合物擬合曲線。
[0049]取Iml重懸液於1.5ml離心管中，蛋白濃度通過改良型BCA試劑盒測得。根據蛋白複合物濃度，用高濃度的Nutlin-3逐步滴定蛋白複合物，nutlin-3:蛋白濃度比依次為
0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5、2、4、6、8、10，每步之間搖勻反應 3min, 12000rpm 離心 lmin,取400 μ I上清測螢光強度。得到的數據擬合製圖，結論與nutlin-3和p53 (15-29)分別與MDM2的Kd值的比值一致(p53 (15_29aa)和nutlin-3對MDM2的Kd分別為140±5nM和263±60nM)。
具體實施方案
[0050]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細描述，但不應理解為是對本發明進行限定。
[0051]本發明的共表達質粒載體構建過程如下:
[0052]首先，共表達蛋白的基因，是對原有基因改造後得到的。MDM2基因可以是從全長MDM2截取17-125位胺基酸的基因，在N端加上His標籤，在C端加上終止子，後在5』端和3』端分別引入與表達載體一致的Nde I和EcoR I酶切位點獲得的，記為MDM2a。p53基因可以是從全長P53截取15-29位胺基酸的基因，在N端加上GFP標籤獲得的，記為p53_GFP。P53-GFP N端加上核糖體結合位點(RBS)，後在5』端和3』端分別引入與表達載體一致的EcoR I和Xho I酶切位點獲得的，記為p53a。將MDM2a基因與p53_GFP基因共同構建在一個質粒上，中間用終止子和核糖體結合位點間隔開。共表達蛋白基因序列如序列表SEQ IDNO:1所示，記為coexpress-MDM2a-p53-GFP。編碼表達的MDM2a蛋白由116個胺基酸組成，分子量為13.48KD，等電點為8.45，胺基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。編碼表達的P53-GFP融合蛋白由254個胺基酸組成，分子量為28.48KD，等電點為5.78，胺基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
[0053]其次，在獲得共表達蛋白的基因後，載體的構建步驟包括:將MDM2a基因通過NdeI和EcoR I雙酶切後連接到同樣雙酶切的pET21-b(+)質粒上，記為pET21_b (+) _MDM2a。然後將p53a因通過EcoR I和Xho I雙酶切後連接到同樣經雙酶切的pET21_b (+) _MDM2a重組質粒中，記為pET21_b (+)-coexpress (見附圖1)，基因序列如序列表SEQ ID NO:4。
[0054]重組質粒經測序驗證後，轉化 入大腸桿菌RP菌株中，得到表達菌株，記為RP (coexpress) ?培養重組表達菌株,加入IPTG誘導，即可得到共表達蛋白。
[0055]所述共表達蛋白置於含有部分Ni親和樹脂的EP管中，MDM2即通過His標籤連接到Ni親和樹脂上，從而形成p53通過蛋白質-蛋白質相互作用結合在MDM2上形成複合體，由於GFP蛋白融合表達在p53上，反應後，樹脂呈現綠色螢光。
[0056]加入候選MDM2拮抗劑，如果存在拮抗作用，p53將從MDM2上釋放，體系中的顏色分布發生改變，反之，如果不存在拮抗作用，p53和MDM2的結合將不會受到影響，體系中的顏色分布將不發生改變。
[0057]綜上所述，本發明的目的是通過下面的技術方案實現的:
[0058](I)利用PCR方法對MDM2和p53基因進行片段截取，得到MDM2a和p53a片段；
[0059](2)MDM2a和p53a片段依次連接到pET21_b (+)載體上，得到重組質粒pET21-b(+)-coexpress ；
[0060](3) pET21_b(+)-coexpress轉化表達菌株,誘導表達得到共表達蛋白；
[0061](4)共表達蛋白形成的共表達體系的驗證。
[0062]實施例1.pET21-b (+) _MDM2a重組質粒的構建
[0063]根據MDM2基因序列設計引物，
[0064]正引物:NdeI為內切酶
[0065]5』 -TGCGCTCATATGCACCATCATCATCATCACTCACAGATTCC-3』
[0066]反引物:EcoR I為內切酶
[0067]5』 -CGGAATTCCTAGTTCTCACTCACAGATGTACC-3』
[0068]以全長MDM2基因(SEQ ID NO:5)為模板進行PCR擴增，得到長度為368bp的DNA片段，依次包括Nde I酶切位點、His標籤、MDM2基因N端17-125序列和EcoR I酶切位點，記為:MDM2a (SEQ ID NO:6)。
[0069]PCR 反應體系(50 μ I):
[0070]
【權利要求】
1.一種MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，包含連接於載體的MDM2，結合於MDM2上的p53和連接於p53的報告蛋白。
2.根據權利要求1所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其中，所述p53和所述MDM2的結合通過蛋白質-蛋白質相互作用，所述報告蛋白與P53形成融合蛋白。
3.根據權利要求1所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其中，所述載體為樹脂，所述樹脂優選為親和樹脂，更優選為Ni親和樹脂，所述報告蛋白為螢光蛋白，優選綠色螢光蛋白(GFP)和紅色螢光蛋白(RFP)。
4.根據權利要求1所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒，其中，MDM2通過標籤連接於載體，所述標籤優選His標籤。
5.一種共表達質粒，其特徵是MDM2基因和p53基因構建在一個載體中。
6.根據權利要求5所述的共表達質粒，其中所述MDM2基因和所述p53基因之間用調控元件間隔開，所述調控元件為終止子和核糖體結合位點。
7.根據權利要求5所述的共表達質粒，其中所述MDM2基因可以是基因全長或是包含編碼MDM2的17-125位胺基酸的基因，p53基因可以是基因全長或是包含編碼p53的15-29位胺基酸的基因。
8.根據權利要求5-7任一項所述的共表達質粒表達的蛋白。
9.一種MDM2拮抗劑的檢驗方法，其特徵為向如上述1-4任一項所示的檢驗試劑盒中加入候選拮抗劑，通過報告蛋白指示拮抗劑導致的MDM2與p53之間的結合變化。
10.根據權利要求1-4所述的MDM2拮抗劑檢驗試劑盒和/或權利要求5-7所述的共表達質粒和/或權利要求8所述的蛋白在檢驗MDM2拮抗劑中的用途。
【文檔編號】C07K19/00GK103954601SQ201410214883
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】董志強, 劉揚中, 陳思明 申請人:中國科學技術大學