針對活化Th1細胞的重組免疫毒素Rantes－DT390的質粒及製備方法與應用的製作方法
2023-06-05 06:08:01
專利名稱：針對活化Th1細胞的重組免疫毒素Rantes－DT390的質粒及製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種特異攻擊並殺傷活化的Th1細胞的新型重組免疫毒素質粒及其製備方法。
背景技術：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是將生物毒素與導向載體(抗體或細胞因子)連接起來構成的雜合分子，又稱生物飛彈或導向毒素。最早的免疫毒素(即第一代免疫毒素)是載體與毒素分子的化學偶聯物，這類免疫毒素免疫原性強、分子量大、滲透性差、在靶部位很難形成有效的濃度、穩定性及均一性較差，毒副作用較強、難以大規模生產，從而限制了其應用。隨著現代生命科學的不斷發展，近年來人們通過基因重組技術對免疫毒素進行了改進，導向載體已由以前的單克隆抗體變成了基因工程抗體和一些配體等，生物毒素的品種更加多樣，在不影響其毒性作用的同時減小了其分子量大小。這種新工藝產生的新型免疫毒素穩定性強、滲透性好、具有更好的導向特異性、且製備時簡單易行、可短期內大量製備，在很大程度上彌補了第一代免疫毒素穩定性差、半衰期短、免疫原性強等不足，極大地推動了免疫毒素在相關領域的深入研究。
有關免疫毒素在生物醫學的應用，主要都集中於對某些惡性腫瘤及與免疫相關的人類疾病的導向治療。在惡性腫瘤的研究中，如血液系統腫瘤(白血病、復發性淋巴瘤等)、黑色素瘤、小細胞肺癌、腦瘤等疾病，利用免疫毒素治療已取得了很大的進展，有些已經進入臨床I、II、III期試驗。這些免疫毒素的作用靶點主要是選擇針對T細胞表面抗原或細胞因子受體，如CD3、CD4、IL-2等，在接受這些免疫毒素的治療後，相應的自身免疫性疾病或GvHD病情雖有減退，但毒副作用也較顯著，甚至使臨床治療被迫終止。產生毒副作用的主要原因之一是由於這類免疫毒素所選擇的導向分子特異性欠佳，往往導致殺傷許多其他無關細胞。自身免疫性疾病(Autoimmune Disease)是一類免疫相關的疾病，產生這類疾病的主要原因是由於各種刺激因素導致免疫系統對自身抗原發起攻擊，造成自身組織損傷和功能障礙。目前的治療措施主要是採用各種非特異的免疫抑制劑，但往往使患者免疫系統受到普遍性抑制而導致感染、腫瘤的發生及骨髓抑制等，且不能有效地防止疾病的復發。因而促使相關領域的研究者從免疫治療的角度，尋求一種特異、安全、有效的治療方法如MHC阻斷法、CD4分子阻斷法、TCR阻斷法、細胞因子治療、T細胞接種以及口服抗原誘導耐受等等，但這些方法或因特異性不高、療效不穩定，或因技術難度大、難以克服的毒副作用等而不能順利地過渡到臨床(見Waldor MK，et al.Science.1985，227415；Chen Y，etal.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355；HolldaySD，et al.Environmental Health Perspectives.108 Suppl 3463-73，2000 Jun；Palmisano GL，et al.Clinical Experimental Immunology.135(2)259-66，2004Feb；)，因而自身免疫性疾病的治療至今仍然是困擾臨床的一大難題。
隨著基礎免疫學的研究進展，人們認識到識別自身抗原的自身反應性T細胞，實際上是由CD4+TH1細胞所承擔的，而CD4+TH2僅具有一定的調節作用(見Lib lau RS，et al.Immunol.Today；1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。由此提示，如果能利用特異性更高的免疫毒素只將這些活化的自身反應性TH1細胞殺死，而不影響TH2細胞，則有可能彌補上述缺陷，可治療自身免疫性疾病。
發明內容
本發明針對現有技術存在的不足，提供一種新型的特異攻擊Th1細胞的重組免疫毒素質粒，為臨床治療自身免疫性疾病提供一種新方案，為重組免疫毒素的應用開闢一條新途徑。
本發明所述的針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。此種質粒由Rantes cDNA鹼基序列(來自gene bank)和白喉毒素的活性片段DT390 cDNA鹼基序列(來自gene bank)連接而成。Rantes是近年發現的一種新型細胞因子，在免疫應答的過程中，活化的T細胞將表達多種受體，如細胞因子IL-2、IL-12、IL-18的受體以及多種化學趨化因子CCR-5，CXCR-3等的受體。這些T細胞的膜受體中，現已證實Rantes受體的表達僅限於活化的Th1細胞，而Th2細胞沒有表達，並且這種膜受體的表達是穩定和持續的(見Karlsson I，et al.Journal of Virology，2004Nov，78(21)11807-15；Emingil G，et al.Journal of Clinical Periodontology.2004Oct，31(10)829-34.)。因此，Rantes受體不僅可以作為識別Th1細胞和Th2細胞的標誌，也為相關的免疫治療提供了一個理想的靶位。本發明選用Rantes為導向分子，白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，構建Rantes-DT390重組免疫毒素質粒，轉染入體內，表達重組免疫毒素，可特異攻擊並殺傷活化的Th1細胞，誘導自身免疫耐受，從而解決了原有免疫毒素特異性欠佳、需要提純的問題，實現有效治療自身免疫性疾病的目的。因此，本發明所述的針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒可在製備治療或預防自身免疫性疾病的藥中應用。
本發明所述針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒的製備方法依次包括以下步驟1、通過RT-PCR反應，獲得Rantes基因；2、將上述擴增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的真核質粒中，即構建成重組質粒。再轉染至感受態細菌中進行擴增，然後篩選出含有正確插入片段的克隆；3、限制性內切酶酶切圖譜分析重組質粒，並進行DNA序列分析，以保證重組質粒中Rantes插入片段的正確性；4、通過蛋白合成抑制實驗測定重組免疫毒素質粒的表達活性。
上述製備方法中，構建重組質粒可選用的真核質粒載體為SRα或pSecTag2。
本發明所述的新型免疫毒素質粒及其製備方法具有以下有益效果1.選擇新型細胞因子Rantes為導向分子，由於Rantes受體只表達在活化的Th1細胞表面，Th2細胞表面沒有表達，因而由Rantes導向的重組免疫毒素只針對Th1細胞，從而使導向攻擊更特異、更有效，減少臨床應用的毒副作用。
2.毒素分子選用的是白喉毒素的活性片段DT390，是細菌毒素的跨膜結構域和酶性結構域，去除了DT分子的細胞結合區，可進一步減少非特異性結合和降低不良反應。
3.通過質粒轉染活體肌肉細胞的方法，將免疫毒素Rantes-DT390的質粒直接導入動物肌肉，使免疫毒素Rantes-DT390在骨骼肌內高效表達而起到治療作用。
4.免疫毒素質粒是通過DNA重組技術來獲得的，它可直接轉染細胞而表達重組免疫毒素，勿需進一步提純免疫毒素蛋白質。同時避免了原來化學偶聯免疫毒素複雜的製備工藝和難以標化的缺點，使其更易產業化。
5.免疫毒素Rantes-DT390亦可用於移植排斥反應及某些腫瘤的防治。
圖1是本發明所述針對活化Th1細胞的重組免疫毒素Rantes-DT390質粒的一種示意圖，真核質粒載體為SRα；圖2是本發明所述重組免疫毒素Rantes-DT390對活化T細胞的蛋白合成抑制試驗結果圖；
圖3是本發明所述重組免疫毒素Rantes-DT390治療組與對照組的臨床評分圖；圖4是流式細胞儀測定本發明所述重組免疫毒素Rantes-DT390對活化T、Th1、Th2和B細胞的細胞毒實驗結果圖。
圖中，1-1-DT390、1-2-Rantes、1-3-SRα真核質粒、3-1-未治療組、3-2-治療組。
具體實施例方式
實施例1重組免疫毒素真核質粒的製備載體選用含有DT390的SRα真核質粒(由美國Wisconsin大學PhD.Hu Huaizhong提供，invitrogen公司)，具體步驟如下1、小鼠Rantes基因的預處理(以下試劑均購於promega公司)(1)用Trizol試劑按以下步驟提取小鼠肝總RNA1)小鼠肝組織100mg。
2)加1mlTrizol。
3)勻漿。
勻漿要徹底，後轉至EP管，組織勻漿量＞100mg時分裝，1ml/每EP管。
4)顛倒混勻10下，室溫5分鐘。
5)加氯仿1/5體積(0.2ml，必須按總體積的1/5)。
6)顛倒混勻10下，室溫5分鐘。
7)離心12000g，4℃，15分鐘。
8)轉上層水相(約400μl)於另一1.5mlEP管中。
9)加等體積異丙醇(約400μl)，混勻室溫10分鐘。
10)離心12000g，4℃，10分鐘。
11)棄上清。
12)加冰預冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml。
13)離心7500g，4℃，5分鐘。
14)棄上清，空氣乾燥5-10分鐘(不能完全乾燥)。
15)溶於DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中，＜10分鐘，助溶)。
(2)逆轉錄反應依次按以下步驟進行1)按下表配備試劑(稀釋10倍後用)。
試劑 濃度(μg/μl)體積(μl)RNA11.5Oligo(dT)150.0522)混勻，離心，70℃，5min。
3)立即冰水浴，稍離心。
4)按下表配備試劑試劑 濃度 體積(μl)終濃度M-MLV Buffer 5×41×dNTP 10mM10.5mMRNasin40U/μl 0.5 20UM-MLV 200U/μl1200UddH2O13.55)混勻，離心，42℃，60min。
6)95℃，10min(破壞MLV)。
7)4℃保存(3)cDNA的PCR反應反應體系試劑 濃度 體積(μl)Taq Buffer 10×2MgCl225mM 1.2dNTP 10mM 0.2上遊引物 12.5pmol/μl 0.5下遊引物 12.5pmol/μl 0.5cDNA模板 2ddH2O 13.3Taq酶2.5U/μl 0.3
PCR擴增的引物上遊5′-CAT GCC ATG GGC CTC ACC ATA TGG CTC GGA C-3′下遊5′-CCG GAA TTC CTA GCT CAT CTC CAA ATA GTT-3′PCR反應條件94℃預變性3min，94℃變性35sec、58℃復性30sec、72℃延伸55sec，34個循環後72℃延伸10min。
(4)擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳分析2、重組免疫毒素SRα真核表達質粒的預處理(1)用限制性內切Nco I及EcoRI雙酶切SRα真核質粒，反應體積20μl(其中含有NcoI酶1μl、EcoRI酶1μl、10×NEbuffer22μl、SRα真核質粒10μl、ddH2O6μl)，37℃過夜(內切酶均購自New England公司)；(2)反應後用1％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統的紫外燈照射下，按膠回收試劑盒(購自Omiga公司)的方法回收大片段。
3、Rantes與SRα真核表達質粒的連接及轉化(1)將上述步驟中所獲得的載體片段及插入片段粗略定量後，按插入片段載體分子摩爾數比＝3～10∶1的連接反應原則進行連接實驗；(2)反應體系如下表，整個反應過程在PCR儀中16℃過夜。連接反應時應分別設立無插入片段和無載體的對照管。使上述擴增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核質粒中，Rantes基因片段與DT390片段通過Nco I酶切位點連接，與SRα真核質粒通過EcoR I酶切位點連接，連接酶為T4DNA，所構建成的重組質粒見圖1。
試劑體積(μl)ddH2O 1110×buffer 2Rantes 2SRα 4T4DNA ligase1Total Volume20(3)將連接產物分別轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞。連接產物的轉化方法按《分子克隆操作指南》進行，主要步驟如下A、取連接產物4μl加入感受態細胞30μl置於1.5ml Ep管中，陰性對照為感受態細胞30μl置於1.5ml Ep管中；B、置於冰上30min，每隔幾分鐘輕彈；C、42℃水浴30Sec；D、冰上放置3min；E、加0.3ml SOC培養基(10ml SOC+50μl 2mol/L Mgcl2)，置於冰上；F、37℃，250rpm振搖1小時；G、取50μl轉化細胞+5μl 0.1g/ml Amp，均勻塗布於含Amp的平板，置37℃孵箱培養過夜。
4、限制性內切酶酶切圖譜分析重組質粒，並進行DNA序列分析，以保證重組質粒中Rantes插入片段的正確性。測序結果表明，重組質粒中含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
5、重組免疫毒素(Rantes-DT390)真核質粒在NIH3T3細胞中的表達(1)在轉染前24h，將NIH3T3細胞(購自invitrogen公司)接種於六孔培養板中，每孔細胞約1×106，置於37℃5％CO2孵箱培養；(2)待細胞長滿至約80-90％融合後，分別以SRα空質粒及Rantes-DT390 SRα質粒轉染真核細胞NIH-3T3，具體操作按Qiagen公司脂質體轉染試劑盒中的說明書進行；(3)質粒轉染後72h，收集細胞。將變性後的蛋白質marker和轉染後細胞裂解上清液在5％的濃縮膠和10％的分離膠中進行SDS-PAGE電泳；(4)電泳完備後，將凝膠上的蛋白質電轉移到硝酸纖維素濾膜上，電轉移後的膜用封閉液(約10％的PBS脫脂奶粉)封閉處理2h，再加入Rantes多克隆抗體應用液作用1h，充分洗滌後再加入酶標二抗兔抗羊IgG，作用1h。最後加底物顯色。
實施例2體外重組免疫毒素Rantes-DT390的生物活性測定1、蛋白合成抑制試驗(1)在無菌操作臺上取小鼠脾臟，獲得脾細胞懸液，接種於細胞培養瓶(約10×106個細胞/ml)，加入conA(10ug/ml)混合培養；(2)培養3天後，收穫細胞，計數並調整細胞濃度為1×106個細胞/ml；(3)轉入96孔細胞培養板(培養液為不含亮氨酸的DMEM培養基)，分別將上述轉染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀釋的濃度加入，50μl/孔，各濃度設立三復孔；(4)繼續培養24h，加入3H亮氨酸10μl(5μci/ml)，2h後收集細胞，液閃測定並計算蛋白合成抑制率(有關結果如圖2所示)。由此表明，重組免疫毒素Rantes-DT390對活化T細胞具有較強的細胞抑制效應。
2、流式細胞儀測定其細胞毒性(1)在無菌操作臺上取小鼠脾臟，用RPMI1640培養基製成脾細胞懸液，與conA(10ug/ml)混合培養；(2)培養3天後，加入上述轉染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀釋的濃度，50μl/孔，各濃度設立三復孔；(3)繼續培養24h，收集細胞，流式細胞儀測定免疫毒素Rantes-DT390分別對活化T、Th1、Th2細胞和B細胞的細胞毒性(CD4+T細胞膜表面標記；IFN-γTh1細胞內標記；IL-4Th2細胞內標記；CD19+B細胞膜表面標記)；(4)流式細胞儀測定結果顯示，T細胞及Th1細胞數目下降40％-60％，而對Th2及B細胞無此影響(如圖4所示)。由此表明重組免疫毒素Rantes-DT390具有良好的靶向特異性。
實施例3重組免疫毒素Rantes-DT390真核質粒對自身免疫性疾病動物模型EAE(experimental allergic encephalomyelitis)的初步治療效果1、EAE(Experimental Allergic Encephalomyelitis)動物模型的建立根據常規方法用C57BL/6小鼠建立EAE模型。
(1)用C57BL/6小鼠建立EAE動物模型，將自提的MBP粗提液與FCA(內含結核分枝桿菌5mg/ml)等體積混和，使用3ml注射器反覆推拉成為油包水的乳劑，採用腹腔注射的方法。
(2)免疫劑量每隻小鼠注射MBP∶FCA(1∶1)混和液0.4ml，百日咳桿菌菌液∶PBS(1∶50)混和液0.2ml(內含百日咳桿菌0.6-1.8×106個)。
(3)對照組每隻小鼠腹腔注射百日咳桿菌菌液與PBS混和液0.2ml(內含百日咳桿菌0.6-1.8×106個)。
(4)免疫時間第1天、第7天免疫兩次。
2.重組質粒對EAE模型的初步治療
(1)用Rantes-DT390重組質粒對EAE動物模型進行治療試驗治療時間在MBP免疫小鼠後第1天、第3天分別治療2次；治療方法使用陽離子脂質體包被的Rantes-DT390重組質粒，採用試驗小鼠大腿肌肉注射的方式；治療劑量50μg/只。
(2)觀察治療後治療組及未治療組的症狀表現，根據臨床評分標準進行打分(Kono分級法)，具體為0分沒有任何臨床症狀；1分動物尾部無力；2分動物尾部無力+前肢或後肢中等無力；3分前肢或後肢嚴重無力，人為翻身後不能恢復；4分肢體麻痺，人為翻身後不能恢復；5分瀕死狀態(有關結果如圖3所示)。
SEQUENCE LISTING110四川大學120針對活化Th1細胞的重組免疫毒素Rantes-DT390的質粒及製備方法與應用1601170PatentIn version 3.221012111386212DNA213小鼠4001ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt tgctagctac60cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct120ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac180gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg240gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa300actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg360gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc420gctgagggga gttctagcgt tgaatatatt aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc480gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt ggaaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag540tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca600tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg gataaaacta agacaaagat agagtctttg660aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg agcgaaagtc cggccaaaac agtatctgag720gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt catcaaacgg cattagagca tcctgaattg780tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat cctgtattcg ctggggctaa ctatgcggcg840tgggcagtaa acgttgcgca agttatcgat agcgaaacag ctgataattt ggaaaagaca900
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1.一種針對活化Th1細胞的重組免疫毒素基因，其特徵在於它具有序列表中SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列。
2.一種針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒，其特徵在於它含有權利要求1所述的核苷酸序列。
3.一種權利要求2所述的針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒的製備方法，其特徵在於依次包括以下步驟(1)通過RT-PCR反應，獲得Rantes基因；(2)將上述擴增的Rantes基因片段插入到含有DT390片段的真核質粒中構建重組質粒，再將重組質粒轉染至感受態細菌中進行擴增，然後篩選出含有正確插入片段的克隆；(3)利用限制性內切酶酶切圖譜分析重組質粒，並進行DNA序列分析；(4)通過蛋白合成抑制實驗測定重組免疫毒素質粒的表達活性。
4.根據權利要求3所述的針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒的製備方法，其特徵在於構建重組質粒可選用的真核質粒載體為SRα或pSecTag2。
5.權利要求2所述的針對活化Th1細胞的重組免疫毒素質粒在製備治療或預防自身免疫性疾病的藥中的應用。
全文摘要
一種針對活化Th1細胞的新型重組免疫毒素質粒，以趨化因子Rantes為導向分子、白喉毒素的活性片段DT390為毒素分子，通過基因重組構建而成。該免疫毒素質粒的製備方法包括重組質粒的構建、重組質粒轉染的工程菌的製備等步驟。該免疫毒素質粒具有嚴格的靶向性，可以通過Rantes的導向作用，以DT390特異性攻擊活化的Th1細胞，誘導特異性免疫耐受，從而避免了無選擇性地殺傷所有T細胞。特別適用於自身免疫性疾病和器官移植排斥反應的防治，亦可應用於某些腫瘤的治療。
文檔編號C12N15/11GK1641023SQ200410081390
公開日2005年7月20日 申請日期2004年12月3日 優先權日2004年12月3日
發明者張 林, 賈怡, 李虹, 陳文捷, 李明遠 申請人:四川大學