可誘導啟動子的製作方法

2023-06-05 11:27:31

專利名稱：可誘導啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物的廣譜疾病抗性，包括系統獲得性抗性(SAR)現象。更具體的說，本發明涉及編碼在植物中參與SAR基因表達調控的蛋白質的基因的鑑定、分離、和表徵。
背景技術：
植物經常受到極其多種致病性生物體的挑戰，包括病毒、細菌、真菌、和線蟲。農作物特別易受攻擊，因為它們通常是作為遺傳統一的單作物而種植的；當疾病攻擊時，損失可能是慘重的。然而，大多數植物具有其自身天生的針對致病性生物體的防禦機制。植物育種家和病理學家已經鑑定了植物病原體抗性的天然變異，並培育到許多農作物中。這些天然疾病抗性基因常常針對病原體提供高水平的抵抗力或免疫性。
系統獲得性抗性(SAR)是植物用於防禦病原體的複雜系統的一種成分(Hunt和Ryals，1996；Ryals等人，1996)。還可參閱美國專利號5,614,395。SAR是植物-病原體應答的一個特別重要方面，因為其是病原體可誘導的、針對廣譜傳染因子(包括病毒、細菌、和真菌)的系統抗性。當SAR信號轉導途徑遭到阻斷時，植物變得更加易受通常引起疾病的病原體的影響，而且它們還變得易受通常不會引起疾病的一些傳染因子的影響。(Gaffney等人，1993；Delaney等人，1994；Delaney等人，1995；Delaney，1997；Bi等人，1995；Mauch-Mani和Slusarenko，1996)。這些觀察結果指示SAR信號轉導途徑對維持植物健康是至關重要的。
在概念上，SAR應答可分成兩個階段。在起動階段，病原體感染受到識別，並釋放出信號，它經過韌皮部到達遠端組織。靶細胞感受到該系統信號，通過表達SAR基因和疾病抗性二者做出反應。SAR的維持階段指數周至植物整個壽命的一段時間，在此期間植物處於準穩定狀態，且疾病抗性得到維持(Ryals等人，1996)。
水楊酸(SA)積累似乎是SAR信號轉導所必需的。由於特定移植物的處理、苯丙氨酸氨裂合酶的後生性(epigenetic)遏制、或特異降解SA的水楊酸羥化酶的轉基因表達而不能積累SA的植物，也不能誘導SAR基因表達或疾病抗性(Gaffney等人，1993；Delaney等人，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1996；Maher等人，1994；Pallas等人，1996)。儘管有人提出SA可能擔當系統信號，然而目前仍有爭議，而且至今確鑿知道的也就是如果SA不能積累，那麼SAR信號轉導遭到阻斷(Pallas等人，1996；Shulaev等人，1995；Vernooij等人，1994)。
最近，擬南芥成為了研究SAR的模式系統(Uknes等人，1992；Uknes等人，1993；Cameron等人，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1994；Dempsey和Klessig，1995)。已經證明可在擬南芥中由病原體和化學品二者激活SAR，諸如SA、2，6-二氯異煙酸(INA)和苯並(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)(Uknes等人，1992；Vernooij等人，1995；Lawton等人，1996)。在用INA或BTH處理或者病原體感染後，至少三種發病機理相關(PR)蛋白質基因，即PR-1、PR-2、和PR-5，伴隨著抗性發動受到並列誘導(Uknes等人，1992，1993)。在菸草這種得到最佳表徵的物種中，病原體或免疫化合物的處理誘導至少九組基因的表達(Ward等人，1991)。通過用各種SAR基因轉化植物已經育成了轉基因疾病抗性植物(美國專利號5,614,395)。
已經分離了具有改良SAR信號轉導的許多擬南芥突變株(Delaney，1997)。這些突變株中首先是所謂的lsd(模擬疾病的損害)突變株和acd2(細胞死亡加速)(Dietrich等人，1994；Greenberg等人，1994)。這些突變株都具有葉上某種程度的自發壞死損害形成、SA水平升高、SAR基因的mRNA積累、和疾病抗性顯著增強。已經分離並鑑定了至少七種不同lsd突變株(Dietrich等人，1994；Weymann等人，1995)。另一類有趣的突變株是cim(組成性免疫性)突變株(Lawton等人，1993)。還可參閱美國專利號5,792,904和國際PCT申請WO 94/16077。就像lsd突變株和acd2，cim突變株具有升高的SA和SAR基因表達和抗性，但是與lsd或acd2不同，它們在葉上不展示可發覺的損害。cpr1(PR基因的組成性表達株)可能是cim突變株的一種類型；然而，因為沒有排除cpr1葉上顯微鏡可見損害的存在，cpr1可能是lsd突變株的一種類型(Bowling等人，1994)。
還分離了SAR信號遭到阻斷的突變株。ndr1(非種特異疾病抗性)是容許含有各種無毒基因的丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)和寄生霜黴(Peronospora parasitica)的通常無毒隔離群二者生長的突變株(Century等人，1995)。顯然，這種突變株在SAR信號的早期遭到阻斷。npr1(PR基因的不表達株)是在INA處理後不誘導SAR信號途徑表達的突變株(Cao等人，1994)。根據其在低細菌濃度接種後支持細菌感染的能力分離了eds(疾病易感性增強)突變株(Glazebrook等人，1996；Parker等人，1996)。某些eds突變株在表型上與npr1非常相似，而且最近證明eds5和eds53是npr1的等位基因(Glazebrook等人，1996)。nim1(非可誘導免疫性)是在INA處理後支持寄生霜黴(即引起霜黴病的媒介)生長的突變株(Delaney等人，1995；美國專利號5,792,904)。儘管nim1能夠在病原體感染後積累SA，然而它不能誘導SAR基因表達或疾病抗性，說明突變阻斷了SA下遊的途徑。nim1應答INA或BTH的能力也受到了削弱，說明阻斷位於這些化學品的作用下遊(Delaney等人，1995；Lawton等人，1996)。
已經分離並鑑定了分別負責nim1和npr1表型的擬南芥等位基因(Ryals等人，1997；Cao等人，1997)。野生型NIM1基因產物在擬南芥中參與導致SAR和基因-對-基因(gene-for-gene)疾病抗性二者的信號轉導級聯反應(Ryals等人，1997)。Ryals等人，1997還報導了nim1的五種其它等位基因，它們顯示變化很大的表型，由化學誘導的PR-1基因表達和真菌抗性遭到微弱削弱至非常強烈的阻斷。將野生型NPR1基因轉化到npr1突變株中不僅補足突變，恢復SAR誘導在PR基因表達和疾病抗性方面的響應性，而且使得轉基因植株在缺乏SAR誘導時對丁香假單胞菌的感染更有抗性(Cao等人，1997)。WO 98/06748描述了由擬南芥分離NPR1和由粘性菸草(Nicotiana glutinosa)分離同系物。還可參閱WO 97/49822、WO 98/26082、和WO 98/29537。
儘管進行了許多研究並採用了尖端且精細的農作物保護措施，包括植物的基因轉化，由於疾病造成的損失仍然保持每年數十億美元。因此，持續需要根據對植物中疾病抗性的遺傳基礎的不斷增長的理解來開發新的農作物保護措施。具體而言，長期需要鑑定、分離、和表徵在植物中參與導致系統獲得性抗性的信號轉導級聯反應的更多基因。
發明概述本發明著手解決上述長期需要，方法是在雙雜交篩選中使用擬南芥NIM1基因作為餌以鑑定與NIM1蛋白質相互作用的植物蛋白質。通過這種篩選可獲得新的NI16和NI19基因。通過來自其它植物諸如馬鈴薯和番茄的總細胞DNA的PCR擴增可獲得NI16基因的同系物。NI16基因在用水楊酸(SA)和苯並(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)處理以及接種病原體後受到快速誘導。NI16基因還在經過BTH處理的過量表達NIM1的植物中受到誘導。NI16基因的轉基因表達導致發病機理相關(PR)蛋白質PR-1的水平升高。誘導的PR-1量與存在的NI16量有關，即具有最高NI16表達的轉基因植株具有最高PR-1水平。認為NI16是SAR應答的必需成分，而且NI16的過量表達激活應答的子集。PR-1在過量表達NI16的nahG和nim1-1植株中也得到升高，這是重要的，因為nim1和nahG兩種植株其應答病原體而誘導PR-1的能力通常都是缺陷的。由此，NI16基因編碼在植物中參與SAR基因表達調控的蛋白質。NI16基因可在轉基因植物中表達，或是單獨的或是聯合NIM1蛋白質，以增強SAR基因諸如PR-1的表達。
具體而言，本發明致力於包含編碼SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、或SEQ ID NO23之胺基酸序列的序列的分離的核酸分子。
本發明還致力於包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、或SEQ ID NO22之編碼區的分離的核酸分子。
本發明還致力於包含編碼在植物中參與導致系統獲得性抗性的信號轉導級聯反應的蛋白質的序列的分離的核酸分子，其中所述序列包含20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個鹼基對的核苷酸區段，其在序列上與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、或SEQ ID NO22之編碼區的相應的連續的20、25、30、35、40、45、或50(優選20)個鹼基對的核苷酸區段相同。
本發明還致力於包含編碼在植物中參與導致系統獲得性抗性的信號轉導級聯反應的蛋白質的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列可用SEQ ID NO20和SEQ ID NO21所示引物通過聚合酶鏈式反應由來自植物的總細胞DNA進行鑑定。
本發明還涵蓋包含與本發明的編碼序列可操作連接的在植物中有活性的啟動子的嵌合基因、包含這樣的嵌合基因的重組載體，其中該載體能夠穩定轉化到宿主中、以及用這樣的載體穩定轉化的宿主。優選的是，所述宿主是植物，諸如下列農業重要農作物之一稻、小麥、大麥、黑麥、油菜、玉米、馬鈴薯、胡蘿蔔、甘薯、甜菜、蠶豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿蔔、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、辣椒、芹菜、西葫蘆、南瓜、黃瓜、蘋果、梨、榲桲、甜瓜、李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、菸草、番茄、高粱、和甘蔗。
另一方面，本發明提供了NI16啟動子的核酸序列。在一個實施方案中，NI16啟動子包含SEQ ID NO24(962bp)。在另一個實施方案中，NI16啟動子包含SEQ ID NO24的片段。例示性的SEQ ID NO24片段包括但不限於SEQ ID NO3核苷酸編號863上遊的區域(即SEQ IDNO25)、SEQ ID NO26(274bp)、和SEQ ID NO27(544bp)。在另一個實施方案中，NI16啟動子包含SEQ ID NO28(274bp)。
另外本發明涵蓋包含與目的基因的編碼序列可操作連接的NI16啟動子或其片段的嵌合基因，其中所述NI16啟動子或其片段在存在化學調節物時調控所述編碼序列的轉錄。在一個優選的實施方案中，所述編碼序列編碼酶，諸如可測定標誌物，由此可在嵌合基因的化學誘導的測定法中觀察標誌物的表達。在相關方面，本發明還體現為包含上述嵌合基因的重組載體，諸如質粒，以及用這樣的嵌合基因穩定轉化的植物或植物組織。
序列表中序列的簡述SEQ ID NO1- 擬南芥(Arabidopsis thaliana)NI16基因的全長cDNA序列。
SEQ ID NO2- 由SEQ ID NO1編碼的NI16蛋白質的胺基酸序列。
SEQ ID NO3- 擬南芥NI16基因區的基因組DNA序列，包括5′上遊啟動子序列。
SEQ ID NO4- 馬鈴薯NI16同系物的全長cDNA序列。
SEQ ID NO5- 由SEQ ID NO4編碼的馬鈴薯NI16的胺基酸序列。
SEQ ID NO6- 番茄NI16同系物的部分cDNA序列。
SEQ ID NO7- 由SEQ ID NO6編碼的番茄NI16的胺基酸序列。
SEQ ID NO8- 由大豆EST AI495102編碼的胺基酸序列。
SEQ ID NO9- 由大豆EST AI461039編碼的胺基酸序列。
SEQ ID NO10-由菸草G8-1基因編碼的胺基酸序列。
SEQ ID NO11-引物NIM5′RI。
SEQ ID NO12-引物NIM3′SalI。
SEQ ID NO13-引物NIMtrunc3′NcoI。
SEQ ID NO14-引物NIMloop5′RI。
SEQ ID NO15-引物16GSP1。
SEQ ID NO16-引物16GSP2。
SEQ ID NO17-引物16GSP3。
SEQ ID NO18-引物16F。
SEQ ID NO19-引物16R。
SEQ ID NO20-引物NI16-DegF。
SEQ ID NO21-引物NI16-DegR。
SEQ ID NO22-擬南芥NI19基因的基因組序列。
SEQ ID NO23-由SEQ ID NO22編碼的NI19蛋白質的胺基酸序列。
SEQ ID NO24-NI16(962bp)啟動子序列。
SEQ ID NO25-NI16(862bp)啟動子序列。
SEQ ID NO26-NI16(274bp)啟動子序列。
SEQ ID NO27-NI16(544bp)啟動子序列。
SEQ ID NO28-NI16(274bp)啟動子序列。
SEQ ID NO29-編碼含內含子序列的GUS報導基因的DNA序列(即GIG) 。
SEQ ID NO30-AtPR1啟動子。
SEQ ID NO31-SMAS啟動子。
定義在描述本發明時將使用下列術語，意圖將它們定義如下。
相關/可操作連接指兩種DNA序列在物理上或在功能上相關。例如，如果啟動子或調控DNA序列與編碼RNA或蛋白質的DNA序列可操作連接，或者這兩種序列的位置使得調控DNA序列將影響編碼或結構DNA序列的表達，則說它們「相關」。
嵌合基因這樣的重組DNA序列，其中啟動子或調控DNA序列與編碼mRNA或表達成蛋白質的DNA序列可操作連接或相關，使得調控DNA序列能夠調控相關DNA序列的轉錄或表達。正如在自然界中所發現的，所述嵌合基因的調控DNA序列通常不與所述相關DNA序列可操作連接。
編碼序列轉錄成RNA諸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA的核酸序列。優選的是，RNA繼而在生物體中翻譯而生成蛋白質。
互補指包含這樣的反向平行核苷酸序列的兩種核苷酸序列，即能夠在反向平行核苷酸序列的互補鹼基殘基之間形成氫鍵的基礎上彼此配對。
表達指植物中內源基因或轉基因的轉錄和/或翻譯。例如，在反義構建物的情況中，表達可僅指反義DNA的轉錄。
表達盒包含與目的核苷酸序列可操作連接的啟動子、能夠在適當宿主細胞中指導特定核苷酸序列表達的核酸序列，所述核苷酸序列又與終止信號可操作連接。它通常還包含核苷酸序列正確翻譯所必需的序列。包含目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，即其至少一種成分對其至少一種其它成分而言是異源的。表達盒還可以是天然存在的，但是以可用於異源表達的重組形式獲得。然而，表達盒對宿主而言通常是異源的，即表達盒的特定核酸序列不在宿主細胞中天然存在，必須通過轉化時間導入宿主細胞或宿主細胞的祖先。表達盒中的核苷酸序列的表達可在組成性啟動子或可誘導啟動子的控制之下，其中可誘導啟動子只在宿主細胞暴露於有些特定外部刺激物時起動轉錄。在多細胞生物體的情況中，諸如植物，啟動子還可以是對特定組織、或其它、或發育階段特異的。
基因位於基因組內且除上述編碼核酸序列以外包含負責控制編碼區段的表達即轉錄和翻譯的其它(主要是調控)核酸序列的限定區域。基因還可包含其它5′和3′非翻譯序列和終止序列。可存在的其它元件有例如內含子。
異源DNA序列術語「異源DNA序列」、「外源DNA區段」或「異源核酸」在用於本文時都指源自對特定宿主細胞而言是外來的來源的序列，或者如果來自相同來源，那麼由其最初的形式進行了修飾。由此，宿主細胞中的異源基因包括對特定宿主細胞而言是內源的但通過例如使用DNA改組進行了修飾的基因。該術語還包括天然存在DNA序列的非天然存在多拷貝。由此，該術語指對細胞而言是外來的或異源的DNA區段，或者對細胞而言是同源的但位於宿主細胞核酸內通常不會發現該元件的位置。外源DNA區段表達而生成外源多肽。
同源DNA序列與它所導入的宿主細胞天然相關的DNA序列。
同類編碼當核酸序列編碼的多肽與參考核酸序列編碼的多肽具有相同的胺基酸序列時，核酸序列與參考核酸序列同類編碼。
分離的在本發明的內容中，分離的核酸分子或分離的酶指經過人工離開其天然環境存在且因此不是天然產物的核酸分子或酶。分離的核酸分子或酶可以純化形式存在，或者可在非天然環境中存在，諸如例如重組宿主細胞。
最小啟動子在缺乏上遊激活時沒有活性或啟動子活性大大降低的啟動子元件，特別是TATA元件。在存在合適轉錄因子時，最小啟動子行使功能而容許轉錄。
天然的指存在於未轉化細胞的基因組中的基因。
天然存在的術語「天然存在的」用於描述可在自然界中發現的、與人類人工生成的截然不同的對象。例如，可由自然界中的來源分離的且未經人類在實驗室中刻意修飾的生物體(包括病毒)中存在的蛋白質或核苷酸序列就是天然存在的。
NI16與NIMl蛋白質相互作用的參與SAR信號轉導級聯反應的基因。
NIM1Ryals等人，1997中描述的參與SAR信號轉導級聯反應的基因。
NIM1由NIM1基因編碼的蛋白質。
核酸術語「核酸」指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非有明確限制，該術語涵蓋含有天然核苷酸的已知同系物的核酸，它們具有與參考核酸相似的結合特性且以與天然存在核苷酸相似的方式進行代謝。除非另有說明，特定核酸序列還隱含其保守修飾變體(如簡併密碼子替代)和互補序列以及明示的序列。具體而言，簡併密碼子替代可通過生成這樣的序列來實現，即其中一個或多個選定的(或所有)密碼子的第三個位置用混和鹼基和/或脫氧肌苷殘基替代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608，1985；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98，1994)。術語「核酸」或「核酸序列」還可與基因、cDNA、和由基因編碼的mRNA互換使用。在本發明的內容中，核酸分子優選是DNA區段。核苷酸通過它們的鹼基以下列標準縮寫表示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和鳥嘌呤(G)。
ORF開放讀碼框。
植物任何完整植株。
植物細胞植物的結構生理學單位，包含原生質體和細胞壁。植物細胞可以是分離單細胞或培養細胞的形式，或者作為更高組織單位諸如例如植物組織、植物器官、或完整植株的一部分。
植物細胞培養物植物單位諸如例如原生質體、細胞培養細胞、植物組織中的細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各個發育階段的胚的培養物。
植物材料指葉、莖幹、根、花或花部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、插條、細胞或組織培養物、或植物的任何其它部分或產物。
植物器官植物的清楚的且明顯的有結構且已分化部分，諸如根、莖幹、葉、花芽、或胚。
植物組織組織成結構和功能單位的一群植物細胞。包括植物中或培養中的任何植物組織。該術語包括但不限於完整植株、植物器官、植物種子、組織培養物和組織成結構和/或功能單位的任何細胞群。該術語聯合或缺乏上文所列或此定義以其它方式包含的任何具體植物組織類型的使用並非意圖排除任何其它植物組織類型。
啟動子編碼區上遊的非翻譯DNA序列，包含RNA聚合酶II的結合位點並起動DNA的轉錄。啟動子區還可包含擔當基因表達調控物的其它元件。
原生質體沒有細胞壁或只有部分細胞壁的分離植物細胞。
純化的術語「純化的」在用於核酸或蛋白質時，指核酸或蛋白質本質上不合在天然狀態與其相關的其它細胞成分。優選處於同質狀態，儘管它可以是幹的或含水的溶液。純度和同質性通常使用分析化學技術來測定，諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析。作為製品中的主要物質存在的蛋白質是基本上純化的。術語「純化的」指核酸或蛋白質在電泳凝膠中本質上產生一條帶。一般而言，這意味著核酸或蛋白質是至少約50％純的，更優選至少約85％純的，且最優選至少約99％純的。
重組DNA分子使用重組DNA技術連接在一起的DNA分子組合。
調控元件參與控制核苷酸序列表達的序列。調控元件包括與目的核苷酸序列可操作連接的啟動子和終止信號。它們還通常包括核苷酸序列正確翻譯所必需的序列。
可選擇標記基因其在植物細胞中的表達給予細胞以選擇優勢的基因。用可選擇標記基因轉化的細胞所擁有的選擇優勢可歸於它們在存在負選擇劑諸如抗生素或除草劑時與未轉化細胞的生長相比的生長能力。轉化細胞與未轉化細胞相比的選擇優勢還可歸於它們利用添加的化合物作為營養物、生長因子、或能源的增強的或全新的能力。選擇標記基因還指其在植物細胞中的表達給予細胞以消極和積極兩種選擇優勢的基因或基因組合。
顯著提高酶活性的提高大於測量技術內在誤差的極限，優選提高存在抑制物時野生型酶的活性的約2倍或更多，更優選提高約5倍或更多，且最優選提高約10倍或更多。
術語「同一的」或百分比「同一性」在兩種或多種核酸或蛋白質序列的語境中指根據使用下列序列比較算法之一的測量或通過目測檢查，兩種或多種序列或子序列在進行最大對應的比較和比對後相同或指定百分比的胺基酸殘基或核苷酸相同。
基本上同一的短語「基本上同一的」在兩種核酸或蛋白質序列的語境中指根據使用下列序列比較算法之一的測量或通過目測檢查，兩種或多種序列或子序列在進行最大對應的比較和比對後具有至少60％、優選80％、更優選90-95％、且最優選至少99％的核苷酸或胺基酸殘基同一性。
優選的是，基本同一性存在於長度為至少約50個殘基的序列區域上，更優選在至少約100個殘基的區域上，且最優選的是序列在至少約150個殘基的長度上是基本上同一的。在一個最優選的實施方案中，序列在編碼區的整個長度上是基本上同一的。此外，基本上同一的核酸或蛋白質序列基本上執行相同的功能。
對於序列比較，通常以一種序列充當測試序列與其進行比較的參考序列。在使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，根據需要指定子序列坐標，並指定序列比對程序參數。然後序列比較算法根據指定的程序參數計算測試序列對參考序列的百分比序列同一性。
用於比較的序列最佳比對可通過例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981的局部同源性算法)、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443，1970的同源性比對算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988的搜索相似性法、這些算法的計算機化執行程序(威斯康星遺傳學軟體包WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)、或目測檢查(一般參閱Ausubel等人，見下文)來進行。
適於測定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一種實例是BLAST算法，它描述於Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410，1990。用於進行BLAST分析的軟體公眾可通過國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。
該算法包括首先通過在檢索序列(query sequence)中鑑定長度為W的、在與資料庫序列中相同長度的詞比對時或是匹配或是滿足有些正面估值(positive-valued)閾得分T的短詞來鑑定高得分序列對(HSP)。T稱為鄰詞得分閾值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人，1990)。
這些初步鄰詞採樣充當起動搜索的種子以尋找包含它們的更長HSP。然後將詞採樣沿著每個序列相兩個方向延伸，直至累積比對得分增加。對於核苷酸序列，累積得分是使用參數M(一對匹配殘基的獎分；總是＞0)和N(錯配殘基的罰分；總是＜0)計算的。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。當累積比對得分由其最大實現值下降數量X，因一個或多個負面-得分殘基比對的累積而累積得分達到零或以下，或者到達任一序列的末端時，停止每個反向的詞延伸。BLAST算法參數W、T、和X決定了算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)採用詞長(W)＝11、期望值(E)＝10、截止值＝100、M＝5、N＝-4、和比較兩條鏈作為默認值。對於胺基酸序列，BLASTP程序採用詞長(W)＝3、期望值(E)＝10、和BLOSUM62評分矩陣作為默認值(參閱Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915，1989)。
除了計算百分比序列同一性以外，BLAST算法還進行兩種序列之間相似性的統計學分析(參閱如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小和概率(P(N))，它提供了兩種核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指標。例如，如果測試核酸序列與參考核酸序列的比較中的最小和概率小於約0.1，更優選小於約0.01，且最優選小於約0.001，那麼認為測試核酸序列與參考序列相似。
兩種核酸序列基本上同一的另一種指標是兩種分子在嚴謹條件下彼此發生雜交。短語「特異雜交」指在嚴謹條件下分子只與複雜混合物(如總細胞DNA或RNA)中存在的特定核苷酸序列發生結合、形成雙鏈(duplexing)、或雜交。「結合」指探針核酸與靶核酸之間的互補雜交，且包括通過降低雜交介質的嚴謹度可容納的微小錯配，以實現靶核酸序列的期望檢測。
「嚴謹雜交條件」和「嚴謹雜交清洗條件」在核酸雜交實驗諸如Southern和Northern雜交的語境中是隨序列而決定的，而且在不同的環境參數下是不同的。較長序列在較高溫度發生特異雜交。關於核酸雜交的廣泛指導可參閱Tijssen，1993，《Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes》，第I部分，第2章，「Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」，Elsevier，New York。一般而言，高嚴謹雜交和清洗條件選擇為比特定序列在限定離子強度和pH的熱熔點(Tm)低約5℃。通常，在「嚴謹條件」下，探針將與其靶子序列發生雜交，但與其它序列不發生雜交。
Tm是50％的靶序列與完全匹配的探針發生雜交的溫度(在限定的離子強度和pH下)。對特定探針選擇恰好與Tm相等的嚴謹條件。具有超過100個互補鹼基的互補核酸在濾膜上在Southern或Northern印跡中發生雜交的嚴謹雜交條件的實例是42℃的含1mg肝素的50％甲醯胺，並將雜交進行過夜。高嚴謹度清洗條件的實例是用72℃的0.15M NaCl清洗約15分鐘。嚴謹清洗條件的實例是用65℃的0.2x SSC清洗15分鐘(關於SSC緩衝液的描述可參閱Sambrook，見下文)。通常，在高嚴謹度清洗之前進行低嚴謹度清洗以清除背景探針信號。例如超過100個核苷酸的雙鏈體的中等嚴謹度清洗的實例是用45℃的1x SSC清洗15分鐘。例如超過100個核苷酸的雙鏈體的低嚴謹度清洗的實例是用40℃的4-6xSSC清洗15分鐘。對於較短探針(如約10至50個核苷酸)，嚴謹條件通常包括鹽濃度低於約1.0M Na離子，通常是約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3，而且溫度通常是至少約30℃。嚴謹條件還可以通過添加去穩定劑諸如甲醯胺來實現。一般而言，比用無關探針在特定雜交測定法中觀察到的信噪比高2倍(或更高)指示特異雜交的檢測。如果它們編碼的蛋白質是基本上同一的，那麼在嚴謹條件下彼此不發生雜交的核酸仍然是基本上同一的。這發生在例如使用遺傳密碼容許的最大密碼子簡併性創建核酸拷貝時。
下面是可用於克隆與本發明的參考核苷酸序列基本上同一的同源核苷酸序列的雜交/清洗條件組的實例優選的是，參考核苷酸序列與參考核苷酸序列在50℃的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中雜交，並在50℃的2X SSC、0.1％SDS中清洗；更希望在50℃的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交，並在50℃的1X SSC、0.1％SDS中清洗；仍然更希望在50℃的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交，並在50℃的0.5X SSC、0.1％SDS中清洗；優選在50℃的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中雜交，並在50℃的0.1X SSC、0.1％ SDS中清洗；更優選在50℃的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中清洗，並在65℃的0.1X SSC、0.1％SDS中清洗。
兩種核酸序列或蛋白質基本上同一的另一種指標是由第一種核酸編碼的蛋白質與由第二種核酸編碼的蛋白質具有免疫學交叉反應性或特異結合。由此，例如在兩種蛋白質只因保守替代而不同時，這兩種蛋白質通常是基本上同一的。
短語「特異性(或選擇性)結合於抗體」或「特異性(或選擇性)免疫反應性」在提及蛋白質或肽時，指存在蛋白質和其它生物製品異質群時對存在特定蛋白質具有決定性的結合反應。由此，在指定的免疫測定條件下，指定抗體結合特定蛋白質且不以顯著量結合樣品中存在的其它蛋白質。在這樣的條件下與抗體特異結合可能需要根據其對特定蛋白質的特異性而選擇的抗體。例如，可選擇針對具有由本發明任何核酸序列編碼的胺基酸序列的蛋白質製備的抗體來獲得對該蛋白質而非其它蛋白質除了多態變體具有特異性免疫反應性的抗體。多種免疫測定法形式可用於選擇對特定蛋白質具有特異性免疫反應性的抗體。例如，固相ELISA免疫測定法、Western印跡、或免疫組織化學常規用於選擇對蛋白質具有特異性免疫反應性的單克隆抗體。關於可用於測定特異性免疫反應性的免疫測定法形式和條件的描述可參閱Harlow和Lane，1988，《Antibodies，A Laboratory Manual》，ColdSpring Harbor Publications，New York，「Harlow and Lane」。通常，特異性或選擇性反應將是背景信號或噪音的至少兩倍，且更常見的是大於背景的10至100倍。
特定核酸序列的「保守修飾變異」指編碼同一的或本質上同一的胺基酸序列的那些核酸序列，或者其中核酸序列不編碼本質上同一的胺基酸序列。因為遺傳密碼的簡併性，許許多多功能同一的核酸編碼任何特定多肽。例如，密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、和AGG都編碼胺基酸精氨酸。由此，在由密碼子指定為精氨酸的每一個位置，該密碼子可改變成所述任何相應密碼子而不會改變所編碼的蛋白質。這樣的核酸變異就是「沉默變異」，它是「保守修飾變異」的一種。本文描述的編碼蛋白質的每一種核酸序列也包括任何可能的沉默變異，除非另有註解。技術人員將認識到，核酸中的每一個密碼子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密碼子ATG)都可通過標準技術進行修飾而生成功能同一分子。因此，編碼蛋白質的核酸的每一種「沉默變異」隱含在每一種所述序列中。
此外，技術人員將認識到在所編碼序列中改變、刪除或添加單個胺基酸或較小百分比胺基酸(通常小於5％，更常見的是小於1％)的個別替代、刪除或添加是「保守修飾變異」，其中改變導致用化學相似胺基酸替代原有胺基酸。提供功能相似胺基酸的保守替代表是本領域眾所周知的。下面的五組各自含有互為保守替代的胺基酸脂肪族，甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳香族，苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫，甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；鹼性，精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性，天冬氨酸(D)、穀氨酸(E)、天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)。還可參閱Creighton，1984，《Proteins》，W.H.Freeman and Company。另外，在所編碼序列中改變、刪除或添加單個胺基酸或較小百分比胺基酸的個別替代、刪除或添加也是「保守修飾變異」。
「子序列」指分別包含更長核酸或胺基酸(如蛋白質)序列的一部分的核酸或胺基酸序列。
在將額外核苷酸(或其它類似分子)摻入核酸時，核酸「得到延長」。最常見的是，這使用聚合物(如DNA聚合物)來進行，如在核酸的3′末端添加序列的聚合酶。
當來自兩種核酸各自的序列在後代核酸中組合時，兩種核酸是「重組的」。當兩種核酸都是重組的底物時，兩種序列是「直接」重組的。當兩種序列使用中間物諸如交換寡核苷酸重組時，兩種序列是「間接重組的」。對於間接重組，不超過一種序列是重組的實際底物，而在有些情況中，兩種序列都不是重組的底物。
兩種分子，例如配體和受體，之間的「特異結合親和力」指一種分子優先結合分子混合物中的另一種分子。
如果結合親和力為約1×104M-1至約1×106M-1或更大，那麼可認為分子的結合是特異性的。
轉化用於將異源DNA導入宿主細胞或生物體的過程。
「經轉化的」、「轉基因的」、和「重組的」指其中導入了異源核酸分子的宿主生物體，諸如細菌或植物。
核酸分子可穩定整合到宿主的基因組中，或者核酸分子也可作為染色體外分子存在。這樣的染色體外分子可以自主複製。轉化細胞、組織、或植株理解為不僅涵蓋轉化過程的最終產物，而且包括其轉基因後代。「未轉化的」、「非轉基因的」、或「非重組的」宿主指不含異源核酸分子的野生型生物體，如細菌或植物。
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克隆 編號保藏日期pRC25NRRL B-302392000年1月7日發明詳述在酵母雙雜交篩選中使用擬南芥NIM1基因(Ryals等人，1997)作為餌以分離新的NIM1相互作用物NI16和NI19。NI16基因在用水楊酸(SA)和苯並(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)處理以及接種病原體後受到快速誘導。NI16基因還在經過BTH處理的過量表達NIM1的植物中受到誘導。NI16基因序列包含與菸草G8-1基因具有高度同源性的區域，後者在用水楊酸處理後受到快速誘導，且響應很低濃度的水楊酸鹽。
使用5′RACE試劑盒測定了全長擬南芥NI16 cDNA，它編碼122個胺基酸的蛋白質。另外，由基因組文庫克隆得到了擬南芥NI16的基因組拷貝。基因組克隆還包含NI16 5′上遊啟動子區，它在與NI16基因組編碼區相鄰的區域中包含數個啟動子元件。這些啟動子元件包括串聯CaMV AS1基序，已知是SA可誘導的(Terzaghi和Cashmore，1995)；串聯TCA1基序，另一種常見的SA可誘導基序(Goldsbrough等人，1993)；MYCATR22元件，擬南芥脫水響應基因rd22(ABA誘導)中的MCY(rd22BPI)結合位點；PAL盒，歐芹中苯丙氨酸氨裂合酶家族的三種推定順式作用元件之一；和HEXAMERAT4元件，擬南芥組蛋白H4啟動子的六鹼基基序。因為NI16基因在用SAR誘導物SA和BTH處理後受到快速誘導，所以預測NI16啟動子可用廣泛的已知SAR誘導物來誘導，且因此可用於美國專利號5,614,395關於菸草PR-la啟動子和WO 98/03536關於擬南芥PR-1啟動子描述的相同目的。
根據本發明，NI16和NI19基因序列可使用下文實施例中描述的技術來分離，或者通過PCR並使用序列表中列舉的NI16序列(SEQ ID NO1或SEQ ID NO3)或NI19序列(SEQ ID NO22)作為構建PCR引物的基礎。例如，與大致NI16編碼序列或其互補序列的最前和最後20-25個連續核苷酸的序列對應的寡核苷酸(如SEQ ID NO20和SEQ ID NO21)可作為PCR引物用於直接由來自來源植物諸如擬南芥、馬鈴薯或番茄的cDNA或基因組文庫擴增NI16基因序列。由此，序列表中列舉的NI16和NI19基因序列以及來自其它植物的同源NI16和NI19基因序列可同樣通過PCR由cDNA和基因組文庫擴增得到。
NI16基因的轉基因表達導致PR-1的組成性表達。因此，NI16基因編碼參與SAR基因表達調控的蛋白質。
可使用標準遺傳工程技術將本發明的NI16或NI19編碼序列插入為植物設計的表達盒以構建依照本發明的嵌合基因。適於在選定的植物宿主中實現期望的表達型式和水平的特異調控序列諸如啟動子、信號序列、5′和3′非翻譯序列、和增強子的選擇屬於本領域常規技術範圍之內。可將由此得到的包含在正確讀碼框中相連的各種元件的分子插入能夠轉化到宿主植物細胞中的載體中。
能夠在植物細胞中發揮功能的啟動子(即能夠在植物細胞中驅動相關編碼序列諸如編碼NI16或NI19蛋白質的序列表達的啟動子)的實例包括擬南芥和玉蜀黍遍在蛋白質啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S或35S啟動子和CaMV雙重啟動子；稻肌動蛋白啟動子；來自菸草、擬南芥、或玉蜀黍的PR-1啟動子；胭脂鹼合酶啟動子；核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssuRUBISCO)啟動子，等等。尤其優選擬南芥遍在蛋白質啟動子。啟動子自身可依照本領域公認的程序進行修飾以操縱啟動子強度，從而提高相關編碼序列的表達。優選用於本發明的啟動子是賦予高水平組成性表達的啟動子。
可將信號或轉運肽與NI16編碼序列在本發明的嵌合DNA構建物中融合以指導所表達蛋白質轉運至期望的作用部位。信號肽的實例包括與植物發病機理相關蛋白質如PR-1、PR-2、等等天然相連的信號肽。參閱如Payne等人，1988。轉運肽的實例包括葉綠體轉運肽，諸如VonHeijne等人，1991、Mazur等人，1987、和Vorst等人，1988中描述的轉運肽；以及線粒體轉運肽，諸如Boutry等人，1987中描述的轉運肽。還包括導致所編碼蛋白質定位於各種細胞區室諸如液泡的序列。參閱例如Neuhaus等人，1991和Chrispeels，1991。
本發明的嵌合DNA構建物可包含多個拷貝的啟動子或多個拷貝的本發明NI16或NI19編碼序列。另外，構建物包含標記物的編碼序列和其它肽的標記物，諸如信號或轉運肽，每一個都與DNA分子中的其它功能元件位於正確的讀碼框中。這些構建物的製備屬於本領域普通技術水平之內。
有用的標記物包括提供除草劑、抗生素或藥物抗性的肽，諸如例如對原卟啉原氧化酶抑制物、潮黴素、卡那黴素、G418、艮他黴素、林肯黴素、氨甲喋呤、草甘膦、膦絲菌素、等等的抗性。這些標記物可用於由未轉化細胞選擇經本發明嵌合DNA構建物轉化的細胞。其它有用的標記物有可通過可視反應例如顯色反應容易檢測的肽酶，例如螢光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、或β-半乳糖苷酶。
可通過許多本領域公認的方法將為植物表達設計的嵌合基因諸如本文設計的嵌合基因導入植物細胞。本領域技術人員將領會，方法的選擇可能取決於轉化所靶向的植物(即單子葉植物或雙子葉植物)和/或細胞器(即核、葉綠體、線粒體)的類型。適於轉化植物細胞的方法包括顯微注射(Crossway等人，1986)、電穿孔(Riggs等人，1986)、農桿菌介導的轉化(Hinchee等人，1988；Ishida等人，1996)、直接基因轉移(Paszkowski等人，1984；Hayashimoto等人，1990)、和使用可由Agracetus公司(Madison，Wisconsin)和Dupont公司(Wilmington，Delaware)購買的裝置進行的彈果微粒加速(參閱例如美國專利號4,945,050；和McCabe等人，1988)。還可參閱Weissinger等人，1988 Sanford等人，1987(洋蔥)；Christou等人，1988(大豆)；McCabe等人，1988(大豆)；Datta等人，1990(稻)；Klein等人，1988(玉蜀黍)；Klein等人，1988(玉蜀黍)；Klein等人，1988(玉蜀黍)；Fromm等人，1990；和Gordon-Kamm等人，1990(玉蜀黍)；Svab等人，1990(菸草葉綠體)；Gordon-Kamm等人，1993(玉蜀黍)；Shimamoto等人，1989(稻)；Christou等人，1991(稻)；Datta等人，1990(稻)；歐洲專利申請EP 0 332 581(鴨茅和其它早熟禾亞科)；Vasil等人，1993(小麥)；Weeks等人，1993(小麥)；Wan等人，1994(大麥)；Jahne等人，1994(大麥)；Umbeck等人，1987(棉)；Casas等人，1993(高粱)；Somers等人，1992(燕麥)；Torbert等人，1995(燕麥)；Weeks等人，1993(小麥)；WO 94/13822(小麥)；和Nehra等人，1994(小麥)。用於通過微彈轟擊將重組DNA分子導入玉蜀黍的特別優選的一組實施方案可參閱Koziel等人，1993；Hill等人，1995；和Koziel等人，1996。另一個優選的實施方案是EP 0292 435中公開的用於玉蜀黍的原生質體轉化法。
一旦將包含NI16或NI19編碼序列的嵌合基因轉化到特定植物物種中，可使用傳統育種技術使它在該物種中繁殖或移動到相同物種的其它品種中，特別包括商業品種。本發明優選的植物包括裸子植物、單子葉植物、和雙子葉植物，尤其是農業上重要的農作物植物，諸如稻、小麥、大麥、黑麥、油菜、玉米、馬鈴薯、胡蘿蔔、甘薯、甜菜、蠶豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿蔔、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、辣椒、芹菜、西葫蘆、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、榲桲、甜瓜、李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、菸草、番茄、高粱、和甘蔗。上文描述的改造到轉基因種子和植物中的遺傳特性通過有性繁殖傳代，且由此可在後代植株中得到維持和繁殖。
實施例通過下面的詳細流程、製備、和實施例更為詳細的例示了本發明。實施例僅僅用於例示目的，而非解釋為限制本發明的範圍。本文所使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的，且描述於Sambrook等人，1989；T.J.Silhavy、M.L.Berman、和L.W.Enquist，1984；及Ausubel，F.M.等人，1987。
I.NIM1相互作用物的分離實施例1NIM1雙雜交篩選在酵母雙雜交篩選中使用擬南芥NIM1基因(Ryals等人，1997)作為餌。所用篩選系統是基於最初由Fields和Song(1989)開發且稍後由Gyuris等人(1993)修改的LexA版本雙雜交篩選系統。使用PCR產物(引物NIM5′RI和NIM3′SalI，見下文表1)將全長NIM1基因序列克隆到餌質粒pEG202(Gyuris等人，1993)中，作為與LexA DNA結合結構域的融合物。使用編碼NIM1蛋白質(Ryals等人，1997)前450個胺基酸的核苷酸序列及引物NIM5′RI和NIMtruncNCOI3′構建另一種餌(NIM450)。使用引物NIMloop5′RI和NIM3′SalI克隆只含有編碼NIM1蛋白質(Ryals等人，1997)胺基酸366-594的NIM1基因C端部分的第三種餌。將這些餌轉化到包含與Leu2基因融合的低靈敏度LexA操縱基因的酵母菌株EGY188中，並進行適當測試以確定NIM1融合蛋白是否內在激活酵母報導基因的表達。使用來自經丁香假單胞菌感染的擬南芥葉片的RNA在質粒pJG4-5中構建酵母表達文庫(來自Jeff Dangl，UNC-Chapel Hill)。該文庫編碼所表達擬南芥基因與B42轉錄激活結構域的融合蛋白。將文庫連同上述三種NIM1餌之一和含有與LacZ融合的2個LexA操縱基因作為第二報導基因的質粒一起進行轉化。在篩選用每種餌分析了大約106個轉化子，通過標準流程分離激活Leu2和LacZ兩種報導基因的個別克隆並測序。最頻繁分離得到的克隆(NI16)用NIM366-594餌找到了25次，用全長餌找到了12次。NI16克隆不與NIM450餌發生相互作用。
使用購自BRL Life Technologies的5′RACE試劑盒測定了全長NI16 cDNA。將cDNA引物16GSP1用於cDNA合成。然後，在TdT裝尾反應後，將引物16GSP2連同製造商提供的刪節錨引物用於通過PCR擴增cDNA產物。將第三種引物16GSP3連同GSP2引物用作PCR對照。擴增得到cDNA片段，克隆到pCR2.1載體(Clonetech)中，並測序。
全長擬南芥NI16 cDNA序列顯示為SEQ ID NO1，而所編碼的122個胺基酸的蛋白質序列顯示為SEQ ID NO2。NI16基因序列包含與菸草G8-1基因具有高度同源性的區域，後者在用水楊酸處理後受到快速誘導，且響應很低濃度的水楊酸鹽(Horvath等人，1996)。
實施例2NI16 mRNA的誘導1.水楊酸和BTH誘導NI16 mRNA由噴灑水、5mM水楊酸鈉溶液(SA)、或300μm苯並(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)溶液的4周齡Wassilewskija(WS-0)植株製備RNA。Ward等人(1991)和Lawton等人(1996)已經證明SA和BTH都在擬南芥中激活SAR且誘導發病機理相關(PR)基因表達。如Ausubel等人(1987)先前所述進行RNA提取和RNA印跡雜交。NI16 RNA在SA或BTH誘導15分鐘內誘導5-10倍，並在SA處理2小時內達到峰值大約50倍誘導，且用BTH處理達到25倍誘導。轉錄物在SA處理後可長達24小時而在BTH處理後至少48小時保持高度誘導。
2.NI16 mRNA應答病原體感染而被誘導而在NahG或nim1-4植株中不被誘導如Lawton等人(1995)先前所述，用含有avrRPM1基因的無毒病原體丁香假單胞菌番茄致病變種(P.s.t.)感染WS-0植株。將四周齡植株的三片葉子在一半中脈上接種緩衝液或P.s.t.，並在0、2、4、6、12、24、48、和72小時時收集局部和系統組織。NI16在局部組織中在4小時內被誘導，而在系統組織中在6小時內誘導5倍，並在感染後至多達72小時保持誘導。在一個分開的實驗的，將WS-0、nim1-4、和NahG植株接種相同的P.s.t.隔離群，並在48小時後收集系統組織。儘管用化學誘導物2，6-二氯異煙酸進行了處理，根據其應答化學誘導和病原體處理的PR-1積累及其對病原體易感性的測量，nim1-4植株其應答病原體的能力受損(Ryals等人，1997)。NahG植株表達細菌水楊酸羥化酶(nahG)基因，且不能積累水楊酸(Gaffney等人，1993和Delaney等人，1994)。在野生型WS-0植株中，NI16在P.s.t.接種後被誘導大約4倍，但在NahG植株中不誘導且在nim1-4植株中只有輕微誘導。在另一個實驗中，nim1-4植株在BTH處理後被2和24小時不能積累NI16轉錄物。由這些實驗結果可以得出結論，水楊酸和功能性NIM1蛋白質是應答病原體誘導NI16所必需的。
實施例3NI16和相關啟動子序列的基因組克隆依照製造商的方案將NI16的基因組拷貝由λZapII文庫(Stratagene)克隆到載體pBluescript中。由文庫得到兩個分開的克隆。克隆4-1包含3.1kb的NI16上遊序列和NI16編碼區，直至內部EcoRI位點(見SEQ ID NO1)。第二個克隆5-1包含the EcoRI位點的3′序列和3.1kb的NI16下遊序列。通過首先由克隆4-1刪除1.87kbBglII/BamHI片段，然後將來自克隆5-1的350bp的EcoRI/EcoRV片段連接到克隆4-1剩餘的EcoRI和EcoRV位點中，得到了完整的基因組克隆。將基因組克隆測序，得到NI16基因組序列，顯示為SEQ ID NO3。啟動子元件位於與NI16基因組編碼區相鄰的5′上遊區域(見SEQ ID NO3)。含有質粒pRC25(在pBluescript中包含大約1.9kb BglII/EcoRV基因組NI16片段)的大腸桿菌菌株DH5α已經於2000年1月7日保藏於NRRL，並指派編號NRRL B-30239。
實施例4NI16的轉基因表達導致組成性PR-1表達在二元載體pBAR35S(來自Jeff Dangl，UNC-Chapel Hill)中製備NI16構建物。首先，通過將NI16的5′序列(通過5′RACE獲得並克隆到AT載體pCR2.1中)作為EcoRI片段克隆到最初pJG4-5克隆的EcoRI位點中，得到了全長克隆。然後，用引物16F和16R(表1)將NI16的整個編碼區PCR克隆回pCR2.1中。用XbaI和SacI切割由此得到的質粒，用於克隆到pBAR35S中。將克隆轉化到農桿菌菌株GV3101(Koncz和Schell，1986)中。使用標準流程轉化WS-0和nim1-4植株，並通過發芽後隔天噴灑60μg/ml BASTA溶液達6天來選擇由此得到的T1種子。4周後對BASTA抗性植株分析N116和PR-1 RNA水平。
回收得到4株高於野生型水平表達NI16的WS-0植株。根據Northern印跡的檢測，它們都具有升高的PR-1 RNA水平。將所有4株植株都培育至T3代。對兩株T3系進行定量Northern，一個具有相對較低水平的NI16RNA(1-1B)，一個具有高水平的NI16 RNA(2-1B)。將Northern印跡與NI16和PR-1探針進行雜交。測量是使用Molecular Dynamics感光成像儀進行的，它直接測量每個單位面積的計數。PR-1 RNA的數量與NI16 RNA的數量直接相關，即NI16的最高表達具有最高水平的PR-1(表2)。以低於通常用於提供針對寄生霜黴的保護的比率施用BTH在轉基因系中沒有顯著提高NI16 RNA的數量。PR-1水平在相同比率在兩個NI16系中像WS-0對照一樣受到誘導，然而，穩定狀態PR-1水平更高，尤其在0和10μM BTH。因此，NI16可能是SAR應答所必需的，且NI16的過量表達可能激活應答子集。PR-1在過量表達NI16的nahG、nim1-1和nim1-4植株中也升高。在34株含有35S-NI16構建物的nim1-1 T1植株中，22株具有升高的PR-1水平。類似的，18/26株nim1-4和20/27株nahG原始轉化株具有升高的PR-1水平。在每種情況中，高NI16表達與高PR-1水平相關。這是重要的，因為nim1和nahG植株其應答病原體而誘導PR1的能力通常是缺陷的。此外，這為NI16的過量表達可至少部分補償植物中SA和功能性NIM蛋白質的缺乏提供了證據。
實施例5通過PCR由馬鈴薯和番茄克隆的NI16同系物使用Marathon cDNA擴增試劑盒由馬鈴薯和番茄克隆NI16的同系物。依照製造商的說明書，由馬鈴薯和番茄polyA RNA製備cDNA，並在兩個末端連接接頭。通過比較擬南芥NI16序列與菸草G8-1序列(Horvath等人，1998)來設計簡併引物。然後使用引物NI16 degR1(SEQ ID NO20)和NI16 degF1(SEQ ID NO21)連同Clonetech提供的接頭引物來擴增cDNA的5′和3′末端。然後使用購自Invitrogen的TOPO-TA克隆試劑盒克隆PCR產物並測序。回收得到完整的馬鈴薯cDNA(SEQ ID NO4)和番茄cDNA的3′端(SEQ ID NO6)。下文表3顯示了擬南芥、馬鈴薯、和番茄克隆以及由菸草G8-1基因和通過BLAST同源性鑑定的兩種大豆EST(AI495102和AI461039)編碼的多肽序列的序列比對。所有cDNA都編碼小蛋白質(＜122個胺基酸)，它們具有在6種序列間45％同一且82％相似的22個胺基酸的核心基序(粗體)。
表1NIM1和NI16克隆中所使用的引物
*n＝a、c、t、或g；y＝c或t；r＝a或g。
表2野生型擬南芥和過量表達NI16的兩種株系中用0、10或100μm BTH誘導後24小時的NI16和PR-1相對水平
表3NI16同源序列的比對AI495102---MEVEKRKNKRVMGEEEESERVKNKRLKGVEEEDGSDGVPTEEEVEEFFAILRRMRMA 57AI461039--------------------------------------GGVPTEEEVEEFFAILRRMRVA 22馬鈴薯 MLLMDGEKKRKRTAIG-------AGDRSKDEVEATVKEEEPPSEAEXDEFFAILRRMHVA 53番茄------------------------------------------SEGEVDEFFAILRRMHMA 18G8-1---MDGEKKRKRTENGKANGGDRNRHERKSAANEHTAVSPPPSEAEVDEFFAILRRMHVA 57NI16---MNNSLKKEERVEED------NGKSDGNRGKPSTEVVRTVTEEEVDEFFKILRRVHVA 51★ ★★★★ ★★★★★AI495102VKYFDDKGRGGRE-WREAL----------------------------------------- 75AI461039VKYFDDKGSGGKE-WRKALETAELTVDHRHDVVAAEEDDKPRKKGGEVI--INEGFDLNA 79馬鈴薯 VKYLQRNAQIRPE-NLNAS-------PA-----GANGVAAGRKRERGIV--RKGDLDLNT 98番茄VKYLQRNAQIQPE-NVNAHGSKLTASPA-----GVNGDATGQKRERGIV--RKGDLDLNT 70G8-1VRYLQESGQKR---------------------------VVP-----------KGDLDLNT 79NI16TRTVAKVNGGVAEGELPSKKRKRSQNLGLRNSLDCNGVRDGEFDEINRVGLQGLGLDLNC 111AI495102----------- (SEQ ID NO8)AI461039VAPEAAEGGGA 90(SEQ ID NO9)馬鈴薯 LPDGGD-----104(SEQ ID NO5)番茄LPDCGDT----77 (SEQ ID NO7)G8-1LPGNGD-----85 (SEQ ID NO10)NI16KPEPDSVSLSL 122 (SEQ ID NO2)
實施例6NIM1相互作用物NI19的分離除了NI16 cDNA克隆，還可在實施例1描述的雙雜交篩選中分離NI19克隆。在用NI19 cDNA克隆對基因庫資料庫進行blast搜索後找到了全長克隆。基因庫(#F14J9)中的細菌人工染色體(BAC)與鹼基19726-19439的序列匹配。使用GCG seqweb翻譯額外的側翼序列(鹼基19726-20000)。在鹼基19897-19513之間找到了開放讀碼框，給出112個胺基酸的預測蛋白質。全長擬南芥NI19基因組序列顯示為SEQID NO22，而所編碼的112個胺基酸的蛋白質序列顯示為SEQ ID NO23。SEQ ID NO22的核苷酸127-413代表了在NIM1雙雜交篩選中分離得到了最初cDNA克隆。
II.本發明的基因序列在植物中的表達可使用常規重組DNA技術將本發明的NIM1相互作用物NI16摻入植物細胞。一般而言，這包括使用本領域知道的標準克隆程序將本發明的編碼序列插入對其而言該編碼序列是異源的(即通常不存在的)表達系統。該載體含有所插入蛋白質編碼序列的轉錄和翻譯所必需的元件。可使用本領域知道的多種載體系統，諸如質粒、噬菌體病毒和其它改良病毒。合適的載體包括但不限於病毒載體，諸如λ載體系統λgt11、λgt10和Charon 4；質粒載體，諸如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；和其它類型系統。表達系統的成分還可進行修飾以提高表達。例如，可採用截短的序列、核苷酸替代或其它修飾。本文所述表達系統實際上可用於在合適條件下轉化任何農作物植物細胞。可使轉化細胞再生成完整植株，使得NIM1相互作用物在轉基因植株中提高SAR基因(如PR-1)表達。
實施例7植物表達盒的構建首先在表達盒中在可在植物中表達的合適啟動子後裝配意圖在轉基因植物中表達的編碼序列。表達盒還可包含轉基因表達所需要的或選擇的任何其它序列。這些序列包括但不限於轉錄終止子、增強表達的外來序列諸如內含子、要害序列(vital sequence)、和意圖將基因產物靶向特定細胞器和細胞區室的序列。然後可將這些表達盒容易的轉移到下文描述的植物轉化載體中。下文是典型表達盒的各種成分的描述。
1.啟動子表達盒中所使用的啟動子的選擇將決定轉基因在轉基因植物中的空間和時間表達型式。所選擇的啟動子將在特定細胞類型(諸如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)中或在特定組織或器官(例如根、葉或花)中表達轉基因，而且選擇將反映期望基因產物積累的部位。或者，所選擇的啟動子可在多種誘導條件下驅動基因表達。啟動子的強度即啟動轉錄的能力有所不同。根據所採用的宿主細胞系統，可使用多種合適的啟動子，包括基因的天然啟動子。下面是可用於表達盒的啟動子的非限制性實例。
a.組成性表達，遍在蛋白質啟動子遍在蛋白質是已知在許多細胞類型中積累的基因產物，而且已經由數個物種克隆了它的啟動子以用於轉基因植物(如向日葵-Binet等人，Plant Science 7987-94，1991；玉蜀黍-Christensen等人，Plant Molec.Biol.12619-632，1989；和擬南芥-Callis等人，J.Biol.Chem.26512486-12493，1990和Norris等人，Plant Mol.Biol.21895-906，1993)。已經在轉基因單子葉植物系統中開發了玉蜀黍遍在蛋白質啟動子， 而且專利出版物EP 0 342 926(Lubrizol)公開了它的序列和為單子葉植物轉化而構建的載體，將其引入本文作為參考。Taylor等人(Plant Cell Rep.12491-495，1993)描述了包含玉蜀黍遍在蛋白質啟動子和第一個內含子的載體(pAHC25)，以及它通過微彈轟擊誘導後在許多單子葉植物的細胞懸浮液中的高活性。擬南芥遍在蛋白質啟動子對於與本發明的核苷酸序列一起使用是理想的。清蛋白啟動子適於轉基因植物中的基因表達，包括單子葉植物和雙子葉植物二者。合適的載體是通過引入適當遍在蛋白質啟動子和/或內含子序列而修飾的pAHC25衍生物或本申請中描述的任何轉化載體。
b.組成性表達，CaMV 35S啟動子已出版的專利申請EP 0 392 225(實施例23)描述了質粒pCGN1761的構建，將其引入本文作為參考。pCGN1761含有「雙重」CaMV 35S啟動子和tm1轉錄終止子，在啟動子和終止子之間具有唯一的EcoRI位點，且具有pUC型主鏈。構建了這樣一種pCGN1761衍生物，它具有除現有EcoRI位點以外包含NotI和XhoI位點的經修飾多接頭。將該衍生物命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用於在其多接頭中克隆cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列))，以用於在轉基因植物中在35S啟動子的控制下表達它們的目的。可經由啟動子5′端的HindIII、SphI、SalI和XbaI位點及終止子3′端的XbaI、BamHI和BglI位點切下這種構建物的整個35S啟動子-編碼序列-tm1終止子盒以轉移到轉化載體中，諸如下文所描述的。此外，可通過HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI的5′切割及任何多接頭限制性位點(EcoRI、NotI或XhoI)的3′切割切下雙重35S啟動子片段以用另一種啟動子替換。如果需要，通過引入可增強翻譯的序列，可在克隆位點附近進行修飾。這在需要過量表達時特別有用。例如，可通過如美國專利號5,639,949的實施例37所述優化翻譯起始位點來修飾pCGN1761ENX，將其引入本文作為參考。
c.組成性表達，肌動蛋白啟動子已知數種同種型(isoform)肌動蛋白在大多數細胞類型中表達，因此肌動蛋白啟動子是組成性啟動子的優良選擇。具體而言，已經克隆並鑑定了來自稻ActI基因的啟動子(McElroy等人，Plant Cell 2163-171，1990)。發現啟動子的1.3kb片段含有在稻原生質體中進行表達所必需的所有調控元件。此外，已經構建了基於ActI啟動子的許多表達載體，專門用於單子葉植物(McBlroy等人，Mol.Gen.Genet.231150-160，1991)。它們引入了ActI-內含子1、AdhI 5′側翼序列和AdhI-內含子1(來自玉蜀黍乙醇脫氫酶基因)、和來自CaMV 35S啟動子的序列。顯示最高表達的載體是35S與ActI內含子或者ActI 5′側翼序列與ActI內含子的融合物。(GUS表達基因的)起始ATG附近序列的優化也增強表達。McElroy等人(Mol.Gen.Genet.231150-160，1991)描述的啟動子表達盒可容易的為基因表達進行修飾，而且特別適合用於單子葉植物宿主。例如，由McElroy的構建物切下含啟動子片段，並用於替換pCGN1761ENX中的雙重35S啟動子，然後可用於插入特定基因序列。然後可將由此構建的融合基因轉移到適當的轉化載體中。在一份分開的報告中，還發現稻ActI啟動子及其第一個內含子在培養的大麥細胞中指導高表達(Chibbar等人，Plant Cell Rep.12506-509，1993)。
d.可誘導表達，PR-1啟動子pCGN1761ENX中的雙重35S啟動子可用將導致合適高表達水平的任何其它啟動子選擇替換。例如，可用美國專利號5,614,395中描述的一種化學可調控啟動子諸如菸草PR-la啟動子替換雙重35S啟動子。或者，可使用Lebel等人，Plant J.16223-233，1998中描述的擬南芥PR-1啟動子。優選使用限制酶由其來源切下選擇的啟動子，或者可使用攜帶適當末端限制性位點的引物通過PCR擴增。如果採取PCR擴增，那麼應當在將擴增的啟動子克隆到靶載體中後對啟動子重新測序以檢查擴增錯誤。由質粒pCIB1004切下化學/病原體可調控的菸草PR-la啟動子(用於構建，參閱EP 0 332 104的實施例21，將其引入本文作為參考)，並轉移到質粒pCGN1761ENX(Uknes等人，Plant Cell 4645-656，1992)中。用NcoI切割pCIB1004，並通過T4 DNA聚合酶處理將由此產生的線性化片段的3′凸出補平。然後用HindIII切割該片段，將由此得到的含PR-la啟動子片段凝膠純化，並克隆到切除了雙重35S啟動子的pCGN1761ENX中。這是這樣進行的，用XhoI切割並用T4聚合酶補平，隨後用HindIII切割並分離含載體終止子的較大片段，向其中克隆pCIB1004啟動子片段。這生成了具有PR-1a啟動子和tm1終止子的pCGN1761ENX衍生物，具有唯一EcoRI和NotI位點的多接頭介於二者之間。可將選擇的編碼序列插入該載體，隨後可將融合產物(即啟動子-基因-終止子)轉移到任何選定轉化載體中，包括下文所描述的。可採用多種化學調節物來誘導選定編碼序列在依照本發明轉化的植物中的表達，包括美國專利號5,523,311和5,614,395中公開的苯並噻二唑、異煙酸、和水楊酸化合物。
e.可誘導表達，乙醇可誘導啟動子某些醇或酮諸如乙醇可誘導的啟動子也可用於賦予本發明的編碼序列以可誘導表達。這樣的啟動子有例如來自構巢麴黴(Aspergillusnidulans)的alcA基因啟動子(Caddick等人，Nat.Biotechnol.16177-180，1998)。在構巢麴黴中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，它的表達在存在化學誘導物時受到AlcR轉錄因子的調控。為了本發明的目的，用本發明的編碼序列替換包含與最小35S啟動子融合的alcA基因啟動子序列的質粒palcACAT中的CAT編碼序列(Caddick等人，Nat.Biotechnol.16177-180，1998)以形成在alcA基因啟動子的控制之下具有編碼序列的表達盒。這是使用本領域眾所周知的方法進行的。
f.可誘導表達，糖皮質激素可誘導啟動子還設想了使用基於類固醇激素的系統誘導本發明核酸序列的表達。例如，採用糖皮質激素介導的誘導系統(Aoyama和Chua，The PlantJournal 11605-612，1997)，並通過施用糖皮質激素誘導基因表達，例如合成的糖皮質激素，優選地塞米松，優選0.1mM-1mM的濃度範圍，更優選10mM-100mM。為了本發明的目的，用本發明的核酸序列替換螢光素酶基因序列以形成在與35S最小啟動子融合的六個拷貝的GAL4上遊激活序列的控制之下具有本發明核酸序列的表達盒。這是使用本領域眾所周知的方法進行的。反式作用因子包括與皰疹病毒蛋白質VP16的反式激活結構域(Triezenberg等人，Genes Devel.2718-729，1988)融合的GAL4 DNA結合結構域(Keegan等人，Science 231699-704，1986)，前者又與大鼠糖皮質激素受體的激素結合結構域(Picard等人，Cell 541073-1080，1988)融合。融合蛋白的表達受到本領域知道的或本文描述的適於在植物中表達的任何啟動子的控制。該表達盒還包含在含有與6xGAL4/最小啟動子融合的本發明核酸序列之植物中。由此獲得了融合蛋白的組織或器官特異性，導致殺蟲毒素的可誘導組織或器官特異性。
g.根部特異表達基因表達的另一種型式是根部表達。合適的根啟動子是Framond(FEBS，290103-106，1991)還有美國專利號5,466,785中描述的玉蜀黍金屬硫蛋白樣(MTL)基因的啟動子，引入本文作為參考。將此「MTL」啟動子轉移到合適的載體中，諸如pCGN1761ENX，用於插入選擇的基因並隨後將整個啟動子-基因-終止子盒轉移到目的轉化載體中。
h.創傷可誘導啟動子創傷可誘導啟動子可能也適於基因表達。已經描述了許多這樣的啟動子(如Xu等人，Plant Molec.Biol.22573-588，1993；Logemann等人，Plant Cell 1151-158，1989；Rohrmeier和Lehle，Plant Molec.Biol.22783-792，1993；Firek等人，Plant Molec.Biol.22129-142，1993；Warner等人，Plant J.3191-201，1993)，而且都適用於本發明。Logemann等人描述了雙子葉馬鈴薯wunI基因的5′上遊序列。Xu等人證明了來自雙子葉馬鈴薯的創傷可誘導啟動子(pin2)在單子葉稻中有活性。另外，Rohrmeier和Lehle描述了玉蜀黍WipIcDNA的克隆，它是創傷誘導的且可使用標準技術用於分離相關啟動子。類似的，Firek等人和Warner等人描述了了來自單子葉植物蘆筍(Asparagus officinalis)的創傷誘導基因，它在局部創傷處和病原體侵入部位表達。使用本領域眾所周知的克隆技術，可將這些啟動子轉移到合適載體中，與本發明相關基因融合，並用於在植物受傷部位表達這些基因。
i.髓優先表達專利申請WO 93/07278描述了優先在髓細胞中表達的玉蜀黍trpA基因的分離，將其引入本文作為參考。呈現了由轉錄起點延伸至-1726bp的基因序列和啟動子。使用標準分子生物學技術，可將此啟動子或其部分轉移到諸如pCGN1761等載體中，其中它可替換35S啟動子並用於以髓優先方式驅動外來基因的表達。事實上，可將含有髓優先啟動子或其部分的片段轉移到任何載體中，並為了在轉基因植物中的效用進行修飾。
j.葉特異表達Hudspeth和Grula(Plant Molec.Biol.12579-589，1989)已經描述了編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉蜀黍基因。使用標準分子生物學技術，可將該基因的啟動子用於在轉基因植物中以葉特異方式驅動任何基因的表達。
k.花粉特異表達WO 93/07278描述了在花粉細胞中表達的玉蜀黍鈣依賴性蛋白質激酶(CDPK)基因的分離。基因序列和啟動子由轉錄起點延伸至1400bp。使用標準分子生物學技術，可將該啟動子或其部分轉移到諸如pCGN1761等載體中，其中它可替換35S啟動子並用於以花粉特異方式驅動本發明核酸序列的表達。
2.轉錄終止子可獲得多種轉錄終止子用於表達盒。它們負責在轉基因和正確的mRNA聚腺苷酸化後終止轉錄。適當的轉錄終止子是已知在植物中發揮功能的終止子，包括CaMV 35S終止子、tm1終止子、胭脂鹼合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用於單子葉植物和雙子葉植物二者。另外，可使用基因的天然轉錄終止子。
3.用於增強或調控表達的序列已經發現許多序列增強來自轉錄單位內的基因表達，而且這些序列可聯合本發明的基因使用以提高它們在轉基因植物中的表達。
已經證明許多內含子序列增強表達，特別是在單子葉植物的細胞中。例如，已經證明玉蜀黍AdhI基因的內含子在導入玉蜀黍細胞後顯著增強其相關啟動子下的野生型基因的表達。發現內含子1特別有效，它在與氯黴素乙醯基轉移酶基因的融合構建物中增強表達(Callis等人，Genes Develop.11183-1200，1987)。在相同的實驗系統中，來自玉蜀黍bronzel基因的內含子在增強表達中具有相似的效果。已經將內含子序列常規引入植物轉化載體，通常在非翻譯前導內。
還知道衍生自病毒的許多非翻譯前導序列增強表達，而且它們在雙子葉植物的細胞中特別有效。具體而言，已經證明來自菸草花葉病毒(TMV，「W序列」)、玉蜀黍褪綠斑駁病毒(MCMV)、和苜蓿花葉病毒(AMV)的前導序列有效增強表達(如Gallie等人，Nucl.Acids Res.158693-8711，1987；Skuzeski等人，Plant Molec.Biol.1565-79，1990)。本領域已知的其它前導序列包括但不限於小RNA病毒前導，例如EMCV前導(腦心肌炎5′非編碼區) (Elroy-Stein，O.、Fuerst，T.R.、和Moss，B.，PNAS USA 866126-6130，1989)；馬鈴薯Y病毒組前導，例如TEV前導(菸草蝕刻病毒)(Allison等人，1986)；MDMV前導(玉蜀黍矮縮花葉病毒)(Virology，1549-20)；人，免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)前導(Macejak，D.G.和Sarnow，P.，Nature35390-94，1991)；來自苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻譯前導(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，Nature 325622-625，1987)；菸草花葉病毒前導(TMV)(Gallie，D.R.等人，《MolecularBiology of RNA》，p237-256，1989)；和玉蜀黍褪綠斑駁病毒前導(MCMV)(Lommel，S.A.等人，Virology 81382-385，1991)。還可參閱Della-Cioppa等人，Plant Physiology 84965-968，1987。
除了將一種或多種上述元件引入本發明靶表達盒的5′調控區以外，還可引入靶表達盒特有的其它元件。這些元件包括但不限於最小啟動子。最小啟動子意指在沒有上遊激活的條件下沒有或幾乎沒有活性的基礎啟動子。在不存在反式激活蛋白時或者在缺乏增強子或應答元件結合位點時，這樣的啟動子在植物中具有低背景活性。對於植物中的靶基因特別有用的一種最小啟動子是由玉蜀黍的bronzel基因獲得的Bz1最小啟動子。Bz1核心啟動子是由「myc」突變型Bz1-螢光素酶構建物pBz1LucR98通過位於-53至-58的NheI位點處的切割得到的(Roth等人，Plant Cell 3317，1991)。衍生的Bz1核心啟動子片段由此由-53延伸至+227，並在5′非翻譯區中包含Bz1內含子-1。對本發明同樣有用的還有通過使用合成TATA元件構建的最小啟動子。TATA元件容許RNA聚合物因子識別啟動子並在缺乏激活的條件下賦予基礎水平的基因表達(通常參閱Mukumoto，Plant Mol.Biol.23995-1003，1993；Green，Trends Biochem.Sci.2559-63，2000)。
4.基因產物在細胞內的靶向已知植物中存在基因產物的多種靶向機制，而且已經較為詳細的鑑定了控制這些機制發揮功能的序列。例如，將基因產物靶向葉綠體受到在多種蛋白質的氨基末端發現的信號序列的控制，這些蛋白質在輸入葉綠體的過程中遭到切割而生成成熟蛋白質(如Comai等人，J.Biol.Chem.26315104-15109，1988)。可將這些信號序列與異源基因產物融合以實現將異源產物輸入葉綠體(van den Broeck等人，Nature 313358-363，1985)。可由編碼RUBISCO蛋白質、CAB蛋白質、EPSP合酶、GS2蛋白質及已知定位於葉綠體的許多其它蛋白質的cDNA的5′端分離編碼適當信號序列的DNA。還可參閱美國專利號5,639,949的實施例37中題為「Expression With ChloroplastTargeting」的部分。
其它基因產物可定位於其它細胞器，諸如線粒體和過氧化物酶頭(如Unger等人，Plant Molec.Biol.13411-418，1989)。也可操作編碼這些產物的cDNA以實現將異源基因產物靶向這些細胞器。這種序列的實例有核編碼的ATP酶和特異天冬氨酸氨基轉移酶線粒體同工型。Rogers等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826512-6516，1985)已經描述了靶向細胞蛋白質體。
另外，已經鑑定了引起基因產物靶向其它細胞區室的序列。氨基末端序列負責靶向ER、質外體、和糊粉細胞的胞外分泌(Koehler和Ho，Plant Cell 2769-783，1990)。另外，氨基末端序列連同羧基末端序列負責基因產物靶向液泡(Shinshi等人，Plant Molec.Biol.14357-368，1990)。
通過將上文描述的靶向序列與目的轉基因序列融合，有可能將轉基因產物引導至任何細胞器或細胞區室。例如，對於靶向葉綠體，將來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶、或GS2基因的葉綠體信號序列以相同讀碼框融合於轉基因的氨基末端ATG。所選擇的信號序列應當包含已知的切割位點，而且所構建的融合物應當考慮到切割所必需的切割位點後的任何胺基酸。在有些情況中，這種需要可通過在切割位點與轉基因ATG之間添加少數胺基酸來滿足，或者替換轉基因序列內的有些胺基酸。可對為輸入葉綠體而構建的融合物測試葉綠體攝取的效力，即使用Bartlett等人，在Edelmann等人編的《Methods in ChloroplastMolecular Biology》一書中，Elsevier，pp1081-1091，1982和Wasmann等人，Mol.Gen.Genet.205446-453，1986描述的技術，體外翻譯體外轉錄的構建物，隨後進行體外葉綠體攝取。這些構建技術是本領域眾所周知的，而且平等適用於線粒體和過氧化物酶體。
上述細胞靶向機制不僅可聯合它們的相關啟動子使用，而且可聯合異源啟動子以實現在與衍生靶向信號的啟動子具有不同表達型式的啟動子的轉錄調控下特異細胞靶向目標。
實施例8植物轉化載體的構建植物轉化領域的普通技術人員知道可獲得用於植物轉化的許多轉化載體，而且本發明相關的基因可聯合任何這些載體使用。載體的選擇將取決於偏愛的轉化技術和轉化的靶物種。對於某些靶物種，可能優選不同的抗生素或除草劑選擇標記。在轉化中常規使用的選擇標記包括nptII基因，它賦予針對卡那黴素和相關抗生素的抗性(Messing和Vierra，Gene 19259-268，1982；Bevan等人，Nature 304184-187，1983)；bar基因，它賦予針對除草劑膦絲菌素的抗性(White等人，Nucl.Acids Res.181062，1990；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79625-631，1990)；hph基因，它賦予針對抗生素潮黴素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mol.Cell Biol.42929-2931)；和dhfr基因，它賦予針對甲氨喋呤的抗性(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104，1983)；EPSPS基因，它賦予針對草甘膦的抗性(美國專利號4,940,935和5,188,642)；和甘露糖-6-磷酸異構酶基因，它提供代謝甘露糖的能力(美國專利號5,767,378和5,994,629)。
1.適用於農桿菌轉化的載體可獲得許多載體用於使用根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的轉化。它們通常攜帶至少一個T-DNA邊界序列，且包括諸如pBIN19等載體(Bevan，Nucl.Acids Res.，1984)。下文描述了適用於農桿菌轉化的兩種典型載體的構建。
a.pCIB200和pCIB2001二元載體pCIB200和pCIB2001用於構建與農桿菌一起使用的重組載體，且以如下方式構建。用NarI消化pTJS75(Sohmidhauser和Helinski，J.Bacteriol.164446-455，1985)得到pTJS75kan，容許切除四環素抗性基因，隨後插入來自pUC4k的攜帶NPTII(Messing和Vierra，Gene 19259-268，1982；Bevan等人，Nature 304184-187，1983；McBride等人，Plant Molecular Biology 14266-276，1990)的AccI片段。將XhoI接頭與含有T-DNA左界和右界、植物可選擇nos/nptII嵌合基因、和pUC多接頭的PCIB7的EcoRV片段連接(Rothstein等人，Gene 53153-161，1987)，並將XhoI消化片段克隆到經SalI消化的pTJS75kan中，產生pCIB200(還可參閱EP 0 332104，實施例19)。pCIB200包含下列唯一多接頭限制性位點EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，通過在多接頭中插入額外限制性位點而產生。pCIB2001多接頭中的唯一限制性位點有EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MLuI、BelI、AvrII、ApaI、HpaI、和StuI。除了包含這些唯一限制性位點以外，pCIB2001還具有植物和細菌卡那黴素選擇標記、用於農桿菌介導的轉化的T-DNA左界和右界、用於在大腸桿菌和其它宿主之間動員的RK2衍生trfA功能、及同樣來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適於克隆包含其自身調控信號的植物表達盒。
b.pCIB10及其潮黴素選擇衍生物二元載體pCIB10包含編碼用於在植物中進行選擇的卡那黴素抗性的基因及T-DNA右界和左界序列，並摻入了來自宿主範圍廣的質粒pRK252的序列，容許它在大腸桿菌和農桿菌二者中複製。Rothstein等人(Gene 53153-161，1987)描述了它的構建。構建了pCIB10的各種衍生物，其中摻入了Gritz等人(Gene 25179-188，1983)描述的潮黴素B磷酸轉移酶基因。這些衍生物使得能夠只對潮黴素(pCIB743)或者對潮黴素及卡那黴素(pCIB715、pCIB717)選擇轉基因植物細胞。
2.適於非農桿菌轉化的載體不使用根癌農桿菌的轉化規避了對所選擇轉化載體中T-DNA序列的需要，因此除了諸如上文描述的包含T-DNA序列的載體以外還可採用缺乏這些序列的載體。不依賴農桿菌的轉化技術包括經由微粒轟擊、原生質體攝取(如PEG和電穿孔)、和顯微注射的轉化。載體的選擇很大程度上取決於偏愛的轉化物種的選擇。下文描述了適用於非農桿菌轉化的典型載體的構建。
a.pCIB3064pCIB3064是適於直接基因轉移技術連同除草劑basta(或膦絲菌素)選擇的pUC衍生載體。質粒pCIB246在與大腸桿菌GUS基因和CaMV35S轉錄終止子的可操作融合物中包含CaMV 35S啟動子，而且描述於PCT出版的申請WO 93/07278。這種載體的35S啟動子在起始位點5′含有兩個ATG序列。使用標準PCR技術以這樣一種方式突變這些位點以消除ATG並生成限制性位點SspI和PvuII。新的限制性位點距離唯一的SalI位點96和37bp，距離實際的起始位點101和42bp。將由此得到的pCIB246衍生物命名為pCIB3025。然後由pCIB3025通過SalI和SacI消化切除GUS基因，將末端補平，並重新連接而生成質粒pCIB3060。質粒pJIT82來自John Innes Centre，Norwich，切下包含來自綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)的bar基因的400bp SmaI片段，並插入pCIB3060的HpaI位點(Thompson等人，EMBO J 62519-2523，1987)。這生成了pCIB3064，它包含CaMV 35S啟動子和終止子控制下的用於除草劑選擇的bar基因、用於氨苄青黴素抗性的基因(用於大腸桿菌中的選擇)、及具有唯一位點SphI、PstI、HindIII和BamHI的多接頭。此載體適於克隆包含其自身調控信號的植物表達盒。
b.pSOG19和pSOG35pSOG35是利用賦予甲氨喋呤抗性的大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DFR)作為選擇標記的轉化載體。使用PCR擴增35S啟動子(-800bp)、來自玉蜀黍Adh1基因的內含子6(-550bp)、和來自pSOG10的18bp GUS非翻譯前導序列。還通過PCR擴增編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250bp片段，並將這兩個PCR片段與來自pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段裝配到一起，pB1221包含pUC19載體主鏈和胭脂鹼合酶終止子。這些片段的裝配生成pSOG19，它包含與內含子6序列、GUS前導、DHFR基因和胭脂鹼合酶終止子融合的35S啟動子。用來自玉蜀黍褪綠斑駁病毒(MCMV)的前導序列替換pSOG19中的GUS前導，生成載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨苄青黴素抗性的pUC基因，且具有HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點可用於克隆外來物質。
3.適於葉綠體轉化的載體為了在植物質體中表達本發明的核苷酸序列，採用質體轉化載體pPH143(WO 97/32011，實施例36)。將核苷酸序列插入pPH143，由此替換PROTOX編碼序列。然後將該載體用於質體轉化和壯觀黴素抗性轉化子選擇。或者，將核苷酸序列插入pPH143，使其替換aadH基因。在這種情況中，對轉化子選擇對PROTOX抑制物的抗性。
實施例9轉化一旦將本發明的核酸序列克隆到表達系統中，將它轉化到植物細胞中。可以多種本領域認可的方法將本發明的接受者和靶表達盒導入植物細胞。用於再生植株的方法也是本領域眾所周知的。例如，Ti質粒載體已經用於外來DNA投遞，以及直接DNA攝取、脂質體、電穿孔、顯微注射、和微彈。另外，來自農桿菌屬的細菌可用於轉化轉化植物細胞。下文描述了用於轉化雙子葉植物和單子葉植物的代表性技術，以及代表性的質體轉化技術。
1.雙子葉植物的轉化用於雙子葉植物的轉化技術是本領域眾所周知的，包括基於農桿菌的技術和不需要農桿菌的技術。非農桿菌技術包括由原生質體或細胞直接攝取外源遺傳物質。這可以通過PCG或電穿孔介導的攝取、微粒轟擊介導的投遞、或纖維注射來實現。這些技術的實例描述於Paszkowski等人，EMBO J 32717-2722，1984；Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199169-177，1985；Reich等人，Biotechnology 41001-1004，1986；和Klein等人，Nature 32770-73，1987。在每種情況中，使用本領域知道的標準技術將轉化細胞再生成完整植株。
農桿菌介導的轉化是轉化雙子葉植物的優選技術，因為它的轉化效率高且可廣泛用於許多不同物種。農桿菌轉化通常包括將攜帶目的外來DNA的二元載體(如pCIB200或pCIB2001)轉移到適當農桿菌菌株中，它可能依賴宿主農桿菌菌株或是在共駐留Ti質粒上或是在染色體上攜帶的vir基因的補足作用(如用於pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542)(Uknes等人，Plant Cell 5159-169，1993)。將重組二元載體轉移到農桿菌中是通過使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌、攜帶諸如pRK2013等質粒且能夠動員重組二元載體到靶農桿菌菌株中的輔助大腸桿菌菌株的三親株交配程序實現的。或者，可通過DNA轉化將重組二元載體轉移到農桿菌中(H_fgen和Willmitzer，Nucl.AcidsRes.169877，1988)。
通過重組農桿菌對靶植物物種的轉化通常包括農桿菌與來自植物的外植體的共培養，且遵照本領域眾所周知的方案。在含有二元質粒T-DNA邊界之間存在的抗生素或除草劑抗性標記的選擇性培養基上使轉化組織再生。
用基因轉化植物細胞的另一種方法包括驅使惰性或生物學活性微粒進入植物組織和細胞。該技術公開於美國專利號4,945,050、5,036,006、和5,100,792，都授予Sanford等人。一般而言，該程序包括在有效穿透細胞外表面並使之摻入其內部的條件下驅使惰性或生物學活性微粒進入細胞。在採用惰性微粒時，可通過用包含期望基因的載體包被微粒而將載體導入細胞。或者，可用載體包圍靶細胞，使得載體經由微粒運送進入細胞。也可驅使生物學活性微粒(如乾酵母細胞、幹細菌、或噬菌體，都包含試圖導入的DNA)進入植物細胞和組織。
2.單子葉植物的轉化大多數單子葉植物物種的轉化現在也已經成為常規。優選的技術包括使用PEG或電穿孔技術將基因直接轉移到原生質體中，以及通過微粒轟擊進入愈傷組織。轉化可使用單一DNA種類或多種DNA種類(即共轉化)來進行，這兩種技術都適用於本發明。共轉化可具有下列優點避免完全的載體構建和生成具有目的基因與選擇標記的非連鎖基因座的轉基因植物；能夠在後代中清除選擇標記，如果需要的。然而，使用共轉化的缺點是分開的DNA種類整合到基因組中的頻率低於100％(Schocher等人，Biotechnology 41093-1096，1986)。
專利申請EP 0 292 435、EP 0 392 225、和WO 93/07278描述了用於由玉蜀黍的精華自交系製備愈傷組織和原生質體、使用PEG或電穿孔轉化原生質體、及由經轉化原生質體再生玉蜀黍植株的技術。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2603-618，1990)和Fromm等人(Biotechnology 8833-839，1990)發表了使用微粒轟擊轉化A188衍生玉蜀黍系的技術。此外，WO 93/07278和Koziel等人(Biotechnology 11194-200，1993)描述了通過微粒轟擊轉化玉蜀黍的精華自交系的技術。該技術利用由授粉後14-15天的玉蜀黍穗切下的長度為1.5-2.5mm的未成熟玉蜀黍胚及用於轟擊的PDS-1000HeBiolistics裝置。
稻的轉化也可通過利用原生質體或微粒轟擊的直接基因轉移技術來進行。已經描述了日本產植物型和印度產植物型的原生質體介導的轉化(Zhang等人，Plant Cell Rep.7379-384，1988；Shimamoto等人，Nature 338274-277，1989；Datta等人，Biotechnology 8736-740，1990)。這兩種類型都可常規使用微粒轟擊來轉化(Christou等人，Biotechnology 9957-962，1991)。此外，WO 93/21335描述了通過電穿孔轉化稻的技術。
專利申請EP 0 332 581描述了用於生成、轉化、和再生早熟禾亞科原生質體的技術。這些技術容許轉化鴨茅屬和小麥。此外，Vasil等人(Biotechnology 10667-674，1992)，使用微粒轟擊into C型長期可再生愈傷組織的細胞，還有Vasil等人(Biotechnology 111553-1558，1993)和Weeks等人(Plant Physiol.1021077-1084，1993)，使用未成熟胚和未成熟胚衍生愈傷組織的微粒轟擊，描述了小麥轉化。然而，用於小麥轉化的優選技術牽涉通過未成熟胚的微粒轟擊來轉化小麥，且在基因投遞前包括高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，將任何數目的胚(長度為0.75-1mm)置於含3％蔗糖(Murashiga和Skoog，Physiologia Plantarum 15473-497，1962)和3mg/L2，4-D的MS培養基上以誘導體細胞胚，這容許在黑暗中進行。在選擇進行轟擊的那天，由誘導培養基中取出胚，並置於滲透劑(即以期望濃度添加蔗糖或麥芽糖的誘導培養基，通常15％)上。容許胚質壁分離2-3小時，然後轟擊。通常每個靶盤二十個胚，儘管這並不重要。使用標準程序將攜帶基因的適當質粒(諸如pCIB3064或pSG35)沉澱到微米尺度的金微粒上。用DuPont Biolistics_ helium裝置射擊每盤胚，使用爆壓約1000psi和標準80網篩。轟擊後，將胚置回黑暗中，恢復約24小時(仍然在滲透劑上)。24小時後，由滲透劑中取出胚，並置回誘導培養基上，它們在此在再生前逗留約一個月。約一個月後，將具有發育中胚胎發生愈傷組織的胚外植體轉移至還含有適當選擇劑(在pCIB3064的情況中是10mg/L basta，而在pSOG35的情況中是2mg/L甲氨喋呤)的再生培養基(MS+1mg/L NAA、5mg/L GA)。約一個月後，將發育的轉移至含有半強度MS、2％蔗糖、和相同濃度選擇劑的更大無菌容器，稱為「GA7s」。
使用農桿菌轉化單子葉植物也已有描述。參閱WO 94/00977和美國專利號5,591,616，將二者都引入本文作為參考。
3.質體的轉化使珊西菸草(Nicotiana tabacum c.v.『Xanthi nc』)的種子在T瓊脂培養基上發芽，每板七粒，成1″環形排列，並本質上如Svab，Z.和Maliga，P.，PNAS 90913-917，1993所述在播種後12-14天用以來自質粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm鎢微粒(M10，Biorad，Hercules，CA)進行轟擊)。將轟擊後的幼苗在T培養基上培育兩天，然後切下葉並在明亮光照(350-500μmol光子/m2/s)下以離軸側向上置於含500μg/ml(二)鹽酸壯觀黴素(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培養基(Svab，Z.、Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.，PNAS 878526-8530，1990)平板上。將轟擊後三至八周在變白葉片下面出現的抗性枝條(shoot)亞克隆到相同選擇性培養基上，使其形成愈傷組織，並分離和亞克隆次生(secondary)枝條(shoot)。通過Southern印跡(Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989)的標準技術評估獨立亞克隆中轉化質體基因組拷貝(同質性)的完全隔離。在1％Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上分離經BamH I/EcoRI消化的總細胞DNA(Mettler，I.J.，Plant Mol.Biol.Reporter 5346-349，1987)，轉移到尼龍膜(Amersham)上，並用與來自pC8的含有部分rps7/12質體靶向序列的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段對應的32P標記的隨機引發DNA序列進行探查。使同質枝條(shoot)在含壯觀黴素的MS/IBA培養基(McBride，K.E.等人，PNAS 917301-7305，1994)上無菌生根並轉移至溫室。
III.育種和種子生產實施例10育種通過用本發明的核酸序列進行轉化獲得的植物可以是極其多種植物物種，包括單子葉植物和雙子葉植物；然而，本發明方法中所使用的植物優選選自上文列舉的農業上重要的靶農作物表。通過育種可將本發明的基因連同對產量和質量重要的其它特徵的表達引入植物品系。育種的方法和技術是本領域知道的。參閱例如Welsh，J.R.，《Fundamentals of Plant Genetics and Breeding》，John Wiley Sons，NY，1981；《Crop Breeding》，Wood，D.R.編，American Societyof Agronomy，Madison，Wisconsin，1983；Mayo，O.，《The Theoryof Plant Breeding》，第二版，Clarendon Press，Oxford，1987；Singh，D.P.，《Breeding for Resis tance to Diseases and InsectPests》，Springer-Verlag，NY，1986；及Wricke和Weber，《Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding》，Walterde Gruyter and Co.，Berlin，1986。
如上所述改造到轉基因種子和植物中的遺傳特性通過有性繁殖或營養生長而傳代，且由此可在後代植株中得到維持和繁殖。一般而言，所述維持和繁殖利用已知的為了適應特定目的而開發的農業方法，諸如耕作、播種或收穫。也可採用諸如水培或溫室技術等專業方法。因為生長中的農作物易受由昆蟲或感染引起的攻擊和損傷以及雜草植物的競爭，所以採取措施來控制雜草、植物疾病、昆蟲、線蟲、和不利於提高產量的其它條件。它們包括機械措施，諸如耕耘土壤或清除雜草和受感染植株，以及使用農用化學品，諸如除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長調節劑、成熟劑和殺昆蟲劑。
依照本發明的轉基因植物和種子的有利遺傳特性的使用還可在植物育種中進行，它致力於開發具有改良特性的植物，諸如害蟲、除草劑、或壓力耐受力、提高的營養價值、提高的產量、或使得存放或脫粒引起的損失降低的改進的結構。各種育種步驟的特徵是詳細說明的人為幹預，諸如選擇進行雜交的株系、指導親本株系的授粉、或選擇適當的後代植株。根據期望的特性，採取不同的育種措施。相關技術是本領域眾所周知的，包括但不限於雜交、近交、回交育種、多系育種、品種混和、種間雜交、非整倍體技術等。雜交技術還包括通過機械、化學、或生化手段的植物絕育以生成雄性或雌性不育植物。雄性不育植物與不同株系的花粉的雜交授粉確保了雄性不育而非雌性不育植物的基因組將統一獲得兩種親本株系的特性。由此，依照本發明的轉基因種子和植物可用於改良植物系的育種，例如提高常規方法諸如除草劑或殺蟲劑處理的效力或者由於它們的改良遺傳特性容許免除所述方法。或者，可獲得具有改良壓力耐受力的新農作物，它們由於優化的遺傳「裝備」而生成質量比不能耐受可比不利發育條件的產物更好的收穫產物。
實施例11種子生產在種子生產中，種子的發芽質量和一致性是關鍵的產品特徵。因為難以保證農作物不含其它農作物和雜草種子，為了控制種子傳播的疾病，和為了生產具有優良發芽的種子，富有培育、調理和銷售純種子經驗的種子生產者已經開發了相當廣泛且詳細說明的種子生產實踐。由此，農民購買經過鑑定達到特定質量標準的種子，代替使用由他自己的農作物收穫的種子，這是常見的實踐。通常用含有除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑、或其混合物的保護劑塗層處理用作種子的繁殖材料。通常使用的保護劑塗層含有諸如克菌丹、萎鏽靈、色拉磨(TMTD_)、methalaxyl(Apron_)、和匹雷米甲(Actellic_)等化合物。如果需要，可將這些化合物與配製領域通常採用的其它載體、表面活性劑、或促進施用的佐劑配製在一起，以提供針對由細菌、真菌、或動物害蟲引起的損害的保護。可通過用液體製劑浸泡繁殖材料或者通過用溼的或幹的聯合製劑進行包被來施用保護劑塗層。其它施用方法也是可能的，諸如定向芽或果實的處理。
IV.疾病抗性評估疾病抗性評估是通過本領域知道的方法進行的。參閱Uknes等人，1993；G_rlach等人，1996；Alexander等人，1993。例如，下文描述了幾種代表性的疾病抗性測定法。
實施例12寄生疫黴(Phytophthora parasitica)(黑梗病)抗性測定法針對寄生疫黴，引起黑梗病的生物體，的抗性的測定法是如Alexander等人(1993)所述在培育的六周齡植物上進行的。給植物灑水，使其排水通暢，然後通過向土壤中施用10ml孢子囊懸浮液(300個孢子囊/ml)進行接種。將接種後的植物置於溫室中，維持在日間溫度23-25℃和夜間溫度20-22℃。用於測定法的枯萎指數如下0＝沒有症狀；1＝沒有症狀；1＝有些枯萎跡象，且緊漲度降低；2＝清楚的枯萎症狀，但沒有腐爛或發育遲緩；3＝清楚的枯萎症狀且發育遲緩，但沒有明顯的莖幹腐爛；4＝嚴重枯萎，且顯著的莖幹腐爛和對根系的有些損傷；5＝同4，但植物接近或已經死亡，且根系嚴重減少。所有測定都是對以隨機設計排列的植物盲目評分的。
實施例13丁香假單胞菌抗性測定法將丁香假單胞菌菸草致病變種菌株#551注射到七株6-7周齡植物的兩片較低葉子中，濃度為每毫升H2O含106或3×106。每個時間點對六株個別植物進行評估。將受到菸草假單胞菌感染的植物依照5點疾病嚴重性等級進行定級，5＝100％死亡組織，0＝沒有症狀。對每天的評估進行T檢驗(LSD)，並在平均疾病定級值後顯示分組。在該評估日後面為相同字母的值在統計學上沒有顯著差異。
實施例14菸草尾孢(Cercospora nicotianae)抗性測定法將菸草尾孢(ATCC #18366)的孢子懸浮液(每毫升100,000-150,000個孢子)以逼進徑流噴灑到葉片表面。將植物在100％溼度維持五天。然後每天對植物噴以水霧5-10次。每個時間點對六株個別植物進行評估。將菸草尾孢在顯示疾病症狀的％葉片面積的基礎上進行定級。對每天的評估進行T檢驗(LSD)，並在平均疾病定級值後顯示分組。在該評估日後面為相同字母的值在統計學上沒有顯著差異。
實施例15寄生霜黴抗性測定法針對寄生霜黴的抗性的測定法是如Uknes等人(1993)所述在植物上進行的。通過噴灑分生孢子懸浮液(每毫升約5×104個孢子)給植物接種相容寄生霜黴的隔離群。將接種後的植物在14小時白天/10小時夜晚循環的栽培室中在潮溼條件下於17℃培育。在接種後3-14天、優選7-12天對植物檢查分生孢子的存在。另外，由每種處理隨機選擇幾株植物，並用乳酚-錐蟲藍染色(Keogh等人，1980)以進行顯微鏡檢查。
實施例16二元啟動子報導基因質粒的構建構建了用於擬南芥轉化的二元啟動子報導基因質粒(pNOV2374)。使用GATEWAYTM技術依照製造商的方案如操作說明書(LifeTechnologies，Rockville，MD)中所述通過重組將調控/啟動子序列與GUS報導基因(Jefferson等人，EMBO J 63901-3907，1987)融合。然後通過電穿孔將構建物轉化到根癌農桿菌菌株中。
pNOV2374是具有VS1複製起點、主鏈中一個拷貝的農桿菌virG基因、及T-DNA左界和右界序列之間的Basta_抗性選擇標記盒的二元載體。Basta_選擇標記盒包含與編碼Basta_抗性的基因(即「BAR」基因，膦絲菌素乙醯基轉移酶)(White等人，Nucl.Acids Res.181062，1990)和35S終止子可操作連接的根癌農桿菌冠癭鹼(manopine)合酶啟動子(AtMas)(Barker等人，Plant Mol.Biol.2335-350，1983)。AtMas啟動子、BAR編碼序列、和35S終止子分別位於pNOV2374的第4211至4679位、第4680至5228位、和第5263至5488位核苷酸。該載體包含GATEWAYTM重組成分，它們是通過使用GATEWAYTM載體變換系統(Li feTechnologies，Rockville，MD)連接含attR位點、ccdB、和氯黴素抗性標記的平端盒而導入二元載體主鏈的。GATEWAYTM盒位於pNOV2374的第126和1818位核苷酸之間。通過LR重組反應插入啟動子盒，由此消除pNOV2374第126和1818位核苷酸之間的DNA序列並用側翼為att序列的目的啟動子替換。重組導致啟動子序列與含內含子的GUS報導基因(GIG)融合。GIG基因(SEQ ID NO29)在GUS第385至576位核苷酸含有來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的ST-LS1內含子(來自Stanton Gelvin博士，Purdue University，並描述於Narasimhulu等人，Plant Cell 8873-886，1996)。選擇標記和啟動子-報導基因盒在二元載體中的取向如下右界--NI16啟動子片段(即SEQ ID NO24、SEQ ID NO27、或SEQ ID NO28)+GIG基因(SEQ ID NO29)+nos--AtMas+BAR+35S終止子左界為了比較啟動子活性，用與GIG基因(SEQ ID NO29)和nos啟動子可操作連接的已知擬南芥PR1(SEQ ID NO30)和SMAS(SEQ ID NO31)啟動子(分別參閱Plant J.16(2)223-233，1998和Plant Mol.Biol.20(2)219-233，1992)製備了其它構建物。選擇標記和啟動子-報導基因盒在這些二元載體構建物中的取向如下右界AtPR1啟動子(SEQ ID NO30)+GIG基因(SEQ ID NO29)+nos--AtMas+BAR+35S終止子左界右界SMAS啟動子(SEQ ID NO31)+GIG基因(SEQ ID NO29)+nos--AtMas+BAR+35S終止子左界實施例17擬南芥轉化1.植物的準備和種植將擬南芥種子以每個4″方罐9粒種子密度播種到弄溼的Fafard發芽混合物上，置於淺盤中，蓋上塑料罩以保持溼氣，然後移到生長室中。發芽後，摘下罩子，並使植物在短日照(8小時光照)條件下生長3-5周以促經營養生長和具有許多花的大型植株的生成。通過提供2-3周的長日照(16小時光照)條件來誘導開花，此時植物已可進行農桿菌中的浸泡接種以生成轉基因植物。
2.農桿菌轉化、培養物生長、和為植物滲透做準備通過電穿孔將二元啟動子報導基因質粒導入農桿菌。二元質粒賦予細菌以壯觀黴素抗性，容許含有質粒的細胞通過在LB+壯觀黴素(50mg/L)的平板上的菌落生長得到選擇。通過來自細菌的質粒DNA的序列分析驗證存在正確的啟動子GUS質粒。
在植物轉化前兩天，將5ml LB+壯觀黴素(50mg/L)培養基接種含有二元啟動子GUS質粒的農桿菌菌株，並於30℃溫育約24小時。然後將每份5ml培養物轉移至500ml LB+壯觀黴素(50mg/L)，並於30℃溫育約24小時。將每份500ml培養物轉移到離心瓶中，並在Sorvall離心機中以5000rpm離心10分鐘。取出上清液並保留沉澱的農桿菌細胞。將農桿菌細胞重懸於500ml修改後滲透培養基(IM+MOD50g/L蔗糖、10mM MgCl、10μM苄氨基嘌呤)，其中已經添加了50μl Silwet L-77(Dupont)。
3.通過浸泡滲透進行的植物轉化將重懸細胞倒入1升三角倒嘴燒杯中。在植物倒插入培養基後，確認所有的花序都覆蓋了細菌。將燒杯輕輕搖動30秒，保持所有的花序組織都被淹沒。在浸泡接種農桿菌後將植物送回生長室。可在5天後進行第二次浸泡以提高轉化頻率。轉化後約4至6周收穫種子。
4.轉基因擬南芥的選擇將來自經轉化擬南芥植株的種子播種到淺盆中弄溼的Fafard發芽混合物上，蓋上罩子以保持溼氣，然後置於生長室中。發芽後，給幼苗噴灑除草劑BASTA_。由於二元啟動子GUS質粒中存在BAR基因，所以轉基因植物具有BASTA_抗性。
實施例18啟動子活性誘導測定法1.用水楊酸處理給三至四周齡植物噴灑溶於H2O的5mM水楊酸(SA)。如細霧般對葉片施加處理。在施加SA前(T0)和施加後各個時間間隔收集葉片組織用於β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)螢光測定法。
2.通過緩衝液注射或病原體接種處理給三至四周齡植物的葉子注射10mM MgCl2(緩衝液)或接種病原體含avrRPM1無毒基因的丁香假單胞菌斑生致病變種，它在擬南芥的Ws栽培變種中引起超敏應答(HR)。用緩衝液或病原體處理後立即收集葉片組織(T0)，並在注射後的各個時間間隔收集葉片組織。通過β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)螢光評估啟動子活性。
實施例19報導基因測定法使用β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的組織化學和螢光測定法定性和定量評估啟動子活性。
1.組織化學β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)測定法為了定性評估啟動子活性，將各種擬南芥組織和器官用於GUS組織化學測定法。將完整器官或組織碎片浸入GUS染色液。GUS染色液含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-Gluc，Duchefa，溶於DMSO的20mM儲液)、100mM磷酸鈉緩衝液pH7.0、10mM EDTA pH8.0、和0.1％Triton X100。將組織樣品於37℃溫育1-16小時。如果需要，可通過幾次70％乙醇清洗除去葉綠素，使樣品清晰。染色後，在可見光顯微鏡下觀察組織以評估顯示GUS表達型式的藍色染色。
2.β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)螢光測定法為了在誘導處理後或者在各種擬南芥組織和器官中定量分析啟動子活性，通過螢光測定法測量GUS表達。收集組織樣品並在冰冷的GUS提取緩衝液(50mM Na2HPO4pH7.0、5mM DTT、1mM Na2EDTA、0.1％TritonX100、0.1％十二烷基肌氨酸鈉)中研磨。將磨碎的樣品在微量離心機中於4℃以10,000離心15分鐘。離心後，取出上清液用於GUS測定和蛋白質濃度測定。
為了測量GUS活性，在預熱至37℃的GUS測定緩衝液(50mM Na2HPO4pH7.0、5mM DTT、1mM Na2EDTA、0.1％Triton X100、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、1mM 4-甲基傘形酮醯-β-D-葡糖醛酸二水合物(MUG))中測定植物提取物。溫育反應液，在30分鐘裡以10分鐘為間隔取出100μl小樣，並通過將100μl小樣加到裝有900μl 2％ Na2CO3的管中終止反應。然後在Tecan分光螢光計上對終止的反應液於365nm激發和455發射波長讀數。蛋白質濃度是使用BCA測定法依照製造商的方案測定的。GUS活性表述為pmol MU/mg蛋白質/min。
表4水楊酸(SA)處理後NI16啟動子片段活性的比較通過施用SA誘導
表5病原體處理後NI16 962bp啟動子片段的活性通過緩衝液或病原體接種誘導
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序列表110Syngenta Participations AGCade，Rebecca MDietrich，Robert ALawton，Kay Ann120可誘導啟動子130A-31089CIP1140
141
15060/171,0081511999-12-1515060/175,5191512000-01-1116031170PatentIn Ver.2.12101211509212DNA213擬南芥220
221CDS222(68)..(433)223基因產物NI16220
221misc_feature222(142)..(147)223SalI位點220
221misc_feature222(344)..(349)223EcoRI位點4001aaaatcagca aataaacttt tcttgactaa gcttaaacga cgccgttaac attttcttct 60
ggctaac atg aac aac tct ttg aag aaa gaa gaa cgc gta gaa gaa gat 109Met Asn Asn Ser Leu Lys Lys Glu Glu Arg Val Glu Glu Asp1 5 10aac gga aaa tct gac ggt aac aga ggg aaa ccg tcg acg gaa gtt gtt 157Asn Gly Lys Ser Asp Gly Asn Arg Gly Lys Pro Ser Thr Glu Val Val15 20 25 30cgg acg gta acg gag gaa gag gtg gat gag ttt ttc aag ata tta cgg 205Arg Thr Val Thr Glu Glu Glu Val Asp Glu Phe Phe Lys Ile Leu Arg35 40 45aga gta cac gtg gcg aca cga acg gtt gcg aaa gtt aac ggc ggt gtt 253Arg Val His Val Ala Thr Arg Thr Val Ala Lys Val Asn Gly Gly Val50 55 60gct gag gga gag tta ccg tct aag aag agg aaa cgg agt cag aat crt 301Ala Glu Gly Glu Leu Pro Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu65 70 75ggg ttg aga aac tcg ttg gat tgt aac ggc gtt cga gac gga gaa ttc 349Gly Leu Arg Asn Ser Leu Asp Cys Asn Gly Val Arg Asp Gly Glu Phe80 85 90gat gag att aat cgg gtc ggg tta cag ggt ttg ggt ttg gat ctg aac 397Asp Glu Ile Asn Arg Val Gly Leu Gln Gly Leu Gly Leu Asp Leu Asn95 100 105 110tgt aaa ccg gaa cca gac agc gtt agt tta tcg ttg tagacttgta443Cys Lys Pro Glu Pro Asp Ser Val Ser Leu Ser Leu115 120gtccttcatg tttttcccct tcttacaata atcaattttt ttttaactac aatacttttg 503aaaaaa5092102211122212PRT213擬南芥4002Met Asn Asn Ser Leu Lys Lys Glu Glu Arg Val Glu Glu Asp Asn Gly1 5 10 15Lys Ser Asp Gly Asn Arg Gly Lys Pro Ser Thr Glu Val Val Arg Thr
20 25 30Val Thr Glu Glu Glu Val Asp Glu Phe Phe Lys Ile Leu Arg Arg Val35 40 45His Val Ala Thr Arg Thr Val Ala Lys Val Asn Gly Gly Val Ala Glu50 55 60Gly Glu Leu Pro Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Gly Leu65 70 75 80Arg Asn Ser Leu Asp Cys Asn Gly Val Arg Asp Gly Glu Phe Asp Glu85 90 95Ile Asn Arg Val Gly Leu Gln Gly Leu Gly Leu Asp Leu Asn Cys Lys100 105 110Pro Glu Pro Asp Ser Val Ser Leu Ser Leu115 12021032111700212DNA213擬南芥220
221misc_feature222(365)..(374)223TCA1基序220
221misc_feature222(426)..(435)223TCA1基序220
221misc_feature222(609)..(614)223MYCATR22 元件220
221misc_feature222(646)..(665)223CAMV AS1水楊酸應答元件
220
221misc_feature222(707)..(712)223PAL BOX220
221misc_feature222(757)..(762)223HEXAMERAT 4 元件220
221misc_feature222(863)..(1228)223NI16基因組編碼區4003tgggttttta ttggataaca tgacaaatat ttatttattt catgagtttt tattggatag 60catgacaaat attaatatat cagtgttaat aacatgtttt gttcttaaaa tacatgcatt 120ttaaaatcag acatttgttt taaaatcaaa tctaatctct tatatcaeaa cgacattgac 180ggaaaattca ggtaaaaaga gaaaataaag aatgagagat agagagattt ctatggaaaa 240agaaagagag aacatgtagg tgaacaaaat aaagagatat gatgatatat tttatgagag 300gtggtgaaga ttattttagg agagggagag agaaatagaa aaagaaaatg acatggtgaa 360tctgaagaag atgaattgtg ttaaagatga agagagaaag agaactccat ggctaaagtc 420tcgtaaagaa gatgaaaaag aaacaaaaga aggaagaaga aagagaaagg ctaaaataga 480ctaactattg ccaaaatttc tgtagccgac aaatactatt tggtccaagg ttattttgtg 540tattcttttg aagtcaaaag ttatttctta catatactct aaaaatatag ccgataccaa 600tttttccaca catggaettc ctttattcca aaagtcaata aagtgtgacg tcatgatact 660tacgctttaa aacatcgcat gatgatgtca ttagcatcaa tctccaccgt ccaatttatt 720tagttgttga caatatcgac cgtctaagtt ccacaccgac ggctataaga gtttcattat 780aaattttagc aaaataaaat cagcaaataa ttttttcttg actaagctta aacgacgccg 840ttaacatttt cttctggcta acatgaacaa ctctttgaag aaagaagaac gcgtagaaga 900agataacgga aaatctgacg gtaacagagg gaaaccgtcg acggaagttg ttcggacggt 960aacggaggaa gaggtggatg agtttttcaa gatattacgg agagtacacg tggcgacacg 1020aacggttgcg aaagttaacg gcggtgttgc tgagggagag ttaccgtcta agaagaggaa 1080acggagtcag aatcttgggt tgagaaactc gttggattgt aacggcgttc gagacggaga 1140attcgatgag attaatcggg tcgggttaca gggtttgggt ttggatctga actgtaaacc 1200ggaaccagac agcgttagtt tatcgttgta gacttgtagt ccttcatgtt tttccccttc 1260ttacaataat caattttttt ttaactacaa tacttttgaa aaaaatggta aaagaagatt 1320attaacatgt tatccaaatt tcagattctt cagttttatt ttatacgtca aaagagaagt 1380tatatatttg caaaactaca agtcaaacaa aagctattta agcgtttgac gttcctaaac 1440aacataaatt ttactaaaat caatgtttta aaaaagtgtt gatggtaaag atatcaattg 1500ggcctttgcc tggcccgttt agtaatattg cagagtaggt atgggcctgt ataagggagt 1560ccaaaaaaag agcgggcatt gcgggttggg tgcgtttgga actttggatt gtggattagt 1620catggtttat ctattaatgt ctgcggactt gtggacgacg cgcttgttct tcttcctctg 1680tttacgactt acgaacatat 1700
2104211608212DNA213Solanum tuberosum220
221CDS222(124)..(438)4004caggtaatac acacagaaaa cattgacata acagatcgaa tacacattat attatattaa 60tgagagaata aagagaagta attgcactag cagtattgac aattaatcag ctagccggct 120tga atg cta ctt atg gac gga gaa aag aag agg aag aga aca gca atc168Met Leu Leu Met Asp Gly Glu Lys Lys Arg Lys Arg Thr Ala Ile1 5 10 15ggc gcc gga gat cgg agt aag gat gag gta gaa gct act gtg aag gag216Gly Ala Gly Asp Arg Ser Lys Asp Glu Val Glu Ala Thr Val Lys Glu20 25 30gag gag ccg ccg tca gag gcg gag gtt gac gag ttc ttc gcg atc tta264Glu Glu Pro Pro Ser Glu Ala Glu Val Asp Glu Phe Phe Ala Ile Leu35 40 45cgg agg atg cat gtg gcg gtg aaa tat ctc cag aga aat gct cag att312Arg Arg Met His Val Ala Val Lys Tyr Leu Gln Arg Asn Ala Gln Ile50 55 60cgg ccg gaa aac ctt aac gca tcg ccg gcc ggt gct aae ggt gtc gca360Arg Pro Glu Asn Leu Asn Ala Ser Pro Ala Gly Ala Asn Gly Val Ala65 70 75gct gga cgg aag aga gaa cgg gga atc gtg aga aaa ggt gat ttg gac408Ala Gly Arg Lys Arg Glu Arg Gly Ile Val Arg Lys Gly Asp Leu Asp80 85 90 95ctc aac act ctg ccg gac ggc gga gac taa ttaacgcagt ttaagcatag 458Leu Asn Thr Leu Pro Asp Gly Gly Asp100 105gttaattaca taaatgcacc cttaattatc gtagattctt aagattgatc tgctgtacag 518attaattaat taaagccttt ttttatatat atttctccgg taaacggttt gctctttgtg 578attttcttta ataaatttaa tttattttat 608
2105211104212PRT213Solanum tuberosum4005Met Leu Leu Met Asp Gly Glu Lys Lys Arg Lys Arg Thr Ala Ile Gly1 5 10 15Ala Gly Asp Arg Ser Lys Asp Glu Val Glu Ala Thr Val Lys Glu Glu20 25 30Glu Pro Pro Ser Glu Ala Glu Val Asp Glu Phe Phe Ala Ile Leu Arg35 40 45Arg Met His Val Ala Val Lys Tyr Leu Gln Arg Asn Ala Gln Ile Arg50 55 60Pro Glu Asn Leu Asn Ala Ser Pro Ala Gly Ala Asn Gly Val Ala Ala65 70 75 80Gly Arg Lys Arg Glu Arg Gly Ile Val Arg Lys Gly Asp Leu Asp Leu85 90 95Asn Thr Leu Pro Asp Gly Gly Asp1002106211349212DNA213Lycopersicon esculentum220
221CDS222(3)..(233)4006ct tcg gag gga gag gtg gat gag ttt ttc gca att tta cgg agg atg 47Ser Glu Gly Glu Val Asp Glu Phe Phe Ala Ile Leu Arg Arg Met1 5 10 15cac atg gcc gta aaa tat ctt cag aga aac gct cag att cag ccg gaa95His Met Ala Val Lys Tyr Leu Gln Arg Asn Ala Gln Ile Gln Pro Glu20 25 30aac gtt aac gct cac ggc agc aag tta acc gca tcg ccg gcc ggt gtt 143Asn Val Asn Ala His Gly Ser Lys Leu Thr Ala Ser Pro Ala Gly Val35 40 45
aac gga gat gca act gga cag aag aga gaa cgg gga atc gtg aga aaa191Asn Gly Asp Ala Thr Gly Gln Lys Arg Glu Arg Gly Ile Val Arg Lys50 55 60ggt gat ttg gac ctc aac act ttg ccg gac tgc gga gac taa233Gly Asp Leu Asp Leu Asn Thr Leu Pro Asp Cys Gly Asp65 70 75cgcagtttaa gcataggtta attacagaaa tgcaccttta attatcgtag attcttaaga 293ttgatctgct gtacaaatta attaaatgaa gccttttttt atatataaaa aaaaaa 349210721176212PRT213Lycopersicon esculentum4007Ser Glu Gly Glu Val Asp Glu Phe Phe Ala Ile Leu Arg Arg Met His1 5 10 15Met Ala Val Lys Tyr Leu Gln Arg Asn Ala Gln Ile Gln Pro Glu Asn20 25 30Val Asn Ala His Gly Ser Lys Leu Thr Ala Ser Pro Ala Gly Val Asn35 40 45Gly Asp Ala Thr Gly Gln Lys Arg Glu Arg Gly Ile Val Arg Lys Gly50 55 60Asp Leu Asp Leu Asn Thr Leu Pro Asp Cys Gly Asp65 70 75210821175212PRT213Glycine max4008Met Glu Val Glu Lys Arg Lys Asn Lys Arg Val Met Gly Glu Glu Glu1 5 10 15Glu Ser Glu Arg Val Lys Asn Lys Arg Leu Lys Gly Val Glu Glu Glu20 25 30Asp Gly Ser Asp Gly Val Pro Thr Glu Glu Glu Val Glu Glu Phe Phe35 40 45
Ala Ile Leu Arg Arg Met Arg Met Ala Val Lys Tyr Phe Asp Asp Lys50 55 60Gly Arg Gly Gly Arg Glu Trp Arg Glu Ala Leu65 70 75210921190212PRT213Glycine max4009Gly Gly Val Pro Thr Glu Glu Glu Val Glu Glu Phe Phe Ala Ile Leu1 5 10 15Arg Arg Met Arg Val Ala Val Lys Tyr Phe Asp Asp Lys Gly Ser Gly20 25 30Gly Lys Glu Trp Arg Lys Ala Leu Glu Thr Ala Glu Leu Thr Val Asp35 40 45His Arg His Asp Val Val Ala Ala Glu Glu Asp Asp Lys Pro Arg Lys50 55 60Lys Gly Gly Glu Val Ile Ile Asn Glu Gly Phe Asp Leu Asn Ala Val65 70 75 80Ala Pro Glu Ala Ala Glu Gly Gly Gly Ala85 902101021185212PRT213Nicotiana tabacum40010Met Asp Gly Glu Lys Lys Arg Lys Arg Thr Glu Asn Gly Lys Ala Asn1 5 10 15Gly Gly Asp Arg Asn Arg His Glu Arg Lys Ser Ala Ala Asn Glu His20 25 30Thr Ala Val Ser Pro Pro Pro Ser Glu Ala Glu Val Asp Glu Phe Phe35 40 45
Ala Ile Leu Arg Arg Met His Val Ala Val Arg Tyr Leu Gln Glu Ser50 55 60Gly Gln Lys Arg Val Val Pro Lys Gly Asp Leu Asp Leu Asn Thr Leu65 70 75 80Pro Gly Asn Gly Asp852101121127212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物 NIM5』RI40011ggaacgaatt catggacacc accattg 272101221126212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物NIM3』SalI40012aaaaaagtcg actaagagca agagtc262101321122212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物NIMtrunc3』NcoI40013cgatctccat ggcagcttgt cc2221014
21120212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物NIMloop5』RI40014gaaccgaatt catgatcgca 202101521120212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物16GSP140015ttccggttta cagttcagat 202101621122212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物GSP240016gacccgatta ataatctcat cg222101721120212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物GSP340017caccatttct ggttggaggt 20
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223人工序列描述引物16F40018acgacgccgt taacattttc 202101921121212DNA213人工序列220
223人工序列描述引物16R40019gaaggggaaa aacatgaagg a 212102021126212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物NI16-DegF220
221misc_feature222(1)..(26)223n＝a，t，c，或g40020cggaggnnga ggtngaygag ttyttc262102121127212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物NI16-DegR220
221misc_feature222(1)..(27)223n＝a，t，c，或g40021gaaraactcr tcnacctcnn ccctccg 2721022211413212DNA213擬南芥220
221CDS222(1)..(336)223NI1940022atg gac aga gac aga aag agg gtg aaa atg gag aag gaa gat gac gaa 48Met Asp Arg Asp Arg Lys Arg Val Lys Met Glu Lys Glu Asp Asp Glu1 5 10 15gaa gaa aag atg gag aag ttg tac aca gtg ctt aaa aac gca agg gaa 96Glu Glu Lys Met Glu Lys Leu Tyr Thr Val Leu Lys Ash Ala Arg Glu20 25 30atg cgg aaa tat gtc aac agc tcc atg gag aag aag aga cag gaa gaa144Met Arg Lys Tyr Val Asn Ser Ser Met Glu Lys Lys Arg Gln Glu Glu35 40 45gaa gaa aga gca agg gtt cgt aga ttc cct tcg ttt cag cca gaa gat192Glu Glu Arg Ala Arg Val Arg Arg Phe Pro Ser Phe Gln Pro Glu Asp50 55 60ttc att ttc atg aat aaa gca gag gcc aac aac att gaa aaa gca gct240Phe Ile Phe Met Asn Lys Ala Glu Ala Asn Asn Ile Glu Lys Ala Ala65 70 75 80aat gag agc tct tca gca tcc aac gag tat gat ggc tct aag gaa aag288Asn Glu Ser Ser Ser Ala Ser Asn Glu Tyr Asp Gly Ser Lys Glu Lys85 90 95caa gaa gga tct gag act aac gtt tgt tta gac ttg aat ctt tct ctg336Gln Glu Gly Ser Glu Thr Asn Val Cys Leu Asp Leu Asn Leu Ser Leu
100 105 110tagcatacat acatacaaga gacaaagagc tcttcagttt ctgtataagc aacaaagaat 396gttagtaact acgtacc 41321023211112212PRT213擬南芥40023Met Asp Arg Asp Arg Lys Arg Val Lys Met Glu Lys Glu Asp Asp Glu1 5 10 15Glu Glu Lys Met Glu Lys Leu Tyr Thr Val Leu Lys Asn Ala Arg Glu20 25 30Met Arg Lys Tyr Val Asn Ser Ser Met Glu Lys Lys Arg Gln Glu Glu35 40 45Glu Glu Arg Ala Arg Val Arg Arg Phe Pro Ser Phe Gln Pro Glu Asp50 55 60Phe Ile Phe Met Asn Lys Ala Glu Ala Asn Asn Ile Glu Lys Ala Ala65 70 75 80Asn Glu Ser Ser Ser Ala Ser Asn Glu Tyr Asp Gly Ser Lys Glu Lys85 90 95Gln Glu Gly Ser Glu Thr Asn Val Cys Leu Asp Leu Asn Leu Ser Leu100 105 11021024211962212DNA213擬南芥40024tgtgtttctc agaaatagca cgaaatattt ataaaaagca tgcaattctc ttatagatcg 60cgaagtttaa aaaaacatat agaattgtta caatattaca tgggttttta ttggataaca120tgacaaatat ttatttattt catgagtttt tattggatag catgacaaat attaatatat180
cagtgttaat aacatgtttt gttcttaaaa tacatgcatt ttaaaatcag acatttgttt240taaaatcaaa tctaatctct tatatcacaa cgacattgac ggaaaattca ggtaaaaaga300gaaaataaag aatgagagat agagagattt ctatggaaaa agaaagagag aacatgtagg360tgaacaaaat aaagagatat gatgatatat tttatgagag gtggtgaaga ttattttagg420agagggagag agaaatagaa aaagaaaatg acatggtgaa tctgaagaag atgaattgtg480ttaaagatga agagagaaag agaactccat ggctaaagtc tcgtaaagaa gatgaaaaag540aaacaaaaga aggaagaaga aagagaaagg ctaaaataga ctaactattg ccaaaatttc600tgtagccgac aaatactatt tggtccaagg ttattttgtg tattcttttg aagtcaaaag660ttatttctta catatactct aaaaatatag ccgataccaa tttttccaca catggacttc720ctttattcca aaagtcaata aagtgtgacg tcatgatact tacgctttaa aacatcgcat780gatgatgtca ttagcatcaa tctccaccgt ccaatttatt tagttgttga caatatcgac840cgtctaagtt ccacaccgac ggctataaga gtttcattat aaattttagc aaaataaaat900cagcaaataa ttttttcttg actaagctta aacgacgccg ttaacatttt cttctggcta960ac 96221025211862212DNA213擬南芥40025tgggttttta ttggataaca tgacaaatat ttatttattt catgagtttt tattggatag 60catgacaaat attaatatat cagtgttaat aacatgtttt gttcttaaaa tacatgcatt120ttaaaatcag acatttgttt taaaatcaaa tctaatctct tatatcacaa cgacattgac180ggaaaattca ggtaaaaaga gaaaataaag aatgagagat agagagattt ctatggaaaa240agaaagagag aacatgtagg tgaacaaaat aaagagatat gatgatatat tttatgagag 300
gtggtgaaga ttattttagg agagggagag agaaatagaa aaagaaaatg acatggtgaa360tctgaagaag atgaattgtg ttaaagatga agagagaaag agaactccat ggctaaagtc420tcgtaaagaa gatgaaaaag aaacaaaaga aggaagaaga aagagaaagg ctaaaataga480ctaactattg ccaaaatttc tgtagccgac aaatactatt tggtccaagg ttattttgtg540tattcttttg aagtcaaaag ttatttctta catatactct aaaaatatag ccgataccaa600tttttccaca catggacttc ctttattcca aaagtcaata aagtgtgacg tcatgatact660tacgctttaa aacatcgcat gatgatgtca ttagcatcaa tctccaccgt ccaatttatt720tagttgttga caatatcgac cgtctaagtt ccacaccgac ggctataaga gtttcattat780aaattttagc aaaataaaat cagcaaataa ttttttcttg actaagctta aacgacgccg840ttaacatttt cttctggcta ac 86221026211274212DNA213擬南芥40026tctaaaaata tagccgatac caatttttcc acacatggac ttcctttatt ccaaaagtca 60ataaagtgtg acgtcatgat acttacgctt taaaacatcg catgatgatg tcattagcat120caatctccac cgtccaattt atttagttgt tgacaatatc gaccgtctaa gttccacacc180gacggctata agagtttcat tataaatttt agcaaaataa aatcagcaaa taattttttc240ttgactaagc ttaaacgacg ccgttaacat tttc27421027211544212DNA213擬南芥40027agattatttt aggagaggga gagagaaata gaaaaagaaa atgacatggt gaatctgaag 60
aagatgaatt gtgttaaaga tgaagagaga aagagaactc catggctaaa gtctcgtaaa120gaagatgaaa aagaaacaaa agaaggaaga agaaagagaa aggctaaaat agactaacta180ttgccaaaat ttctgtagcc gacaaatact atttggtcca aggttatttt gtgtattctt240ttgaagtcaa aagttatttc ttacatatac tctaaaaata tagccgatac caatttttcc300acacatggac ttcctttatt ccaaaagtca ataaagtgtg acgtcatgat acttacgctt360taaaacatcg catgatgatg tcattagcat caatctccac cgtccaattt atttagttgt420tgacaatatc gaccgtctaa gttccacacc gacggctata agagtttcat tataaatttt480agcaaaataa aatcagcaaa taattttttc ttgactaagc ttaaacgacg ccgttaacat540tttc 54421028211274212DNA213擬南芥40028tctagaaata tagccgatac caatttttcc acacatggac ttcctttatt ccaaaagtca60ataaagtgtg acgtcatgat acttacgctt taaaacatcg catgatgatg tcattagcat120caatctccac cgtccaattt atttagttgt tgacaatatc gaccgtctaa gttccacacc180gacggctata agagtttcat tataaatttt agcaaaataa aatcagcaaa taattttttc240ttgactaagc ttaaacgacg ccgttaacat tttc274210292112001212DNA213人工220
223GUS報導基因帶有內含子40029
atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa120gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt180cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca240ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat300aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg360tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa420taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat480gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt540ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa600ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag660cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac720accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt780aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt840gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg900aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa960agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380
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1.包含啟動子的分離的核酸分子，其中該啟動子包含SEQ ID NO26或SEQ ID NO28。
2. 權利要求1的分離的核酸分子，其中所述啟動子能夠由SAR誘導化學品或病原體誘導。
3. 權利要求2的分離的核酸分子，其中所述SAR誘導化學品是水楊酸(SA)或苯並(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)。
4.權利要求2的分離的核酸分子，其中病原體是丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)。
5.包含與目的編碼序列可操作連接的權利要求1的分離的核酸分子的嵌合基因。
6.包含權利要求5的嵌合基因的重組載體。
7.包含權利要求5的嵌合基因的轉基因宿主細胞。
8.權利要求7的轉基因宿主細胞，其中該宿主細胞是植物細胞。
9.包含權利要求8的轉基因宿主細胞的轉基因植物。
10.來自權利要求9的轉基因植物的轉基因種子，其中該種子包含所述嵌合基因。
11.包含啟動子的分離的核酸分子，其中該啟動子包含SEQ IDNO24或其片段。
12.權利要求11的分離的核酸分子，其中所述SEQ ID NO24片段包含SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、和SEQ ID NO27之一。
13.權利要求11的分離的核酸分子，其中所述啟動子可由SAR誘導化學品或病原體誘導。
14.權利要求13的分離的核酸分子，其中所述SAR誘導化學品是水楊酸(SA)或苯並(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)。
15.權利要求13的分離的核酸分子，其中所述病原體是丁香假單胞菌。
16.包含與目的編碼序列可操作連接的權利要求11的分離的核酸分子的嵌合基因。
17.包含權利要求16的嵌合基因的重組載體。
18.包含權利要求16的嵌合基因的轉基因宿主細胞。
19.權利要求18的轉基因宿主細胞，其中該宿主細胞是植物細胞。
20.包含權利要求19的轉基因宿主細胞的轉基因植物。
21.來自權利要求20的轉基因植物的轉基因種子，其中該種子包含所述嵌合基因。
全文摘要
擬南芥NI16是在酵母雙雜交篩選中通過它與NIM1蛋白質的相互作用而分離得到的，且編碼在植物中參與SAR基因調控的一種蛋白質。NI16在經過苯並(1，2，3)噻二唑－7－硫代羧酸S－甲酯(BTH)處理的過量表達NTM1的植株中受到強烈誘導。本文公開了擬南芥NI16啟動子的核酸序列。
文檔編號A01H5/00GK1954075SQ200480042402
公開日2007年4月25日 申請日期2004年3月12日 優先權日2004年3月12日
發明者R·M·凱德, R·A·迪特裡希, K·A·勞頓 申請人:辛根塔參與股份公司