丹參酚酸b在製備防治骨質疏鬆症藥物製劑中的應用的製作方法

2023-06-05 12:44:01 1

專利名稱：：丹參酚酸b在製備防治骨質疏鬆症藥物製劑中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及由丹參酚酸B製劑在防治老年性骨質疏鬆症的應用。
背景技術：
：原發性骨質疏鬆症是老年人的常見病，從整個世界範圍來看，60歲以上老人佔整個人口中的比例不斷上升，我國目前已步入老齡化社會，因而關注老人身體健康，提高生活質量顯得十分重要。由於骨質疏鬆，老年人脊椎骨折，髖部骨折發生率在增高，併發症嚴重,常長期臥床，失去生活能力，死亡率高達15-30%，因此防治老年骨質疏鬆病不僅是現代醫學界急待解決的問題，也是一個社會化問題。原發性骨質疏鬆症本質上是衰老的集中體現，可分為絕經後骨質疏鬆和老年性骨質疏鬆。前者多見於絕經後1520年由於雌激素不足的婦女，為高轉換型骨質疏鬆；後者多見於70歲以上的老年人，男女均可發病，多為低轉換型骨質疏鬆。目前防治骨質疏鬆症的藥物主要分為三種類型一類為抑制骨吸收的藥物，如雌激素、降鈣素、孕激素、二膦酸鹽類等；另一類是促進骨形成的藥物，如氟化物、同化類固醇激素、依普拉芬等；第三類為作用骨礦化的藥物，如鈣劑、維生素D等。第一類是預防、治療絕經後骨質疏鬆症的主要藥物，但存在嚴重的不良反應，其最嚴重不良反應是刺激子宮內膜增生，增加子宮內膜癌的發病率，而且長期使用也會增加乳腺癌的發病率和引起子宮出血等。第二類則較適合於老年性骨質疏鬆，但這一類藥物還處於研發的初始階段，有良好前景，其代表藥氟化物證明可增加骨量，但卻會降低骨質量而誘發繼發性骨折。第三類藥物療效明確且安全，但也存在一些不良反應。因此，尋找療效肯定，無毒副作用的防治骨質疏鬆的藥物成為了一個新的研究熱點。丹參是我國傳統醫學中應用廣泛的藥物，其化學成分主要分為兩類，即脂溶性的二瞎醌類化合物和水溶性的酚酸類成分。在我國傳統醫學中應用丹參主要為其水煎液，國內外學者對丹參水溶性成分的研究比較深入。丹參的水溶性成分均具有酚酸性結構，其中最早發現的為丹參素，化學名稱為3，4-二羥基苯乳酸，丹參酚酸是一類含有酚羥基的有機酸類化合物，是丹參水溶性成分中重要的組成部分。丹參酚酸有多種，但都具有相似的基本結構，並具有相似的作用。丹參酚酸B又稱為丹參酚酸乙(salvianolic-acidB)或紫草酸B(lithospermicacidB)，是一種縮酚酸類多羥基化合物，淡黃色無定形粉末，分子式C36H3o016，為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，是目前研究較多的丹參酚酸之一。丹參酚酸B對心、腦、肝等器官具有重要的藥理作用，已有報導的作用主要有下述幾方面1.對心肌缺血再灌注損傷的保護作用1.對心肌缺血再灌注損傷的保護作用有研究證實，丹參酚酸B對缺血再灌注引起的體外灌流大鼠心臟發揮保護作用，降低心室纖顫發生率，減輕心肌細胞超微結構的破壞程度，縮小心肌梗死的範圍，減少LDH、CPK從心肌細胞的溢出、降低缺血心肌中MDA含量，提高SOD的活力，對心肌組織表現出明顯的保護作用。有文獻報導，丹參酚酸B對血小板功能有明顯影響，對多種因素引起的血小板聚集均有顯著的抑制作用，而且在抑制血小板聚集的同時，對膠原誘導的血小板釋放5-羥色胺(5-HT)也有顯著的抑制作用。2.對心臟微血管內皮細胞的損傷起保護作用心臟缺血缺氧時，心臟微血管內皮細胞最易損傷，實驗研究表明丹參酚酸B預處理可抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的鈣離子超載、減少內皮素(ET)及腫瘤壞死因子a(TNF-a)的釋放、改善血栓素/前列環素(TXA2/PGI2)系統的平衡狀態、降低缺氧/復氧損傷後內皮細胞細胞間黏附分子的表達，起到保護內皮細胞的作用。3.對動脈粥樣硬化的防治作用丹參酚酸B對動脈粥樣硬化具有抑制作用，影響血液中脂質代謝。低密度脂蛋白(LDL)氧化修飾是動脈粥樣硬化發生發展的一個重要原因，氧化修飾的LDL具有細胞毒性作用，易於被巨噬細胞識別並大量攝取形成泡沫細胞，影響單核細胞的遷移，從而促使動脈粥樣硬化的發生發展。實驗研究表明，丹參酚酸B能有效抑制Cu2+誘導的LDL的氧化修飾，對防治動脈粥樣硬化有重要意義，其作用機制可能與清除自由基、螯合Cu2+有關。泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊內出現的特徵性病理細胞。泡沫細胞中高度表達血管內皮生長因子(VEGF)，在體外培養的U937泡沫細胞模型中，丹參酚酸B劑量依賴性的抑制泡沫細胞VEGF的表達，對動脈粥樣硬化有預防和治療作用。此外，丹參可通過抑制內源性膽固醇的合成，抗脂蛋白的氧化，抑制單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)，對抗H202誘導的平滑肌細胞(VSMCs)凋亡，抑制平滑肌細胞增生相關基因c-myc的表達等作用來預防和治療動脈粥樣硬化。4.抗氧化作用丹參酚酸B具有很強的抗氧化作用，體內外實驗證明，丹參酚酸B能清除氧自由基、降低羥自由基活性；顯著地抑制由NADPH-維生素C和Feh-半胱氨酸誘導的腦線粒體、肝線粒體和腎線粒體脂質過氧化，其抗氧化活性比維生素E強百倍至千倍；是目前已知的抗氧化作用最強的天然產物之一，這一作用已被不同實驗者在不同的實驗條件下做了反覆證明。5影響三磷酸腺苷(ATP)酶的活性有國內學者研究發現，丹參酚酸B在適當濃度下(<liimol/L)可以使Na+-K+-ATP酶活性升高,但在高濃度時則表現為抑制作用;丹參酚酸對Ca2、Mg2+-ATP酶活性的影響與其對Na+-K+-ATP酶活性的作用基本相似，但對不同組織中酶活性的影響不完全一致。丹參酚酸B(310mg/kg，ip)連續應用l周，可使原發性高血壓大鼠心肌Na+-K+ATP酶基因表達的增強效應減弱,表現出對Na+-K+-ATP酶基因表達的調節作用。6、對腦的保護作用和對學習記憶功能的影響血管內皮生長因子(VEGF)是內皮細胞特異性的有絲分裂原，具有促進內皮細胞增生，提高血管通透性等生物學特性。腦缺血後，低氧可激活VEGF及其受體(VEGFR)系統，促使半影區VEGF表達，VEGF誘導大量新生血管形成，促進血管增生，增加受累組織的血流灌注和供氧量，減少神經元的凋亡和死亡，減輕腦損傷程度。實驗研究顯示丹參酚酸B與冰片、三七等配伍可顯著提高VEGFmRNA表達，促進新生血管形成，並能較好地抑制VEGF誘導血管通透性增加的作用。丹參酚酸B影響大腦內祌經遞質含量，正常大鼠連續給丹參酚酸B(310mg/kg,ip，qd)5天，正常大鼠腦內遞質含量發生變化，表現為多巴胺(DA)、5-HT等遞質代謝產物含量降低，但單胺類遞質的含量無明顯變化。近年研究證明，丹參酚酸B對衰老動物模型、老年痴呆動物模型有一定的治療作用。其不僅可以通過抗氧化作用保護神經細胞，而且對e澱粉樣蛋白聚集有明顯的抑制作用。7、抗肝纖維化和對肝臟疾病的防治作用丹參酚酸B對肝臟疾病的防治作用首先體現在其抗肝纖維化方面。肝纖維化是肝臟經受各種肝臟致炎因子刺激以後,從肝臟炎症進展至肝硬化必然經過的中間階段,已有研究表明肝纖維化可以逆轉。肝星狀細胞(hepaticstellatecdl,HSC)的活化是肝纖維化發生發展的中心環節,轉化生長因子-e1(TGF-e1)是最重要的促HSC活化的細胞因子。肝貯脂細胞(FSC)是一種肝臟實質細胞，在病理條件下被激活後大量增生,同時產生細胞外基質(ECM)的能力增長數十倍,因此，FSC在肝纖維化形成過程中也起到了重要作用。丹參酚酸B能抑制TGF-e1的HSC胞內信號轉導及其受體蛋白的表達，從而拮抗TGF-M的促HSC活化,並能抑制活化FSC增生，抑制FSC生成細胞外基質而減少膠原纖維在肝內的沉積。另有研究表明,丹參酚酸B鎂鹽具有抗脂質過氧化抗肝損害的作用，有減輕肝組織纖維化程度的功能，臨床用於治療慢性B型肝炎肝纖維化取得滿意效果。研究發現，丹參酚酸B鎂鹽具有抗脂質過氧化抗肝損害的作用，有減輕肝組織纖維化程度的功能。丹參酚酸B具有保護肝功能的作用。日本學者對丹參酚酸B鎂鹽進行了比較系統的研究,發現丹參酚酸B鎂鹽可以對抗D-半乳糖胺引起的大鼠肝損傷，顯著降低血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性，減輕肝細胞壞死程度。但是，丹參酚酸B對骨質疏鬆的影響至今沒有報導，本研究發現丹參酚酸B有明顯的抗骨質疏鬆作用
發明內容發現丹參酚酸B對骨質疏鬆有明顯的防治作用，證明了丹參酚酸B在防治骨質疏鬆發明的新用途，提出了丹參酚酸B在製備防治老年性骨質疏鬆症的藥物製劑方面的應用，特別是丹參酚酸B可製成臨床其他可接受的藥物製劑，如片劑、丸劑、衝劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、滴丸、皮膚外用製劑中的任何一種，供臨床應用。具體實施例方式實施例一1.實驗動物分組給藥及藥物的製備1.1實驗動物及飼養條件SPF級成年雌性未孕SD大鼠32隻，體重271.67i25.63g，由廣東省實驗動物中心提供，廣東省實驗動物質量合格證編號粵監證字2006A015。飼養條件飼養室內溫度保持24'C28°C，溼度在50%60%，專室分籠飼養，每籠兩隻，隔日更換墊料，自由攝水，攝食(本院動物中心提供的標準飼料)，每周稱體重一次。1.2實驗設計與分組去卵巢實驗時除假手術組外其餘各組大鼠以3%戊巴比妥鈉無菌溶液0.13ml100g"BW腹腔注射麻醉，無菌條件下腹部手術切除雙側卵巢後縫合，假手術組大鼠只切開肌層進入腹腔尋找出卵巢後不切除並回納腹腔。手術後觀察傷口癒合情況並常規飼養，觀察2d後開始作灌胃預防給藥。32隻大鼠隨機分為4組，分別為假手術組、去卵巢組、利維愛、丹酚酸B組(SalB)8隻。從去卵巢後2d開始，陽性對照藥利維愛按0.25mgkg—1bwd"，丹酚酸B組按12.5mg*kg"bwd"灌胃給藥；假手術組及去卵巢組每天給予等量蒸餾水灌胃，連續90d。每天各組灌胃給藥情況如下組別動物數實驗時間(天)處理措施假手術組890假手術+蒸餾水去卵巢組890去卵巢+蒸餾水利維愛組890去卵巢+利維愛0.25mgkg1bwd—1丹酚酸B組890去卵巢+丹酚酸B12.5mgkg1bw.d—1所有大鼠殺前13、14天皮下注射25mg.kg"鹽酸四環素各一次，於殺前3、4兩天皮下注射鈣黃綠素5mg.kg"各一次，兩螢光標記間隔10天。每周稱量一次體重，自由飲水給食。實驗結束後，用3%戊巴比妥鈉(1.5mLkg")行腹腔注射麻醉後右心室徹底抽血處死(以減少骨髓中紅細胞，排除幹擾，使骨片更易於觀察分析)。檢測指標右側脛骨上段製成不脫鈣骨切片、中段骨製成不脫鈣骨磨片，進行骨組織形態計量學參數檢測；取右尺骨鹽酸消化後測骨鈣、磷和骨羥脯氨酸含量，取右股骨及第5腰椎分別測量其骨重、骨密度，以此評價實驗大鼠骨成分、骨量變化；另外稱取子宮溼重計籌子宮指數以觀察子宮大體變化。1.3藥物的製備丹酚酸B:為乾燥粉末製品，購自西安鴻生生物技術有限公司，出廠HPLC法檢測丹酚酸B含量為10.5%,批號060605,重金屬含量《10PPM、農藥殘留含量《2PPM、細菌總數《1000CFU/g、黴菌及酵母菌《100CFU/g,未檢出沙門氏菌、大腸桿菌等有害致病菌，符合動物灌胃給藥標準。用蒸餾水配製成1.25mgml—1丹酚酸B溶液，lml100g"bwd—1灌胃給藥，每日鮮配。利維愛為替勃龍片，南京歐加農生產有限公司生產，規格:2.5mg/片，批號LH-0502-10。2實驗方法2.1大鼠內臟重量的測定子宮及右股骨等重量(溼重)採用稱重法，計算子宮/體重比、股骨/體重比。2.2骨鈣、磷及羥脯氨酸含量的測定方法將右尺骨精密稱重後，8(TC烘烤72h至恆重，再次精密稱重並記錄。隨後將每份骨標本置於10ml安培瓶中加入6mol/LHCL5ml，酒精噴燈火燒瓶口密封后108'C烤箱恆溫消化24h後取出過濾。將濾液分成兩份，一份以1:200稀釋後用ICP儀測定Ca、P等元素的含量，再依據標準品含量及樣品稀釋倍數計算Ca、P等元素的含量；另一份濾液，股骨以1:10稀釋，調PH值至7.07.4後，按照羥脯氨酸(hyp)測定試劑盒方法用UV-752型紫外分光光度計測定樣品吸光度值，依據公式計算骨中羥脯氨酸含量。2.3骨組織形態計量學方法脛骨上段脫水塑料包埋，製作非脫鈣骨切片，厚度為4ym和9ym，二甲苯透明後樹脂封片，用圖像分析儀分別測量松質骨動、靜態形態學計量學參數。靜態參數包括骨小梁百分率(n/。Tb,Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)，動態參數中骨形成參數包括螢光周長百分率(％L.Pm),礦化沉積率(MAR),骨形成率(BFR/BS)，骨形成率(BFR7BV)，骨形成率(BFR/BV);通過動態參數，可以了解骨表面礦化的量和速率，並解釋靜態參數變化的原因。脛骨中段脫水塑料包埋，製作非脫鈣骨磨片，厚度為40ym,二甲苯透明後樹脂封片，用圖像分析儀測量皮質骨形態學計量學參數如皮質骨面積(Ct.Ar),皮質骨面積百分比(％Ct.Ar)，骨髓腔面積百分比(％Ma.Ar)。2.4骨密度的測定美國GE-Lunar公司DEXA骨密度儀測量實驗大鼠離體右股骨及第5腰椎骨密度。2.5統計學分析差分析(ANOVA)，方差齊採用LSD檢驗；方差不齊則採用Tamhane'sT2檢驗；偏態分布則用Kruskal-Wallis秩和檢驗後，再進一步用Conover'st檢驗比較兩兩組間差別。3.實驗結果3.1丹酚酸B對去卵巢大鼠子宮、股骨重量的影響丹酚酸B對去卵巢大鼠子宮、股骨重量的影響見表3.1:表3.1丹酚酸B對去卵巢大鼠子宮、股骨重量的影響(3f土s)tableseeoriginaldocumentpage8*P<0,05vs假手術組，**P<0.01vs假手術組，△P<0.05vs去卵巢組，△△P<0.01vs去卵巢組由表3.1的結果可見，與假手術組相比，去卵巢組股骨指數顯著減少(PO.01)，與去卵巢組相比各幹預組股骨指數均不同程度揚高(P《0.05或P〈0.01);與假手術組相比，利維愛組明顯增加大鼠子宮重量外(P《.01)，丹酚酸B組與去卵巢組大鼠子宮重量都明顯下降(P<0.01)，和去卵巢組相比，丹酚酸B組對子宮重量無明顯差異。3.2丹酚酸B對去卵巢大鼠尺骨有機質和鈣、磷含量的影響丹酚酸B對去卵巢大鼠尺骨的有機質(骨hyp/骨幹重)、無機質(骨鈣/骨幹重)的影響見表3.2:表3.2丹酚酸B對去卵巢大鼠尺骨成分的影響(3f土"組別骨hyp/骨幹重(mg/g)骨鈣/骨幹重(mg/g)假手術組17.1±1.5跳4±8.3去卵巢組14.1±3.1*82.0±15.7*利維愛組18.0±2,6a186.7土56.9aa丹酚酸B組19.2±1.9aa128.2±24.3aa*P<0.05vs假手術組，**P<0.01vs假手術組，△PO.05vs去卵巢組，△△P<0.01vs去卵巢組由表3.2可知，與假手術組相比，去卵巢組尺骨的hyp、Ca分別下降了17.5%、18.3%(P<0.05);提示去勢大鼠同時有骨鈣和骨膠康的丟失。與去卵巢組相比，利維愛、丹酚酸B均能分別增加hyp、Ca(P〈0.01))，說明丹酚酸B能有效預防去勢大鼠尺骨Ca、P的丟失，效果和利維愛相當。3.3丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨上段松質骨形態計量學靜態參數的影響丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨上段骨組織計量學中靜態參數%化.Ar(骨小梁面積百分數)、Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.N(骨小梁數量)、Tb.Sp(骨小梁分離度)的影響見表3.3:表3.3丹酚酸B對去卵巢大鼠松質骨靜態參數的影響(5±s)tableseeoriginaldocumentpage9*PO.05vs假手術組，**P<0.01vs假手術組，△P<0.05vs去卵巢組，△△PO.01vs去卵巢組由表3.3可知與假手術組比較，去卵巢組的骨形態計量學研究觀察到脛骨上段的靜態參數中骨小梁面積百分率(％Tb.Ar)和Tb.Th(骨小梁厚度)、骨小梁數量(Tb.N)分別降低了75.5%、16.7%和71.4%;骨小梁分離度(Tb.Sp)增加了3.5倍(P〈0.01);而與去卵巢組比較，利維愛、丹酚酸B分別能不同程度改善上述形態學參數(P〈0.05或P〈0.01)，說明丹酚酸B可以有效預防去卵巢對大鼠松質骨顯微結構的破壞。3.4丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨上段松質骨形態計量學動態參數的影響丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨上段骨組織形態計量學中動態參數^L.Pm(螢光周長百分率)、MAR(骨礦化沉積率)及三種骨形成率指標BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV的影響見表3.4:表3.4丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨上段松質骨動態參數的影響(3f士s)組tableseeoriginaldocumentpage9*P<0.05vs假手術組，"PO.01vs假手術組，△PO.05vs去卵巢組，△△P<0.01vs去卵巢組由表3.4可知，與假手術組相比，去卵巢組大鼠的WL.Pm(螢光周長百分率)增加了約2.2倍(P<0.01),而MAR(骨礦化沉積率)則增高了69.1%(P〈0.01)，各骨形成率亦明顯升高(P〈0.05或P〈0.01)，反映了去勢手術對脛骨上段松質骨的作用主要表現為顯著增加骨轉化;而與OVX組相比，丹酚酸B組的各項動態參數均表現為降低骨轉化，與利維愛相似(P〈0.05或P〈0.01)。3.5丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨中段骨皮質骨靜態參數的影響丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨中段骨皮質骨靜態參數Ct.Ar(皮質面積)、％Ct.Ar(皮質面積百分率)、％Ma.Ar(骨髓面積百分率)的影響見表3.5:表3.5丹酚酸B對去卵巢大鼠脛骨中段骨皮質骨靜態參數的影響(3F士s)tableseeoriginaldocumentpage10*P<0.05vs假手術組，**P<0.01vs假手術組，△P<0.05vs去卵巢組，△△PO.01vs去卵巢組由表3.5可知，與假手術組比較，去卵巢組大鼠的鬼Ma.Ar增加表明骨髓腔擴大，％Ct.Ar降低提示皮質骨面積減少(P<0.05):而丹酚酸B能使大鼠的Ct.Ar明顯增加(P<0.05)。說明丹酚酸B對去卵巢大鼠中段骨的皮質骨形成有一定的作用。3.6丹酚酸B對去卵巢大鼠骨密度的影響丹酚酸B對去卵巢大鼠右股骨及第5腰椎骨密度的影響見表3.6:表3.6丹酚酸B對去卵巢大鼠右股骨及第5腰椎骨密度的影響(i士s)tableseeoriginaldocumentpage10*P<0.05vs假手術組，**P<0.01vs假手術組，△PO.0'5vs去卵巢組，△△P<0.01vs去卵巢組由表3.6可知，與假手術組相比，去卵巢組大鼠股骨及第5腰椎骨密度顯著下降(P〈0.01、P〈0.05);利維愛、丹酚酸B均能使去勢大鼠骨密度增加(P〈0.01或P〈0.05)，其中丹酚酸B對腰椎骨密度的影響比利維愛明顯。權利要求1.丹參酚酸B在製備防治骨質疏鬆的藥物製劑中的應用。全文摘要本發明涉及用丹參酚酸B製備防治骨質疏鬆症藥物製劑，研究表明用丹參酚酸B製備的藥物製劑，對去卵巢大鼠導致的高轉換型的骨質疏鬆有非常明顯的預防和治療作用，臨床可用於老年性骨質疏鬆症的預防及治療作用，特別是對絕經期後骨質疏鬆和對腎上腺糖皮質激素等藥物造成的骨質疏鬆也具有較好的預防及治療作用。文檔編號A61K31/343GK101401804SQ20081017686公開日2009年4月8日申請日期2008年11月21日優先權日2008年11月21日發明者鐵吳,燎崔,張新樂,張益嘉,彬李申請人:廣東醫學院