一種調控上轉換發光納米材料體內外自噬和毒性的方法

2023-06-05 01:17:36 2

專利名稱：一種調控上轉換發光納米材料體內外自噬和毒性的方法
技術領域：
本發明屬於納米生物學領域，具體涉及一種調控上轉換發光納米材料體內外自噬和毒性的方法。
背景技術：
基於稀土的上轉換發光納米顆粒(upconversion nanophosphors, UCN)作為新一代生物發光標記，相比有機螢光染料和量子點等下轉換發光標記而言，上轉換發光納米顆粒具有光穩定性好、化學穩定性高、吸收和發射帶很窄、發光壽命長、潛在生物毒性小等優點，上轉換發光標記因採用近紅外連續雷射作為激發源，具有較深的光穿透深度、無生物背景螢光幹擾、對生物組織幾乎無損傷等顯著優勢，使其成為生物成像的理想標記物。此外，由於稀土上轉換納米材料為稀土摻雜氟化物納米顆粒，其具有較低的聲子能，可以降低非輻射躍遷提高發光強度，在氧化物、硫化物、磷化物等眾多基質中脫穎而出，近年來也被廣泛應用在分析檢測、疾病治療等領域。然而，稀土上轉換納米顆粒作為無機納米顆粒，用於體內應用及臨床試驗之前還存在著許多問題。例如，其易團聚且不溶於水，很難應用於體內環境；在體內進行生物成像及體內光動力治療應用時，其會與很多組織、細胞及生物分子進行非特異性的粘附，影響作用效果；進入細胞或動物體內，其會引發嚴重的細胞自噬，甚至導致細胞死亡等。細胞自噬是細胞在營養缺乏等外界刺激下的應激反應，通過形成雙層膜結構將部分胞質和細胞器包裹形成自噬體後與溶酶體融合形成自噬溶酶體，將內含物消化並重新利用。近年來的研究發現一個納米材料普遍存在的生物學效應，即納米材料進入細胞內導致自噬水平異常升高。納米材料引發的自噬是一把雙刃劍。隨著納米科技的迅猛發展，自發或有目的性地進入人體的納米材料與日俱增，而這些納米材料在體內組織器官中極可能產生的自噬效應對人類健康帶來了安全性隱患，另一方面，自噬與重大疾病的發生、發展息息相關，對於廣泛應用於生物醫學診斷和治療的納米材料，通過對納米材料引發的自噬進行人為調控，有望促進納米材料在癌症等重大疾病中的診斷和治療應用。目前，對自噬的調控研究主要是針對自噬自身水平的調控，例如自噬誘導齊U: 二氫青蒿素(CN102038678A)，以線粒體為靶點的二吡啶甲基胺類配體的錳配合物(CNl 01392007)，4-苯並噻酚氨基喹唑啉衍生物(CN101836992A)，β -咔啉釕配合物(CN101845060A)，植物病毒(菸草花葉病毒)(CN101653462)，雷帕黴素(CN102274219A)，非受體酪氨酸激酶c-Abl特異性抑制劑(CN1899616)，羥基酪醇(CN102397268A);自噬抑制劑:巴佛洛黴素Al (CN101953845A)，3-甲基腺嘌呤、SB203580、LY294002或渥曼青黴素(CN101869568A)，氯喹(CN101920015A)，羥基氯喹(CN101428025)。而對於無機納米材料誘導的自噬的調控研究目前仍是一片空白。

發明內容

本發明提供了一種調控上轉換發光納米材料體內外自噬和毒性的方法，所述方法包括將多肽和上轉換發光納米材料混合孵育，以使所述多肽特異性結合納米顆粒，其中，所述上轉換發光納米材料包含稀土。在實施例中，應用噬菌體展示技術識別出的多肽具有一個編碼展示多肽CTARSPWIC (RE-0,SEQ ID NO:1)的核苷酸序列。攜帶該展示多肽的噬菌體顯示出特異性的高親和力結合稀土納米顆粒的能力。本發明中還提供了高親和力的特異性結合稀土納米顆粒的多肽及其類似物的化學合成，這些類似物包括噬菌體展示技術篩選鑑定出的胺基酸序列。包括含有噬菌體展示肽的胺基酸序列的特定多肽及其類似物，顯示出能夠高特異性結合稀土納米材料的能力。這些稀土納米材料包括稀土金屬氧化物，稀土金屬硫化物，稀土金屬硫氧化物，基於稀土元素摻雜的上轉換發光納米材料以及一切含有稀土元素的化合物。任何本領域的技術人員所熟知的這些多肽或蛋白質的生產技術包括但不限於通過諸如重組技術等標準的分子生物學技術來表達肽或蛋白質、從自然原料中分離肽或蛋白質、或者化學合成這些肽或蛋白質等，都包括在本發明的保護範圍之內。在一個較佳的實施例中，合成出一個序列為ACTARSPWICG (RE-1，SEQ ID NO:2)的多肽，RE-1包括了 RE-O的序列，即來源於噬菌體M13外殼蛋白上的RE-O序列加上兩個末端胺基酸A和G。在另一些實施例中，RE-1的多肽類似物也被合成出來。這些多肽類似物包括RE-3 (ACffPATRISCG, SEQ ID NO:4)，它是RE-1兩端的各2個胺基酸不變、中間七個胺基酸順序打亂形成的；RE-2X(ACTARSPWICGGGACTARSPWICG，SEQ ID NO: 13)，它是由兩個 RE-1組成的。已經證實這些多肽及其類似物高親和力的特異性結合稀土納米材料的能力。在另一些實施例中，RE-1的多肽類似物也被合成出來。這些多肽類似物包括RE-2 (TARSPWI，SEQ ID NO:3)，它是RE-1去掉兩端各2個胺基酸後剩餘的中間七個胺基酸組成的；RE-4 (AATARSPffICG, SEQ ID NO:5)，它是RE-1的一個單獨胺基酸被替換(C —A);RE-5 (ACAARSPffICG, SEQ ID NO:6)，它是RE-1的一個單獨胺基酸被替換(T —A);RE-6 (ACTAASPffICG, SEQ ID NO:7)，它是RE-1的一個單獨胺基酸被替換(R —A);RE-7 (ACTARAPffICG, SEQ ID NO:8)，它是 RE-1 的一個單獨胺基酸被替換(S — A);RE-8 (ACTARSAffICG, SEQ ID NO:9)，它是 RE-1 的一個單獨胺基酸被替換(P — A) ;RE_9(ACTARSPAICG，SEQ ID NO: 10)，它是 RE-1 的一個單獨胺基酸被替換(W — A) ;RE_10(ACTARSPffACG, SEQ ID NO: 11 )，它是 RE-1 的一個單獨胺基酸被替換(I — A) ;RE_11(ACTARSPff I AG, SEQ ID NO:12)，它是RE-1的一個單獨胺基酸被替換(C — A)。已經證實這些多肽及其類似物一般親和力結合稀土納米材料的能力。在另一些實施例中，RE-1的多肽類似物也被合成出來。這些多肽類似物包括RE-Ag (ACTARSPffICGGGNPSSLFRYLPSD, SEQ ID NO:14)，它是由 RE-1 和金屬銀特異性結合肽(NPSSLFRYLPSD)組成的，已經證實了它可以同時與稀土納米顆粒和金屬銀高親和力的特異性結合。RE-Ti (RKLPDAGGGACTARSPffICG, SEQ ID NO: 15)，它是由 RE-1 和金屬鈦特異性結合肽(RKLPDA)組成的，已經證實了它可以同時與稀土納米顆粒和金屬鈦高親和力的特異性結合。RE-AT (CLSYYPSYCGGACTARSPffICG, SEQ ID NO: 16)，它是由 RE-1 和凋亡細胞靶向肽(CLSYYPSYC)組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到凋亡細胞表面。RE-PH (SMSIARLGGACTARSPffICG,SEQ ID N0:17)，它是由RE-1和前列腺組織靶向肽(SMSIARL)組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到前列腺組織。RE-BH (CLEVSRKNCGGACTARSPffICG, SEQ ID NO: 18)，它是由 RE-1 和腦組織靶向肽(CLEVSRKNC)組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到腦組織。RE-LH (CGFECVRQCPERCGGACTARSPWICG, SEQ ID NO:19)，它是由RE-1和肺臟組織靶向肽(CGFECVRQCPERC)組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到肺臟組織。RE-DH(ACTARSPffICGGPKKKRKVC, SEQ ID NO:20)，它是由 RE-1 和核酸定位肽(PKKKRKV)組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到細胞核。RE-SMAC (ACTARSPffICGGGAVPIAQK, SEQ ID NO:21 )，它是由 RE-1 和促凋亡多肽SMAC(AVPIAQK)組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到凋亡細胞。RE-1-RGD (CRGDCGGACTARSPffICG, SEQ ID NO:22)，它是由RE-1和腫瘤細胞靶向肽R⑶組成的，已經證實了它不僅可以與稀土納米顆粒高親和力的特異性結合，而且可以將稀土納米顆粒靶向到腫瘤細胞。本發明也提供了編碼諸如多肽RE-O (SEQ ID NO:1)、RE_1 (SEQ ID NO:2)、RE_2X(SEQ ID NO:13), RE-3 (SEQ ID NO:4)或者是它們的部分的分離的核苷酸、同系物和類似物，或者在嚴格條件下雜交為編碼SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:4或者是它們的部分所示的胺基酸序列的核苷酸序列，都具有高親和力的特異性結合稀土納米顆粒的能力。進一步地，本發明還提供了核苷酸、同系物和類似物，包括編碼SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO:4所示胺基酸序列、它們的部分、或者是它們的互補序列的核苷酸序列。本發明利用稀土特異性結合多肽對上轉換發光納米材料的表面修飾，降低了上轉換發光納米材料在Hela細胞和Balb/c小鼠肝臟組織中的誘導細胞自噬的水平，進一步降低了上轉換發光納米材料的細胞毒性和肝損傷，提高了納米材料的生物安全性；將稀土特異性結合肽連接腫瘤細胞靶向序列RGD合成雙功能多肽RE-1-RGD，提高了上轉換發光納米材料誘導細胞自噬的能力，進一步增強納米材料在腫瘤細胞中的毒性，有效提高了納米材料的診療效果。


圖1為上轉換發光納米材料誘導細胞自噬形成GFP-LC3點狀聚集結果圖。圖2為RE-1屏蔽上轉換發光納米材料誘導的細胞自噬的濃度梯度效應結果圖。其中，圖2A、圖2B和圖2C為UCN結果；圖20、圖2E和圖2F為UCP結果，圖2G和圖2H為UCN-S結果。圖3為RE-1類似物對上轉換發光納米材料誘導的細胞自噬的影響結果圖。其中，圖3A、圖3B和圖3C為UCN結果；圖30、圖3E和圖3F為UCP結果。圖4為Western Blot檢測RE_1屏蔽上轉換發光納米材料誘導的細胞自噬結果圖。圖4A為UCN結果；圖4B為UCP結果。圖5為透射電鏡檢測RE-1屏蔽上轉換發光納米材料在細胞中自噬體的形成。其中，圖5A為UCN結果；圖5B為UCP結果。圖6為Western Blot檢測RE-1屏蔽上轉換發光納米材料誘導小鼠肝臟組織的細胞自噬結果圖。其中，圖6A為UCN結果；圖6B為UCP結果。
圖7為透射電鏡檢測RE-1屏蔽上轉換發光納米材料在誘導小鼠肝臟組織中自噬體的形成結果圖。其中，圖7A為UCN結果；圖7B為UCP結果。圖8為RE-1降低上轉換發光納米材料在Hela細胞中引發的細胞毒性結果圖。其中，圖8A為UCN的MTT結果；圖8B為UCN的PI染色結果；圖8C為UCP的MTT結果；圖8D為UCP的PI染色結果。圖9為RE-1類似物影響上轉換發光納米材料在Hela細胞中引發的細胞毒性的能力結果。其中，圖9A為UCN的結果；圖9B為UCP的結果。圖10為RE-1屏蔽UCP在小鼠肝臟組織中引發的肝損傷結果圖。圖11為RE-1-RGD提高上轉換發光納米材料UCN的Hela細胞特異性粘附能力的結果圖。圖12為RE-1-RGD增強上轉換發光納米材料UCN的細胞自噬能力結果圖。圖13為RE-1-R⑶增強UCN在Hela細胞中引發的細胞毒性結果圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限制本發明的範圍。以下實施例中的Hela細胞來源自中國科學院上海生化所；Hela_LC3細胞為穩定轉染eGFP-LC3質粒的細胞株，其中eGFP_LC3質粒攜帶有GFP報告基因，由東京醫科齒科大學的 N.Mizushima 教授提供；DMEM 培養基購自 Gibco(USA);UCP 購自 Phosphor Technology(UK)0MTT細胞活力檢測方法如下:加入樣品的細胞培養24h後，加入0.5mg/mlMTT液，培養4h後，棄去孔中的MTT液，加入200 μ I DMS0，搖床上輕輕震蕩lOmin，然後用酶標儀570nm波長下檢測。PI染色檢測方法如下:加入樣品的細胞培養24h後，加入Hoechst33342(IOmM)和PI (IOmM)染色lOmin，然後用螢光顯微鏡檢測，拍照，統計細胞的個數為500個。Western blot檢測步驟如下:細胞培養24h後，收集細胞用細胞裂解液(購自碧雲天公司)裂解細胞，沸水煮IOmin後，15%SDS-PAGE電泳後溼轉法將蛋白轉移到尼龍膜上(購自 Amersham 公司)。以 anti_LC3 (購自 Novus 公司)為一抗,GAPDH (購自 Millipore 公司)為內參，ant1-rabbit (購自 Promega 公司)為二抗進行 western blot。數據分析方法如下:student』 s-T test進行數據分析並用Origin做圖。實施例1、噬菌體展示技術篩選特異性與Nd2O3結合的短肽用來篩選特異性與Nd2O3結合的肽的文庫,是由New England Biolabs (Mass,MA)提供的，為含有二硫鍵的七肽文庫(Ph.D.-C7C)。這個文庫中的隨機片段的兩側是半胱氨酸殘基，它們可以在噬菌體組裝過程中被氧化形成二硫鍵的連接，這樣就形成一個環肽和靶對象相互作用。這個文庫含有超過二十億個克隆數。文庫中隨機肽在小外殼蛋白PlII的氨基端，所以每個噬菌體顆粒都表達五個拷貝。Ph.D.-C7C文庫中噬菌體表達隨機序列的位置之前是丙氨酸-半胱氨酸。在隨機肽和PlII蛋白間含有短的連接序列(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_絲氨酸)。(Ph.D. _C7C卩遼菌體肽展示試劑盒，http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp)。將 2 μ I 的 101° 個卩遼菌體與 Iml Nd203( lmg/ml,購自廣州惠州瑞爾化學)混合，在37°C搖床中孵育2h，12000rpm高速離心IOmin後，沉澱用TBST (含有2%吐溫-20，pH7.5)洗滌10次，將結合在Nd2O3上的噬菌體回收，然後與0.5ml快速生長的大腸桿菌ER2378 (購自New England Biolabs, Mass, MA)混合，鮮育0.5h後加入20ml的LB培養基(胰蛋白腖0.2g ;酵母提取物0.1g ;氯化鈉0.2g)中擴增6h。擴增的噬菌體在磷酸緩衝液(150mM NaCl, 50mM Tris-HCl，pH7.5)中重懸，並用來做第二輪的篩選。將第三輪迴收的卩遼菌體鋪在含有X-gal(5-bromo-4-chloro-3-1ndolyl-β _D_galactoside)和 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)的 LB 平板上，隨機挑取 15 個藍色的噬菌斑，用DNA自動測序儀(ABI3730)進行測序。其中12個(命名為RE0B-1)都是含有同樣的插入序列，編碼的肽序列是CTARSPWIC (RE-0, SEQ ID NO:1)0實施例2、特異性結合肽及其類似物的化學合成本申請中的多肽委託上海吉爾生化公司利用標準的FMOC固相合成法在多肽自動合成儀(CS536-1381，CS Bio C0., Menlo Park，CA)中合成，並用HPLC純化使其純度大於95%,利用質譜儀(ThermoFisher Scientific, Thermo, USA)鑑定分子量。序列ACTARSPWICG (RE-1, SEQ ID NO:2)的肽合成步驟如下。末端胺基酸丙氨酸和甘氨酸來源於M13表面蛋白。RE-1使用標準的FMOC固相合成法，一般的手動合成步驟如下:將大約 0.2mM Fmoc-Gly-Wang resin 加到手動反應試管(Peptide International),加入DMF使其膨脹2h。然後加入20%哌啶/DMF反應2min以除去Fmoc保護基團，重複一次去保護基的步驟，冰反應20min。陽性的Kaiser檢測結果表明樹脂上有自由氨基。胺基酸殘基按照如下的循環方法加到樹脂上:按照RE-1的序列將三倍過量的Fmoc保護胺基酸、三倍過量的HOBT和三倍過量的DIPEA/DMF加到反應試管中。在N2流中偶聯反應2h，反應試管用真空泵抽乾。N端保護的肽用DMF (5次X Imin)洗滌以除去過量的反應物，然後如前述方法用20%的哌啶/DMF去Fmoc保護基。反應試管用DMF洗滌以除去哌啶，進行重複的步驟偶聯序列中的下一個胺基酸。合成好有側鏈保護的Na-Fmoc-Ala-Cys-Thr-Ala-Arg-Ser-Pro-Trp-1le-Cys-Gly-resin結合物後,肽樹脂結合物用DMF (4次X Imin)洗漆,並用真空抽乾。氨基末端Fmoc保護基用20%哌啶/DMF除去。側鏈的去保護以及肽樹脂鍵的斷裂用IOml的裂解液(95%三氟乙酸、2.5%水和2.5%三異丙基矽烷)在500rpm振蕩下反應3h。將反應物轉移到預稱重的錐形瓶中，用冰的無水乙醚沉澱。粗產物真空乾燥48h。將70-100mg的粗產物用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化並凍幹成粉末。肽的純度用分析型RP-HPLC鑑定，其分子量用質譜儀鑑定。使用上述相同方法合成對照肽ACNATLPHQCG (AP-1，SEQ ID NO:23)和多肽類似物及衍生物。AP-1是一個有相同末端胺基酸而包含不相干內部序列的11肽。FITC通過Acp偶聯到RE-1和AP-1的氨基端。實施例3、UCN (NaYF4:Yb, Er)的合成方法球狀的NaYF4:18% Yb, 2% Er納米顆粒用如下方法合成。氯化釔(0.1562g)、氯化鐿(0.0503g)、氯化鉺(0.0055g)與3ml油酸和17ml十八烯混合在50ml長頸瓶中，加熱到160°C,然後冷卻至室溫。氫氧化鈉(0.0lg)和氟化銨(0.148g)溶入IOml甲醇中，並逐滴加入上述長頸瓶中， 攪拌30min確保氯化物充分反應。將上述溶液慢慢加熱蒸發掉甲醇，100°C脫氣lOmin，然後在氬氣中加熱至300°C並維持lh。溶液自然冷卻，沉澱納米晶體。再用乙醇沉澱，乙醇/水(體積比1:1)洗滌三次之後，在室溫下用IM鹽酸處理5h以除去表面的油酸，再用水和環己烷洗滌10次。對油酸在230nm的特徵吸收峰進行了檢測以確保其完全去除。UCN和UCN-S通過加入不同量的油酸合成(UCN:3ml油酸，UCN-S:6ml油酸)。合成的UCN儲存在水中以備使用。實施例4、上轉換發光納米材料(UCN, UCP, UCN-S)作為自噬誘導劑在細胞中引發自噬的能力將Hela_LC3細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2 X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，分別加入濃度為IOOmM的海藻糖(trehalose)(作為提高細胞自噬水平的化合物，陽性對照)、100 μ g/ml的上轉換發光納米材料(UCN，UCP，UCN-S)。陰性對照為加入等體積的PBS。細胞培養24h後，螢光顯微鏡觀察GFP報告基因的螢光，拍照，統計結果。結果顯示，上轉換發光納米材料(UCN，UCP, UCN-S)能夠不同程度的誘導Hela_LC3細胞自噬，並產生不同程度的細胞空泡現象，上轉換發光納米材料在相同劑量下誘導細胞自噬的能力依次為UCP>UCN>UCN-S (圖1)。實施例5、RE-1屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP, UCN-S)在細胞中引發自噬的能力RE-1包裹的上轉換發光納米材料(UCN，UCP, UCN-S)的合成方法如下:將50 μ g、10 μ g、350 μ g RE-1 分別與 100 μ g UCN、UCP、UCN-S 混合，37°C孵育 2h, 12000rpm 離心後，用水洗滌3次，洗去多餘的未結合的RE-1肽。沉澱用100 μ I水重懸備用。將Hela_LC3細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度梯度為Oyg/mlUOyg/ml、100μ g/mlU000 y g/ml的包裹和未包裹RE-1肽的UCN，UCP，UCN_S。細胞培養24h後，螢光顯微鏡觀察GFP報告基因的螢光，拍照，統計結果。分別以LC3聚集點和產生空泡的數量來評估細胞自噬能力。結果顯示，UCN，UCP，UCN_S誘導細胞自噬的能力隨著加入劑量的增加而增加，其中UCN-S並不引起細胞空泡。RE-1能夠顯著的屏蔽UCN (圖2A、圖2B和圖2C)，UCP (圖2D、圖2E和圖2F)，UCN-S (圖2G和圖2H)誘導的細胞自噬，且實驗結果具有統計學意義。實施例6、RE-1類似物屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在細胞中引發自噬的能力RE-1類似物RE-2，RE-3，RE-5包裹的UCN，UCP的合成方法如下:將50 μ g、10 μ g的 RE-1 類似物 RE-2, RE-3, RE-5 分別與 100 μ g UCN、UCP 混合，37°C孵育 2h, 12000rpm 離心後,用水洗滌3次,洗去多餘的未結合的肽。沉澱用100 μ I水重懸備用。將Hela_LC3細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2 X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為lOOyg/ml的UCN，UCN+RE-1,UCN+RE-2，UCN+RE-3, UCN+RE-5。空白對照為等體積的PBS，陰性對照為100 μ g/ml UCN和10mg/ml PEG的混合物，陽性對照為IOOmM海藻糖和50ugRE_l的混合物。細胞培養24h後，螢光顯微鏡觀察，拍照，統計結果。將Hela_LC3細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為lOOyg/ml的UCP，UCP+RE-1,UCP+RE-2，UCP+RE-3，UCP+RE-5。空白對照為等體積的PBS。細胞培養24h後，螢光顯微鏡觀察，拍照，統計結果。分別以LC3聚集點和產生空泡的數量來評估細胞自噬能力。結果顯示，RE-1類似物RE-2，RE-3，RE-5包裹後，屏蔽UCN誘導細胞自噬的能力有程度上的不同，其中屏蔽效果依次為RE-l>RE-3>RE-5，而RE-2幾乎沒有屏蔽能力，實驗結果具有統計學意義(圖3A、圖3B和圖3C)。同樣對於RE-1類似物RE_2，RE_3，RE-5包裹後屏蔽UCP誘導細胞自噬的能力也得出相同的結果(圖3D、圖3E和圖3F)。實施例7、RE-1屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在細胞中引發自噬的能力將Hela細胞接種在24孔細胞培養板中，密度約3_5 X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為100 μ g/ml的UCN和UCN+RE-1，空白對照為等體積的PBS，陰性對照為100 μ g/ml的UCN和10mg/ml的PEG的混合物，陽性對照為IOOmM海藻糖。然後進行western blot檢測。將Hela細胞接種在24孔細胞培養板中，密度約3_5 X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為100 μ g/ml UCP和UCP+RE-1，空白對照為等體積的PBS，陰性對照為100 μ g/ml UCP+AP-1的混合物，400 μ g/ml Ti02+AP_l的混合物，陽性對照為400 μ g/ml Ti02。然後進行western blot檢測。結果顯示，自噬發生後自噬標誌蛋白LC3蛋白會發生I型(18KD)和II型(16KD)的剪切，UCN和UCP均能提高細胞自噬水平(LC3II型明顯增加)，而包裹了 RE-1後顯著阻止了 LC3II型的增加。說明RE-1有效屏蔽了 UCN和UCP誘導細胞自噬的能力。並且這種屏蔽效果是特異的，只 有RE-1肽能屏蔽這種效果，AP-1沒有這個能力。相同的，RE-1隻能屏蔽UCN和UCP誘導細胞自噬的能力，不能屏蔽TiO2誘導的細胞自噬(圖4A =UCN ;圖4B:UCP)。實施例8、RE-1屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在細胞中自噬體的形成將Hela細胞接種在24孔細胞培養板中，密度約3_5X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為100yg/ml UCN, UCP, UCN+RE-1,UCP+RE-1。空白對照為等體積的PBS。細胞培養24h後，收集細胞的用2.5%戊二醛二甲胂緩衝(pH值7.4)在4°C原位固定lh，再在室溫條件下用2%四氧化鋨固定lh，然後用乙醇梯度脫水，再把細胞樣品包埋在環氧樹脂(EP0N812)裡。將包埋好的細胞樣品切成超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色後，切片用透射電子顯微鏡(JE0L-1230，JE0L，日本)觀察，拍照。結果顯示，UCN和UCP樣品組，細胞內產生大量的自噬體和空泡。而UCN+RE-1和UCP+RE-1樣品中並沒有發現。說明RE-1顯著屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在細胞中自噬體的形成(圖5A:UCN ； 5B =UCP)ο實施例9、RE-1屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在小鼠肝臟組織中引發的細胞自噬Balb/c小鼠(購自斯萊克斯，上海，中國)在無菌動物房中飼養，尾靜脈注射300 μ g(劑量為 15mg/kg)的 UCN、UCN+PEG (含有 IOmg PEG)、UCN+RE-1、UCP、UCP+RE_1、UCP+AP_1。對照注射等體積的生理鹽水。24h後，取出小鼠的肝臟組織，然後進行western blot檢測。結果顯示，UCN和UCP均能提高小鼠肝臟組織的自噬水平(LC3II型明顯增加)，而包裹了 RE-1後顯著阻止了 LC3II型的增加。說明RE-1有效屏蔽了 UCN和UCP誘導細胞自噬的能力。而PEG並不能屏蔽UCN誘導的肝臟自噬能力，同樣的AP-1也不能屏蔽UCP誘導的肝臟自噬能力(圖6A =UCN ；圖6B:UCP)。
實施例10、RE-1屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在小鼠肝臟組織中自噬體的形成將實施例9中取出的小鼠肝臟組織用2.5%戊二醛二甲胂緩衝液(pH值7.4)在4°C原位固定lh，再在室溫條件下用2%四氧化鋨固定lh，然後用乙醇梯度脫水，再把細胞樣品包埋在環氧樹脂(EP0N812)裡。將包埋好的細胞樣品切成超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色後，切片用透射電子顯微鏡(JE0L-1230，JEOL,日本)觀察，拍照。結果顯示，UCN和UCP樣品組，肝細胞內產生大量的自噬體和空泡且細胞質彌散，線粒體破裂或內含物丟失嚴重。而UCN+RE-1和UCP+RE-1樣品中並沒有發現。說明RE-1顯著屏蔽上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在肝臟組織中自噬體的形成，屏蔽自噬，而PEG和AP-1均沒有這個能力(圖7A =UCN ;圖7B:UCP)。實施例11、RE-1能夠降低上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在Hela細胞中引發的細胞毒性將Hela細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度梯度為10 μ g/ml，100 μ g/ml，250 μ g/ml, 500 μ g/ml, 1000 μ g/ml的未包裹和包裹RE-1肽的UCN和UCP。細胞培養24h後，分別進行MTT細胞活力檢測和PI染色檢測細胞死亡情況。結果顯示，UCN和UCP樣品組，細胞死亡率較高，納米材料對細胞的毒性隨濃度的增加而增加。而包裹了 RE-1後，細胞毒性明顯減低了。說明RE-1有效提高了上轉換發光納米材料的生物安全性(圖8A =UCN的MTT結果；圖8B =UCN的PI染色結果；圖8C =UCP的MTT結果；圖8D =UCP的PI染色結果)。實施例12、檢測RE-1類似物影響上轉換發光納米材料(UCN，UCP)在Hela細胞中引發的細胞毒性的能力將Hela細胞接 種在96孔細胞培養板中，密度約1_2X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度lmg/ml的UCN，UCP, UCN+PEG (含有IOmg PEG),UCN+RE-1,UCP,UCP+RE-1,UCN+RE-2,UCN+RE-3,UCN+RE-5,UCP+RE-2,UCP+RE-3，UCP+RE-5,細胞培養24h後，分別進行MTT細胞活力檢測和PI染色檢測細胞死亡情況。結果顯示，RE-1的類似物RE-2，RE-3，RE-5包裹後，對UCN和UCP引發的細胞毒性有不同程度上的影響，其中屏蔽細胞毒性的效果依次為RE-l>RE-3>RE-5，而RE-2幾乎沒有屏蔽能力。實驗結果具有統計學意義(圖9A:UCN ;圖9B:UCP)。實施例13、RE-1屏蔽UCP在小鼠肝臟組織中引發的肝損傷將實施例9中取出的小鼠肝臟組織用2.5%戊二醛二甲胂緩衝(pH值7.4)在4°C原位固定lh，再在室溫條件下用2%四氧化鋨固定lh，然後用乙醇梯度脫水，再把細胞樣品包埋在石蠟裡。將包埋好的細胞樣品切成超薄切片，用HE (蘇木精-伊紅)染色，螢光顯微鏡下觀察，拍照。結果顯示，UCP和UCP+AP-1樣品組，肝組織彌散，大量炎性細胞浸潤，多數肝細胞處於凋亡或死亡狀態；而UCP+RE-1樣品組，肝細胞完整，狀態完好。說明UCP能夠造成肝臟組織損傷，而包裹了 RE-1後，肝損傷程度明顯降低了，AP-1並沒有這樣的效果(圖10)。實施例14、RE-1-RGD提高了上轉換發光納米材料UCN的Hela細胞特異性粘附能力
將Hela細胞培養在蓋玻片(長寬均為22mm)上，正面細胞朝上或細胞朝下分別置於6孔板中，蓋玻片架在已經滅菌的小玻璃體(長寬高均為2mm)上，然後將含有未包裹和已經包裹了 RE-1，RE-1-RGD的上轉換發光納米材料的4ml DMEM培養基緩慢倒入六孔板中，使得細胞充分浸入培養基中，細胞蓋玻片的位置正好位於液體的中間高度。並放置在37°C的細胞培養箱中培養2h，然後用PBS洗滌3次，並用裝備有980nm紅外雷射器(MDL_980nmlW，Changchun New Industries Optoelectronics Tech.C0., Ltd, China)的突光顯微鏡(Olympus 1X71, Olympus, Japan)觀察細胞表面上結合的 UCN。結果顯示，未包裹RE-1的上轉換發光納米材料組有大量的非特異性粘附顆粒，包裹RE-1的上轉換發光納米材料組，細胞表面粘附的上轉換發光納米顆粒則大大的減少了，而包裹了 RE-1-RGD的上轉換發光納米材料組，細胞表面粘附的上轉換發光納米顆粒顯著高於前面兩組；說明連接了腫瘤細胞靶向序列RGD後的RE-1-RGD能夠顯著提高UCN與Hela細胞的粘附能力(圖11)。實施例15、RE-1-RGD增強上轉換發光納米材料UCN的細胞自噬能力RE-1-RGD 包裹的 UCN 的合成方法如下:將 50 μ gRE-1-RGD 與 100 μ gUCN混合，37°C孵育2h，12000rpm離心後，用水洗滌3次，洗去多餘的未結合的RE-1肽。沉澱用100 μ I水
重懸備用。將Hela_LC3細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為lOOyg/mlUCN，UCN+RE-1,UCN+1-RGD。空白對照為等體積的PBS。細胞培養24h後，螢光顯微鏡觀察細胞中LC3點狀聚集和空泡，拍照。結果顯示，包裹了 RE-1-R⑶的UCN組，細胞中的LC3點狀聚集和空泡比UCN組顯著增多，說明RE-1-RGD能夠特異性的靶向到細胞上，增強細胞自噬，提高UCN的診療效果(圖12A)。將Hela細胞接種在24孔細胞培養板中，密度約3_5 X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為100 μ g/ml UCN, UCN+PEG (含有IOmgPEG)，UCN+RE-1，UCN+1-RGD。空白對照為等體積的PBS。陽性對照為IOOmM海藻糖。然後進行western blot檢測。結果顯示，包裹了 RE-1-R⑶的UCN組，細胞中的LC3II型明顯增多，說明RE-1-RGD能夠顯著提高UCN的細胞自噬水平(圖12B)。實施例16、RE-1-RGD能夠增強UCN在Hela細胞中引發的細胞毒性將Hela細胞接種在96孔細胞培養板中，密度約1_2 X IO4/孔，過夜培養，待用。在加樣前，先將細胞換入新鮮培養基DMEM，加入濃度為lmg/ml UCN, UCN+RE-1，UCN+RE-1-RGD。細胞培養24h後，分別進行MTT細胞活力檢測和PI染色檢測細胞死亡情況。結果顯示，包裹了 RE-1-RGD的UCN組，細胞死亡率明顯比UCN組提高很多，說明RE-1-RGD能夠增強UCN在Hela細胞中弓I發 的細胞毒性，能夠有效提高UCN殺傷腫瘤細胞的能力(圖13A為MTT結果；圖13B為PI染色的結果)。
權利要求
1.一種調控上轉換發光納米材料體內外自噬和毒性的方法，其特徵在於，所述方法包括將多肽和上轉換發光納米材料混合孵育，以使所述多肽特異性結合納米顆粒，其中，所述上轉換發光納米材料包含稀土。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述多肽含有SEQID NO:1所示的多肽序列或其類似物。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述類似物是通過將SEQID N0:1所示的多肽序列的胺基酸增加、缺失、變換順序或替換獲得。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述胺基酸增加的類似物為SEQID NO:2,SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:2USEQ ID NO:22 所示的多肽序列。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述胺基酸缺失的類似物為SEQID NO:3所示的多肽序列。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述胺基酸變換順序的類似物為SEQIDNO:4所不的多妝序列。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述胺基酸替換的類似物為SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的多肽序列。
8.一種核苷酸序列，其特徵在於，所述核苷酸序列含有編碼如權利要求2所示的多肽序列或其類似物的核苷酸序列。
全文摘要
本發明提供了一種調控上轉換發光納米材料體內外自噬和毒性的方法，包括將多肽和上轉換發光納米材料混合孵育，以使所述多肽特異性結合納米顆粒，其中，所述上轉換發光納米材料包含稀土。本發明利用稀土特異性結合多肽對上轉換發光納米材料的表面修飾，降低了上轉換發光納米材料在Hela細胞和Balb/c小鼠肝臟組織中的誘導細胞自噬的水平，進一步降低了上轉換發光納米材料的細胞毒性和肝損傷，提高了納米材料的生物安全性；將稀土特異性結合肽連接腫瘤細胞靶向序列RGD合成雙功能多肽RE-1-RGD，提高了上轉換發光納米材料誘導細胞自噬的能力，進一步增強納米材料在腫瘤細胞中的毒性，有效提高了納米材料的診療效果。
文檔編號C12N15/11GK103173216SQ20121026013
公開日2013年6月26日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年6月7日
發明者溫龍平, 張雲嬌, 許婧 申請人:中國科學技術大學