中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白的製作方法

2023-06-01 10:25:41 1

專利名稱：：中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，特別地，本發明涉及一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白。更具體地說，本發明涉及中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7(Mainroyaljellyprotein)基因的cDNA序列，該cDNA序列編碼的AccMRJP7是西方蜜蜂"/w'5/ze"j'/era)AmcMRJP-7蛋白的同系物，該AccMRJP7經過翻譯後加工所得到的蛋白是西方蜜蜂AmcMRJP7蛋白(AmcMRJP7)的同系物。本發明還涉及有該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和蛋白的應用，以及所述多核苷酸和所述蛋白的製備方法。
背景技術：
：蜂王漿(RJ)是由成年工蜂頭部的外分泌腺體分泌的一種化合物，它是蜂群用於哺育蜂幼蟲的食物的重要組分，是促進幼蟲產生級型分化的最重要的營養因素。蛋白質是蜂王漿最主要的組分之一，佔王漿乾重的50y。(Klaudiny"a/.1994,JApicRes.33:105-111.)。一般王漿蛋白由水溶性蛋白(WSPs)和非水溶性蛋白組成，其中水溶性蛋白佔總蛋白含量的46%-89%CTomodawW.1977,/z'c16:125-130;TakenakaandEchigo1983,A^ppowiVoge汰(3gaA:wXa油..57:1203-1209)，為王漿蛋白的主要部分，稱MajorRoyalJellyProteins(MRJPs)(LenskyandRakover1983,0附;？屍/j^z'o/.75:607-615)。此外，Schmitzova等根據研究結果推測蜂王漿蛋白中MRJPs的含量可能達到90%(Schmitzovada/.1998,Ce〃Mo/h/e54(9):1020-1030)。Drapeau等通過對西方蜜蜂基因組研究確定，西方蜜蜂MRJPs家族有9個成員，即MRJP1MRJP9(Drapeau"a/.2006，GenomeResearch，16:1385-1394)。王漿酸(10-羥基-2-癸烯酸)曾是歷史上最早明確具有抗菌活性和抗腫瘤作用的王漿活性成分，迄今一直作為國際貿易中鑑別王漿質量的特徵指標應用。隨白組分具有護肝、免疫調節、抗疲勞等功能。據報導Watanabe等報導，西方蜜蜂MRJP1能無血清培養中人淋巴細胞生長(Watanabewa/.1998.Cyotec/wo/ogy.26:23-27.);Kamakura等發現分子量為57kD的MRJP1蛋白具有促進小鼠原代肝細胞DNA合成和抗疲勞作用(Kamakura"a/，2001，JNutrSciVitaminol(Tokyo).47(6):394-401.);Majtan等發現體外表達的MRJP1具有刺激老鼠巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子"(TNF")，提高肝細胞的增殖功能，對老鼠還有抗疲勞的作用(Majtan"a/,2005，IntImmunopharmacol.6(2):269-278)。Okamoto等報導MRJP3具有抗過敏和免疫調節功能，可能是王漿中的抗炎因子(Okamoto"a/2003，LifeSci.73(16):2029-2045)。因此，MRJPs蛋白己顯示出重要的營養學價值。在目前全世界己報導的9個蜜蜂屬(j;^)成員中，只有西方蜜蜂(j;^swe仏/era,分布最廣的常見亞種為義大利蜜蜂Ame//^ra^/^)和東方蜜蜂04.cem^)是得到人工馴化和規模化人工養殖，並用於蜂蜜生產。相對於西方蜜蜂來說，東方蜜蜂，包括我國特有的亞種中華蜜蜂(Acera"acera"a)因生產性能低，蜂群數量在原產地處於萎縮狀態。但國內外研究表明，因中華蜜蜂因長期適應於我國地理氣候，具有西方蜜蜂所不具備的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物學特點也多不同於前者,在蜜蜂育種和生態多樣性保護等方面具有非常重要的利用價值。根據Pothichot等研究發現，東西方蜜蜂的王漿營養功能存在差異把東西方蜜蜂1日齡以內的幼蟲轉移到西方蜜蜂蜂群中培育王臺，初始的王臺接受率無明顯差異，均接受良好，到3-4日齡時中蜂王臺中的幼蟲出現死亡而被意蜂清除，死亡率很高，而意蜂王臺則一切正常(PothichotandWongsiri.1993，AsianApic.128-133);東方蜜蜂和西方蜜蜂王漿中各組分的含量以及蜂王交叉詞養試驗也驗證了東方蜜蜂和西方蜜蜂的王漿成分不同這一觀點(TakenakaandTakenaka1996,BiosciBiotechBiochem.60:518-520)。蜜蜂種間蜂王漿，包括蛋白營養功能差異客觀存在，對西方蜜蜂MRJPs的廣泛研究不能取代東方蜜蜂MRJPs的相關研究和開發利用。泰國學者近年來從分布於泰國的另一個東方蜜蜂亞種印度蜜蜂04.cemmZm^'ca)王漿腺cDNA文庫中克隆到了主要王漿蛋白AcMRJPl、AcMRJP2、AcMRJP5基因序列，未能得到AcMRJP4、AcMRJP6AcMRJP8基因序列(Srisuparbh&<2/2003，JBiochemMolBiol.36(6):572-579;Imjongjiraketal2005,JBiochemMolBiol.38(1):49-57)。近年來我國蘇松坤等從構建的中華蜜蜂8曰齡工蜂頭部的cDNA文庫中獲得了中華蜜蜂編碼AccMRJPl、AccMRJP2、AccMRJP3和AccMRJP5的完整cDNA序列(蘇松坤等2004，遺傳學報；31(11):1248-1253;蘇松坤等2005，中國農業科學.38(3):612-618;Suda/.2005.Apidologie.36:389-401)，並發布於國際GenBank。蘇松坤等已申報了關於AccMRJPl的兩項發明專利(1)中華蜜蜂AccMRJPl表達產物酶解製備抗高血壓多肽的方法(申請號200810061679.X)，(2)促進細胞生長的中華蜜蜂AccMRJPl真核表達產物的製備方法(申請號200810061679.X)。但是，對於AccMRJPs中cDNA含量相對較少的基因，如AccMRJP4，一直未克隆成功，AccMRJP6和AccMRJP7均只有獲得部分序列(Su"a/.2005.Apidologie.36:389-401)，因技術原因未能得到全長基因序列。如他們在GenBank中只公布了編碼AccMRJP7蛋白的220個胺基酸序列的核苷酸序列(GenBank序列號GI:AY862496)，而根據發明人研究結果，AccMRJP7的完整蛋白實際全長有449個胺基酸，即蘇松坤等發布的蛋白序列缺少249個個胺基酸，而這部分序列是不可能在科研和應用中實現重組表達的。本發明獲得完整的AccMRJP7基因序列，為實現其生物工程利用提供了技術關鍵，具有十分重要的創新價值。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種中華蜜峰王漿主蛋白AccMRJP7基因，它具有SEQIDNo.5所示的序列。一種上述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白，它具有SEQIDNo.6所示的胺基酸序列。上述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白在製備抗體方面的應用。本發明的有益效果是:本發明首次提取分離中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的基因，該基因所編碼的AccMRJP7蛋白是一種生物活性物質，可應用於功能或營養食品，可作為抗原用於蜂王漿質量快速檢測試劑的製備，用其作為抗原製備的抗體適合於作蜜蜂MRJPs家族蛋白的分子生物學科研，為開發蜂王漿蛋白深加工和營養產品開發提供新的依據。圖1是中華蜜蜂頭部cDNA文庫克隆內擴增出的AccMRJPs家族及相關王漿多肽PCR產物片斷瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中，15-16泳道為AccMRJP7;圖2是中華蜜蜂AccMRJP7的PCR擴增結果及重組質粒雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中，A圖為AccMRJP7PCR產物；B圖為pMD18-T-AccMRJP7雙酶切(Sam/H&J^oI)瓊脂糖凝膠電泳鑑定圖；C圖為pGEX-4T-2-AccMRJP7雙酶切(SflmT/I&^/zoI)瓊脂糖凝膠電泳鑑定圖；M為DNAMarker;箭頭所示為目的基因片段；圖3是不同IPTG濃度下中華蜜蜂AccMRJP7基因重組表達產物的SDS-PAGE分析電泳圖；其中，M為標準蛋白分子量Marker;泳道1為未轉化任何載體的大腸桿菌BL21(DE3);泳道2為質粒pGEX-4T-2在大腸桿菌BL21(DE3)中表達；泳道3-6為GST-AccMRJP7融合蛋白(箭頭所示)在不同濃度IPTG(0.004g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.32g/L)誘導下的表達情況；圖4是中華蜜蜂GST-AccMRJP7多克隆抗體與西方蜜蜂王漿蛋白樣品和中華蜜AccMRJP5和AccMRJP3a真核表達產物的Westernblot印跡分析電泳圖；其中，圖A為西方蜜蜂王漿蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖，M為標準蛋白分子量Marker,RJ所示為西方蜜蜂王漿蛋白樣品。圖B和C為Westemblot印跡分析結果；RJ所示為西方蜜蜂王漿蛋白；泳道1和2為對照，分別為正常粉紋夜蛾(7hWz印/,'am',Tn)細胞抽提物和Tn細胞感染對照病毒後抽提物；泳道3為Tn細胞感染Accmrjp5重組病毒後的表達產物；泳道4為Tn細胞感染AccMRJP3a重組病毒後的表達產物。箭頭所示為AccMRJP5和AccMRJP3a表達產物的位置AmMRJPs各成員位置的標示參照Schmitzova等發表的西方蜜蜂蜂王漿(Schmitzova"a/1998,CellMolLifeSci.54(9):1020-1030)。具體實施例方式本發明提取分離的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因全長為1350個核苷酸，其詳細序列見SEQIDNo.5，開放讀框位於11350位核苷酸。在本發明中，"分離的"、"純化的"或"基本純的"DNA是指，該DNA或片段己從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來；還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。在本發明中，術語"中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列"指編碼具有中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的核苷酸序列，如SEQIDNo.5中11350位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指位於SEQIDNo.5序列的編碼框11350位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQIDNo.5中11350位核苷酸序列同源性低至約70%簡併序列也能編碼出SEQIDNo.6所述的序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下，與SEQIDNo.5中從核苷酸11350位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQIDNo.5中從核苷酸1234位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7相同功能蛋白的、SEQIDNo.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5'和/或3'端添加數個核苷酸。在本發明中，"基本純的"蛋白質是指其佔樣品總物質的至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層折、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。在本發明中，術語"中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7"指具有中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7活性的SEQIDNo.6序列1-439的多肽。該術語還包括具有與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7相同功能的、SEQIDNo.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7蛋白的活性片段和活性衍生物。該蛋白的變異形式包括:同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導突變體，在高或低的嚴謹度條件下能與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的抗血清獲得的蛋白。本發明還提供了其他蛋白，如包含中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7蛋白片段的融合蛋白。發明還提供中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的類似物，這些類似物與天然中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如P、Y胺基酸)的類似物。應理解，本發明的蛋白並不限於上述例舉的代表性的蛋白。修飾(通常不改變一級結構)形式包括；體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中.或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的蛋白。本發明還包括中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用於抑制細胞內中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的表達。本發明還包括一種探針分子，該分子通常具有中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列的8100個，較佳地150個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7核苷酸分子。本發明還包括檢測中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合，較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間，引物長度一般為1550個核苷酸。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞，較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如Tn細胞、CHO細胞、COS細胞等。另一方面，本發明還包括對中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，"特異性"是指抗體能結合於中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產物或片段。較佳地，指那些能與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的分子，也包括那些並不影響中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladneretal，美國專利No.4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自中華蜜蜂王漿主蛋白的抗體部分的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備，例如，純化的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來製備抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohlera/1975，Nature256:495，；Kohler"1976，Eur丄Immimol,6:511;Kohleretal1976,Eur.J.Immunol，6:292;Hammerlinge"/1981,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier,N.Y.)。本發明的抗體包括能阻斷中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7功能的抗體以及不影響中華蜜蜂王槳主蛋白AccMRJP7功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術而獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如五.co/f)中製備的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。在本發明的一個實施例中，中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日齡的中華蜜蜂工蜂頭部混合樣本(每個日齡各取IO個頭)抽提總RNA，反轉錄成cDNA建立文庫，通過文庫大規模表達序列片斷(EST)的DNA測序，用生物信息學軟體進行有效性處理、功能基因序列拼接和功能注釋，建立EST資料庫。獲得AccMRJP家族成員，包括2個AccMRJP7功能基因的完整編碼序列。然後根據功能基因的EST來源和編號，從EST資料庫查出具有5'端起始序列EST的30個對應克隆，抽提目標質粒作為模板，用載體中的一對M13通用引物，艮卩5，端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG，3，端引物GGAAACAGCTATGACCATGA進行PCR擴增，PCR產物電泳鑑定，對其中2個AccMRJP7克隆測定cDNA全長，將所得DNA序列與AmMRJP7和拼接序列AccMRJP7進行比對和同源分析獲得編碼完整AccMRJP7蛋白序列的開放閱讀框(ORF)，其擴增產物測序後得到的全長cDNA序列見SEQIDNo.5。以一個具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆為模板，用一對根據AccMRJP7核苷酸序列設計的一對寡核苷酸為引物，即5'端引物5，-GGATCCATGGCCATTGTTCGAAAAAATTC-3，，3，端弓|物5'-CTCGAGCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'，進行PCR擴增。將擴增產物插入pMD18-T載體，進行陽性克隆測序後確認得到SEQIDNo.5的全長cDNA序列。引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pGEX-4T-3上的限制性內切酶的酶切位點。將從pMD18-T載體雙酶切獲得的AccMRJP7基因片斷插入PGEM-4T-2(帶GST編碼序列)載體，陽性克隆轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，加IPTG進行誘導表達，獲得分子量為66kDa的AccMRJP7-GST融合表達蛋白，將誘導表達產物用超聲波破碎後，取沉澱進行SDS-PAGE電泳。用GST單克隆抗體對AccMRJP7-GST融合表達蛋白SDS-PAGE膠進行Western-blot檢測，66kDa蛋白印跡呈特異性條帶。從SDS-PAGE凝膠中切下特異性表達的蛋白條帶，進行透析，冷凍乾燥，用生理鹽水溶解純化蛋白作為抗原免疫白毛黑眼兔，6.1周後，從兔頸動脈收集血液，製取抗血清，-70'C保存備用。採用間接ELISA法。以免疫前採集的正常兔血清為陰性對照，經高速離心的西方蜜蜂蜂王槳溶液上清為抗原，HRP標記的羊抗兔IgG做酶標二抗，對所製備多克隆抗體進行酶聯免疫吸附試驗，OPD顯色後在492nm下測定OD值，確定抗體的效價正常。用AccMRJP7-GST多克隆抗體作為一抗，對西方蜜蜂王漿蛋白，以及同中華蜜蜂AccMRJP-3a和AccMRJP-5基因的重組杆狀病毒-昆蟲細胞表達蛋白SDS-PAGE膠進行Westernblot檢測，西方蜜蜂分泌王漿中的AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5，重組表達中華蜜蜂AccMRJP-3a和AccMRJP-5蛋白印跡均有特異性條帶，提供了用一種MRJP成員抗體檢測MRJP家族多種蛋白的新方法。中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7為中華蜜蜂王漿腺表達的蛋白，本發明的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7為研究中華蜜蜂王漿主要蛋白，乃之西方蜜蜂主要蛋白相關的分子機理提供了基礎。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明範圍。實施例1:中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的克隆和測定1.cDNA文庫構建用油漆筆標記當日羽化的中蜂工蜂，在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日齡期進行回捕，-8(TC保存。分別從每個日齡工蜂樣品取10個頭部，加液氮勻漿，加TRIZOL進行總RNA提取。用試劑盒分步純化出mRNA，合成cDNA第一鏈和第二鏈。然後用末端補平酶將雙鏈cDNA末端補平，加上五"iI接頭並將其磷酸化，再經屈ol酶切處理，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定，再用MinEluteGelExtraction試劑盒進行凝膠回收。將cDNA與載體pBluescriptIISK(+)相連，用電擊反應法轉化￡.co//DH10B感受態菌，加SOC培養基，3'7"C搖床復甦1h，取50菌液塗布含有IPTG/X-gal的LB培養基，37'C培養過夜。從生長轉化菌的平板上隨機挑取若干個菌落，培養，抽提質粒，採用M13通用引物進行PCR擴增鑑定文庫質量。2.cDNA文庫測序從文庫挑取單克隆接種在含LB培養基的96孔板，37'C培養18小時左右，提取質粒作為模板，用通用引物M13進行PCR擴增，樣品經純化後放入Megabace1000中進行測序，得到SEQIDNo.5所示的基因序列。3.EST功能注釋、晶片用EST篩選與資料庫構建利用浙江大學生物信息服務平臺伺服器進行EST片段處理和拼接，phrap軟體作有效性處理.。選出具有獨立功能的Contig、Siglet序列，用Ontology(GO)和Blast軟體進行功能注釋。用DNAstar軟體選出與Contig、Siglet序列相匹配的EST代表性序列。從中選出代表性AccMRJP家族成員，包括AccMRJP7功能基因的完整編碼序列。然後根據功能基因的EST來源和編號，從EST資料庫查出具有5'端起始序列王漿腺分泌的AccMRJP家族成員及相關多肽的EST對應克隆，抽提目標質粒作為模板，用載體中的一對M13通用引物，即5'端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG,3，端引物GGAAACAGCTATGACCATGA進行PCR擴增，PCR產物電泳鑑定，所選30個克隆有29個呈現0.5-2.5kb的DNA片斷(見附圖l)。其中2個AccMRJP7克隆顯示大小為1.5kb的DNA片斷。對2個AccMRJP7克隆測定cDNA全長，將所得DNA序列與AmMRJP7和拼接序列AccMRJP7進行比對和同源分析，均顯示編碼完整AccMRJP7蛋白序列的開放閱讀框，其擴增產物測序後得到的全長cDNA序列見SEQIDNo.5。根據得到的全長cDNA序列推導出中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的胺基酸序列，共449個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQIDNo.6。實施例2:同源比較用本發明的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中，用Blast程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現，它與西方蜜蜂王槳主蛋白AmMRJP7(GenBank發布的序列號GI:40949636)有顯著的同源性。AccMRJP7與AmMRJP7的胺基酸序列聯配結果(見表1)。AccMRJP7與AmMRJP7胺基酸序列的長度分別為449aa和443aa，兩者的同源性為84.2%，AmMRJP7中一些對應於AccMRJP7Asn位點的序列由Asp取代，但是AccMRJP7胺基酸序列中Asp的含量(6.4%)只是較AmMRJP7中偏低(8.1%)。兩個胺基酸序列C末端的差異較大，AmMRJP7胺基酸序列較AccMRJP7在426aa-431aa位點間缺失了NQNNNI六個胺基酸。從序列整體上看，AccMRJP7中多個Asn(N)位點在AmMRJP7中被Asp(D)位點取代。對AccMRJP7的胺基酸組成進行分析後發現，整個序列中Asn含量高達13.6%，而AmMRJP7中Asn含量僅為9.5%。另外，引起兩者中Asn含量差異懸殊的原因可以由AccMRJP7C末端出現的多個Asn位點來解釋。如前所述，東西方蜜蜂的王漿成分不同，相對應的單個MRJPs成員也存在或多或少的差異，兩MRJP7胺基酸序列C末端的不同，AccMRJP7的胺基酸序列中的RGD位點在AmMRJP7中也不存在。同時用本發明的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中，用Blast程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現，蘇松昆提交的編碼中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的部分核苷酸的蛋白序列的胺基酸序列的長度為220aa(在GenBank發布的序列號GI:AY862496),該序列是參考義大利蜜蜂王漿主蛋白AmMRJP7核苷酸序列，由不同王漿腺cDNA文庫克隆的測序獲得的6個EST拼接而成，而不是一個連續而完整的cDNA序列。相對於本發明的完整蛋白序列，蘇松昆的序列缺少了第110和300-449胺基酸序列，且其中兩者還有3個胺基酸不同(見表2)。其序列比完整序列缺少50%以上，如應用於重組表達將缺乏生物不能顯示生活活性，因而不能應用於科研和應用。表1:中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7與義大利蜜蜂主蛋白AccMRJP7(GenBank發布的序列號GI:40949636)的比較進行同源比較的兩個序列是:AccMRJP7與AmMRJP7AccMRJP7殘基總數449AmMRJP7殘基總數443表示一致殘基的符號為AccMRJP7AmMrjp7AccMRJPAraMrjp7AccMRJP7AmMRJP7AccMRP7AmMRJP7AccMRJP7Am服JP7AccMRjP7AmMRJP7AccM!UP7AmMRJP77i:MTKWLFMVVCLGIACQGAIVRKNSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQAAIQSGEYDHTKNYPFDV701:MTRWLFMVACLGIACQGAILRENSA亂KNSLKVMHEWKYIDYDFGSEEK職AIQSDEYDHTKNYPFDV70*************************************************************771:DQWRDKTFVTVLRYDGVPSSLNVISDKTGNGG虹QPYP亂沐TKYKDCSGI糧而AVmYDRLWVLD140771:DQ卿KTFVTVLRYDGVPSSLNVISEKTGNGGRLLQPYPDWSWTKYKDCSGIVSAYSIA皿FDRLWVLD140****************************************************************141:SGLINNIQPMCSPKLLVFDL,NSSQLLKQVDIPHDIAVNTTTENGRLASLVVQAMNPMNTLVYLSDNRGDA210211:LIVYQNSDDSFHRLTSNTFNYDPRYTKMTVEGESFTVQDGIYGMALSPMTNNLYYSPLASRDLYYVNTKP280***************************************************************281:FMKSEYGE麗QYKGVQNIFNTQSTAKAVS跳VLFFGLV麗AVGCWNEHQTLQRENTDMVAQNEETLQ350281:FIKSEYGENKVQYNGVQDVFNTQTTAKAVSKNGILFFGL麗TAVGCWNEHQT攀NT麗AQNEETLQ350***************************************************************351:MIVGMKIKELLPHIVIIDINNIINNEYMLVLSNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVTDLLENTRCANSN420351:MIVGMKIKQLLPHIVIIDIDNIINDEYMLVLTNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVSDLLENTRCTNFN420***************************************************************421:IQNNNNQNNNI,QNNDNNLKITINSLIN449421:IQNDDSDENNDD------SIRITIDASFN443由表1可見，中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7與義大利蜜蜂主蛋白AccMRJP7的同源性為84.2%。表2:本發明中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7(Shen7)與蘇松昆在GenBank發布的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7部分胺基酸序列(Su-7)，在GenBank發布的序列號GI:AY862496)的比較進行比較的兩個序列是Shen7與Su-7Shen7殘基總數449Su-7殘基總數220表示一致殘基的符號為Shen71:MTKWLFMVVCLGIACQGAIVRKNSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQAAIQSGEYDHTKNYPFOT70Su-71:C---------LGIACQGAIVRKKSARNLENSLNVLHEWKYIDYDFGSEERRQMIQSGEYDHTKNYPFDV61*氺氺氺*氺水氺氺*氺*氺*氺*氺氺*氺氺氺氺氺氺氺氺氺**氺*氺氺氺氺氺氺*氺氺氺氺氺;{:氺氺氺氺氺氺*氺氺*氺氺氺氺Shen7Su-7Shen7Su-7Shen7Su-7211:LIVYQNSDDSFHRLTSNTFDYDPKY麗TIEGESFTTQNGISG亂SPLTNNLYYSPLASRDLYYVNTKP280202:LIVYQNSDDSF亂SSNTL---------------------------------------------------220281221Shen7Su-7Shen7351Su-7221Shen7421Su-7221FMKSEYGENNVQYKGVQNIFNTQSTAKAVSKNGVLFFGLVNNTAVGCWNEHQTLQRENTDMVAQNEETLQ350----------------------------------------------------------------------221MIVGMKIKELLPHIVIIDINNIINNEYMLVLSNRMQKILNNDLNFNDINFRILIGGVTDLLENTRCANSN420----------------------------------------------------------------------221IQNNNNQN,INNQNNDNNLRITINSLIN449實施例3，中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7在大腸桿菌中的表達在該實施例中，以實施例1中具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆為模板，用一對根據AccMRJP7核苷酸序列設計的一對寡核苷酸為引物擴增的AccMRJP7基因在在大腸桿菌中進行重組表達。PCR反應中使用的5'寡核苷酸引物序列為5，端弓l物5，-GATCCATGGCCATTGTTCGAAAAAATTC-3，(SEQIDNo.1)，該引物含有Bam/fl限制性內切酶的酶切位點，翻譯起始密碼子和AccMRJP7的部分編碼序列；3'端引物序列為3'端引物5'畫TCGAGCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'(SEQIDNo.2)該引物含有XhoI限制性內切酶的酶切位點，翻譯終止子和AccMRJP7的部分編碼序列。引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pGEX-4T-2上的限制性內切酶的酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(Ori)、一個IPTG可調啟動子/操縱子(P/0)，一個凝血酶識別位點，一個谷光甘肽S轉移酶(GST)融和蛋白標記物以及限制性內切酶克隆位點。以具有完整AccMRJP7核苷酸序列的克隆AccMRJP7為模板進行PCR擴增，經電泳檢測，得到如圖2A所示的目的DNA片斷。陽性克隆測序後測序得到SEQIDNo.5的全長cDNA序列。將擴增產物純化，插入pMD18-T載體。對連至pMD18-T載體的連接產物pMD18-T-Accm咖7用萬amHI和WoI進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見前者在約2700bp和1300bp處(圖7-lB)與預期載體和目的片段大小相符的片段。用I禾H屈oI消化pMD18-T載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pGEX-4T-2載體並保持開放讀框在凝血酶識別位點起始點(Ori)。隨後用連接混合物轉化商品名為BL21的￡.//菌株，BL21含有多拷貝的重組質粒，其表達laclq阻遏物並攜帶抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒。用萬amHI和loI雙酶切所得質粒，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在約4900bp和1300bp處有與預期載體和目的片段大小相符的片段(圖2C)。測序驗證中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的cDNA片段，該序列為SEQIDNo.5序列的11350，與已正確插入了載體。將鑑定正確的重組表達質粒轉化人BL21(DE3)感受態細胞中，塗布菌液於含IOO"g/mlAmp的LB平板中，挑取白色菌落，接種於含同等質量濃度Amp的LB液體培養基中，37"C振蕩培養過夜活化。按每支試管6ml含Amp的LB液體培養基加入IOOul菌液的量，轉接活化菌液，共接四支試管，37°C、220r/min振蕩培養至OD600:0.6-1.0，按一定濃度梯度加入IPTG(每支試管中加入IPTG的終濃度分別為0.004g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.32g/L，)，37。C、180r/min誘導培養4h。每個濃度梯度下分別取1ml菌液，8000r/min離心5min收集菌體，棄上清後，加入PBS200tU震蕩懸浮沉澱，8000r/min離心5min，棄上清，再加入等體積的PBS和2XSDS凝膠加樣緩衝液，混勻後IOO°C煮沸10min，12000r/min離心1min，取其上清液。誘導產物經10%的SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍R-250染色2h後，室溫搖床上脫色至背景色脫盡觀察。鑑定表達該蛋白的分子量大小為約66kDa。SDS-PAGE和薄層掃描結果顯示，不同IPTG濃度下表達量不同，在IPTG終濃度為0.08g/L條件下，表達量最高，此時，表達產物佔細胞總蛋白的22.8%(圖3，泳道5)。實施例4:製備抗體將實施例3中獲得的重組蛋白親和層析法進行分離，或SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離用來免疫動物以產生抗體。具體方法如下將誘導表達產物用超聲波破碎後，取上清和沉澱進行SDS-PAGE電泳，結果表明表達產物主要在沉澱中，即主要以包涵體形式存在。沉澱經SDS-PAGE電泳後，從凝膠中切下特異性表達的蛋白條帶，裝入透析帶中，置於透析槽透析過夜，將透析液轉入1.5mleppendorf管中，冷凍乾燥，用0.9%的生理鹽水溶解純化的蛋白，從而完成GST-AccMRJP7抗原的製備。具體抗體製備步驟如下(1)選取14-16周齡的健康白毛黑眼兔，每次注射0.5mg左右純化的融合蛋白抗原。免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對照。(2)融合蛋白抗原溶於700pl生理鹽水，加700pl弗氏完全佐劑和適量青黴素、鏈黴素溶液乳化，皮下多點注射免疫。(3)3.3周後，融合蛋白抗原溶於700)il生理鹽水，加700pl弗氏不完全佐劑和適量青黴素、鏈黴素溶液乳化，皮下多點注射免疫。(4)4.2周後，融合蛋白抗原溶於1ml生理鹽水肌肉注射免疫。(5)5.1周後，再次用1ml溶有融合蛋白抗原的生理鹽水加強免疫。同時，從兔耳抽血樣，採用間接ELISA方法進行多抗血清效價測定。(6)6.l周后，頸動脈收集血液，置室溫下使其凝固。(7)將凝固的血液放入37。C溫箱內半小時，再置4'C冰箱過夜，使血塊收縮，抗血清析出；(8)吸出抗血清，3000r/min離心10min，吸上清液分裝，-70T保存備用。採用間接ELISA法。以免疫前採集的正常兔血清為陰性對照，經高速離心的蜂王漿溶液上清為抗原，HRP標記的羊抗兔IgG做酶標二抗，對所製備多克隆抗體進行酶聯免疫吸附試驗，OPD顯色後在492nm下測定OD值，確定抗體效價。多克隆抗體的稀釋採用倍半法，第一次稀釋100倍，第二次200倍，依次類推。所表達蛋白在抗體稀釋倍數為1.024X1S時，多克隆抗體OD492平均值仍大於陰性對照OD492值的兩倍(表3)。為MRJPs的研究和檢測提供了材料。表3:本發明中GST-AccMRJP7融合蛋白多克隆抗體效價的ELISA檢測tableseeoriginaldocumentpage16實施例5:以中華蜜蜂王漿主蛋白GST-AccMRJP7抗體檢測MRJPs將實施例4中獲得的-GSTAccMRJP7抗體，通過Westernblot檢測在杆狀病毒-昆蟲細胞系統中表達的AccMRJP-3a和AccMRJP-5蛋白。具體方法如下在無血清條件下，用Lipofectin介導重組的Bacmid-AccMRJP-3a和Bacmid-AccMRJP-5基因組DNA轉染生長狀態良好的粉紋夜蛾細胞Tn-5Bl-4。轉染72h後收穫呈球形的細胞，進行蛋白樣品SDS-PAGE電泳。將實施例4中製備的GST-AccMRJP7多抗與西方蜜蜂王漿蛋白樣品和中蜂主要王漿蛋白基因AccMRJP5和AccMRJP3a的真核表達產物進行Westernblot分析。方法如下1.蛋白樣品經SDS-PAGE後，剪取與分離膠相同大小的PVDF膜，將分離膠、3MM濾紙及PVDF膜置Transferbuffer中平衡1520min。2.將3MM濾紙、PVDF膜、分離膠和3MM濾紙依次裝入轉移夾中，用Bio-RadTrans-BlotCell半乾轉移系統，轉移條件為恆電壓15V20min。3.帶樣品的PVDF膜用封閉液(用lxPBST溶解的4%脫脂奶粉)室溫封閉lh。4.棄封閉液，加入一抗於4y。脫脂奶粉中室溫反應lh或4t:反應過夜；5.洗滌液洗滌3次，每次10min;6.加HRP酶標二抗於lxPBST中室溫反應lh。7.洗滌液洗滌3次，每次10min;8.將PVDF膜置於10mlHRP反應底物DAB溶液中顯色，待陽性條帶顯示後用ddH20中止反應，PVDF膜自然乾燥後保存或拍照留作數據。結果顯示AccMRJP-5多克隆抗體能與西方蜂王漿蛋白樣品中多種主要王漿蛋白產生免疫反應，如顯示出明顯的AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3、AmMRJP5印跡，與在真核系統中表達的AccMRJP5和AccMRJP3a蛋白特異性結合(圖4)。在NCBI中對AccMRJP7蛋白序列進行BLAST搜索後發現，AccMRJP7與西方蜜蜂四種主要王漿蛋白AmMRJPl、AmMRJP2、AmMRJP3和AmMRJP5的胺基酸序列同源性分別為67%、72%、66%和78%，與已報導的AccMRJP5蛋白序列的同源性為73%。本發明利用GST-AccMRJP7多克隆抗體成功檢測了多個西方蜜蜂MRJPs成員，以及中華蜜蜂AccMRJP5和AccMRJP3a的真核表達產物，也進一步證明了蜂王漿主要蛋白各成員之間具有較高的同源性。提供了用一種MRJP成員抗體檢測MRJP家族多種蛋白的新方法。實施例6:中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7在真核細胞(Tn細胞株，即粉紋野蛾細胞株)中的表達在該實施例中，以AccMRJP7的PCR擴增產物作為插入片段。PCR反應中使用的5'寡核苷酸引物序列為5'陽CTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3'(SEQIDNo.3)，該引物含有屈ol限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是起始密碼子開始的中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7編碼序列的24個核苷酸；3'端引物序列為5，-AAGCTTCTAATTAATTAAAGAGTTTATTG-3'(SEQIDNo.4),該引物含有w/""m限制性內切酶的酶切位點，翻譯終止子和中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的部分編碼序列。引物上限制性內切酶酶切位點對應於Tn細胞表達載體pBacFastHTb上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gm1)，一個噬菌體複製起點(Ori)、一個病毒複製起點(SV40)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)，一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。用^70//和歷^/III消化pBacFastHTa載體及插入片段，隨後用連結混合物轉化ETGI菌株，在含有Ampr和Gmf的LB培養皿上篩選轉化子，補加Ampr和Gmr的LB液體培養基中培養(O/N)含所需構建物的克隆，抽提質粒，測序驗證大中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7的cDNA片段已正確插入了載體。隨後用重組質粒轉化Eco//DH10Bac菌株，在含有Amp\Gmf、四環素的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Ampr、Gmr、四環素的LB液體培養基中培養(0/N)含所需構建物的克隆，抽提質粒，經Sepharose2B柱純化，回收質粒-70'C保存。2B柱純化，回收質粒-7(TC保存。質粒轉染Tn細胞是採用脂轉染法，用Lipofectin(GiBcoLife)進行的。轉染48小時後，收集細胞及細胞上清，含重組病毒粒子的細胞上清用於下一輪感染。經2-3周的TC-100連續傳代培養，收集細胞，用超聲裂解法破碎細胞，以含NaCl0.5mM、imidazola5mM、PMSF1mM的20mMTris-CI(PH8.0)溶液為平衡液及洗脫液，蛋白液用經預平衡的Ni2+Sepharose6B柱過柱；再用含imdazola50mM、NaC10.5mM、PMSFlmM的20mMTris-CI(PH8.0)的溶液，洗去雜蛋白，專一性的吸附的6XHis的融合蛋白，再用含imdazola500mM、NaCl0.5mM、PMSFlmM的20mMTris-CI(PH8.0)的溶液進行洗脫.然後以PBS(PH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。用10%的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定的6XHis的融合蛋白的分子量大小約為51KDa。用6XHis單克隆抗體和GST-AccMRJP7多抗進行Westernblot檢測，均顯示51KDa印跡。中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白基因序列表SEQUENCELISTING<110〉浙江大學<120〉中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白<160〉6〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉28〈212〉腿<213〉ApisceranacerariamainRoyaljellyprotein7〈400〉1gatccatggccattgttcgaaaaaattc28〈210〉2<211〉28〈212〉DNA〈213〉Apisceranaceranamainroyaljellyprotein72tcgagctaattaattaaagagtttattg28<210〉3〈211〉30〈212〉DNA<213〉Apisceranaceranamainroyaljellyprotein73ctcgagatgaagaactattcaaaaaatgca30〈210>4<211〉29〈212〉■<213〉Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7Apisceranaceranamainroyaljellyprotein7〈400〉5atgacaaagtggttgtttatggtggtatgccttggcatagcttgtcaaggcgccattgtt60cgaaaaaattctgcacgaaacttggaaaattcgttgaacgtacttcacgaatggaaatat120atcgattatgatttcggtagcgaagaaagaagacaagctgcgattcaatctggcgaatac1.80gatcatacgaaaaattatcccttcgatgtcgatcaatggcgtgataagacttttgtcacc240gtattaagatacgatggtgtgccttcttctttgaacgtgatatctgataaaactggcaac300ggtggacgacttctacaaccgtatcctgattggttgtggacgaaatataaagattgctct360ggaatcgtgaacgcttacaatattgcggtcgataaatacgELcagattgtgggttttggat420tcaggtcttatcaacccatgtgttccccaaaattgcttgtctttgatcta480aattgctcaagcaagtggatataccgcsLCgatattgccgtaaataccacc540acagaaaacggaagattagcatctttagttgtccaagctatgaatcctatgaatactctg600gtgtatttgtcagacaacagaggtgacgctttaatcgtctaccaaaattccgacgattcc660ttccatcgattgacttccaacactttcgattacgatcccaaatataccaaaatgacgatt720gtttcacaaca_C3￡L3￡Ltggaatttctggaatggctcttagtcccctgaca780aacaatctttattacagtcctctcgcttctcgcgatttgt840ttcatgaaatcagaatatggagaaaataatgtccaatataaaatattttc■caaccgctaaagcggtatcg3a^6Ltggcgttcttttcttcggtctcgtg960ctgttggttgttggaacgag1020atggtcgctcaaaatg犯g3atgatcgttgt犯gg^tt6L1080cttccacatatcgtcattattatgttagta1140g3atgc犯a^aatattaaacaBtgELtCtt3tattaacttc1200cga^ttttgattggaggtgtgaccgacttgctcgttgcgc1260ataacaatcaaaataacaatattaacaatctaacaat11a1320agaatcacaataaactctttaMtaattag1350〈210>6〈211〉449〈212〉PRT〈213〉Apis〈400〉6MetThrLys1GlyAlalieAsnValLeu35GluArgArg50AsnTyrPro65ValLeuArgLysThrGlyTrpThrLys115AlaValAsp130AsnAsnlie145AsnSerSerceranaceranamainroyaljellyprotein7TrpLeuPheMetValValCysLeuGlyVal20HisGinPheTyrAsn100TyrLysGinGinLeu5ArgGluAlaAspAsp85GlyLysTyrProLeu165LysTrpAlaVal70GlyGlyAspAspMet150LeuAsnLyslie55AspValArgCysArg135CyslysSerTyr40GinGinProLeuSer120LeuSerGinAla25lieSerTrpSerLeu105GlyTrpProValCys10ArgAspGlyArgSer90GinlieValLysAsp170AsnTyrGluAsp75LeuProValLeuLeu155lieLeuAspTyr60LysAsnTyrAsnAsp140LeuProlieAlaCysGin15GluAsnSerLeu30PheGlySerGlu45AspHisThrLysThrPheValThr80VallieSerAsp95ProAspTrpLeu110AlaTyrAsnlie125SerGlyLeulieValPheAspLeu160HisAsplieAla175ValAsnAlaMetAspAla210ThrSer225GluGlySerProLeuTyrAsnAsn290ThrAla305AsnAsnGluAsnValGlylieAsn370MetGin385ArglieAlaAsnAsnGinAsnThrAsn195LeuAsnGluLeuTyr275ValLysThrThrMet355AsnLysLeuSerAsn435Thr180ProlieThrSerThr260ValGinAlaAlaAsp340LyslielielieAsn420AsnThrMetValPhePhe245AsnAsnTyrValVal325MetlielieLeuGly405lieAspGluAsnTyrAsp230ThrAsnThrLysSer310GlyValLysAsnAsn390GlyGinAsnAsnThrGin215TyrThrLeuLysGly295LysCysAlaGluAsn375AsnValAsnAsnGlyLeu200AsnAspGinTyrPro280ValAsnTrpGinLeu360GluAspThrAsnLeu440Arg185ValSerProAsnTyr265PheGinGlyAsnAsn345LeuTyrLeuAspAsn425LeuTyrAspLysGly250SerMetAsnValGlu330GluProMetAsnLeu410AsnlieAlaSerLeuSerAspSer220TyrThr235lieSerProLeuLysSerliePhe300LeuPhe315HisGinGluThrHislieLeuVal380PheAsn395LeuGluGinAsnThrlieUuValValGin190AspAsnArgGly205PheHisArgLeuLysGlyAlaGlu285AsnPheThrLeuVal365LeuAspAsnAsnAsn445MetMetSer270TyrThrGlyLeuGin350lieSerlieThrAsn430SerThrlie240AlaLeu255ArgAspGlyGluGinSerLeuVaJ320GinArg335MetlielieAspAsnArgAsnPhe400ArgCys415lieAsnLeulie權利要求1.一種中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因，其特徵在於，它具有SEQIDNo.5所示的序列。2.—種權利要求1所述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白，其特徵在於，它具有SEQIDNo.6所示的胺基酸序列。3.—種權利要求2所述中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因的編碼蛋白在製備抗體方面的應用。全文摘要本發明公開了中華蜜蜂王漿主蛋白AccMRJP7基因及其編碼蛋白，該基因具有SEQIDNo.5所示的DNA序列；該基因的編碼蛋白具有SEQIDNo.6所示的胺基酸序列，該編碼蛋白能製備抗體；本發明為MRJP7的生物工程應用奠定了一定基礎，特別是提供了一種用一種MRJPs成員抗體檢測MRJP家族蛋白的新方法，在蜂王漿科研和生產領域具有廣泛用途。本發明為進一步研究MRJP相關的蛋白活性分子機理，開發與MRJPs相關的功能食品、診斷試劑及生物試劑打下了基礎。文檔編號C07K14/435GK101434954SQ20081016361公開日2009年5月20日申請日期2008年12月22日優先權日2008年12月22日發明者張傳溪,豔李,沈立榮,程家安,邢麗蘋申請人:浙江大學