間歇性低氧對心肌梗塞的治療作用的製作方法
2023-06-01 11:29:36 2
專利名稱：間歇性低氧對心肌梗塞的治療作用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫學領域，涉及間歇性低氧在心肌梗塞治療中的用途。
背景技術：
氧是人類及絕大多數生物賴以生存的必需條件，也是機體生理功能調節的重要因子。低氧是生命發育的基本環境，人類胚胎是在低氧環境中發育的，出生後仍有部分組織處於低氧環境。因此低氧研究涉及生命科學的基本問題，研究低氧與人體組織、器官和細胞的損傷及其保護具有重要的醫學價值。
眾所周知，心肌梗塞隨缺血程度的加重和梗塞面積的擴大，對人體造成的損害是呈進行性發展的。根據世界衛生組織的報導，在西方國家急性冠狀動脈阻塞是導致死亡的主要原因，到2020年它將成為全世界的主要死因。Yellow，Downey等指出，現有的治療手段對於缺血性心臟病的幹預相當有限(Yellon DM，Downey JM.Preconditioning the myocardiumfrom cellular physiology to clinicalcardiology.Physiol Rev.2003；831113-1151.)。因此迫切需要一種更為有效的幹預手段，尤其是新的方法，來限制心肌梗塞病變的進展程度。
在過去的幾十年中，科學家們發現長期生活在高原地區的人們其心肌梗塞的發生率和死亡率都很低，這引起了人們對低氧研究的興趣。這些流行學上的發現已經在實驗室中得到了證實。1973年Meerson等報導每天在模擬高原環境中預生活5小時，一周連續5天，可使大鼠因冠狀動脈阻塞引起的死亡率下降84％，心肌梗塞面積減少35％(Meerson FZ，Gomzakov OA，Shimkovich MV.Adaptation to high altitude hypoxia as a factor preventing development ofmyocardial ischemic necrosis.Am J Cardiol.1973；3130-34.)。在低壓氧艙中給予低氧預適應後，可使動物在急性心肌缺血後，心臟顫動的發作次數和死亡率下降2-3倍，並且使心梗後的瘢痕減少1/3，還可促進瘢痕附近血管的增生(Meerson FZ，Ustinova EE，Orlova EH.Prevention and elimination of heartarrhythmias by adaptation to intermittent high altitude hypoxia.Clin Cardiol.1987；10783-789.)。在實驗中研究慢性低氧常在高原低氧環境下進行，或是在實驗室模擬高原環境的低壓氧艙中進行。但是，這些文獻說明的是低氧預適應後，心肌梗塞的病症減輕，即低氧處理發生在心肌梗塞之前，是一種預防手段而非治療手段。
間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)不同於持續性低氧，它是在低氧環境中保持一段時間，然後恢復至常氧環境。近年來，許多研究表明，間歇性低氧具有與缺血預適應(ischemia preconditioning，IP)相類似的對心肌的保護作用。出生後的大鼠經間歇性低氧預適應5周後，能明顯改善缺氧再灌注(ischemia-reperfusion)損傷後的心功能。間歇性低氧提高心肌對缺血再灌注損傷的耐受性，也能顯著提高心肌的抗氧化能力和對氧的利用能力。雄性S.D大鼠在間歇性低氧環境中生活28天和42天後，與對照組相比具有明顯的抗心肌缺血和再灌性心律失常作用，此抗心律失常作用在間歇性低氧14天後逐漸發生，並可有效維持脫離低氧處理後的二周左右時間。間歇性低氧可促進大鼠心肌組織微血管生成，增加冠脈流量，也可通過調控Bcl-2/Bax的表達抑制缺血再灌後心肌細胞的凋亡。
目前在心肌缺血損傷的研究方面，都是將間歇性低氧作為一種預適應手段(IH preconditioning)，提高心肌對缺血缺氧的抵抗力，從而起到心肌保護作用。然而，臨床上迫切需要解決的卻是在心肌梗塞發生後如何減少梗死面積和缺血損傷區域。但是，間歇性低氧是否能有效的改善已經發生的急性或亞急性心肌梗塞，即是否具有緩解或治療作用尚未見報導。
發明內容
本發明的目的在於提供氧在治療心肌梗塞中的應用。
本發明的另一目的在於提供間歇性低氧在心肌梗塞治療中的用途。
在本發明的第一方面，提供一種氧氣艙設備的用途，用於製備治療心肌缺血、梗塞的設備，所述的氧氣艙設備包括一個封閉的艙體，所述艙體中包括氧氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氧氣供給裝置提供氧氣，使得氧氣艙內的氧氣滿足以下條件氧分壓Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)。
在本發明的第二方面，提供一種氧氣的用途，用於製造治療心肌缺血、梗塞的設備或製劑。
在本發明的一個優選例中，所述的氧氣在治療心肌缺血、梗塞的設備中以低氧-常氧相間隔的方式給予，所述低氧-常氧相間隔的時間為低氧6±2小時，常氧18±2小時，並且，所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧為氧分壓Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)。
在本發明的一個優選例中，所述低氧-常氧相間隔的時間為低氧6±1小時，常氧18±1小時，並且，所述的低氧為氧分壓Po2＝84±10mmHg(或11.2±1.4kPa)，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)。
在本發明的第三方面，提供一種治療哺乳動物心肌缺血、梗塞的方法，採用間歇性低氧處理來實施治療，包括步驟使所述哺乳動物在低氧-常氧相間隔的環境中進行治療，並且，每天將患有心肌梗塞的哺乳動物置於低氧環境中生活6±2小時，其餘18±2小時生活於常氧環境；所述的低氧為環境中的氧分壓Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；連續治療7-50天。
在本發明的一個優選例中，每天將患有心肌梗塞的哺乳動物置於低氧環境中生活6±1小時，其餘18±1小時生活於常氧環境；所述的低氧為環境中的氧分壓Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.5kPa；連續治療7-35天。
在另一優選例中，每天將患有心肌梗塞的哺乳動物置於所述低氧環境中生活6小時，其餘18小時生活於常氧環境；所述的低氧為環境中氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；連續治療10-35天。
在本發明的第四方面，提供一種提高患心肌梗塞的哺乳動物心肌組織中內新生毛細血管的方法，將所述哺乳動物置於低氧-常氧相間隔的環境中，每天在低氧環境中生活6±2小時，其餘18±2小時生活於常氧環境；所述的低氧為環境中的氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；連續治療7-50天。
在本發明的一個優選例中，每天在低氧環境中生活6±1小時，其餘18±1小時生活於常氧環境；所述的低氧為環境中的氧分壓Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.4kPa；連續治療7-35天。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
圖1.實驗安排方案及實驗動物分組圖。大鼠分成不同的實驗組，各自進行不同的結紮或手術處理。MI-Nor組行冠狀動脈左前降支結紮手術+正常給氧；MI-IH組行冠狀動脈左前降支結紮手術+間歇性低氧處理。另兩組各自進行假手術，分別作為MI-Nor組和MI-IH組的對照。S-Nor組假手術+正常給氧；S-IH組假手術+間歇性低氧處理。
圖2.間歇性低氧治療對大鼠心臟射血分數(EF)、左心室舒張末期內徑(LVDD)的影響。射血分數(EF，A)和左心室舒張末期內徑(LVDD，B)的超聲心動測量。假手術動物的EF或LVDD僅呈現微小的變化。在MI後，EF逐漸下降且LVDD逐漸上升，但是在MI 21天、35天(處理14天、28天)後，MI-IH組心臟收縮功能與常氧處理的大鼠(MI-Nor組)的心臟更好(p＜0.05)。
圖3.M型超聲心動圖顯示間歇性低氧治療後大鼠心功能的改變。代表性M-性影像。心肌梗塞的間歇性低氧(IH)處理與提高的左心室功能相關。A在MI 21天(處理14天)後的M型影像，呈現顯著的心腔擴大和左室前壁運動減弱。B在MI後21天(處理後14天)MI-IH組的M型影像，心室擴張降低和心臟收縮功能改善。C和DMI後35天(處理28天)，左心室擴張且前壁運動異常在MI-Nor組中持續，但在MI-IH組中消失了。
圖4.間歇性低氧治療減少心肌梗塞面積。Evan’s藍和TTC染色。A.由Evan’s藍確定心肌梗塞面積，而非梗塞的(染成紅色)和梗塞的(未染色)區域在與1％氯化三苯基四氮唑孵育後確定。B.以冠狀動脈左前降支結紮手術後21天和35天(處理後14天和28天)的心肌梗塞面積的百分數表示的心肌梗塞面積。結果以每組4-5個心臟的平均值±標準誤差來表示。與MI-Nor組相比，*p＜0.05。
圖5.間歇性低氧治療促進心肌微血管的增生。免疫組織化學染色梗塞組織的外周的CD34。A.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)組在MI 21天後(14天IH或正常含氧量處理後)的免疫組化染色。B.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)組在MI35天後(28天IH或含氧量處理後)的免疫組化染色。可觀察到毛細血管的內皮細胞變薄且缺少平滑肌細胞，刻度標記為50μm。C.每mm2梗塞區域中IH處理對於毛細血管的平均數的影響，與MI-Nor相比，毛細血管的平均數明顯增加(*p＜0.05，**p＜0.01，MI-IH)。
圖6.間歇性低氧治療促進心肌組織VEGF蛋白的表達。A.假手術、冠狀動脈左前降支結紮手術21和35天後，用大鼠心肌內免疫印跡來指示間歇性低氧處理對於VEGF表達的影響；VEGF蛋白以25kDa表達。在6個獨立的實驗中獲得相似的結果(每個實驗重複3次)。B.免疫印跡的平均光密度結果。VEGF蛋白含量以Sham-Nor組的平均值百分比表示。與相應的常氧組相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，發現間歇性低氧作為一種幹預治療手段，對心肌梗塞具有緩解和治療作用。所述間歇性低氧通過低氧系統(更特別的為低氧艙)來實施。基於此，完成了本發明。
在本發明中，術語「間歇性低氧」是一種治療幹預手段，指間隔給予動物低氧-常氧-低氧循環的環境。
在本發明中，術語「低氧」是指氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa；更特別的，氧分壓Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa；最佳的，氧分壓Po2＝84±5mmHg或11.2±0.5kPa。
在本發明中，術語「常氧」是指氧分壓Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)；更特別的，氧分壓Po2＝159±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)；更佳的，氧分壓Po2＝159±5mmHg(或20.7kPa±0.5kPa)。
在本發明中，「低氧系統」是指一種可製造低氧環境的設備，其也可稱為「低氧設備」、「低氧艙」、「低壓氧艙」等。
本發明人的研究結果顯示，在大鼠心肌梗塞後，給予間歇性低氧治療，即每天在相當於5000米海拔高度(即Po2＝159±20mmHg或20.7kPa±3kPa)的低壓氧艙中生活4-8小時，然後恢復常氧環境，連續治療10-30天後，間歇性低氧能明顯促進心梗後大鼠心功能的恢復，減少心梗面積，增加冠脈流量，促進微血管的增生，對大鼠心肌梗塞有明顯的改善作用。由此，提示間歇性低氧對於人的心肌梗塞的緩解和治療也可產生明顯作用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1低氧系統一種用於製備治療心肌缺血、梗塞的氧氣艙設備，所述的氧氣艙設備包括一個封閉的艙體，所述艙體中包括氧氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氧氣供給裝置提供氧氣，所述的氧氣排出裝置可排出氧氣。
該氧氣艙可使得其內的氧氣滿足以下條件氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa。
在使用時，調節氧氣供給裝置，使氧氣艙內的氧分壓穩定在Po2＝84±1mmHg或11.2±0.14kPa，將哺乳動物置於其內，維持有效長時間(如6小時)後，關閉氧氣供給裝置，使氧氣維持在常氧範圍(Po2＝159mmHg±20mmHg(或20.7kPa±3kPa))小時。重複上述步驟10-30天，即可達到治療或緩解心肌梗塞的效果。
實施例2動物分組和動物模型的建立I.動物分組雄性Sprague-Dawley大鼠(體重150-180克)均為清潔級動物，購自中國科學院上海實驗動物中心。如圖1所示，按實驗設計要求，大鼠被隨機分組。
分組後，對其中一部分大鼠行冠狀動脈左前降支結紮手術(LADocclusion)，造成大鼠急性心肌梗塞。另一部分大鼠則作為假手術組(Shamsurgery)，不對其冠狀動脈進行結紮。術後在常溫條件下密切觀察7天。然後大鼠被隨機分組至常氧環境繼續生活，或至低壓氧艙中治療。本發明人將心梗後的大鼠置於低壓氧艙中治療14天和28天，即大鼠心梗7天後，每天在相當於5000米海拔高度的低壓氧艙中生活6小時，然後恢復至常氧環境，連續治療14天和28天(MI-IH組)。常氧組大鼠在心梗7天後，也在常氧條件下連續生活14天和28天作為對照觀察(MI-Nor組)。MI-IH和MI-Nor組分別設假手術組Sham-IH，Sham-Nor。所有的大鼠分別在術前、術後7天、術後21天(治療14天)和術後35天(治療28天)測量體重及動脈血壓。
II.建立大鼠心肌梗塞模型1.實驗器械與試劑包括動物人工呼吸機(DW2000 volume-cycled rodent ventilator，Jiapen Technology，Co，Shanghai)、心電圖儀、頸內動脈穿刺針、常規手術器械、1％戊巴比妥鈉、70％酒精、醫用縫合線、6/0的醫用無損傷縫合針、醫用透氣膠布。
2.實驗步驟對大鼠心臟的冠狀動脈左前降支進行結紮，使大鼠左心室前壁缺血造成心肌梗塞。給予大鼠腹腔內注射1％戊巴比妥鈉(50mg/kg)後，將大鼠置於手術板上。頸部和左胸脫毛後，用70％酒精消毒。沿頸部正中切開然後逐層分離，暴露氣管。將頸內動脈穿刺針沿大鼠甲狀軟骨下氣管第2-3軟骨環縫隙內插入，隨後立即接上動物呼吸機，維持通氣量45-50次/分。在左胸第3-4肋骨處，打開胸腔，剪去心外膜，暴露心臟。冠狀動脈左前降支一般沿左心房與肺動脈圓錐之間的動脈溝出發，基本與室間隔平行前行。由左前降支出發點向後向下約1-2mm處用6-0醫用無損傷縫合針結紮，注意結紮時避免穿破心臟。結紮成功後肉眼直接可觀察到左心室前壁顏色改變，心臟收縮減弱。冠狀動脈結紮後逐層縫合，關閉胸腔。術後撤去呼吸機，幾秒鐘後待大鼠恢復自主呼吸，直接接上心電圖儀記錄大鼠術後的心電。心電圖監護可見肢導R波振幅升高，I，aVL導聯ST段明顯抬高，證明結紮成功。
實施例3間歇性低氧對大鼠生理參數的影響測量血液參數指標在心梗手術後21天，35天(也即術後常氧或間歇性低氧治療14天，28天)，將大鼠麻醉後，從腹股溝動脈處採血1ml，分別測得外周血血紅蛋白濃度、紅細胞記數和白細胞記數。
結果，各組大鼠體重、動脈血壓、血紅蛋白及紅細胞計數值見表1。在術後第7天，四組大鼠動脈血壓基本一致。心梗手術後經間歇性低氧治療14天，28天後分別發現MI-IH組大鼠的血壓值較常氧組(MI-Nor)升高(14天後，間歇性低氧組比常氧組＝142.8±1.4比125.1±1.8，p＜0.01；28天後，間歇性低氧組比常氧組＝153.1±1.5比132.8±1.7，p＜0.01)，但這些大鼠的血壓值均在生理範圍內。由此可見，大鼠心肌梗塞後經間歇性低氧治療14天和28天，動脈血壓值有一定程度的升高，但並未導致高血壓。
大鼠心肌梗塞後經間歇性低氧治療14天、28天，其血紅蛋白值和紅細胞計數與常氧組(MI-Nor)相比，均無明顯差異(p＞0.05)。心梗後IH治療對血紅蛋白和紅細胞計數無明顯影響。
表1 各組大鼠體重、動脈血壓、血紅蛋白及紅細胞計數值
與相應的假手術值相比，*p＜0.05；與相應的正常含氧值相比，**p＜0.01；p＜0.05，p＜0.01。
實施例4間歇性低氧對大鼠心功能具有保護作用1.離體心臟Langendorff灌流1)灌流液Krebs-Henseleit buffe(mM)118 NaCl，4.7 KCl，1.2 KH2PO4，1.2 MgSO4，1.8 CaCl·2H2O，25 NaHCO3，11 Glucose。超純水配置，pH7.4，以95％O2，5％CO2混合氣體充灌30分鐘。
2)恆壓Langendorff灌流裝置此系統主要由管道系統、恆溫系統、氧合器和恆流泵組成。氧合器用於灌流液的供氧；恆流泵用於控制灌流系統的灌注壓，本實驗灌注壓恆定於80mmHg；恆溫系統則使灌流液保持恆定溫度，本實驗所用灌流液溫度為37℃。
3)實驗操作雄性S.D大鼠，1％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔內注射麻醉。仰位固定，打開胸腔，迅速取出心臟置於冰冷的K-H液中(4℃)；剪開心包，分離主動脈，將充滿灌流液的套管插入主動脈，結紮固定；注入灌流液排出心臟內剩餘血液，將主動脈套管快速連於Langendorff灌流裝置。在左心房側壁剪一小口，將小乳膠水囊通過房室瓣插入左心室。和乳膠水囊相連的導管通過三通管連接壓力轉換器。壓力轉換器(model Gould P23 Db，AC Instrument Ltd.Australia)信號通過橋式放大器輸入多導記錄系統(PowerLab system，Australia)，通過計算機運行chart軟體完成信號的實時採集和處理。流量檢測裝置直接連於多導記錄系統，記錄冠脈流量(CF)。記錄的心功能參數包括心率(HR)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室峰壓(LVPSP)、左心室發展壓(LVDP＝LVPSP-LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±LVdp/dt max)。離體心臟經20分鐘平衡灌流後，取下心臟，液氮速凍，用於分子生物學檢測；或10％中性福馬林固定，用於病理學檢測；或進行Evan’s染色，測量心肌梗塞面積。
結果如表2所示，經常氧或間歇性低氧處理14天，28天後，各組大鼠心率值基本一致。離體心臟Langendorff灌流顯示MI-Nor組與MI-IH組之間心臟收縮功能有顯著差異，主要表現在LVDP，±LVdp/dt數值上。在假手術組大鼠(sham groups)，除冠脈流量之外，其各項心功能參數在常氧組與間歇性低氧組之間均無明顯變化(S-Nor比S-IH，p＞0.05)。心肌梗塞大鼠在間歇性低氧治療14天和28天後，與常氧組相比，LVDP，±LVdp/dt max各項指標均有明顯改善。心肌梗塞後經間歇性低氧治療一段時間，可促進大鼠心功能的恢復。
在假手術組大鼠，經IH處理14天和28天後，與常氧組比較，冠脈流量明顯增加(14天，間歇性低氧組比常氧組＝21.2±0.8比15.1±1.5，p＜0.01；28天，間歇性低氧組比常氧組＝18.9±2.4比13.2±0.8，p＜0.01)，CF值分別增加了40.9％和43.9％。同樣，心梗後的大鼠經IH治療14天，28天後，與常氧組相比，CF也顯著增加(14天，間歇性低氧組比常氧組＝15.9±0.6比12.5±0.6，p＜0.05；28天，間歇性低氧組比常氧組＝16.6±0.6比12.7±0.8，p＜0.05)，CF值分別增加了26.8％和30.8％。這說明間歇性低氧的參與能明顯增加冠脈流量，改善心肌缺血狀態。
表2.IH治療對大鼠離體心功能指標的影響
與相應的假手術值相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與相應的常氧組相比，p＜0.05，p＜0.01。
2.超聲心動圖評價所有試驗動物在心梗前，心梗後第7天，第21天及第35天均進行了經胸超聲心動圖檢查。以往的報導已經證實了大鼠經胸超聲心動圖的精確性和可重複性。超聲心動圖使用商業購買的15-MHz線陣探頭(Philips Sonos 5500成像系統，S12)進行，檢查期間所有大鼠均用戊巴比妥鈉麻醉，平臥位於左側胸骨旁切面記錄圖像。採用二維超聲引導下M型超聲心動圖，在心室腔最大的短軸切面上測量室間隔厚度(IVS)，左室後壁厚度(LVPW)，左室舒張末期內徑(LVDD)，左室收縮末期內徑(LVDS)。儀器將自動計算出左室射血分數(EF)，以及短軸縮短率(FS)。所有的測量均由一位有經驗的且不知道分組情況的技術員進行，所有測值均為3個連續心動周期的平均值。心梗後第七天EF≥90％的大鼠視為心梗不顯著而被剔除。
術前，心梗後第7天，第21天(即治療後第14天)，以及術後第35天(即治療後第28天)的超聲心動圖測值列於表3。各組在術前超聲心動圖指標無顯著差異。冠脈結紮後第7天，IH治療的MI組(MI-IH)以及常氧(normoxia)治療的MI組(MI-Nor)的所有心超指標較術前均有顯著變化，室間隔厚度(IVS)變薄，分別下降18.2％和19.4％；左心室舒張末期內徑(LVDD)擴張27.8-36.7％，射血分數(EF)和短軸縮短率(FS)分別下降27.9-29％和45.8-46.9％。心梗後第7天，MI-IH組與MI-Nor兩組之間各指標無統計學差異，但與假手術組相比，兩個心梗組的指標均有顯著變化。這提示心梗模型的成功建立，而且MI-IH組與MI-Nor組的基礎水平具有可比性。
如圖2A所示，在整個實驗過程中，sham組大鼠射血分數(EF％)在各個時間點，其數值基本保持穩定。MI-Nor組大鼠在心梗手術後7天，EF值明顯下降(92.6％比66.7％)，而且隨時間的延長，其EF值始終維持在較低水平。MI-IH組大鼠在心梗術後7天EF值下降至65.5％，但經間歇性低氧治療14天後，其EF值與MI-Nor組相比顯著上升(MI-IH比MI-Nor＝71.5±2.7％比58.2±3.5％，p＜0.05)。在IH治療28天後，MI-IH與MI-Nor二組之間EF值的差異仍然十分顯著(MI-IH比MI-Nor＝72.5±3.6％比60.6±3.5％，p＜0.05)。
如圖2B所示，在整個實驗過程中，sham組大鼠左室舒張末期內徑(LVDD)在各個時間點無明顯變化。冠脈結紮術後7天，MI-Nor與MI-IH二組大鼠LVDD明顯擴大(MI-Nor組由0.5020.008至0.6420.021，p＜0.05；MI-IH組由0.4630.029至0.6330.016，p＜0.05)。心梗後第21天(即治療後14天)，MI-Nor組大鼠LVDD繼續顯著擴大，而MI-IH組大鼠經間歇性低氧治療，其LVDD增加程度明顯低於MI-Nor組(0.8220.03比0.7080.03，p＜0.05)。該現象在心梗後第35天(即治療後28天)仍然明顯(0.8740.05比0.7550.03，p＜0.05)。
M型超聲心動圖顯示(圖3)，與MI-Nor組左室前壁收縮減弱或收縮消失形成對比，梗死的心臟在接受間歇性低氧治療14天後(MI-IH)左室前壁運動改善，IH阻止LVDD的進一步擴大，心室功能良好。2周後，MI-Nor組仍持續存在左室擴張和前壁運動異常，而MI-IH組在IH治療28天後上述現象消失，心臟收縮功能明顯改善。
實施例5間歇性低氧減少心肌梗塞面積1)試劑Evan’s藍染料(Sigma)氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)0.05M PBS緩衝液0.2M磷酸緩衝液(pH7.4)2)步驟離體心臟灌流後，從Langendorff灌流裝置上取下心臟，由主動脈內注入1ml 0.5-1％的Evan’s染料，將正常心肌與缺血區心肌(area at risk)區分開。然後用生理鹽水衝洗乾淨，將心臟放於液氮中快速冷凍20min。由液氮中取出心臟，順房室溝從心尖部至心基部平行將大鼠心室切成0.1-0.2cm厚的心肌片，將心肌片放在1％TTC溶液中37℃溫孵10-15min。染色過程中不時搖動染色液使之與心肌充分接觸。染色後立即用水衝洗去多餘的染料。心肌梗死區不著色，呈灰白色；缺血但仍存活的心肌被TTC染成紅色。染色結束後將心肌切片置於10％中性福馬林溶液中固定，以增強染色強度。將染色後的心肌切片平鋪於二塊載玻片之間，照相，掃描，用電腦軟體圖像分析法(image-proplus 5.0)確定心肌梗死的面積。心肌梗死範圍以每一心臟總梗死面積(IF)佔總缺血區面積(area at risk，AR)的百分比表示。
離體心臟灌流後，取下心臟，用Evan′s藍和1％TTC染色後，計算心肌梗塞面積。結果顯示(圖4)，心梗後21天(即治療後14天)MI-IH組心梗面積為21.7±3.1％，與MI-Nor組35.9±4.3％相比，明顯減少(p＜0.05)。在心梗後35天(即治療後28天)，MI-Nor組心梗面積達到55.0±6.4％，而MI-IH組經間歇性低氧治療，心梗面積縮小至32.6±4.2％，二者存在顯著差異(p＜0.05)。所以，大鼠心肌梗塞後經間歇性低氧治療14天、28天，可有效減少心梗面積，提高心肌的存活能力，對心臟起到保護作用。
實施例6間歇性低氧促進心肌微血管形成(1)試劑二甲苯 無水酒精 95％酒精 3％H2O2(甲醇)0.01M PBS緩衝液pH 7.2-7.60.1M枸櫞酸鹽緩衝液(pH 6.0)DAB顯色劑小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體，使用濃度1∶100(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)羊抗鼠二抗(即用型，長島公司EnVisionTM試劑)(2)免疫組織化學染色離體心臟灌流後，取下心臟，用生理鹽水衝洗乾淨，10％中性福馬林固定心臟標本。順房室溝由心尖部至冠狀動脈左前降支結紮處平行切取三塊心臟組織，厚約2mm。常規石蠟包埋後，採用免疫組織化學EnVision二步法進行染色。玻片經APES(Sigma公司)、丙酮預處理，4～5um厚石蠟切片，60℃烘烤2h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇入水。3％H2O2(甲醇)溶液孵育20min，滅活內源性過氧化物酶活性，蒸餾水漂洗。切片置於pH 6.0的枸櫞酸鹽緩衝液內，微波抗原修復98℃15min，室溫冷卻20min後PBS漂洗3次；然後滴加一抗，4℃溼盒孵育過夜。PBS漂洗3次，EnVisionTM二抗室溫孵育30min，PBS漂洗3次，DAB顯色，蘇木精襯染，常規梯度乙醇脫水，樹脂封片。以PBS緩衝液代替一抗作為陰性對照。
(3)CD34免疫組化染色可以顯示血管內皮細胞心肌細胞之間微血管呈單個內皮或成簇內皮細胞陽性。每個標本選三張切片，每一張切片選取5個血管密度最多的區域，然後在400倍視野下分別記數毛細血管數目，取其平均值。
計算毛細血管密度(/mm2)＝平均毛細血管數/400倍視野(0.2mm2)，觀察心肌內毛細血管數量的變化。
結果本實施例應用免疫組織化學染色方法，用CD34抗體標記血管內皮細胞，來反映心肌組織中血管增生的情況。心肌梗死後在梗塞區周圍的心內膜下可見較多新生毛細血管，每張切片選取五個不重疊的區域，在高倍視野下(×400倍)計數毛細血管密度(/mm2)。結果顯示，心梗後21天(即治療後14天)，MI-IH組經間歇性低氧治療，與常氧組MI-Nor相比，毛細血管密度顯著增加(624±40.7比397.1±42.5/mm2，p＜0.05)。從圖5可見，MI-IH組在心梗周圍毛細血管增生活躍，排列密集。心梗後35天(即治療後28天)，MI-IH組毛細血管密度進一步增加，與MI-Nor組之間繼續存在顯著差異(MI-IH比MI-Nor＝919.3±98.4比516.4±50.7，p＜0.05)。
由此可見，間歇性低氧治療可促進心肌梗塞後心肌微血管的增生，改善心肌的缺血程度。
實施例7.
間歇性低氧促進VEGF蛋白的表達(1)試劑和溶液二硫蘇糖醇(DTT)、Tween-20、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)一級抗體小鼠抗大鼠VEGF購自Santa Cruz公司(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)二級抗體HRP酶標羊抗鼠IgG、蛋白電泳分子量標準品均購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；Triton X-100、苯甲基磺醯氟(PMSF)、TEMED購自MERCK公司(Merck KGaA，64271 Darmstadt，Germany)；丙烯醯胺(Acrylamide)、雙丙烯醯胺(Bisacrylamide)為Fluka公司產品(Buchs，Switzerland)；硝化纖維素膜購自Amersham公司(Buckinghamshire，UK)；化學螢光顯色劑-Western Blotting Chemiluminescence Reagent，購自PE公司(PerkinElmer Life Science.Inc)其它化學試劑包括Tris-Base、Glycine、EDTA、sodium vanadate、CoomassieBrilliant Blue G-250、Coomassie Brilliant Blue R-250、Bromophenol Blue等均為分析純級國產試劑。
勻漿緩衝液A(mM)Tris 50.0，pH 7.4，EDTA 1.0，DTT 0.5，PMSF 0.4，Na3VO4 1.0，Protease Inhibitor Cocktail 0.02％(V/V)，pH 7.4；Bradford蛋白測定液乙醇95％w/v，磷酸85％w/v和超純水以1∶2∶17的體積混合加入終濃度為0.1mg/ml的Coomassie Brilliant Blue G-250，以濾紙抽氣過濾；2倍樣本緩衝液(mM)Tris-HCl 125.0，SDS 4.0％(w/v)，Bromophenol Blue0.005％(w/v)，Sucrose 350.0，DTT 150.0，pH 6.8；丙烯醯胺貯備液30g丙烯醯胺和0.8g雙丙烯醯胺溶於超純水，終體積為100ml，以定性濾紙過濾，4℃避光存放；8倍分離膠緩衝液貯備液Tris-HCl(pH 8.8)3.0M，SDS 1.0％(w/v)，4℃存放備用；4倍濃縮膠緩衝液貯備液Tris-HCl(pH 6.8)0.5M，SDS 0.4％(w/v)，4℃存放備用；濃縮膠貯備液丙烯醯胺貯備液16.7％(v/v)，4倍濃縮膠緩衝液貯備液25％(v/v)，4℃避光存放；10％過硫酸銨(w/v)使用前新鮮配製，一周內使用；電泳槽電極液Tris-Base 25mM，Glycine 0.25M，SDS 0.1％(w/v)，pH8.3；
轉移槽電極液Tris-Base 25mM，Glycine 192mM，甲醇20％(v/v)，pH 8.3；TBST緩衝液(Tris-Buffer Saline containing Tween-20)Tris-Base 20mM，NaCl 137mM，Tween-20 0.1％(v/v)，pH 7.6；抗體封閉液含有2％BSA的TBST緩衝液。
(2)蛋白的提取分離和定量蛋白的提取分離(以下所有操作均在冰水浴或低溫下進行)心肌組織(約50～100mg)自液氮中取出，加入0.5ml預冷的勻漿緩衝液，在4℃以高速勻漿機將心肌組織徹底勻漿，勻漿後置於冰上30min。將勻漿液倒入1.5ml Eppendorff管，在4℃以10,000g/min的速度離心20min，將離心分層後的上清液分裝，置-70℃冰箱內保存。
Bradford法蛋白定量以高純度BSA作為標準蛋白(1mg/ml)繪製標準曲線，取10μl的樣本加入1ml的Bradford蛋白測定液，混合均勻；室溫靜置五分鐘後，以紫外可見光光度計(Lambda 2S UV/VIS型Perkin Elmer公司Germany)讀取595nm之OD值，通過標準曲線計算出樣本的蛋白濃度。
(3)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)變性蛋白質樣本的製備取50μg的蛋白樣本加入4倍蛋白樣本緩衝液，混合均勻，在沸水浴中煮沸10min後，立即放入0℃的冰水浴中冷卻並分裝，置-70℃冰箱冷藏。
SDS-PAGE凝膠(12％)的製備加入3.2ml的30％丙烯醯胺貯備液、1ml的8倍分離膠緩衝貯備液和3.8ml的超純水，混合均勻；再加入10％的過硫酸銨80μl和TEMED 8μl，迅速攪拌混勻，倒入裝置好的玻璃槽中約4/5高，上面輕輕地覆以超純水隔離膠體與空氣，並使表面平整；待膠體凝結後，倒掉純水，並以超純水衝洗乾淨，以定性濾紙吸乾表面水分，取配製好的濃縮膠(5％貯備液)3ml，加入10％的過硫酸銨30μl和TEMED 3μl，迅速均勻後，倒入玻璃槽內，插入樣品梳，待膠體凝結後取出樣品梳。
電泳在電泳槽內加入電泳槽電極液，趕出樣品槽內的氣泡。在樣品槽內分別加入蛋白電泳分子量標準品陽性對照和蛋白樣本，樣本上樣量均為50μg；接通電源，先以80V的恆壓電泳40min，再以120V的恆壓繼續電泳約2-3h，至溴酚蘭染料跑至凝膠底部結束電泳。
轉膜將取下的SDS-PAGE電泳膠體、硝化纖維素膜、定性濾紙以及纖維墊放在電泳槽轉移液內，以夾三明治方式(中間為膠體和硝化纖維素膜，外面分別夾以濾紙和纖維墊)夾牢，徹底清除內部的氣泡；然後放入裝滿電極液的轉移槽內；正確接通電極和電源，通以150mA的恆流約4h，將膠體上的蛋白質轉印到硝化纖維素膜上。
抗體標記將轉印有蛋白的硝化纖維素膜取出，標記方向和蛋白分子量標準印記；然後浸入抗體封閉液，搖床上室溫下孵育2h以封閉非特異性蛋白結合位點；將硝化纖維素膜浸於含有一抗(Primary antibodyanti-VEGF 1∶1000稀釋)的一抗孵育液中，4℃孵育過夜，以TBST於搖床上洗膜10min×3次。將硝化纖維素膜浸入含有辣根過氧化酶標記的二級抗體(Secondary antibody，Goatanti-mouse horseradish peroxidase 1∶5000)的二抗孵育液中，室溫下搖晃孵育2h，再以TBST洗膜15min×3次。
顯色成像利用辣根過氧化酶顯色劑的化學螢光方法，使X感光膠片成像來檢測相關蛋白的位置及其含量；用掃描儀將圖像輸入計算機再用蛋白條帶分析軟體Gel-Pro Analyzer 3.0，Media Cybernetics，USA來對相關蛋白進行定量。
數據處理所有數據均以均數±標準誤差(mean±S.E)表示。不同處理組之間比較通過單因素方差分析ANOVA或Student’st檢驗進行。P＜0.05時差異具有顯著性。
Western Blot免疫印跡法檢測心肌組織中VEGF蛋白的表達，結果顯示(圖6)，大鼠心肌梗塞後21天(即治療後14天)，間歇性低氧組(MI-IH)VEGF表達值為247±34.1，顯著高於常氧組(MI-Nor)134.6±19.7(p＜0.05)。在心梗後35天(即治療後28天)，這二組VEGF表達的差異依舊十分顯著(MI-IH 2 44.9±26.7比MI-Nor 123.5±5.3，p＜0.01)。這提示間歇性低氧治療可提高大鼠心肌梗塞後心肌組織中VEGF蛋白的表達，進而促進微血管的增生。
綜上，本發明證實了間歇性低氧對大鼠心肌梗塞具有明顯的治療作用。IH能促進梗塞後大鼠心功能的恢復，減少心肌梗塞面積。IH通過誘導VEGF表達增強，促進心肌組織內微血管增生，減少心肌細胞損傷，對大鼠心肌梗塞有顯著的改善作用。間歇性低氧作為一種新的幹預治療手段，為心肌梗塞的臨床治療提供了新的途徑。
討論本發明在大鼠心肌梗塞後，將間歇性低氧作為一種幹預治療手段，研究間歇性低氧治療對大鼠心肌梗塞是否具有保護作用。研究結果第一次表明，在相當於海拔高度5000米的低壓氧艙中給予間歇性低氧治療14天和28天，對於缺血和梗塞的心肌均具有明顯的改善作用。這一新的心肌保護作用具體表現在通過IH治療，可改善大鼠心梗後的心功能，有助於心功能的恢復；有效地減少心肌梗塞面積，提高心肌的存活能力；增加心肌組織內VEGF蛋白的表達，從而促進心肌內毛細血管的增生，增加冠狀動脈流量，改善心肌缺血程度。同時，經IH治療14天和28天後，與常氧對照組相比，大鼠外周血中血紅蛋白濃度和紅細胞計數沒有明顯增加，表明IH對心肌梗塞的治療並不影響這二者的水平，從而可減少因血細胞容積增多導致血栓形成的危險性。因此，本發明的研究結果表明，IH治療對大鼠慢性心肌缺血損傷具有一定的保護作用。
以往過多的研究集中在缺血預適應(ischemic preconditioning)對心肌的保護方面。心肌缺血預適應(IPC)是指心肌在經歷了一次或多次短暫的缺血/再灌注後，對隨後發生的長時間缺血損傷的耐受性明顯增強。此現象在1986年首次發現以來，已在不同種屬動物、不同臟器得到驗證，說明IPC是廣泛存在的機體保護性防禦反應。間歇性低氧適應能提高心肌對缺血/再灌注損傷的耐受性)；提高心肌的抗氧化能力和對氧的利用能力，減少再灌注性心律失常；減輕心肌細胞壞死和凋亡，促進心肌功能的恢復等。間歇性低氧能提高心肌抗缺血缺氧能力，對提高人體健康狀況和運動能力具有積極的意義。目前，許多實驗都是將間歇性低氧作為一種預適應手段(IH preconditioning)，而未見有關將間歇性低氧用於治療方面的研究報導。本發明第一次將間歇性低氧用於大鼠心肌梗塞後的治療。結果發現，IH同樣也具有明顯的治療作用，可改善心肌梗死後的心功能，促進心肌組織內血管的增生等。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種氧氣艙設備的用途，其特徵在於，用於製備治療心肌缺血、梗塞的設備，所述的氧氣艙設備包括一個封閉的艙體，所述的艙體中包括氧氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測裝置，其中，所述的氧氣供給裝置提供氧氣，使得氧氣艙內的氧氣滿足以下條件氧分壓Po2＝84±20mmHg。
2.一種氧氣的用途，其特徵在於，用於製造治療心肌缺血、梗塞的設備或製劑。
3.如權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述的氧氣在治療心肌缺血、梗塞的設備中以低氧-常氧相間隔的方式給予，並且，所述低氧-常氧相間隔的時間為低氧6±2小時，常氧18±2小時；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159±20mmHg。
4.如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述低氧-常氧相間隔的時間為低氧6±1小時，常氧18±1小時；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±10mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg。
5.一種治療哺乳動物心肌缺血、梗塞的方法，其特徵在於，採用間歇性低氧處理來實施治療，包括步驟使所述哺乳動物在低氧-常氧相間隔的環境中進行治療，並且，每天將患有心肌梗塞的哺乳動物置於低氧環境中生活6±2小時，其餘18±2小時置於常氧環境；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg；連續治療7-50天。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，每天將患有心肌梗塞的哺乳動物置於低氧環境中生活6±1小時，其餘18±1小時置於常氧環境；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±10mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg；連續治療7-35天。
7.一種提高患心肌梗塞的哺乳動物心肌組織中新生毛細血管生長的方法，其特徵在於，將所述哺乳動物置於低氧-常氧相間隔的環境中，並且，每天將患有心肌梗塞的哺乳動物置於低氧環境中生活6±2小時，其餘18±2小時置於常氧環境；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg；連續治療7-50天。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述低氧-常氧相間隔的時間為低氧6±1小時，常氧18±1小時；所述的低氧為環境中的氧分壓Po2＝84±10mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg；連續治療7-35天。
全文摘要
本發明公開了一種低氧系統的新用途，用於心肌缺血、梗塞的治療。本發明還公開了氧在製造心肌缺血、梗塞治療設備中的用途。本發明還公開了一種治療哺乳動物心肌缺血、梗塞的方法，採用間歇性低氧處理來實施治療。本發明證實了間歇性低氧對大鼠心肌缺血、梗塞具有明顯的治療作用，其作為一種新的幹預治療手段，為心肌缺血、梗塞的臨床治療提供了新的途徑。
文檔編號A61K9/10GK1989920SQ200510112359
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者楊黃恬, 周兆年, 許偉青, 朱儀 申請人:中國科學院上海生命科學研究院