一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體及其應用的製作方法
2023-06-02 01:55:01 3
專利名稱：一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種聚醚類抗生素免疫檢測的免疫抗體及其應用，屬於酶聯免疫分析技術領域。
背景技術：
聚醚類抗生素由於其特殊的物理化學特性及其作用機理，此類藥物在生產中應用比較廣泛。目前，已普遍應用於家禽、家兔等的抗球蟲，成為世界上使用最早銷量最大的抗球蟲藥物；除此以外，還作為飼料添加劑應用到養牛業和養豬業，提高牛和豬的生產性能，促進個體生長。但此類藥物的不合理使用將會導致畜禽體內組織及畜產品如肉、蛋、奶中的藥物殘留，對人類健康造成威脅，有研究表明莫能菌素能導致和加重心血管疾病或造成心血管功能紊亂。聚醚類抗生素對不同動物體的毒性作用不同，主要對動物的生長及繁殖性能產生明顯危害，對人類主要導致肌肉和心臟病變。隨著近年來人們對食品中抗生素殘留關注程度越來越高，聚醚類抗生素使用帶來的殘留問題日益引起人們的重視。
但就目前的形勢而言，我國畜禽產品的人均佔有量遠遠低於世界發達國家，全面禁止這類藥物的使用是不現實的，為了達到高產、高效的目標，獸藥在畜禽養殖中的作用在短期內是無法取代的。鑑於此，為保障人民的身體健康，有效控制生產中獸藥的合理使用和對其殘留量進行監控，開發一種快速、可靠、靈敏，適於獸藥殘留現場監控的痕量分析方法具有重要的現實意義。目前莫能菌素殘留分析方法主要是通過提取、淨化後，再配以柱後衍生和高效液相色譜或液質聯用，這種檢測方法費用昂貴、樣品前處理過程複雜、對儀器設備要求較高、而且需要消耗大量的有機溶劑，從而造成對環境的二次汙染。
免疫分析是一種快速、靈敏、操作簡單、費用低的一種檢測方法。聚醚類抗生素是一類具有通用結構的小分子化合物，需要通過與大分子蛋白類物質偶聯後用於免疫動物，刺激動物免疫系統來產生針對聚醚類抗生素通用結構的抗體。由於聚醚類抗生素本身不具備直接同蛋白類大分子物質偶聯的位點，因此，需要對其進行改造。
發明內容
本發明的目的在於針對聚醚類抗生素殘留免疫檢測中抗體對特定物質的特異性較強，建立一種適用於檢測一類聚醚類抗生素殘留的免疫分析方法，提供一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體及其應用。
本發明的目的是這樣實現的一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體，其特徵在於，以莫能菌素鈉鹽為半抗原，首先對半抗原進行改造，改造後的半抗原再與蛋白質偶聯製備成免疫原，並通過免疫紐西蘭大白兔製備成多克隆抗體或通過小鼠免疫、細胞融合、篩選及克隆化培養製備成單克隆抗體。
所述的對半抗原進行改造可以通過鹽酸浸泡法或陽離子交換法進行改造，獲得莫能菌素酸。
所述的對半抗原進行改造也可以通過丁二酸酐衍生化法進行改造，獲得莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物。
所述的與蛋白質偶聯製備成免疫原是採用水溶性碳二亞胺法實現的，具體步驟是先稱取濃度為0.25mmol的莫能菌素酸160mg±10mg溶於2mL50％(v/v)吡啶與水的混合物中；再稱取碳化二亞胺160mg±10mg溶於2mL水中，緩慢加入到莫能菌素酸溶液中，邊加邊攪拌2h，稱取濃度為0.005mmol的牛血清蛋白340mg±10mg或225mg±10mg的卵清蛋白溶於8mL水中，將此溶液緩慢滴加至上述混合液中，並保持pH為6.0±0.5左右，滴加結束後將混合液於室溫暗處放置24h；將反應完成的溶液置於透析袋內透析4天，透析液為PBS液，透析後真空冷凍乾燥保存，製備成免疫原，其中採用牛血清蛋白製備的免疫原為免疫原，採用卵清蛋白製備的免疫原為包被抗原。
所述的與蛋白質偶聯製備成免疫原是採用氯甲酸異丁酯法實現的，具體步驟是先稱取濃度為0.16mmol的莫能菌素酸104mg±10mg，溶於20mL無水二甲基甲醯胺中，冷卻至4℃，加入等摩爾三正丁胺66ul和氯甲酸異丁酯52ul，於4℃放置30min；稱取濃度為0.005mmol的牛血清蛋白272mg±10mg或180mg卵清蛋白溶於100mL無水二甲基甲醯胺與蒸餾水比例為1∶1的混合液中；混合液的pH＝8.5，將此溶液緩慢滴加至莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物中，磁力攪拌器攪拌4h，4℃過夜，透析5天，分裝真空乾燥冷凍保存，製備成免疫原；或者稱取濃度為0.25mmol的莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物192.5mg±10mg溶於2.5mL二氧六環中，10℃持續攪拌，加入等摩爾的三丁胺47ul和氯甲酸異丁酯35ul，10℃持續攪拌50min，形成混合酸酐液；稱取濃度為0.005mmol的牛血清蛋白340mg±10mg或225mg±10mg的卵清蛋白溶於22mL0.1M碳酸鹽緩衝液中，緩慢加入22mL二氧六環，保持在4℃，將混合酸酐液緩慢滴加入持續攪拌的蛋白質溶液中，反應5h，4℃透析4次，真空冷凍乾燥保存，製備成免疫原，其中採用牛血清蛋白製備的免疫原為人工免疫原，採用卵清蛋白製備的免疫原為包被抗原。
本發明涉及的一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體在檢測中的應用，其特徵在於，獲得的單克隆抗體或多克隆抗體用於對動物源性食品的樣品進行聚醚類抗生素殘留的檢測，樣品為固體質或液體質。
被測對象中的聚醚類抗生素殘留是指莫能菌素或拉沙洛菌素或奈及利亞菌素或馬杜拉酶素殘留。
本發明獲得的單克隆抗體或多克隆抗體可用於常規的間接競爭性ELISA檢測，或通過金、酶、螢光標記抗體後用於直接ELISA檢測。
本發明的優點在於以改造後的莫能菌素鈉鹽與蛋白質進行偶聯後免疫動物，所製備的抗體對聚醚類抗生素藥物有特異性，可用於動物源性食品如肉、蛋、奶中聚醚類抗生素殘留的篩選檢測，利用本發明涉及的免疫抗體對動物源性食品進行聚醚類抗生素免疫檢測，具有快速、簡便的特點。
圖1是莫能菌素鈉鹽的紅外光譜圖；圖2是採用鹽酸浸泡法改造的莫能菌素半抗原的紅外光譜圖；圖3是採用陽離子交換法改造的莫能菌素半抗原的紅外光譜圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
實施例一、半抗原改造採用鹽酸浸泡法對半抗原進行改造是這樣實現的稱取500mg的莫能菌素鈉鹽，溶於1mL雙蒸水中，加入5mL濃度為6摩爾的鹽酸(HCl)，浸泡45～50min，充分接觸後，用乙醚萃取，將萃取液於真空乾燥箱中除去乙醚，析出晶體。製備成莫能菌素酸。析出晶體採用薄層層析及紅外光譜鑑定，圖2是採用鹽酸浸泡法改造的莫能菌素半抗原的紅外光譜圖。
採用陽離子交換法對半抗原進行改造是這樣實現的稱取16.308g陽離子交換樹脂用蒸餾水攪拌洗滌3次後加入層析柱中，調節流速為1.5mL/min；加入200mL濃度為2摩爾的鹽酸處理層析柱，再加入80mL濃度為2mol的氫氧化鈉抽吸，最後加入雙蒸水200mL再抽吸；重複此操作一次；完成後加入濃度為4摩爾鹽酸浸泡1h(緩慢流出使其與交換樹脂充分接觸)；用雙蒸水衝洗直至流出液體為中性(PH＝7.0)，關閉旋塞待用；稱量4.5g莫能菌素鈉鹽溶於30mL二氯甲烷中；將此溶液過交換柱；在洗脫過程中可補加溶劑二氯甲烷；按每管3mL量接收洗脫液；分別取2ul洗脫液進行薄層層析檢測(展開劑為9∶1的二氯甲烷與甲醇)，混合Rf(斑點相對遷移率)相同的收集管並置於真空乾燥箱中40℃乾燥析出白色晶體物質，製備成莫能菌素酸。析出晶體採用薄層層析及紅外光譜鑑定，圖3是採用鹽酸浸泡法改造的莫能菌素半抗原的紅外光譜圖。
圖1是莫能菌素鈉鹽的紅外光譜圖，圖2是利用鹽酸浸泡法改造的莫能菌素半抗原的紅外光譜圖，圖3是利用陽離子交換法改造的莫能菌素半抗原的紅外光譜圖。與莫能菌素鈉鹽的紅外圖譜相比較，採用5mL的濃度為6摩爾的鹽酸(HCl)浸泡50min與陽離子交換法製備的晶體具相同的紅外光譜圖譜在波長1709.7cm-1與3531.3cm-1具有強的羰基及羧基吸收峰，在2882.6～2972.9cm-1及800～1500cm-1有明顯的雜環特徵吸收峰與原粉鈉鹽相符，但波長1564.8cm-1處未見鈉鹽強吸收峰，可說明鈉鹽已經被置換成為羧酸。
採用丁二酸酐衍生化法對半抗原進行改造是這樣實現的稱量500mg莫能菌素鈉鹽，將其溶於5mL吡啶中，邊攪拌邊加入721.5mg琥珀酸酐並置於25℃真空乾燥箱中反應2天，反應進程通過薄層層析進行監測；加入幾滴水終止反應；抽真空除去吡啶，析出透明或白色晶體；將析出物溶於20mL二氯甲烷中；用0.02當量的HCl洗滌上述溶液4次(5mL/次)，雙蒸水洗滌3次(3mL/次)；無水Na2SO4乾燥一天，過濾；濾液經真空乾燥箱中40℃乾燥析出晶體；通過薄層層析進行鑑定及檢測純度；以矽膠(200-300目)作吸附劑，二氯甲烷-甲醇作洗脫劑進行梯度洗脫分離提純(重複3次)，乾燥後析出晶體，晶體通過薄層層析鑑定通過該方法製備成莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物。
實施例二、氯甲酸異丁酯法製備人工免疫原或包被抗原1、人工免疫原或包被抗原可以這樣製備稱取192.5mg(0.25mmol)莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物溶於2.5mL二氧六環中，10℃持續攪拌；加入等摩爾的三丁胺47ul和氯甲酸異丁酯35ul，10℃持續攪拌50min，形成混合酸酐液；稱取340mg(0.005mmol)牛血清蛋白(BSA)溶於22mL0.1摩爾的碳酸鹽緩衝液中，緩慢加入22mL二氧六環，保持在4℃；將混合酸酐液緩慢滴加入持續攪拌的蛋白質溶液中，反應5h；4℃透析4次，分裝真空乾燥冷凍保存，製備成人工免疫原。
稱取225mg卵清蛋白(OVA)替換前面所述的牛血清蛋白(BSA)，將卵清蛋白(OVA)溶於22mL0.1摩爾的碳酸鹽緩衝液中，緩慢加入22mL二氧六環，保持在4℃；將混合酸酐液緩慢滴加入持續攪拌的蛋白質溶液中，反應5h；4℃透析4次，分裝真空乾燥冷凍保存，製備成包被抗原。
2、人工免疫原和包被抗原也可以這樣製備稱取104mg(0.16mmol)莫能菌素酸，溶於20mL無水二甲基甲醯胺(DMF)中，冷卻至4℃；加入等摩爾三正丁胺66ul和氯甲酸異丁酯52ul，於4℃放置30min；稱取272mg(0.005mmol)牛血清蛋白(BSA)溶於100mL無水二甲基甲醯胺(DMF)與蒸餾水配比為1∶1的混合液中，混合液的pH＝8.5；將此溶液緩慢滴加至莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物中，磁力攪拌器攪拌4h，4℃過夜，透析5天，分裝真空乾燥冷凍保存，製備成人工免疫原。
稱取180mg卵清蛋白(OVA)替換前面所述的牛血清蛋白(BSA)，將卵清蛋白(OVA)溶於100mL無水二甲基甲醯胺(DMF)與蒸餾水配比為1∶1的混合液中，混合液的pH＝8.5；將此溶液緩慢滴加至莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物中，磁力攪拌器攪拌4h，4℃過夜，透析5天，分裝真空乾燥冷凍保存，製備成包被抗原。
實施例三、水溶性碳二亞胺法製備免疫原和包被抗原人工免疫原和包被抗原還可以這樣製備稱量160mg(0.25mmol)莫能菌素酸溶於2mL50％(v/v)吡啶與水的混合物中；稱量碳化二亞胺(EDC)160mg溶於2mL水中，逐滴加入到莫能菌素酸中，邊加邊攪拌2h；稱取340mg(0.005mmol)牛血清蛋白(BSA)溶於8mL水中，將此溶液緩慢滴加至上述混合液中，並保持pH為6.0左右，滴加結束後將混合液於室溫暗處放置24h；將反應完成的溶液置於透析袋內透析4天，透析液為PBS液，透析後真空冷凍乾燥保存，製備成人工免疫原。
稱取225mg卵清蛋白(OVA)替換前面所述的牛血清蛋白(BSA)，將卵清蛋白(OVA)溶於8mL水中，再將此溶液緩慢滴加至上述混合液中，並保持pH為6.0左右，滴加結束後將混合液於室溫暗處放置24h；將反應完成的溶液置於透析袋內透析4天，透析液為PBS液，透析後真空冷凍乾燥保存，製備成包被抗原。
實施例四、多克隆抗體製備。
多克隆抗體的製備方法為以人工合成的免疫原，免疫紐西蘭大白兔，背部皮下及腿肌多點注射，當效價達最佳時，心臟採血，先用硫酸銨分步沉澱法初步純化後，再經Sephadex G-200進一步純化得高質量廣譜性抗體。
在本實施例中，根據實施例2或實施例3方法製備的Mon-HS-BSA和Mon-BSA兩種免疫原各免疫3隻紐西蘭大白兔，具體免疫方案如表1。
完成表1中免疫程序後，利用方陣滴定法將兩種抗血清分別用Mon-HS-OVA包被抗原進行檢測，確定最佳的抗原-抗體組合及其最佳工作濃度，結果見表2。並利用建立的抗原抗體最佳工作條件來分析不同種類的聚醚類抗生素對該抗原—抗體結合反應的抑制作用。以莫能菌素為對象，建立回歸方程，計算其I10和I50。選取包括莫能菌素、拉沙洛菌素、鹽黴素、甲基鹽黴素、馬杜拉黴素和奈及利亞菌素，將藥劑抑制率對藥劑濃度進行回歸分析，得出回歸方程，並計算各藥劑對抗體反應的I值，結果見表3。
表1製備聚醚類抗生素多克隆抗抗體動物免疫方案
由表2可以看出，用EDC法合成的免疫原免疫動物的效果與氯甲酸異丁酯法相比較差。由氯甲酸異丁酯法抗原得到的抗體中，以0799號兔子分泌抗體效價最高，為1∶12800，在本文後面的研究中以該抗體為研究對象。利用0799號兔子產生的抗體進行方陣滴定，所得結果為抗原、抗體最佳工作濃度均為1∶2000。
表2抗體效價測定結果
以莫能菌素為研究對象，建立的回歸方程為I＝0.6599+0.230lgC，r＝0.9702，I50＝0.2017ug/ml，I10＝0.003678ug/ml。多種聚醚類抗生素對抗體的I50經計算示於表3。
表3不同抗生素對抗體的抑制能力
從表3可以看出，抗體對抗原先導物莫能菌素有較強的親和力，I50為0.2017ug/ml。
實施例五、單克隆抗體製備單克隆抗體的製備方法為以人工合成的免疫原，免疫BALB/C小鼠，每隻小鼠取100ug免疫原，與等體積氟氏完全佐劑混合乳化均勻，背部皮下、腿肌和腹腔膜內多點注射。3周後，加強免疫，劑量不變，佐劑改為氟氏不完全佐劑。加強免疫三次後，採血測效價，待血清效價不再上升時，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天後取脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞按5～10∶1的比例混合於50ml離心管進行融合，融合後的細胞經培養後待孔內的雜交細胞數量達到300個以上時，取細胞培養上清液用於酶聯免疫檢測，每次檢測均為復孔檢測，在每次檢測後的第二天重複檢測，以確證結果。將強陽性孔內的細胞用有限稀釋法進行克隆培養，並跟蹤記錄，經過3次以上的克隆培養和檢測，均為陽性的孔內的細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。雜交瘤細胞株經過擴大培養後用來製備腹水。提前一周用0.5ml石蠟油注射小鼠腹腔，將106個雜交瘤細胞懸浮在1ml無血清培養基中，注入小鼠腹腔內。10天後，小鼠腹部明顯膨大，收集腹水。用正辛酸—硫酸銨沉澱法來純化單克隆抗體。
在本實施例中，取Balb/C小鼠4隻，每隻小鼠100ug免疫原，與等體積氟氏完全佐劑混合乳化均勻，背部皮下、腿肌和腹腔膜內多點注射。3個周后，加強免疫，劑量不變，佐劑改為氟氏不完全佐劑。加強免疫5次後，斷尾採血，6隻小鼠中有3隻血清中抗體滴度達到1∶6400，有2隻達到1∶25600，有1隻達到1∶51200並不再上升，此時選取效價最高的3號小鼠取脾細胞做融合。
在無菌操作條件下，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞按5～10∶1的比例混合於50ml離心管，加入30ml無血清IPMI1640培養基，1200r/min離心10min棄上清，將細胞團輕輕振松，置於37℃水浴中。把1ml50％PEG-4000緩緩加入細胞中，在1min內滴完，同時輕輕攪動底部沉澱，靜置1min。沿管壁緩慢加入無血清培養液終止融合過程。前30秒緩慢勻速加入1ml，後30秒加入2ml，然後快速加入27ml無血清培養液，1200r/min離心10min，棄上清。用30ml HAT培養基懸浮細胞，將懸浮液移入預先培養有飼養細胞的96孔細胞培養板內，放置在5％CO2、37℃細胞培養箱內培養。並同時把末加融合劑的骨髓瘤細胞和脾細胞混合培養以作為陰性對照。融合3天後，背景開始變得清晰，非融合細胞破碎死亡，融合的細胞形成小的細胞群落。融合7天後，細胞克隆高度純化。用ELISA方法初步檢測結果顯示陽性反應的孔佔83％，吸光值大於1的強陽性孔佔5.8％。將強陽性孔內的細胞經過4次克隆，得到1株穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞為3M3。將雜交瘤細胞經過擴大培養，一部分細胞凍存於液氮罐中，一部分細胞用來製備腹水。
選取6隻經產Balb/C小鼠，提前一周用0.5ml石蠟油注射到小鼠腹腔，將大約106個雜交瘤細胞懸浮在1ml無血清IPMI1640培養基中，注入小鼠腹腔內。10天後，待小鼠腹部明顯膨大時收集腹水。用正辛酸—硫酸銨沉澱法來純化腹水。用核酸蛋白紫外掃描儀測定IgG的A278nm/A251nm值，並測定A278nm的值，根據所得數據初步判斷是否為IgG球蛋白。
腹水抗體經純化後，在紫外蛋白分析儀上測得抗體的A278nm/A251nm的值約為2.6。根據哺乳動物IgG的A278nm/A251nm約為2.5-3.0，而其它蛋白質的這個比值為1-1.5的特點，可以初步判定純化後得到的蛋白為IgG蛋白。
根據方陣滴定的原則，在抗原稀釋2000倍，濃度為25ug/ml，抗體稀釋約4000倍時，吸光值為1，可以確定抗體最佳工作濃度為4000倍。
在本實施例中使用的無血清IPMI1640培養基由北京夏斯生物技術有限公司經銷。
實施例六、固相間接競爭性ELISA檢測步驟1、包被在96微孔板內每孔加入100ul包被液(包被抗原用碳酸鹽緩衝液溶解)，4℃過夜或37℃溫育2小時；2、封閉取出96微孔板，棄去包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的磷酸鹽緩衝液，下同)洗滌三次，甩幹，並在每孔中加入200ul封閉液(1％OVA)，37℃溫育1小時；3、加樣取出酶標板，用PBST洗滌三次，甩幹，將樣品去除懸浮雜質後，與等體積抗體混合液混合，按表4所示注入96微孔板內，每孔100ul，同時，酶標板61-66孔加入50ul的抗體和50ul的PBS，H行各孔加入100ul的PBS，37℃溫育2小時；4、加酶標SPA(葡萄球菌A蛋白)取出酶標板，用PBST洗滌，甩幹，於每孔中加入100ul酶標SPA稀釋液，37℃溫育45分鐘。
5、加底物液取出酶標板，PBST洗滌三次，甩幹。加入現配的底物液，37℃溫育15分鐘。
6、終止反應每孔中加入50ul 2M硫酸溶液終止反應。
7、讀數，加硫酸後立即用吸水紙吸乾酶標板底部，將酶標板置於酶標儀上，在450nm波長下，以H行作為為空白調零，測定各孔的OD值。
8、設定對照孔G1-G6的OD值的平均值為Bx0，同一樣品的重複孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數據都以三次重複的平均值為準。各樣品測定對應的抑制率為I＝100％[(Bx0-Byp)/Bx0]。
9、結果判斷，根據樣品OD值計算抑制率，若抑制率＞20％，表明樣品中可能聚醚類抗生素殘留，需進一步進行儀器確認。
實施時，所述的抗體可以採用單克隆抗體也可以採用多克隆抗體，所述的樣品可以採用固體質或液體質。在本實施例中，所述的抗體為多克隆抗體，所述的樣品為液體質。
實施案例七、固相直接檢測步驟1、包被在96微孔板內每孔加入100ul包被抗原稀釋液，4℃過夜或37℃溫育2小時；2、封閉取出96微孔板，棄去包被液，用PBST洗滌三次，甩幹，並在每孔中加入200ul封閉液，37℃溫育1小時；3、加樣取出酶標板，用PBST洗滌三次，甩幹，將樣品用甲醇與水以5∶95混合液提取，提取液濃縮淨化處理後與等體積辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體混合液混合，按表4所示注入96微孔板內，每孔100ul，同時，61-66孔加入50ul的酶標記抗體和50ul的PBS，H行各孔加入100ul的PBS，37℃溫育2小時。具體實施時，也可以採用金標記抗體或螢光標記抗體替代所述的酶標記抗體。
4、加底物液取出酶標板，用PBST洗滌三次，甩幹。於每孔中加入現配的底物液，37℃溫育15分鐘。
5、終止反應每孔中加入50ul 20Mol硫酸溶液終止反應。
6、讀數，加硫酸後立即用吸水紙吸乾酶標板底部，將酶標板置於酶標儀上，在450nm波長下，以H行各孔為空白調零，測定各孔的OD值。
7、設定對照孔61-66的OD值的平均值為Bx0，同一樣品的重複孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數據都以三次重複的平均值為準。各樣品測定對應的抑制率為I＝100％[(Bx0-Byp)/Bx0]。
8、結果判斷，根據樣品OD值計算抑制率，若抑制率＞20％，表明樣品中可能有聚醚類抗生素殘留，需進一步進行儀器確認。
實施時，所述的抗體可以採用單克隆抗體也可以採用多克隆抗體，所述的樣品可以採用固體質或液體質。在本實施例中，所述的抗體為單克隆抗體，所述的樣品為固體質。
表4酶標板中的加樣實驗模型
實施例八、免疫試劑盒檢測聚醚類抗生素酶聯免疫檢測試劑盒採用競爭性酶免疫測定技術測定聚醚類抗生素的含量。試劑盒中將抗莫能菌素抗體包被於微孔壁上，酶結合物中含有標記了辣根過氧化物酶的莫能菌素，反應過程中與標準品、質控血清及待測標本中無標記的莫能菌素共同競爭包被於微孔壁上的抗莫能菌素特異抗體的有限結合位點。反應後衝洗掉未結合物，加酶的底物進行反應，然後用酶標儀測定結合上有酶活性的抗原複合物來測定食品中莫能菌素殘留。
免疫檢測試劑盒包括1.微孔反應板96孔(8孔×12條)，用抗-莫能菌素多克隆抗體包被微孔反應板；2.酶合物含莫能菌素與辣根過氧化物酶的結合物；3.標準品五個梯度莫能菌素濃度；4.質控血清；5.顯色液A含過氧化氫和穩定劑；B含色素基質和穩定劑；6.洗液一瓶，10倍濃縮洗液20ml，使用前用蒸餾水稀釋10倍；7.終止液含1當量的H2SO4溶液；8.說明書一份。
檢測時，按照說明書逐步進行，分別計算出各標準品質控後樣品的B/B。％(B＝不同濃度標準品的OD值，B。為0濃度標準品的OD值，即酶標板本底的OD值)，以標準品濃度(ng/ml)為橫坐標，B/B。為縱坐標，在對數坐標紙上繪製標準曲線，通過外標法得出待測樣品的濃度。
權利要求
1.一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體，其特徵在於，以莫能菌素鈉鹽為半抗原，首先對半抗原進行改造，改造後的半抗原再與蛋白質偶聯製備成免疫原，並通過免疫紐西蘭大白兔製備成多克隆抗體或通過小鼠免疫、細胞融合、篩選及克隆化培養製備成單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體，其特徵在於所述的對半抗原進行改造是通過鹽酸浸泡法或陽離子交換法進行改造，獲得莫能菌素酸。
3.根據權利要求1所述的一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體，其特徵在於所述的對半抗原進行改造是通過丁二酸酐衍生化法進行改造，獲得莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物。
4.根據權利要求1或2所述的一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體，其特徵在於所述的與蛋白質偶聯製備成人工免疫原是採用水溶性碳二亞胺法實現的，具體步驟是先稱取濃度為0.25mmol的莫能菌素酸160mg±10mg溶於2mL50％(v/v)吡啶與水的混合物中；再稱取碳化二亞胺160mg±10mg溶於2mL水中，緩慢加入到莫能菌素酸溶液中，邊加邊攪拌2h，稱取濃度為0.005mmol的牛血清蛋白340mg±10mg或225mg±10mg的卵清蛋白溶於8mL水中，將此溶液緩慢滴加至上述混合液中，並保持pH為6.0±0.5，滴加結束後將混合液於室溫暗處放置24h；將反應完成的溶液置於透析袋內透析4天，透析液為PBS液，透析後真空冷凍乾燥保存，製備成免疫原，其中採用牛血清蛋白製備的免疫原為人工免疫原，採用卵清蛋白製備的免疫原為包被抗原。
5.根據權利要求1或2或3所述的一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體，其特徵在於所述的與蛋白質偶聯製備成人工免疫原是採用氯甲酸異丁酯法實現的，具體步驟是先稱取濃度為0.16mmol的莫能菌素酸104mg±10mg，溶於20mL無水二甲基甲醯胺中，冷卻至4℃，加入等摩爾三正丁胺66ul和氯甲酸異丁酯52ul，於4℃放置30min；稱取濃度為0.005mmol的牛血清蛋白272mg±10mg或180mg卵清蛋白溶於100mL無水二甲基甲醯胺與蒸餾水比例為1∶1的混合液中；混合液的pH＝8.5，將此溶液緩慢滴加至莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物中，磁力攪拌器攪拌4h，4℃過夜，透析5天，分裝真空乾燥冷凍保存，製備成免疫原，其中採用牛血清蛋白製備的免疫原為人工免疫原，採用卵清蛋白製備的免疫原為包被抗原；或者稱取濃度為0.25mmol的莫能菌素鈉-琥珀酸酐衍生物192.5mg±10mg溶於2.5mL二氧六環中，10℃持續攪拌，加入等摩爾的三丁胺47ul和氯甲酸異丁酯35ul，10℃持續攪拌50min，形成混合酸酐液；稱取濃度為0.005mmol的牛血清蛋白340mg±10mg或225mg±10mg的卵清蛋白溶於22mL0.1M碳酸鹽緩衝液中，緩慢加入22mL二氧六環，保持在4℃，將混合酸酐液緩慢滴加入持續攪拌的蛋白質溶液中，反應5h，4℃透析4次，真空冷凍乾燥保存，製備成免疫原，其中採用牛血清蛋白製備的免疫原為人工免疫原，採用卵清蛋白製備的免疫原為包被抗原。
6.根據權利要求1所述免疫抗體在檢測中的應用，其特徵在於，其特徵在於，獲得的單克隆抗體或多克隆抗體用於對動物源性食品的樣品進行聚醚類抗生素殘留的檢測，樣品為固體質或液體質。
7.根據權利要求6所述免疫抗體在檢測中的應用，其特徵在於所述的聚醚類抗生素殘留是指莫能菌素或拉沙洛菌素或奈及利亞菌素或馬杜拉酶素殘留。
8.根據權利要求6或7所述免疫抗體在檢測中的應用，其特徵在於獲得的單克隆抗體或多克隆抗體用於常規的間接競爭性ELISA檢測，或通過金、酶、螢光標記抗體後用於直接ELISA檢測。
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測聚醚類抗生素殘留的免疫抗體及其應用，免疫抗體是以免疫抗體以莫能菌素鈉鹽為半抗原，首先對半抗原進行改造，改造後的半抗原再與蛋白質偶聯製備成人工免疫原，並通過免疫紐西蘭大白兔製備成多克隆抗體或通過小鼠免疫、細胞融合、篩選及克隆化培養等過程製備單克隆抗體。並將獲得的單克隆抗體或多克隆抗體用於對動物源性食品的樣品進行聚醚類抗生素殘留檢測。本發明的優點在於以改造後的莫能菌素鈉鹽與蛋白質進行偶聯後免疫動物，所製備的抗體對聚醚類抗生素藥物具有特異性，可用於動物源性食品中聚醚類抗生素殘留的篩選檢測，利用本發明涉及的免疫抗體進行聚醚類抗生素免疫檢測，具有快速、簡便的特點。
文檔編號G01N33/532GK1677107SQ20051003843
公開日2005年10月5日 申請日期2005年3月14日 優先權日2005年3月14日
發明者劉鐵錚, 王冉, 魏瑞成, 張嶽梅 申請人:江蘇省農業科學院