具有纖維素分解增強活性的多肽和編碼它的多核苷酸的製作方法

2023-06-16 11:53:11

專利名稱：：具有纖維素分解增強活性的多肽和編碼它的多核苷酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽和編碼這些多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用這些多肽的方法。相關技術的說明纖維素是一種由簡單糖類葡萄糖通過P-l，4-聯結共價鍵合而成的聚合物。許多微生物可產生水解P-聯結的葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶(endoglucanases)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases)和P_葡糖苷酶(P-glucosidases)。內切葡聚糖酶在隨機的部位消化纖維素聚合物，使其暴露於纖維二糖水解酶的攻擊之下。纖維二糖水解酶從該纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖分子。纖維二糖是一種水溶性的葡萄糖13_1，4-聯結二聚物。13-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含纖維素原料轉化為乙醇具有大量原料易得、可理想地避免材料的焚燒和填埋，以及乙醇燃料的清潔性等優勢。木材、農業殘餘物、草本作物，以及城市固體廢物已被考慮用來作為生產乙醇的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素構成。一旦纖維素被轉化為葡萄糖，葡萄糖即被酵母容易地轉化為乙醇。提高轉化含纖維素原料的能力在本領域中將會是有利的。W02005/074647公開了來自土生梭孢殼(Thielaviaterrestris)的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽及其多核苷酸。W02005/074656公開了來自橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽及其多核苷酸。公布的美國專利申請序列號2007/0077630公開了來自裡氏木黴(Trichodermareesei)的具有纖維素分解增強活性的分離的多肽及其多核苷酸。本發明提供具有纖維素分解增強活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。
發明內容本發明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60%同一性之胺基酸序列的多肽；(b)由與(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列、(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈在至少中等嚴緊度條件下雜交的多核苷酸所編碼的多肽；(c)由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性之核苷酸序列的多核苷酸所編碼的多肽；禾口(d)SEQIDNO:2的成熟多肽包含一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入的變體。本發明還涉及編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的分離的多核苷酸，它們選自下組(a)編碼包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少60%同一性的胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(b)與(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈在至少中等嚴緊度條件下雜交的多核苷酸；(c)包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性之核苷酸序列的多核苷酸；禾口(d)編碼SEQIDNO:2的成熟多肽包含一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入的變體的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體、重組宿主細胞，以及產生具有纖維素分解增強活性的多肽的方法。本發明還涉及抑制多肽在細胞中的表達的方法，包括對細胞施用或者在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中該dsRNA包含本發明的多核苷酸的子序列。本發明還涉及這樣的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地該dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發明還涉及用於降解或轉化含纖維素材料的方法，包括在有效量的此類具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，其中與不存在所述具有纖維素分解增強活性的多肽時相比，該具有纖維素分解增強活性的多肽的存在增加含纖維素材料的降解。本發明還涉及產生發酵產物的方法，包括(a)在有效量的此類具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下，用有效量的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中與不存在所述具有纖維素分解增強活性的多肽時相比，該具有纖維素分解增強活性的多肽的存在增加含纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發酵微生物將步驟(a)的經糖化的含纖維素材料發酵以產生發酵產物；和(c)從發酵回收發酵產物。本發明還涉及包含編碼此類具有纖維素分解增強活性的多肽的分離的多核苷酸的植物。本發明還涉及產生此類具有纖維素分解增強活性的多肽的方法，包括(a)在有助於產生此類具有纖維素分解增強活性的多肽的條件下培養包含編碼該多肽的多核苷酸的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因可操作地連接於編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包含SEQIDN0:2的胺基酸1-15或者由SEQIDNO:2的胺基酸1-15組成，其中所述基因對於所述核苷酸序列而言是外源的。附圖簡要說明圖1顯示一種具有纖維素分解增強活性的土生梭孢殼NRRL8126多肽的cDNA序列及推定的胺基酸序列(分別為SEQIDNO:1和2)。圖2顯示pTter6IF的限制性酶切圖。圖3顯示pAlLo23的限制性酶切圖。圖4顯示pMJ04的限制性酶切圖。圖5顯示pCaHj527的限制性酶切圖。圖6顯示pMT2188的限制性酶切圖。圖7顯示pCaHj568的限制性酶切圖。圖8顯示pMJ05的限制性酶切圖。圖9顯示pSMail30的限制性酶切圖。圖10顯示米麴黴(Aspergillusoryzae)P-葡糖苷酶的天然信號序列的DNA序列及胺基酸序列(SEQIDNO:37和38)。圖11顯示特異腐質黴(Humicolainsolens)內切葡聚糖酶V信號序列的DNA序列及胺基酸序列(SEQIDNO:41和42)。圖12顯示pSMail35的限制性酶切圖。定義纖維素分解增強活性(cellulolyticenhancingactivity):術語"纖維素分解增強活性"在此定義為增強具有纖維素分解活性的蛋白質對含纖維素材料的水解的生物學活性。為本發明的目的，纖維素分解增強活性是通過測量纖維素分解性蛋白質在下述條件下水解含纖維素材料所致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來加以確定的l-50mg總蛋白/gPCS中的纖維素，其中總蛋白包含80-99.5%w/w的纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素，及0.5-20%w/w的具有纖維素分解增強活性的蛋白質，5(TC歷時1_7天，與用相等的無纖維素分解增強活性的總蛋白加載量(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進行的對照水解反應作比較。在一個優選的方面，加載的纖維素酶蛋白是在有3%總蛋白重量的米麴黴P-葡糖苷酶(根據W002/095014在米麴黴中重組表達的)或3%總蛋白重量的煙麴黴(Aspergillusfumigatus)P-葡糖苷酶(根據WO02/095014的實施例22在米麴黴中重組表達的)存在的CELLUCLAST1.5L(NovozymesA/S，BagSVaerd，Denmark)的混合物，將其用作纖維素分解活性的來源。所述具有纖維素分解增強活性的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20%，優選至少40%，更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70%，更優選至少80%，進一步更優選至少90%，最優選至少95%，進一步最優選至少100%的纖維素分解增強活性。所述具有纖維素分解增強活性的多肽以下述方式增強由具有纖維素分解活性的蛋白質所催化的含纖維素材料的水解將為達到同樣水解程度所需的纖維素分解酶的量減少優選至少0.1倍，更優選至少0.2倍、更優選至少0.3倍、更優選至少0.4倍、更優選至少0.5倍、更優選至少1倍、更優選至少3倍、更優選至少4倍、更優選至少5倍、更優選至少10倍、更優選至少20倍、進一步更優選至少30倍、最優選至少50倍、進一步最優選至少100倍。纖維素分解活性(cellulolyticactivity):術語"纖維素分解活性"在本文中定義為水解含纖維素材料的生物學活性。纖維素分解蛋白可水解或水解羧甲基纖維素(CMC)，從而降低溫育混合物的粘度。由此造成的粘度下降可以用振動粘度計(例如Sofraser，France產的MIVI3000)來測定。纖維素酶活性(以纖維素粘度單位(CellulaseViscosityUnit,CEVU)作為量度)測定是通過測量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來確定樣品中催化活性的量。測定在適合纖維素分解蛋白和底物的溫度和PH進行。對於CELLUCLASTTM(NovozymesA/S，BagSVaerd，Denmark)，進行測定的條件為40°C、於0.1M磷酸鹽pH9.0緩衝液中，歷時30分鐘，以CMC為底物(33.3g/L羧甲基纖維素Hercules7LFD)，且酶濃度為大約3.3-4.2CEVU/ml。CEVU活性是相對於公認的酶標準品，例如CELLUZ預ETMStandard17-1194(獲自NovozymesA/S，BagSV2erd,Denmark)來計算的。為本發明的目的，纖維素分解活性是通過測量在下述條件下纖維素分解性混合物對含纖維素材料的水解的增加來確定的l-10mg纖維素分解蛋白質/gPCS中的纖維素，歷時5-7天，50°C，與不加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。內切葡聚糖酶術語"內切葡聚糖酶"在本文中定義為一種內切-1，4-(1，3;1，4)-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(諸如羧甲基纖維素和羥甲基纖維素)、地衣澱粉中的1，4-P-D-糖苷聯結；混合型P-l，3葡聚糖如穀物(cereal)P-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其他含纖維素性組分的植物材料中的P-1，4鍵的內水解(endohydrolysis)。為本發明的目的，內切葡聚糖酶活性是根據Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59:257-268所述的程序利用羧甲基纖維素(CMC)水解來確定的。纖維二糖水解酶術語"纖維二糖水解酶"在本文中定義為一種1，4-13-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化水解纖維素、纖維寡糖、或任何含P-l，4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4-e-D-葡糖苷聯結，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。為本發明的目的，纖維二糖水解酶活性是依照Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters149:152—156;vanTilbeurgh禾PClaeyssens,1985，FEBSLetters187:283-288中記載的程序加以測定的。在本發明中，Lever等人的方法被用來評估玉米秸稈中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等人的方法被用於測定對一種螢光性二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。|3-葡糖苷酶術語"13-葡糖苷酶"在本文中定義為一種13-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化水解末端非還原性13-D-葡萄糖殘基，釋放13-D-葡萄糖。為本發明的目的，P_葡糖苷酶活性是根據Venturi等，2002'J.BasicMicrobiol.42:55-66記載的基本程序來測定的，只是使用了如本文所述的不同條件。一個單位的P-葡糖苷酶活性定義為在100mM擰檬酸鈉、0.01^TWEEN⑧20中，5(TC、pH5條件下每分鐘從作為底物的4mM對硝基苯基-13-D-吡喃葡萄糖苷產生1.0微摩爾對硝基苯酚。家族61糖苷水解酶術語"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"在本文中定義為落入根據HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydorlasesbasedonamino_acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316以及HenrissatB.禾口BairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydorlases，Biochem.J.316:695-696所述的糖苷水解酶家族61的多肽。目前，Henrissat將GH61家族歸於未分類之列，表明該家族所屬的多肽的機制、催化性親核體/鹼、催化性質子供體以及3D結構等性質均系未知。GH61蛋白又被稱為CEL61蛋白。含纖維素材料生物質的初生細胞壁中主要的多糖是纖維素，豐度第二高的是半纖維素，第三是果膠。在細胞停止生長後產生的次生細胞璧也含有多糖，並且被與半纖維素共價交聯的多聚體木質素所增強。纖維素是脫水纖維二糖的同聚物，因此是一種直鏈P-(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有複雜的分枝結構和一系列取代基。雖然纖維素一般是無定形的，但植物組織中發現的纖維素主要呈現為由平行葡聚糖鏈構成的不溶性晶體基質。半纖維素通常通過氫鍵連接於纖維素以及其他半纖維素上，這有助於細胞壁基質的穩定化。含纖維素材料可以是任何含有纖維素的材料。纖維素通常存在於例如植株的莖、葉、果/種殼(hulls)、果/種皮(husks)和穗軸(cobs)，或者樹的葉、枝、和木材等之中。含纖維素材料可以是，但不限於，草質材料(herbaceousmaterial)、農業殘餘物(agriculturalresidues)、林業殘餘物(forestryresidues)，城市固體廢物(municipalsolidwastes)、廢紙(wastepaper)，以及紙槳和造紙廠殘餘物(pulpandpapermillresidues)。含纖維素材料可以是任何類型的生物質，包括但不限於木材資源、城市固體廢物、廢紙、作物和作物殘餘物(見例如Wiselogel等，1995，《HandbookonBioethanol》(CharlesE.Wyman編)，第105-118頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman，1994，BioresourceTechnology50:3_16丄ynd，1990，AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719;Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics，《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》，T.Sch印er總編，第65巻，第23-40頁，Springer-Verlag，NewYork)。在本文中應該理解，纖維素可以是木素纖維素的形式，它是一種植物細胞壁材料，在混合的基質中包含木質素、纖維素和半纖維素。在一個優選的方面，含纖維素材料是玉米秸稈(cornstover)。在另一個優選的方面，含纖維素材料是玉米纖維。在另一個優選的方面，含纖維素材料是玉米穗軸。在另一個優選的方面，含纖維素材料是稻草(ricestraw)。在另一個優選的方面，含纖維素材料是紙和紙漿加工廢物。在另一個優選的方面，含纖維素材料是木本或草本植物。在另一個優選的方面，含纖維素材料是甘蔗渣。含纖維素材料可以直接使用，或者可以使用本領域已知的常規技術對其進行預處理。例如，物理預處理技術可包括各種類型的粉碎(milling)、輻射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆石皮(steaming/steamexplosion)、禾口溼熱分角牟作用(hydrothermolysis);化學預處理技術可包括稀酸、鹼、有機溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳、和pH受控的溼熱分解作用；而生物預處理技術可涉及施加溶木質素性微生物(參見，例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass，《HandbookonBioethanol-ProductionandUtilization》，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC，179—212;Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan，J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomass8forFuelsProduction》，Himmel，M.E.，Baker，J.0.禾口0verend，R.P.編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.禾口Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》，Sch印er，T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;01sson，L禾口Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;以及Vallander，L.禾口Eriksson,K._E.L.，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。預處理的玉米秸稈術語"PCS"或"預處理的玉米秸稈"在本文中定義為通過熱和稀酸處理從玉米秸稈獲得的含纖維素材料。為本發明的目的，PCS是通過本文中說明的方法製備的。分離的多肽本文所用的術語"分離的多肽"是指從一個來源分離的多肽。在一個優選的方面，所述多肽是通過SDS-PAGE測定為至少1%純、優選至少5%純、更優選至少10%純、更優選至少20%純、更優選至少40%純、更優選至少60%純、進一步更優選至少80%純、最優選至少90%純的。基本上純的多肽術語"基本上純的多肽"在本文是指這樣的多肽製備物，其含有以重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，進一步更優選至多2%，最優選至多1%，進一步最優選至多0.5%的與其天然地或重組地相伴隨的其他多肽物質。因此，優選的是，基本上純的多肽以製備物中存在的總多肽物質的重量計是至少92%純、優選至少94%純、更優選至少95%純、更優選至少96%純、更優選至少96%純、更優選至少97%純、更優選至少98%純、進一步更優選至少99%、最優選至少99.5%純、進一步最優選100%純的。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即，多肽製備物實質上不含與其天然地或重組地相伴隨的其他多肽物質。這可以通過例如用公知的重組技術或通過經典的純化方法製備所述多肽來實現。成熟多肽術語"成熟多肽"在本文中定義為經過翻譯和任何翻譯後修飾(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之後，處於其最終形式的具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個優選的方面，基於SignalP程序所作的SEQIDNO:2的胺基酸1_15為信號肽的預測，成熟多肽是SEQIDNO:2的胺基酸16-317。成熟多肽編碼序列術語"成熟多肽編碼序列"在本文中定義為編碼成熟的具有纖維素分解增強活性的多肽的核苷酸序列。在一個優選的方面，基於SignalP程序所作的SEQIDN0:1的核苷酸1-45編碼信號肽的預測，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:l的核苷酸46-951。同一性兩個胺基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的相關性用參數"同一性"來描述。為本發明的目的，兩個胺基酸序列之間同一性程度的確定使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，TrendsinGenetics16:276-277)，優選3.0.0或更新的版本中的Needle程序所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)。所用的可選參數為缺口形成罰分(g即openpenalty)10、缺口延伸罰分(g即extensionpenalty)0.5、和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。將Needle的標記為"longestidentity"("最長同一性")(使用-nobrief(無簡述)選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性使用，它是這樣計算出來的(相同的殘基數x100)/(比對長度-比對中的缺口總數)為本發明的目的，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度的確定使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，同上)，優選3.0.0或更新的版本中的Needle程序所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)。所用的可選參數為缺口形成罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。將Needle的標記為"longestidentity"("最長同一性")(使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性使用，它是這樣計算出來的(相同的脫氧核糖核苷酸數x100)/(比對長度-比對中的缺口總數)同源序列術語"同源序列"在本文中定義為用SEQIDNO:2的成熟多肽進行tfasty搜索(Pearson,W.R.，1999，《BioinformaticsMethodsandProtocols》，S.Misener和S.A.Krawetz編，第185-219頁)時，給出的E值(或稱期望值)小於O.OOl的預測蛋白質。多肽片段術語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2的成熟多肽的氨基端和/或羧基端缺失一個或多個(數個)胺基酸而得到的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有纖維素分解增強活性。在一個優選的方面，片段含有SEQIDN0:2的成熟多肽或其同源序列的至少255個胺基酸殘基、更優選至少270個胺基酸殘基、最優選至少285個胺基酸殘基。子序列術語"子序列"在本文中定義為從SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的5'端和/或3'端缺失了一個或多個(數個)核苷酸的核苷酸序列；或者其同源序列；其中所述子序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽片段。在一個優選的方面，子序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少765個核苷酸、更優選至少810個核苷酸、最優選至少855個核苷酸。等位變體(allelicvariant):術語"等位變體"是指基因的佔據同一染色體座位的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變異在天然情況下通過突變產生，並可導致群體中的多態性。基因突變可以是沉默的(被編碼的多肽中沒有變化)，或者可以編碼胺基酸序列被改變的多肽。多肽的等位變體是基因的等位變體所編碼的多肽。分離的多核苷酸本文中所用的術語"分離的多核苷酸"是指從一個來源分離而來的多核苷酸。在一個優選的方面，所述多核苷酸通過瓊脂糖凝膠電泳測定為至少1%純、優選至少5%純、更優選至少10%純、更優選至少20%純、更優選至少40%純、更優選至少60%純、進一步更優選至少80%純、最優選至少90%純。基本上純的多核苷酸本文中所用的術語"基本上純的多核苷酸"是指這樣的多核苷酸製備物，其不含有其他無關或不需要的核苷酸，並且處於適合在經基因工程改造的蛋白質的生產系統中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有以重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，進一步更優選至10多2%，最優選至多1%，進一步最優選至多0.5%的與其天然地或重組地相伴隨的其他多核苷酸物質。但是，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非翻譯區，如啟動子和終止子。優選的是，基本上純的多核苷酸以重量計為至少90%純、優選至少92%純、更優選至少94%純、更優選至少95%純、更優選至少96%純、更優選至少97%純、進一步更優選至少98%純、最優選至少99%純、進一步最優選至少99.5%純。本發明的多核苷酸優選是處於基本上純的形式，即多核苷酸製備物基本上不含與其天然地或重組地相伴隨的其他多核苷酸物質。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或者上述來源的任意組合。編碼序列當用於本文時，術語"編碼序列"是指這樣的核苷酸序列，它直接規定其蛋白質產物的胺基酸序列。編碼序列的邊界一般是由可讀框決定的，後者通常以ATG起始密碼子或其他可選的起始密碼子如GTG及TTG開始，而以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的、或重組的核苷酸序列。cDNA:術語"cDNA"在本文中定義為這樣的DNA分子，它能夠從獲自真核細胞的成熟的、經剪接的mRNA分子通過逆轉錄製備得到。cDNA缺少在對應的基因組DNA中通常存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄物是mRNA的前體，它經歷一系列步驟被加工之後作為成熟的、經剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過一個稱為剪接的過程去除內含子序列。因此，從mRNA衍生而來的cDNA缺少任何內含子序列。核酸構建體術語"核酸構建體"在用於本文時是指這樣的單鏈或雙鏈核酸分子其是從天然存在的基因分離的，或者經過修飾而以原本不會存在於自然界中的方式包含核酸的片段，或者是合成的。當核酸構建體包含本發明的編碼序列的表達所需的控制序列時，術語"核酸構建體"與術語"表達盒"是同義的。控制序列術語"控制序列"在本文中定義為包括編碼本發明多肽的多核苷酸的表達所必需的所有組件。每個控制序列對於編碼多肽的核苷酸序列而言，或者對於其它控制序列而言，可以是天然的或者外來的。這樣的控制序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽(prop印tide)序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。在最低程度上，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。控制序列可以具有接頭，用來引入特異性限制性位點以幫助將控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區連接。可操作地連接術語"可操作地連接"在本文中是指這樣一種構型，其中控制序列相對於多核苷酸序列的編碼序列被置於合適的位置上，使得該控制序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語"表達"包含多肽產生過程中涉及的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾、以及分泌。表達載體術語"表達載體"在本文中定義為一種線性或環狀DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，且可操作地連接於為其表達提供條件的其他核苷酸。宿主細胞術語"宿主細胞"在用於本文時包括任何易於被包含本發明的多核苷酸的核酸構建體或表達載體所轉化、轉染、轉導等的細胞類型。修飾術語"修飾"在本文中意指對由SEQIDNO:2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列進行的任何化學修飾；以及對編碼此類多肽的DNA進行的遺傳操作。修飾可以是一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(數個)胺基酸側鏈的替換。人工變體當在本文中使用時，術語"人工變體"是指由這樣的生物體所產生的具有纖維素分解增強活性的多肽所述生物體表達SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾型多核苷酸序列。所述修飾型多核苷酸序列是對SEQIDN0:1公開的多核苷酸序列或其同源序列通過修飾加以人工幹預而獲得的。發明詳細說明具有纖維素分解增強活性的多肽在第一個方面，本發明涉及包含如下所述的胺基酸序列或由這樣的胺基酸序列組成，且具有纖維素分解增強活性的分離的多肽(下文稱為"同源多肽)所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優選至少60%，更優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，進一步更優選至少90%，最優選至少95%，進一步最優選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的同一性程度。在一個優選的方面，同源多肽包含如下所述的胺基酸序列或由這樣的胺基酸序列組成所述胺基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽有10個胺基酸、優選5個胺基酸、更優選4個胺基酸、進一步更優選3個胺基酸、最優選2個胺基酸、進一步最優選1個胺基酸不同。本發明的多肽優選包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體、或它們具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的胺基酸序列。在另一個優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的成熟多肽。在另一個優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的胺基酸16-317或其等位變體、或它們具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的胺基酸16-317。在另一個優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的胺基酸序列或其等位變體、或它們具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的胺基酸序列組成。在另一個優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的成熟多肽組成。在另一個優選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的胺基酸16-317或其等位變體、或它們具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的胺基酸16-317組成。在第二個方面，本發明涉及由包含如下所述的核苷酸序列或由這樣的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼的、具有纖維素分解增強活性的分離的多肽所述核苷酸序列在優選極低嚴緊度條件下，更優選低嚴緊度條件下，更優選中等極嚴緊度條件下，更優選中_高嚴緊度條件下，進一步更優選高嚴緊度條件下，最優選極高嚴緊度條件下與(i)SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch禾口T.Maniatis，1989，MolecularCloning,ALaboratoryMa皿al，第二片反，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的子序列含有至少100個連續的核苷酸，或者優選至少200個連續的核苷酸。而且，子序列可編碼具有纖維素分解增強活性的多肽片段。在一個優選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。可以利用SEQIDNO:1的核苷酸序列或其子序列以及SEQIDNO:2的胺基酸序列或其片段來設計核酸探針，根據本領域公知的方法從不同屬或種的菌株中鑑定並克隆出編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的DNA。具體的，可以使用這樣的探針，依照標準Southern印跡程序與感興趣的屬或種的基因組或cDNA進行雜交，來從其中鑑定和分離出相應的基因。這樣的探針可以顯著地短於整個序列，但其長度應當為至少14個、優選至少25個、更優選至少35個、最優選至少70個核苷酸。不過，優選的是核酸探針長度為至少100個核苷酸。例如，核酸探針長度可以為至少200個核苷酸、優選至少300個核苷酸、更優選至少400個核苷酸、或最優選至少500個核苷酸。可以用更長的探針，例如優選至少600個核苷酸、更優選至少700個核苷酸、進一步更優選至少800個核苷酸、或最優選至少900個核苷酸長的核酸探針。DNA和RNA探針都可以使用。通常將探針加以標記用於檢測相應的基因(例如用32P、3H、35S、生物素和抗生物素蛋白(avidin)標記)。本發明涵蓋這樣的探針。因此，對於從這樣的其他菌株製備的基因組DNA或者cDNA文庫，可以從中篩選與上文描述的探針雜交且編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的DNA。來自這樣的其他菌株的基因組或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳或其他分離技術來加以分離。對於來自所述文庫的DNA或者分離的DNA，可以將其轉移並固定在硝酸纖維素或者其他合適的載體材料上。為了鑑定與SEQIDN0:1或其子序列同源的克隆或DNA，優選將所述載體材料用於Southern印跡中。為本發明的目的，"雜交"表示所述核苷酸序列在極低到極高嚴緊度條件與對應於下述序列的帶標記的核酸探針雜交SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列；其全長互補鏈；或它們的子序列。在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子可以用例如x射線膠片來檢測。在一個優選的方面，所述核酸探針是SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優選的方面，所述核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸46-951。在另一個優選的方面，所述核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽的多核苷酸，或其子序列。在另一個優選的方面，所述核酸探針是SEQIDN0:1。在另一個優選的方面，所述核酸探針是大腸桿菌NRRLB-50044中所含的質粒pTter61F中包含的多核苷酸序列，其中其多核苷酸編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優選的方面，所述核酸探針是大腸桿菌NRRLB-50044中所含的質粒pTter61F中包含的成熟多肽編碼區。對於長度為至少100個核苷酸的長探針而言，極低到極高嚴緊度條件定義為42t:下在5XSSPE，0.3%SDS，200yg/ml變性剪切的鮭魚精子DNA，及25%甲醯胺(對於極低和低嚴緊度)、35%甲醯胺(對於中等和中-高嚴緊度)、或50%甲醯胺(對於高和極高嚴緊度)的條件下，按照標準的Southern印跡程序以最優條件進行歷時12-24小時的預雜交和雜交。對於長度為至少100個核苷酸的長探針而言，最後在優選45t:(極低嚴緊度)、更優選50°C(低嚴緊度)、更優選55°C(中等嚴緊度)，更優選60°C(中-高嚴緊度)、進一步更優選65t:(高嚴緊度)、最優選7(TC(極高嚴緊度)下，用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。對於長度為約15個核苷酸到約70個核苷酸的短探針而言，嚴緊度條件定義為在比^吏用豐艮據Bolton禾口McCarthy(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)的計算方法算出的Tm低大約5。C到大約10°C的溫度下，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、1XDenhardt氏溶液、lmM焦磷酸鈉、lmM磷酸二氫鈉、0.lmMATP和0.2mg/ml酵母RNA中，按照標準的Southern印跡程序以最優條件進行歷時12-24小時的預雜交、雜交和雜交後洗滌。對於長度為約15個核苷酸到約70個核苷酸的短探針而言，在比算出的Tm低5°C到10°C的溫度下，用6XSCC+0.1%SDS洗滌1次15分鐘，再用6XSSC洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發明涉及由包含如下所述核苷酸序列或者由這樣的核苷酸序列組成的多核苷酸所編碼，且具有纖維素分解增強活性的分離的多肽所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%，更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%、進一步最優選96%、97%、98%或99%的同一性程度，且編碼活性多肽。參見本文中"多核苷酸"部分。在第四個方面，本發明涉及包含SEQIDN0:2的成熟多肽中一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入的人工變體；或其同源序列。優選地，胺基酸改變在性質上是不重要的，即為不會顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性的保守胺基酸取代或者插入；小的缺失，通常為l個到大約30個胺基酸的缺失；小的氨基端或羧基端延伸，如一個氨基端的甲硫氨酸殘基；最多約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變靜電荷或其他功能來方便純化的小延伸，如多聚組氨酸序列段、抗原性表位或結合結構域。保守取代的例子是下述各組之內進行的取代鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。一般不會改變特定活性的胺基酸取代是本領域已知的，並且在例如H.Neurath和R.L.Hill，1979於TheProteins,AcademicPress,NewYork—書中有描述。最常出現的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/11e、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20種標準的胺基酸之外，可以用非標準胺基酸(例如4-羥脯氨酸、6_^甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-甲基絲氨酸)來取代野生型多肽的胺基酸殘基。可以用有限數目的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸、以及非天然胺基酸來取代胺基酸殘基。"非天然胺基酸"系在蛋白質合成之後被修飾過，和/或在其側鏈中具有與標準胺基酸不同的化學結構。非天然胺基酸可以是化學合成的，優選地是可商購的，包括哌啶酸&1。6(3011(^(^(1)、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。或者，胺基酸改變具有這樣的性質，以至於多肽的物理化學性質被改變。例如，胺基酸改變可改善多肽的熱穩定性、改變底物特異性、改變最適PH，等等。可以根據本領域已知的程序，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081-1085)來鑑定親本多肽中的關鍵胺基酸。在上述後一種技術中，在分子中每個殘基處引入單一的丙氨酸突變，然後測試所得的突變分子的生物學活性(即纖維素分解增強活性)，來鑑定對該分子的活性有關鍵作用的胺基酸殘基。另見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其他生物學相互作用也可以通過對結構的物理學分析來加以確定，如通過核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記等技術，與針對推定的接觸部位胺基酸的突變相結合來加以確定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992'J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992，FEBSLett.309:59-64。也可以分析與本發明多肽之親緣多肽的同一性，據此推測關鍵胺基酸的身份。可以使用已知的誘變、重組和/或改組方法來進行和測試單個或多個胺基酸的取代、缺失和/或插入，然後進行相關的篩選程序，例如Reidhaar-01son和Sauer，1988，Science241:53—57;Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152—2156;W095/17413;或W095/22625中公開的那些。其它可用的方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837;美國專利5，223，409;W092/06204)和區域定向誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145;Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法可以與高通量自動化篩選方法結合起來用於檢測宿主細胞表達的經克隆、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。對於編碼活性多肽的誘變DNA，可以使用本領域中的標準方法從宿主細胞中加以回收並快速測序。這些方法使人們能夠快速地確定感興趣的多肽中個別胺基酸殘基的重要性，而且可以用於結構未知的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽(如SEQIDNO:2的胺基酸19-317)的胺基酸取代、缺失和/或插入的總數為10個、優選9個、更優選8個、更優選7個、更優選至多6個、更優選5個、更優選4個、進一步更優選3個、最優選2個、進一步最優選1個。具有纖維素分解增強活性的多肽的來源具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽可以從任何屬的微生物獲得。為本發明的目的，術語"從...獲得"(或"獲自...")在本文中與特定的來源聯用時，意思應該是指由核苷酸序列編碼的多肽是由所述來源產生的，或者是由插入了來自該來源的所述核苷酸序列的菌株產生的。在一個優選的方面，從特定來源獲得的多肽是胞外分泌的。具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈黴菌屬(Str印tomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Xactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(0ceanobacillus)的具有纖維素分解增強活性的多肽，或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)或尿枝原體屬(Ure即lasma)的具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個優選的方面，所述多肽是嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解澱粉芽包桿菌(Bacillus咖yloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegateri咖)、短小芽孢桿菌(Bacillusp咖ilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的具有纖維素分解增強活性的多肽。15在另一個優選的方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Str印tococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Str印tococcusuberis)或馬鏈球菌獸瘟亞種(Str印tococcusequisubsp.Zoo印idemicus)的具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是不產色鏈黴菌(Str印tomycesachromogenes)、除蟲鏈黴菌(Str印tomycesavermitilis)、天藍色鏈黴菌(Str印tomycescoelicolor)、灰色鏈黴菌(Str印tomycesgriseus)或淺青紫鏈黴菌(Str印tomyceslividans)的具有纖維素分解增強活性的多肽。具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽還可以是真菌多肽，更優選酵母多肽，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍黴屬(Yarrowia)的具有纖維素分解增強活性的多肽；或者更優選絲狀真菌多肽，諸如枝頂孢黴屬(Acremonium)、蘑燕屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、麴黴屬(Aspergillus)、短梗黴屬(Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬(Botryospaeria)、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、毛殼菌屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角屬(Clavic印s)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、慄疫病菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、網孢菌屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤黴屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質毒屬(Humicola)、孝巴菌屬(Irpex)、香燕屬(Lentinula)、小球腔菌屬(Leptospaeria)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、新考瑪脂黴屬(Neocallimastix)、脈包菌屬(Neurospora)、擬青黴屬(Paecilomyces)、青黴屬(PeniciIlium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛黴屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸黴屬(Tolypocladium)、木黴屬(Trichoderma)、Trichophaea、輪枝抱屬(Verticillium)、小包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)的具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個優選的方面，所述多月太是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)的具有纖維素分角率增強活性的多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢黴(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱麴黴(Aspergillusaculeatus)、泡盛麴黴(Aspergillusawamori)、煙麴黴、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、日本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、黑麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(Aspergillusoryzae)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpa皿icola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆抱狀嫌抱(Fusariumbactridioides)、禾穀嫌抱(Fusariumcerealis)、庫成嫌抱(Fusariumcrookwellense)、大刀嫌抱(Fusariumculmorum)、禾本禾鬥嫌抱(Fusariumgraminearum)、禾赤嫌抱(Fusariumgrami皿m)、異抱嫌抱(Fusariumheterosporum)、合歡木嫌抱(Fusariumnegundi)、尖嫌抱(Fusariumoxysporum)、多枝嫌抱(Fusariumreticulatum)、粉紅嫌抱(Fusariumroseum)、接骨木嫌抱(Fusariumsambuci皿m)、膚色嫌抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝包嫌包(Fusariumsporotrichioides)、硫色嫌抱(Fusariumsulphureum)、圓鐮包(Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)、灰色腐質酶(Humicolagrisea)、特異腐質黴、疏棉狀腐質毒(Humicolalanuginosa)、乳白孝巴菌(Irpexlacteus)、米赫毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲黴(Myceliophthorathe擺phila)、粗糙脈孢菌(Ne訓sporacrassa)、繩狀青黴(Penicilliumf皿iculosum)、產紫青黴(Penicilliumpurpuroge皿m)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、哈茨木黴(Trichodermaharzia皿m)、康寧木黴(Trichodermakoningii)、長枝木黴(Trichodermalongibrachiatum)、裡氏木黴(Trichodermareesei)或綠色木黴(Trichodermaviride)的具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是無色梭孢殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭包殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱子梭抱殼(Thielaviamicrospora)、Thielaviaovispora、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila或土生梭孢殼的具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個更優選的方面，所述多肽是土生梭孢殼的具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個最優選的實施方案中，所述多肽是土生梭孢殼NRRL8126的具有纖維素分解增強活性的多肽，例如包含SEQIDN0:2的胺基酸序列的多肽，或它的片段，例如成熟蛋白。應當理解的是，就前文所述的物種而言，本發明涵蓋了它們的完全和不完全狀態，以及其它分類學上的等同物，例如無性型，不管它們已知的種名是什麼。本領域技術人員可以很容易地識別出合適的等同物的身份。公眾可以在若干保藏機構容易地獲取這些物種的菌株，這樣的機構諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和北方區域研究中心農業研究機構專利培養物保藏中心(NRRL)。此外，還可以使用上文所述的探針，從包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分離的微生物在內的來源鑑定和獲取這樣的多肽。用於從天然生境分離微生物的技術是本領域中公知的。然後可以通過類似地篩選此類微生物的基因組文庫或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用探針檢測到了編碼多肽的多核苷酸序列，就可以使用本領域普通技術人員公知的技術(參見例如Sambrook等，1989同上)分離或者克隆該多核苷酸。本發明的多肽還包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本發明的核苷酸序列(或其部分)而產生的。產生融合多肽的技術是本領域已知的，包括將編碼各多肽的編碼序列連接起來使它們符合閱讀框，並使得被融合的多肽的表達處於相同的啟動子和終止子的控制之下。融合多肽還可以包含切割位點。融合蛋白一旦被分泌，該位點就被切割，從融合蛋白中釋放出具有纖維素分解增強活性的多肽。切割位點的實例包括但不限於Kex2位點，其編碼二肽Lys-Arg(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnology13:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381);Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其被因子Xa蛋白酶在精氨酸殘基之後切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512);Asp_Asp_Asp_Asp_Lys位點，其被腸激酶在賴氨酸之後切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987);His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其被GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240-248);Leu_Val_Pro_Arg_Gly_Ser位點，其被凝血酶在Arg之後切割(Stevens,2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48);Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其被TEV蛋白酶在Gin之後切割(Stevens,2003，同上)；以及Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其被一種基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶在Gln之後切割(Stevens,2003，同上)。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，它們包含編碼本發明具有纖維素分解增強活性的多肽的核苷酸序列或者由這樣的核苷酸序列組成。在一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:1或者由其組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50044所含的質粒pTter61F中包含的序列，或者由該序列組成。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，或者由其組成。在另一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:l的胺基酸46-951，或者由其組成。在另一個更優選的方面，所述核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50044所含的質粒pTter61F中包含的成熟多肽編碼序列，或者由該序列組成。本發明還涵蓋編碼這樣的核苷酸序列，它們編碼包含SEQIDN0:2的胺基酸序列或其成熟多肽或由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其成熟多肽組成的多肽，並且與SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列存在基於遺傳密碼簡併性的差異。本發明還涉及SEQIDNO:l的編碼SEQIDNO:2的具有纖維素分解增強活性的片段的子序列。本發明還涉及突變的多核苷酸，其包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中至少一處突變或由其構成，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDN0:2的成熟多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或它們的組合。從這樣的基因組DNA克隆本發明的多核苷酸可以例如這樣實現通過使用公知的聚合酶鏈式反應(PCR)或對表達文庫進行抗體篩選以檢測具有共同的結構特徵的克隆的DNA片段。參見例如Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增程序諸如連接酶鏈式反應(LCR)、連接激活的轉錄(LAT)和基於核苷酸序列的擴增(NASBA)。多核苷酸可以從梭孢殼屬的菌株或其它的或近緣的生物體分離，因此，例如，可以是所述核苷酸序列的多肽編碼區域的等位變體或種變體(speciesvariant)。本發明還涉及包含下述核苷酸序列或由其組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少60%的同一性程度、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、進一步更優選至少90%、最優選至少95%、進一步最優選至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性，並且編碼活性多肽。為了合成與所述多肽基本上相似的多肽，可能需要對編碼本發明的多肽的核苷酸序列進行修飾。術語與多肽"基本上相似"是指所述多肽的非天然存在的形式。這些多肽與分離自其天然來源的多肽可能存在一些經過工程化改造的差異，例如，在特異性活性、熱穩定性、最適pH等方面有所不同的人工變體。變體序列可以基於作為SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列呈示的核苷酸序列而構建，例如其子序列，和/或通過導入這樣的核苷酸取代來構建此類核苷酸取代不會使該核苷酸序列編碼的多肽具有其它胺基酸序列，而是對應於要用來產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者可以通過引入可能產生不同的胺基酸序列的核苷酸取代來構建。核苷酸取代的一般說明可參見例如Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107。本領域技術人員將容易想到，可以在對於分子的功能有關鍵作用的區域之外進行這樣的取代，而仍然產生活性的多肽。對於由本發明分離的多核苷酸編碼的多肽的活性所必需的、因此優選不予以取代的胺基酸殘基，可以根據本領域已知的程序，諸如定點誘變或丙氨酸分區誘變(參見例如C皿ningham和Wells，1989，同上)，來加以鑑定。在後一種技術中，在分子中每一個帶正電的殘基處引入突變，並測試所得的突變分子的纖維素分解增強活性，從而鑑定出對該分子活性有關鍵作用的胺基酸殘基。還可以通過對使用核磁共振分析、晶體學或光親和標記等技術(參見例如deVos等，1992，同上文；Smith等，1992，同上文；Wlodaver等，1992，同上文)所確定三維結構的分析來確定底物_酶相互作用的位點。本發明還涉及如下所述的編碼本發明多肽的分離的多核苷酸所述多核苷酸在如本文定義的極低嚴緊度條件下，優選低嚴緊度條件下，更優選中等嚴緊度條件下，更優選中_高嚴緊度條件下，進一步更優選高嚴緊度條件下，最優選極高嚴緊度條件下與(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和子序列雜交(Sambrook等，1989，同上文)。在一個優選的方面，所述互補鏈是SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發明還涉及通過下述方式獲得的分離的多核苷酸(a)使DNA群體在極低、低、中等、中-高、高、或極高嚴緊度條件下與(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈雜交，且(b)分離編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的雜交多核苷酸。在一個優選的方面，所述互補鏈是SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構建體本發明還涉及核酸構建體，其包含與一種或多種(數種)控制序列可操作連接的本發明的分離的多核苷酸，所述控制序列指導編碼序列在合適的宿主細胞中在與這些控制序列相容的條件下表達。可以對編碼本發明多肽的分離的多核苷酸進行多種方式的操作以便於表達所述多肽。取決於表達載體，在插入載體之前對多核苷酸的序列進行操作可能是理想的或者必要的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域公知的。控制序列可以是合適的啟動子序列，啟動子序列是被宿主細胞所識別來表達編碼本發明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子序列可以是任何在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，而且可以從對宿主細胞而言為同源或異源的胞外或胞內多肽獲得。適於指導本發明的核酸構建體的轉錄，尤其是在細菌宿主細胞中轉錄的啟動子的例子是獲自大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌a-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌a_澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、以及原核P_內醯胺酶基因的啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，禾口tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。ScientificAmerican,1980，242:74-94中〃Usefulproteinsfromrecombi薩tbacteria"禾口Sambrook等，1989(同上)中描述了其它啟動子。適於在絲狀真菌宿主細胞中指導本發明的核酸構建體的轉錄的啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、米赫根毛黴(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性a-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性a-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、米赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴磷酸丙糖異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、裡氏木黴P-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶1、裡氏木黴纖維二糖水解酶11、裡氏木黴內切葡聚糖酶1、裡氏木黴內切葡聚糖酶n、裡氏木黴內切葡聚糖酶ni、裡氏木黴內切葡聚糖酶iv、裡氏木黴內切葡聚糖酶v、裡氏木黴木聚糖酶i、裡氏木黴木聚糖酶n、裡氏木黴e-木糖苷酶；以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性a-澱粉酶基因和米麴黴磷酸丙糖異構酶基因的啟動子的雜合體)；以及它們的突變、截短和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子是從釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得的。對酵母宿主細胞有用的其他啟動子在Romanos等，1992，Yeast8:423-488中有記載。控制序列還可以是合適的轉錄終止子序列。終止子序列是被宿主細胞識別來終止轉錄的序列。終止子序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的3'末端。任何可在所選的宿主細胞中發揮功能的終止子都可以用於本發明。優選的用於絲狀真菌宿主細胞的終止子是從米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的。優選的用於酵母宿主細胞的終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得的。對酵母宿主細胞有用的其他終止子在Romanos等，1992(同上)中有記載。控制序列也可以是合適的前導序列，前導序列是mRNA中的一種不被翻譯的區域，它對於宿主細胞進行的翻譯而言是重要的。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5'末端。任何可在所選擇的宿主細胞中發揮功能的前導序列都可以用於本發明。優選的用於絲狀真菌宿主細胞的前導序列是從米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴磷酸丙糖異構酶的基因獲得的。用於酵母宿主細胞的前導序列是從釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a_因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛_3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得的。控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，聚腺苷酸化序列是一段與核苷酸序列的3'末端可操作連接的序列，轉錄後被宿主細胞所識別，作為向被轉錄的mRNA添加聚腺苷酸殘基的信號。任何可在所選擇的宿主細胞中發揮功能的聚腺苷酸化序列都可以用於本發明。優選的用於絲狀真菌宿主細胞的聚腺苷酸化序列是從米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴a-葡糖苷酶的基因獲得的。Guo禾口Sherman,1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990記載了在酵母宿主細胞中有用的聚腺苷酸化序列。控制序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼的胺基酸序列連接於多肽的氨基末端，並引導被編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5'端可以固有地包含信號肽編碼序列，該序列天然地以符合翻譯閱讀框的方式連接於編碼序列中編碼分泌型多肽的區段。或者，編碼序列的5'端可以包含對該編碼序列而言為外源的信號肽編碼序列。在編碼序列天然地不包含信號肽編碼序列的場合，可能需要外源信號肽編碼序列。或者，可以簡單地用外源信號肽編碼序列取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，引導被表達的多肽進入所選的宿主細胞的分泌途徑，即分泌到培養基中的任何信號肽編碼序列都可以用於本發明。對細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從芽孢桿菌NCIB11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶、地衣芽孢桿菌P_內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌prsA的基因獲得的信號肽編碼序列。Simonen禾PPalva，1993，MicrobiologicalReviews57:109-137記載了其它信號肽。對絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶、特異腐質黴內切葡聚糖酶V、和疏棉狀腐質黴脂肪酶的基因獲得的信號肽編碼序列。對酵母宿主細胞有用的信號肽是從釀酒酵母a-因子和釀酒酵母轉化酶獲得的。其它有用的信號肽編碼序列在Romanos等，1992，同上文中有記載。在一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1_15或者由SEQIDNO:2的胺基酸1-15組成。在另一個優選的方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1-45或者由SEQIDNO:1的核苷酸1_45組成。控制序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位於多肽的氨基末端的胺基酸序列。所得的多肽被稱為酶原(proenzyme)或原多肽(propolyp印tide)(或者在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前肽通常是沒有活性的，並且通過將前肽從原多肽中催化或自催化切割出來可以轉化為成熟的活性多肽。前肽編碼序列可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母a-因子、米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶的基因獲得(W095/33836)。在信號肽和前肽序列都存在於多肽氨基末端的場合，前肽序列位於多肽氨基末端的相鄰位置，而信號肽序列位於前肽序列的氨基末端的相鄰位置。添加這樣的調控序列可能也是理想的該序列容許相對於宿主細胞的生長調節多肽的表達。調控系統的例子有導致基因的表達響應於化學或物理剌激(包括調控性化合物的存在)而開啟或關閉的那些調控系統。原核系統中的調控系統包括lac、tac、和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調控序列。其他調控序列的例子有使基因能夠擴增的調控序列。在真核系統中，這些調控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴增的二氫葉酸還原酶基因，和在重金屬存在下被擴增的金屬硫蛋白基因。在這些場合，編碼多肽的核苷酸序列將與調控序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及包含本發明的多核苷酸、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體。可以將本文中描述的各種核酸和控制序列連接起來產生重組表達載體，後者可包括一個或多個(數個)便利的限制性位點以便於在這些位點上插入或替換編碼多肽的核苷酸序列。或者，可以將核苷酸序列或包含該序列的核酸構建體插入合適的表達用載體來表達本發明的多核苷酸序列。在生成表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中使得該編碼序列與合適的表達用控制序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何可便利地進行重組DNA程序並且能夠帶來核苷酸序列的表達的載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇通常將取決於載體與該載體要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性的或者閉合環狀的質粒。所述載體可以是自主複製的載體，即作為染色體外實體存在，其複製不依賴於染色體複製的載體，例如質粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可含有任何用於保證自我複製的工具。或者，載體可以是這樣的載體，當它被導入宿主細胞時，整合到基因組中並隨同它整合到其中的染色體一起複製。另外，可以使用單一的載體或質粒，或兩個或更多個共同包含要導入宿主細胞基因組的總DNA的載體或質粒，或者轉座子。本發明的載體優選含有一個或多個(數個)選擇標記，這些標記容許容易地選擇經過轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇標記是這樣的基因，其產物可提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性，對營養缺陷型的原養性，等等。細菌選擇標記的例子有來自枯草芽孢桿菌或者地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的標記。用於酵母宿主細胞的合適標記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、bar(草銨膦乙醯轉移酶)、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷轉移酶)，和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及它們的等同物。優選用於麴黴細胞的是構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因，以及吸水鏈黴菌(Str印tomyceshygroscopicus)的bar基因。本發明的載體優選包含容許載體整合到宿主細胞的基因組或者容許載體在細胞中不依賴基因組自主複製的元件。為了整合到宿主細胞基因組中，載體可能依賴多核苷酸的編碼多肽的序列或者載體的任何其它元件來通過同源或異源重組整合到基因組中。或者，載體可含有附加的核苷酸序列，用來指導通過同源重組在染色體上的精確位置整合到宿主細胞的基因組中。為了增加在精確位置上整合的機率，整合元件優選應含有足夠數目的與相應靶序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10，000個鹼基對，優選400-10，000個鹼基對，最優選800-10，000個鹼基對，以提高同源重組的概率。整合元件可以是任何與宿主細胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼的或者編碼的核苷酸序列。此外，載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。為了自主複製，載體可進一步包含複製起點，該起點使得載體能夠在所討論的宿主細胞中自主地複製。複製起點可以是在細胞中發揮功能的任何介導自主複製的質粒複製子。術語"複製起點"或"質粒複製子"在本文中定義為使質粒或載體能夠在體內複製的核苷酸序列。細菌複製起點的實例有容許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，以及容許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMP1的複製起點。用於在酵母宿主細胞中的複製起點的例子有2微米複製起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，以及ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的複製起點的例子有AMA1和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175;W000/24883)。AMA1基因的分離，以及包含該基因的質粒或載體的構建，可以根據WO00/24883中公開的方法來實現。可以向宿主細胞中插入本發明多核苷酸的多於一個拷貝以增加基因產物的生產。可以通過下述方法獲得多核苷酸的拷貝數的增加向宿主細胞基因組中插入至少一個額外拷貝的序列；或者納入伴隨該多核苷酸的可擴增選擇標記基因，由此通過在合適的選擇劑的存在下培養細胞，可以選擇出含有擴增拷貝數的選擇標記基因，從而也就含有更多拷貝的所述多核苷酸的細胞。用於連接上述元件來構建本發明的重組表達載體的程序是本領域技術人員公知的(參見例如Sambrook等，1989，同上文)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，它們包含本發明的分離的多核苷酸，有利地用於多肽的重組生產中。將包含本發明多核苷酸的載體導入宿主細胞使得載體作為染色體整合子或者如前文所述的自複製的染色體外載體被保持。術語"宿主細胞"涵蓋親本細胞的任何因複製過程中的突變而與親本細胞不同的後代。宿主細胞的選擇在很大程度上將取決於編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是任何在本發明的多肽的重組生產中有用的細胞，例如原核生物或真核生物。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限於芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限於大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或尿枝原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。本發明的實踐中可以使用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限於嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌細胞。在一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，所述細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞也可以是任何鏈球菌屬細胞。本發明的實踐中可以使用的鏈球菌屬細胞包括但不限於似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞也可以是任何鏈黴菌屬細胞。本發明的實踐中可以使用的鏈黴菌屬細胞包括但不限於不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍色鏈黴菌、灰色鏈黴菌和淺青紫鏈黴菌細胞。在一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是不產色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是除蟲鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是天藍色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是灰色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，所述細菌宿主細胞是淺青紫鏈黴菌細胞。向芽孢桿菌屬細胞中導入DNA可以通過例如原生質體轉化(參見例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)、使用感受態細胞(參見例如Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823—829，或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)、通過電穿孑L(參見例如Shigekawa禾口Dower，1988，Biotechniques6:742—751)，或通過接合(參見例如Koehler禾PThorne，1987JournalofBacteriology169:5271—5278)來實現。向大腸桿菌細胞中導入DNA可以通過例如原生質體轉化(參見例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見例如Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)來實現。向鏈黴菌屬細胞中導入DNA可以通過例如原生質體轉化和電穿孔來實現(參見例如Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)、接合(參見例如Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)、或轉導(參見例如Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)來實現。向假單胞菌屬細胞中導入DNA可以通過例如電穿孔(參見例如Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)、或接合(參見例如Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)來實現。向鏈球菌屬細胞中導入DNA可以通24過例如天然感受態(參見例如Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32:1295—1297)、原生質體轉化(參見例如Catt和Jollick，1991，Microbios.68:189-2070)、電穿孔(參見例如Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)、或接合(參見例如Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)來實現。儘管如此，本領域已知的任何用於將DNA導入宿主細胞的方法都可以使用。宿主細胞也可以是真核生物，諸如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。在一個優選的方面，所述宿主細胞是真菌細胞。本文所用的"真菌"包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheF皿gi，第八版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定義的)，禾口卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上文，第171頁引用的)等門，以及全部有絲分裂包子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，同上文)。在一個更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。本文所用的"酵母"包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內孢黴目(Endomycetales))、產擔子孢子囊酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬於半知菌類(FungiImperfecti)(芽包糹岡(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在將來可能有所改變，為了本發明的目的，酵母將如BiologyandActivitiesofYeast(Ski皿er，F.A.，Passmore，S.M.禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述加以定義。在一個進一步更優選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬細胞。在一個最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍黴(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等，1995，同上文定義)。絲狀真菌的一般特徵在於由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲壁。營養生長是通過菌絲延伸，且碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的芽殖，且碳分解代謝可以是發酵的。在一個進一步更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞枝頂孢黴屬、麴黴屬、短梗黴屬、煙管黴屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子屬、鬼傘屬(Copri皿s)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、網孢菌屬、鐮孢屬、腐質黴屬、梨孢菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸黴屬、栓菌屬(Trametes)、或木黴屬細胞。在一個更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另一個更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、幹擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、幹擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispa皿ocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpa皿icola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Copri皿scinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、米赫毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、產紫青黴、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌芹側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢殼、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、雜色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴細胞。真菌細胞可以用包括方式本身已知的原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生的方法來加以轉化。用於麴黴屬和木黴屬宿主細胞轉化的合適方法描述於EP238023禾口Yelton等，1984，ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesUSA81:1470-1474。Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述了轉化鐮孢屬的種的合適方法。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.編的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology，第194巻，第182-187頁，AcademicPress,NewYork;Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163;禾口Hi騰n等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所述的方法轉化。生產方法本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，所述方法包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養細胞，所述細胞以野生型形式可產生所述多肽；和(b)回收該多肽。在一個優選的方面，所述細胞屬於梭孢殼屬。在一個更優選的方面，所述細胞是土生梭孢殼。在一個更優選的方面，所述細胞是土生梭孢殼NRRL8126。本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，所述方法包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養如本文所述的重組宿主細胞，和(b)回收所述多肽。本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，所述方法包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養如本文所述的重組宿主細胞，其中該宿主細胞包含在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中具有至少1個突變的突變核苷酸序列，其中所述突變的核苷酸序列編碼包含SEQIDNO:2的成熟多肽或由其組成的多肽；和(b)回收所述多肽。在本發明的生產方法中，用本領域中公知的方法在適於多肽產生的營養培養基中培養細胞。例如，可在實驗室或工業發酵罐中通過搖瓶培養、和小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態發酵)培養細胞，這在合適的培養基中和使多肽能被表達和/或分離的條件下進行。用本領域中已知的程序，在含有碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適的培養基可從商業供應商得到或根據公開的組成(例如，於美國典型培養物保藏中心的目錄中)製備。如果多肽分泌到營養培養基中，則可直接從培養基中回收該多肽。如果該多肽不被分泌，則可從細胞裂解產物中回收它。可使用本領域中已知的、對所述多肽為特異性的方法檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，可如本文所述地使用酶測定法確定多肽的活性。可以使用本領域已知的方法回收得到的多肽。例如，可以通過常規方法，包括，但不限於，離心、過濾、抽提、噴霧乾燥、蒸發或沉澱將多肽從營養培養基中回收出來。本發明的多肽可通過本領域中已知的多種方法進行純化，所述方法包括，但不限於，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE、或萃取(見，例如，ProteinPurificationJ._C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)，來獲得基本上純的多肽。植物本發明還涉及包含編碼本發明具有纖維素分解增強活性的多肽的分離的多核苷酸而以可回收量表達和產生所述多肽的植物，例如轉基因植物、植株部分、或植物細胞。所述多肽可從植物或植株部分回收。或者，可以將含有重組多肽的植物或植株部分直接用於改善食物或飼料的質量，例如提高營養價值、可口性、和流變性，或破壞抗營養因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例有禾草(grasses)，例如草地草(藍草，早熟禾屬(Poa));草料草，諸如羊矛屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);溫帶草(temperategrass)，例如剪股穎屬(Agrostis);和穀類(cereals)，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。雙子葉植物的實例有菸草、豆科作物諸如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆、和大豆，和十字花科植物(十字花科(Brassicaceae))，諸如花椰菜、油菜籽(rapeseed)、和十分近緣的模式生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植株部分的實例有莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、和塊莖，以及構成這些部分的單獨組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、脈管組織、分生組織。特殊的植物細胞小室，諸如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細胞質也認為是植株部分。此外，任何植物細胞，無論組織來源如何，也認為是植株部分。類似的，植株部分，諸如有利於本發明應用而分離的特定組織和細胞也認為是植株部分，例如胚、胚乳、糊粉、和種皮。這些植物、植株部分、和植物細胞的後代也包括在本發明範圍之內。表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞的構建可根據本領域已知的方法進行。簡而言之，植物或植物細胞的構建可通過將一種或多種(數種)編碼本發明多肽的表達構建體摻入植物宿主基因組或葉綠體基因組中並將所得的經修飾植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞來進行。表達構建體便利地是核酸構建體，它含有編碼本發明多肽的多核苷酸且該多核苷酸與所選定的植物或植株部分中表達此核苷酸序列所需的適當調控序列可操作地連接。而且，表達構建體可包含用於鑑定整合了該表達構建體的宿主細胞的選擇標記，和將此構建體導入所討論的植物所需要的DNA序列(後者取決於所用的DNA導入方法)。例如，根據希望在何時、在何處、和怎樣表達多肽來決定調控序列的選擇，所述調控序列諸如啟動子和終止子序列和任選的信號或轉運序列。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成性的或可誘導的，或者是發育、階段、或組織特異性的，基因產物可以靶27向特定組織或植株部分諸如種子或葉。調控序列在例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506有描述。對於組成性表達，可使用35S-CaMV、玉蜀黍遍在蛋白1、和稻肌動白l啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294;Christensen等，1992，PlantMol.Biol.18:675-689;Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissues)諸如種子、馬鈴薯i央莖、和果實(Edwards和Coruzzi，1990，AnnRevGenet24:275-303)，或來自於代謝庫(metabolicsinktissues)組織諸如分生組織(Ito等，1994，PlantMolBiol24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白(prolamin)、球蛋白、或清蛋白啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來自蠶豆(Viciafaba)豆球蛋白B4和未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711)，來自種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜(Brassican即us)的貯藏蛋白n即A啟動子，或者本領域已知的任何其它種子特異啟動子，例如W091/14772中所述。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子，諸如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或者傷口誘導性啟動子諸如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣，啟動子可通過非生物處理例如溫度、乾旱、或鹽度變化來誘導，或通過外源施加能激活啟動子的物質，例如乙醇、雌激素、植物激素諸如乙烯、脫落酸和赤黴酸以及重金屬來誘導。還可使用啟動子增強子元件以在植物中獲得本發明多肽的更高表達。例如，啟動子增強子元件可以是位於啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如Xu等，1993，同上中公開了利用水稻肌動蛋白1基因的第一個內含子來增強表達。選擇標記基因和表達構建體的任何其它部分可選自本領域中可利用的那些。根據本領域已知的常規技術將核酸構建體摻入植物基因組中，包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化(biolistictransformation)、禾口電穿孑L(Gasser等，1990，Science244:1293;Potrykus，1990，Bio/Technology8:535;Shimamoto等，1989，Nature338:274)。目前，根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumt咖efaciens)介導的基因轉移是用於產生轉基因雙子葉植物的首選方法(其綜述可參見Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且也可用於轉化單子葉植物，儘管這些植物常使用其它轉化方法。目前，選擇用於產生轉基因單子葉植物的方法是粒子轟擊(以轉化用DNA包被的金或鎢微粒)胚的愈傷組織或發育中的胚(Christou，1992，PlantJournal2:275-281;Shimamoto，1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等，1992，Bio/Technology10:667-674)。一種備選的單子葉植物轉化方法是基於原生質體轉化來進行，如0mirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-428中所描述的。在轉化後，根據本領域熟知的方法選出已摻入了表達構建體的轉化體，並使其再生成為完整植株。通常轉化程序設計成在再生期間或在後代中選擇性清除選擇基因，例如28通過兩種單獨T-DNA構建體的共轉化或通過特異重組酶進行的選擇基因的位點特異切除來進行。本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，所述方法包括(a)在有利於產生所述多肽的條件下，培養轉基因植物或植物細胞，所述植物或植物細胞包含編碼具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。纖維素分解增強活性的去除或降低本發明還涉及產生親本細胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼本發明的多肽的多核苷酸序列或其部分，結果生成當在同樣條件下培養時較該親本細胞產生較少的所述多肽的突變體細胞。突變體細胞可以通過使用本領域公知的方法，例如插入、破壞、替換或缺失，降低或消除編碼本發明多肽的核苷酸序列的表達，來加以構建。在一個優選的方面，所述核苷酸序列是失活的。要加以修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區或者編碼區中對活而言必需的部分，或者編碼區表達所需的調控元件。此類調控或控制序列的例子可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響核苷酸序列表達的部分。其他用於可能的修飾的控制序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄活化子。核苷酸序列的修飾或失活可以通過對親本細胞進行誘變並選擇該核苷酸序列的表達已降低或消除的突變細胞來進行。誘變可以是特異性的或者是隨機性的，可以使用例如合適的物理或化學誘變劑、使用合適的寡核苷酸、或者通過使DNA序列經受PCR生成的誘變來實施。此外，可以使用這些誘變劑的任何組合來實施誘變。適於本目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、以及核苷酸類似物。當使用此類作用劑時，誘變通常如下進行將要誘變的親本細胞在所選擇的誘變劑存在下在合適的條件下溫育，並篩選和/或選擇展現所述基因的表達降低或無表達的突變細胞。核苷酸序列的修飾或失活可通過在基因中或在其轉錄或翻譯所需要的調控元件中引入、替換、或去除一個或多個(數個)核苷酸來進行。例如，可插入或去除核苷酸從而導致終止密碼子的引入、起始密碼子的去除、或可讀框的改變。這些修飾或滅活可根據本領域已知的方法通過定點誘變或PCR產生誘變來完成。雖然，原則上，修飾可在體內進行，即直接在表達要修飾的核苷酸序列的細胞上進行，優選的是如下文例示的那樣在體外進行修飾。便利的消除或降低細胞核苷酸序列表達的方法的一個實例是基於基因替換、基因缺失、或基因破壞技術。例如，在基因破壞方法中，將對應於內源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產生缺陷的核酸序列，然後將其轉化到親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，缺陷的核酸序列替換內源核苷酸序列。可能理想的是，缺陷的核苷酸序列還編碼可用於選擇核苷酸序列已經被修飾或破壞了的轉化體的標記。在一個特別優選的方面，利用選擇標記，諸如用本文所述的那些，來破壞核苷酸序列。或者，核苷酸序列的修飾或失活可通過已建立的反義或RNAi技術使用與核苷酸29序列互補的序列來進行。更具體的說，細胞核苷酸序列的表達可通過引入與基因核苷酸序列互補的序列來降低或消除，其中該引入的序列可在細胞中轉錄並能與細胞中所產生的mRNA發生雜交。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA發生雜交的條件下，所翻譯蛋白質的量由此被降低或消除。本發明還涉及在編碼所述多肽的核苷酸序列或其控制序列中包含破壞或缺失的親本細胞的突變細胞，這導致該突變細胞與親本細胞相比產生的所述多肽較少或不產生多肽。這樣構建的多肽缺陷的突變細胞作為宿主細胞用於天然和/或異源多肽的表達特別有用。因此，本發明還涉及生產天然或異源多肽的方法，所述方法包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養突變細胞；並(b)回收所述多肽。術語"異源多肽"在本文中定義為對宿主細胞來說不是天然的多肽，經過修飾改變了天然序列的天然蛋白質，或是經過重組DNA技術對宿主細胞的處理從而使其表達發生了量變的天然蛋白質。在另一個方面，本發明涉及通過發酵生成本發明多肽和感興趣的蛋白質產物二者的細胞來生產基本上沒有纖維素分解增強活性的蛋白質產物的方法，其中在發酵完成之前、當中、或之後往發酵液中加入有效量的可抑制纖維素分解增強活性的試劑，並從發酵液中回收目的產物，以及任選地對回收產物進行進一步純化。在另一個方面，本發明涉及通過下列步驟來生產基本上沒有纖維素分解增強活性的蛋白質產物的方法，在允許產物表達的條件下培養細胞，並對所得培養液進行PH和溫度聯合處理以便顯著地降低纖維素分解增強活性，並從培養液中回收產物。或者，pH和溫度聯合處理可對從培養液中回收的酶製備物進行。任選地，pH和溫度聯合處理增強可與纖維素分解增強抑制劑處理結合使用。根據本發明的這個方面，可能消除至少60%、優選至少75%、更優選至少85%、仍更優選至少95%、且最優選至少99%的纖維素分解增強活性。通過使用這種方法可實現纖維素分解增強活性的完全消除。優選地，在pH為2-4或9-11和至少60-7(TC的溫度範圍內進行足夠時間的pH和溫度聯合處理以達到預期的效果，其中30-60分鐘通常是足夠的。可使用本領域已知的方法進行培養和目的產物的純化。本發明的產生基本上沒有纖維素分解增強性的產物的方法在真核多肽，尤其是真菌蛋白質例如酶的生產中特別令人感興趣。所述酶可以選自，例如，澱粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶、或植物細胞壁降解酶。此類酶的例子包括氨肽酶、澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、P_半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卣素過氧化物酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉穀氨醯胺酶、或木聚糖酶。纖維素分解增強性缺陷的細胞也可以用來表達有藥用意義的異源蛋白質如激素、生長因子、和受體等。應當理解，術語"真核多肽"不但包括天然多肽，還包括通過胺基酸取代、缺失或添加或其他這類修飾形式進行了修飾而提高活性、熱穩定性、pH耐受性等的多肽，例如酶。30在一個進一步的方面，本發明涉及一種基本上沒有纖維素分解增強活性的蛋白質產物，其是通過本發明的方法產生的。抑制多肽表達的方法本發明還涉及抑制細胞中多肽表達的方法，所述方法包括對細胞施用或者在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發明的多核苷酸的子序列。在一個優選的方面，所述dsRNA的長度為大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個雙鏈體核苷酸。所述dsRNA優選是小幹擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優選的方面，所述dsRNA是用於抑制轉錄的小幹擾RNA(siRNA)。在另一個優選的方面，所述dsRNA是用於抑制轉錄的微RNA(miRNA)。本發明還涉及這樣的雙鏈RNA(dsRNA)分子，它們包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的一部分，用於在細胞中抑制多肽表達。雖然本發明不限於任何具體的作用機制，dsRNA可以進入細胞並導致具有相似或相同序列的包括內源mRNA在內的單鏈RNA(ssRNA)的降解。當細胞被暴露於dsRNA時，來自同源基因的mRNA通過一種稱為RNA幹擾(RNAi)的過程被選擇性地降解。本發明的dsRNA可以用於基因沉默性治療(gene-silencingther即eutics)。在一個方面，本發明提供使用本發明的dsRNA來選擇性降解RNA的方法。該方法可以在體外、離體或體內實施。在一個方面，dsRNA分子可用來在細胞、器官或動物中生成功能喪失突變。製備和使用dsRNA用於選擇性降解RNA的方法是本領域中公知的，參見例如美國專利6，506，559、美國專利6，511，824、美國專利6，515，109、和美國專利6，489，127。組合物本發明還涉及包含本發明多肽的組合物。優選的是，組合物是富集了這類多肽的。術語"富集"是指組合物的纖維素分解增強活性已經被增加，例如以至少1.1的富集因子增加。所述組合物可包含本發明的多肽作為主要組分，例如單一組分組合物。或者，組合物還可含有多種酶活性，諸如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酷酶、a_半乳糖苷酶、13-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、a-葡糖苷酶、|3-葡糖苷酶、滷素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶、或木聚糖酶。在一個優選的方面，所述組合物包含一種或多種如本文所述的纖維素分解酶和本發明的多肽。通過例如下列微生物可產生其它酶，例如屬於麴黴屬的微生物，優選棘孢麴黴、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴、或米麴黴；鐮孢屬，優選杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、或鑲片鐮孢；腐質黴屬，優選特異腐質酶或疏棉狀腐質黴；或木黴屬，優選哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴、或綠色木黴。可根據本領域已知的方法來製備多肽組合物，並且它可以是液體或乾燥組合物的形式。例如，多肽組合物可以是顆粒或微粒的形式。可以根據本領域已知的方法對要包含在組合物中的多肽加以穩定化。下文給出了本發明多肽組合物的優選用途的實例。本發明多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件可根據本領域已知的方法來確定。含纖維素材料的加工方法本發明還涉及降解或轉化含纖維素材料的方法，所述方法包括在有效量的本發明的具有纖維素分解增強活性的多肽存在下，用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，其中與不存在具有纖維素分解增強活性的多肽時相比，具有纖維素分解增強活性的多肽的存在增加所述含纖維素材料的降解。本發明還涉及用於產生發酵產物的方法，所述方法包括(a)在有效量的本發明的具有纖維素分解增強活性的多肽存在下，用有效量的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中與沒有所述具有纖維素分解增強活性的多肽存在時相比，所述具有纖維素分解增強活性的多肽的存在增加所述含纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發酵微生物發酵步驟(a)的經糖化的含纖維素材料以產生發酵產物；和(c)從發酵中回收發酵產物。本發明的方法可以用來將含纖維素材料例如木素纖維素水解(糖化)成可發酵糖，並將可發酵糖轉化為許多有用的物質例如化學品和燃料。從含纖維素材料生產期望的發酵產品通常涉及預處理、酶促水解(糖化)和發酵。本發明的含纖維素材料的加工可以使用本領域已知的方法來完成。此外，本發明的方法可以使用任何為了依照本發明運行而配置的生物質加工裝置來實現。單獨或同時進行的水解(糖化)和發酵包括，但不限於單獨水解和發酵(SHF)、同時糖化和發酵(SSF)、同時糖化和共發酵(SSCF)、混合水解和發酵(hybridhydrolysisandfermentation,HHF)、SHCF(單獨水解和共發酵)、HHCF(混合水解和發酵)、及直接微生物轉化(匿C)。本文中應當理解，本領域中任何包括預處理、酶促水解(糖化)、發酵或它們的組合的方法都可用於實施本發明的方法。常規裝置可以包括補料分批攪拌反應器、分批攪拌反應器、帶超濾的連續流動攪拌反應器、和/或連續活塞流動柱反應器(FernandadeCastilhosCorazza，Fl6vioFariadeMoraes，GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel，2003，Optimalcontrolinfed—batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33_38;Gusakov，A.V.禾口Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、碾磨反應器(Ryu，S.K.禾PLee，J.M.，1983，Bioco読rsionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor，Biotechnol.Bioeng.25:53-65)、或具有電磁場誘發的強烈攪拌的反應器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，0.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,A卯l.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應器類型包括，例如，用於水解和/或發酵的流化床型、厭氧汙泥床(upflowblanket)型、固定化型、以及擠出機型反應器。預處理.在本發明的方法的實施中，本領域已知的任何預處理方法都可以用來破壞含纖維素材料的植物細胞壁組分。在預處理之前還可以使用本領域已知的方法對含纖維素材料進行預浸泡、潤溼、或調製(conditioning)。常規的預處理包括但不限於蒸汽預處理(有或沒有爆破)、稀酸預處理、熱水預處理、石灰預處理、溼氧化、溼爆破、氨纖維爆石皮(ammoniafiberexplosion)、有機溶劑予頁處理(organosolvpretreatment)、和生物預處理。其它預處理包括超聲、電穿孔、微波、超臨界0)2、超臨界1120、和氨滲濾(ammoni即ercolation)。可以在水解和/或發酵之前預處理含纖維素材料。預處理優選在水解之前進行。或者，預處理可以和水解同時進行，諸如在用一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性處理含纖維素材料以釋放可發酵糖如葡萄糖和/或麥芽糖的同時進行預處理。在大多數情況下預處理步驟本身會導致一些生物質轉化成可發酵糖(即使沒有酶存在)。蒸汽預處理.在蒸汽預處理中，將含纖維素材料加熱以破壞植物細胞壁組分，包括木質素、半纖維素、和纖維素，以使得纖維素和其它部分如半纖維素(hemicellulase)暴露於酶。使纖維素材料通至或通過反應容器，在那裡噴射蒸汽以升溫到需要的溫度和壓力，並在其中保持需要的反應時間。蒸汽預處理優選在140-23(TC、更優選160-20(TC、最優選170-19(TC進行，其中最優的溫度範圍取決於化學催化劑的添加。蒸汽預處理的停留時間優選1-15分鐘、更優選3-12分鐘、最優選4-10分鐘，其中最優的停留時間取決於溫度範圍和化學催化劑的添加。蒸汽預處理容許相對較高的固形物載量，使得含纖維素材料在預處理過程中一般僅是輕微潮溼的。蒸汽預處理通常與預處理後對材料的爆破性出料(explosivedischarge)相結合，後者被稱為蒸汽爆破(steamexplosion)，即將材料急速瞬時置於大氣壓和湍流下，以通過碎裂作用增加暴露的表面積(Duff和Murray,1996，BioresourceTechnology855:1-33;Galbe禾卩Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國專利申請20020164730)。在蒸汽預處理之前往往添加催化劑如H2S04或S02(典型地為0.3_3%w/w)，催化劑可減少時間和溫度，增加收率，以及改善酶促水解(Ballesteros等，2006，A卯l.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。化學預處理術語"化學預處理"是指任何可促進纖維素、半纖維素和/或木質素的分離和/或釋放的化學預處理。合適的化學預處理過程的例子包括稀酸預處理、石灰預處理、溼氧化、氨纖維/冷凍爆破(AFEX)、氨滲濾(APR)、和有機溶劑預處理。在稀酸預處理中，將含纖維素材料與稀酸，通常是H2S04，以及水混合形成漿液，蒸汽加熱到希望的溫度，然後經過一段停留時間瞬時變化到大氣壓。稀酸預處理可以用多種反應器設計來實施，例如活塞流動反應器、逆流反應器、或連續逆流收縮床反應器(Duff和Murray,1996，同上文；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以採用數種鹼性條件下的預處理方法。這些鹼性預處理包括，但不限於石灰預處理、溼氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆破(AFEX)。石灰預處理用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨在85-15(TC的低溫下進行，停留時間為1小時至數日(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966;Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。W02006/110891、W02006/11899、W02006/11900和W02006/110901公開了使用氨的預處理方法。溼氧化是一種熱預處理，典型地在180-20(TC進行5-15分鐘，同時添加氧化劑如過氧化氫或氧過壓(Schmidt和Thomsen，1998，BioresourceTechnol.64:139-151;Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預處理優選在1-40%乾物質、更優選2-30%乾物質、最優選5-20%乾物質的條件下進行，並且經常通過添加鹼，如碳酸鈉來提高初始pH。溼氧化預處理方法的一種變化形式，稱為溼爆破(溼氧化和蒸汽爆破的結合)，可以處理高達30%的乾物質。在溼爆破中，在預處理過程中經過一定的停留時間後引入氧化劑。然後瞬間變化到大氣壓而終止預處理(W02006/032282)。氨纖維爆破(AFEX)涉及用液態或氣態的氨在中等溫度如90-10(TC和高壓如17-20巴的條件下處理含纖維素材料5-10分鐘，其中乾物質含量可高達60%(Goll即alli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014-2018)。有機溶劑預處理通過使用乙醇水溶液(40-60%乙醇)在160-20(TC萃取30_60分鐘來使含纖維素材料脫木質素(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。通常添加硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，大部分的半纖維素被去除。Schell等，2003，A卯l.Biochem.andBiotechnol.第105-108巻，第69-85頁和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686以及美國專利申請公布2002/0164730描述了其他合適的預處理方法的例子。在一個方面，化學預處理作為酸處理，更優選作為連續稀酸和/或弱酸(mildacid)處理來實施。所述酸通常是硫酸，但也可以用其它的酸，如乙酸、擰檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或它們的混合物。弱酸處理在優選1-5，更優選1-4，最優選1-3的pH範圍內進行。在一個方面，酸濃度在優選0.01-20wt%酸，更優選0.05-10wt%酸，進一步更優選O.l-5wt^酸，最優選0.2-2.0wt^酸的範圍。將所述酸與含纖維素材料接觸，並在一定溫度如160-20(TC，優選165-195t:的範圍內保持自若干秒到若干分鐘不等的時間，例如1秒至60分鐘。在另一個方面，預處理作為氨纖維爆破步驟(AFEX預處理步驟)來實施。在另一個方面，預處理在水漿液中進行。在優選的方面，含纖維素材料在預處理過程中以優選10-80wt%之間，更優選20-70wt%之間，最優選30-60wt%之間，諸如50wt%左右的量存在。經過預處理的含纖維素材料可以不予洗滌，或者可以用任何本領域已知的方法洗滌，例如用水洗滌。機械預處理術語"機械預處理"是指各類研磨(grinding)或粉碎(milling)(例如乾粉碎，溼粉碎或振動球粉碎(vibratoryballmilling))。物理預處理術語"物理預處理"是指任何可促進纖維素、半纖維素和/或木質素從含纖維素材料分離和/或釋放的預處理。例如，物理預處理可涉及輻射(例如微波輻射)、蒸汽處理/蒸汽爆破、溼熱分解作用，和它們的組合。物理預處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆破)。在一個方面，高壓是指在優選約300-約600psi，更優選約350-約550psi，最優選約400-約500psi的範圍，如450psi左右。在另一個方面，高溫意指約100-約30(TC，優選約140-約235t:範圍的溫度。在一個優選的方面，機械預處理在使用如上定義的高壓及高溫的分批過程式蒸汽噴射水解裝置系統(batch-process，steamgunhydrolyzersystem)中，如可獲自SundsDefibratorAB，Sweden的SundsHydrolyzer中進行。物理和化學聯合預處理可以既以物理方式又以化學方式處理含纖維素材料。例如，預處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。根據需要，物理預處理和化學預處理可以順序地或同時地進行。還可以包含機械預處理。於是，在一個優選的方面，對含纖維素材料進行機械、化學、或物理預處理，或它們的任何組合，來促進纖維素、半纖維素和/或木質素的分離和/或釋放。生物預處理術語"生物預處理"是指任何可促進纖維素、半纖維素和/或木質素從含纖維素材料分離和/或釋放的生物預處理。生物預處理技術可涉及施用溶木質素微生物(參見例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass，《HandbookonBioethanol-ProductionandUtilization》，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC，179-212;Ghosh禾卩Singh，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan，J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel，M.E.，Baker，J.0.禾口0verend，R.P.編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.禾口Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》，Sch印er，T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;01sson禾卩Hahn_Hagerdal，1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331，及Vallander禾口Eriksson,1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。MiL.在水解步驟，又稱糖化中，經過預處理的含纖維素材料被水解以將纖維素或者半纖維素降解成可發酵糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解以酶促方式進行，使用包含有效量的具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽的纖維素分解酶組合物。該組合物的酶組分也可以順序地添加。在本發明的方法中，纖維素分解酶組合物可以包含在將含纖維素材料加工成葡萄糖，或將半纖維素加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它們的聚合物，或如下所述的它們的衍生產物的加工中涉及的任何蛋白質。在一個方面，所述纖維素分解酶組合物包含內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、P_葡糖苷酶，或它們的組合。在另一個方面，所述纖維素分解酶組合物還包含一種或多種附加的用於改善含纖維素材料降解的酶活性。優選的附加酶有半纖維素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶、和/或角質酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶、或它們的混合物。纖維素分解酶組合物可以是單組分製備物，例如一種內切葡聚糖酶，多組分製備物，例如一種或多種內切葡聚糖酶，一種或多種纖維二糖水解酶；和一種或多種P-葡糖苷酶，或者多組分蛋白製備物與單組分蛋白製備物的組合。纖維素分解蛋白可在酸性、中性或鹼性pH範圍內具有活性，即，水解含纖維素材料。如上文所述，本發明中使用的纖維素分解蛋白可以是單組分製備物，即基本上不含其它纖維素分解性組分的組分。單個組分可以是重組組分，即通過克隆編碼該單個組分的DNA序列，然後用該DNA序列轉化細胞，並在宿主中表達而產生的(參見例如WO91/17243和WO91/17244)。宿主細胞可以是異源宿主(酶對宿主而言是外來的)或者宿主也可以是野生型宿主(酶對宿主而言是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發酵液中純化此類蛋白來加以製備。添加了有效量的具有纖維素分解增強活性的多肽的纖維素分解酶組合物可以是任何適合在本文所述的方法中使用的形式，例如含或不含細胞的粗發酵液、乾粉或顆粒劑、非粉化性顆粒劑(non-dustinggranulate)、液體、穩定化液體、或經保護的酶。顆粒劑例如可如在美國專利4，106，991和4，661，452中所公開的方法製備，並可任選使用本領域已知的方法進行包衣。例如，液體酶製備物可根據既定的方法通過加入穩定劑諸如糖、糖醇或其它多元醇、和/或乳酸或其它有機酸來穩定化。經保護的酶可根據EP238，216中所公開的方法製備。具有纖維素分解酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。術語"從...獲得"(或"獲自...")在此處意思是指所述酶可以是從天然產生所述酶作為天然酶的生物體分離而來的。"從...獲得"(或"獲自...")在此處還意指所述酶可以是在宿主生物體中重組產生的，其中重組產生的酶對於宿主生物體而言為天然的或外來的，或者具有經修飾的胺基酸序列，例如缺失、插入和/或取代了一個或多個胺基酸，即作為天然胺基酸序列的突變體和/或片段的重組產生的酶或通過本領域已知的核酸改組方法產生的酶。天然酶的意義中涵蓋天然變體，外來酶的意義中涵蓋通過化學或重組誘變，如通過定點誘變或改組獲得的變體。因此，纖維素分解性蛋白的經過化學修飾或蛋白質工程改造的突變體也可以用於本發明。在一個優選的方面，獲自給定來源的多肽是胞外分泌的。具有纖維素分解酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，諸如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬的具有纖維素分解酶活性的多肽，或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或尿枝原體屬的具有纖維素分解酶活性的多肽。在一個優選的方面，所述多肽是嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌的具有纖維素分解酶活性的多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種的具有纖維素分解酶活性的多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍色鏈黴菌、灰色鏈黴菌、或淺青紫鏈黴菌的具有纖維素分解酶活性的多肽。具有纖維素分解酶活性的多肽還可以是真菌多肽，更優選酵母多肽，如假絲酵母36屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬的具有纖維素分解酶活性的多肽；或者更優選絲狀真菌多肽，如枝頂孢黴屬、蘑菇屬、鏈格孢屬、麴黴屬、短梗黴屬、葡萄座腔菌屬、擬蠟菌屬、毛殼菌屬、金孢子菌屬、麥角屬、旋孢腔菌屬、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬、慄疫病菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、網孢菌屬、鐮孢屬、赤黴屬、全鞭毛蟲屬、腐質黴屬、耙菌屬、香菇屬、小球腔菌屬、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha、根毛黴屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸黴屬、木黴屬、Trichophaea、輪枝孢屬、小包腳菇屬、或小包腳菇屬的具有纖維素分解酶活性的多肽。在一個優選的方面所述多肽是卡爾酵母、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母的具有纖維素分解酶活性的多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢黴、棘孢麴黴、泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴、米麴黴、嗜角質金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpa皿icola、Chrysospori咖queenslandic咖、Chrysosporiumzonat咖、杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰色腐質酶、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、乳白耙菌、米赫毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、繩狀青黴、產紫青黴、黃孢平革菌、無色梭孢殼、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲|梭孢殼、Thielaviafimeti、小孢子梭孢殼、Thielavia0visp0r3、Thiel3vi即eruviMi3、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢殼、哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴、綠色木黴或Trichophaeasaccata的具有纖維素分解酶活性的多肽。在本發明的方法中，可以使用任何一種或多種內切葡聚糖酶，一種或多種纖維二糖水解酶，和/或一種或多種P_葡糖苷酶，以及其他纖維素分解性蛋白質，例如一種或多種半纖維素酶。可以用於本發明的細菌內切葡聚糖酶的例子包括但不限於解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內切葡聚糖酶(W091/05039;W093/15186;美國專利5，275，944;W096/02551;美國專利5，536，655，W000/70031，W005/093050);褐色喜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)內切葡聚糖酶III(W005/093050);和褐色喜熱裂孢菌內切葡聚糖酶V(W005/093050)。可以用於本發明的真菌內切葡聚糖酶的例子包括但不限於裡氏木黴內切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263;GenBank登錄號M15665);裡氏木黴內切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;GenBank登錄號M19373);裡氏木黴內切葡聚糖酶III(0kada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563;GenBank登錄號AB003694);裡氏木黴內切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249:584-591;GenBank登錄號Yl1113);和裡氏木黴內切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-228;GenBank登錄號Z33381);棘孢麴黴內切葡聚糖酶(0oi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884);川地麴黴(Aspergilliskawachii)內切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);金孢子菌屬菌種(Chrysosporiumsp.)CI(美國專利6，573，086;GenP印t登錄號AAQ38150);Corynascusheterothallicus(美國專利6，855，531;GenP印t登錄號AAY00844);Erwiniacarotovara內切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14);尖鐮孢內切葡聚糖酶(GenBank登錄號L29381);灰腐質黴thermoidea變體菌株內切葡聚糖酶(GenBank登錄號AB003107);Melanocarpusalbomyces內切葡聚糖酶(GenBank登錄號MAL515703);粗糙脈孢菌內切葡聚糖酶(GenBank登錄號XM—324477);馬瘤胃弧菌(Piromycesequi)(Eberhardt等，2000，Microbiology146:1999-2008;GenP印t登錄號CAB92325);米根黴(Rhizopusoryzae)(Moriya等，2003，J.Bacteriology185:1749-1756;GenBankTM登錄號AB047927，AB056667、AB056668);和土生梭孢殼(W02004/053039;EMBL登錄號CQ827970)。公開了使用依照HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino_acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316;以及HenrissatB.禾口BairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolasess，Biochem.J.316:695-696的分類法分類的超過13個糖基水解酶家族中的其它內切葡聚糖酶。在一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是裡氏木黴內切葡聚糖酶II(CEL5A)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是裡氏木黴內切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是嗜熱毀絲黴CEL7內切葡聚糖酶。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL12內切葡聚糖酶。在另一個優選的方面，所述內切葡聚糖酶是Chrysosporiumluck麗enseCEL45內切葡聚糖酶。在一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)是SEQIDN0:46的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶11(CEL5A)是SEQIDNO:48的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶III(CEL12A)是SEQIDNO:50的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)是SEQIDNO:52的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述嗜熱毀絲黴CEL7內切葡聚糖酶是SEQIDN0:54的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述ChrysosporiumlucknowenseCEL12內切葡聚糖酶是SEQIDNO:56的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述ChrysosporiumlucknowenseCEL45內切葡聚糖酶是SEQIDNO:58的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶1(CEL7B)由SEQIDNO:45的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶11(CEL5A)由SEQIDNO:47的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶III(CEL12A)由SEQIDNO:49的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)由SEQIDNO:51的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述嗜熱毀絲黴CEL7內切葡聚糖酶由SEQIDNO:53的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述ChrysosporiumlucknowenseCEL12內切葡聚糖酶由SEQIDNO:55的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述ChrysosporiumlucknowenseCEL45內切葡聚糖酶由SEQIDNO:57的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。所述裡氏木黴內切葡聚糖酶1(CEL7B)可根據Penttila等，1986，Gene45:253-263獲得。所述裡氏木黴內切葡聚糖酶11(CEL5A)可根據Saloheimo等，1988，Gene63:11-22獲得。所述裡氏木黴內切葡聚糖酶111(CEL12A)可根據0kada等，1988，A卯l.Environ.Microbiol.64:555-563獲得。所述裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)可根據Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-228獲得。所述嗜熱毀絲黴CEL7內切葡聚糖酶可根據WO95/024471獲得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL12內切葡聚糖酶可根據W02001/25468獲得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL45內切葡聚糖酶可根據WO2000/20555獲得。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是裡氏木黴纖維二糖水解酶1(CEL7A)。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲黴CEL7纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維二糖水解酶是土生梭孢殼纖維二糖水解酶。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A)是SEQIDNO:60的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個優選的方面，所述裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)是SEQIDNO:62的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶是SEQIDNO:64的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲黴CEL7纖維二糖水解酶是SEQIDNO:66的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶是SEQIDN0:68的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴纖維二糖水解酶1(CEL7A)纖維二糖水解酶由SEQIDN0:59的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)纖維二糖水解酶由SEQIDNO:61的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶由SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲黴CEL7纖維二糖水解酶由SEQIDNO:65的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶由SEQIDNO:67的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。所述裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A)可以依照Shoemaker等，1983，Biotechnology(N.Y.)l:691-696獲得。所述裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)可以依照Terri等，1987，Gene51:43-52獲得。所述具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶可以依照W02001/79507獲得。所述不具有纖維素結合域的嗜熱毀絲黴CEL7纖維二糖水解酶可以依照W02003/000941獲得。所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶可以依照WO2006/074435獲得。在另一個優選的方面，所述e-葡糖苷酶獲自米麴黴。在另一個優選的方面，所述e-葡糖苷酶獲自煙麴黴。在另一個優選的方面，所述e-葡糖苷酶獲自巴西青黴(Penicilliumbrasilia皿m)，例如巴西青黴IBT20888株。在另一個優選的方面，所述e-葡糖苷酶獲自黑麴黴。在另一個優選的方面，所述e-葡糖苷酶獲自棘孢麴黴。在一個更優選的方面，所述米麴黴13-葡糖苷酶是SEQIDNO:70的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述煙麴黴P-葡糖苷酶是SEQIDNO:72的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述巴西青黴P-葡糖苷酶是SEQIDN0:74的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述黑麴黴P-葡糖苷酶是SEQIDN0:76的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述棘孢麴黴P-葡糖苷酶是SEQIDN0:78的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個更優選的方面，所述米麴黴P-葡糖苷酶由SEQIDNO:69的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述煙麴黴P-葡糖苷酶由SEQIDN0:71的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述巴西青黴P-葡糖苷酶由SEQIDNO:73的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述黑麴黴P-葡糖苷酶由SEQIDNO:75的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個更優選的方面，所述棘孢麴黴P-葡糖苷酶由SEQIDNO:77的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。所述具有P-葡糖苷酶活性的米麴黴多肽可以根據WO2002/095014獲得。所述具有P-葡糖苷酶活性的煙麴黴多肽可以根據WO2005/047499獲得。所述具有P_葡糖苷酶活性的巴西青黴多肽可以根據WO2007/019442獲得。所述具有P_葡糖苷酶活性的黑麴黴多肽可以根據Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲得。所述具有P_葡糖苷酶活性的棘孢麴黴多肽可以根據Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲得。在另一個優選的方面，所述P-葡糖苷酶是SEQIDNO:80的米麴黴P-葡糖苷酶變體BG融合蛋白。在另一個優選的方面，所述米麴黴P-葡糖苷酶變體BG融合蛋白由SEQIDN0:79的多核苷酸編碼。在另一個優選的方面，所述P-葡糖苷酶是SEQIDNO:82的米麴黴P-葡糖苷酶融合蛋白。在另一個優選的方面，所述米麴黴P-葡糖苷酶融合蛋白由SEQIDNO:81的多核苷酸編碼。在一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽；P-葡糖苷酶；裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A);裡氏木黴纖維二糖水解酶11(CEL6A)，和裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽；P_葡糖苷酶；裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A)，裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)，裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)，並進一步包含(1)選自裡氏木黴內切葡聚糖酶II(CEL5A)、裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)、和裡氏木黴內切葡聚糖酶111(CEL12A)的一種或多種酶，和/或進一步包含(2)土生梭孢殼纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽；SEQIDN0:82的P-葡糖苷酶融合蛋白；具有SEQIDNO:60的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A)，具有SEQIDNO:62的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和具有SEQIDNO:46的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽；SEQIDN0:82的P-葡糖苷酶融合蛋白；具有SEQIDNO:60的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A)，具有SEQIDNO:62的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和具有SEQIDNO:46的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)，且進一步包含選自下組的一種或多種酶具有SEQIDN0:47的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶II(CEL5A)，具有SEQIDNO:51的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)，以及具有SEQIDNO:49的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽；SEQIDN0:82的P-葡糖苷酶融合蛋白；具有SEQIDNO:60的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶I(CEL7A)，具有SEQIDNO:62的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和具有SEQIDNO:46的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)，並進一步包含具有SEQIDNO:68的成熟多肽的土生梭孢殼纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的本發明的多肽；SEQIDN0:82的P-葡糖苷酶融合蛋白；具有SEQIDNO:60的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶1(CEL7A)，具有SEQIDNO:62的成熟多肽的裡氏木黴纖維二糖水解酶II(CEL6A)，以及具有SEQIDNO:46的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶I(CEL7B)，並進一步包含(l)選自具有SEQIDNO:47的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶II(CEL5A)、具有SEQIDNO:51的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)、和具有SEQIDN0:49的成熟多肽的裡氏木黴內切葡聚糖酶III(CEL12A)的一種或多種酶，和/或進一步包含(2)具有SEQIDNO:68的成熟多肽的土生梭孢殼纖維二糖水解酶。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含選自下組的一種或多種(數種)組分有內切葡聚糖酶活性的嗜熱毀絲黴CEL7多肽，有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多肽，有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽，有纖維二糖水解酶活性並具有纖維素結合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7多肽，和有纖維二糖水解酶活性而沒有纖維素結合域的嗜熱毀絲黴CEL7多肽。在另一個優選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含有內切葡聚糖酶活性的嗜熱毀絲黴CEL7多肽，有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多肽，有內切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽，有纖維二糖水解酶活性並具有纖維素結合域的CEL7多肽，和有纖維二糖水解酶活性而沒有纖維素結合域的嗜熱毀絲黴CEL7多肽。在另一個優選的方面，上述組合物還包含一種或多種(數種)具有P-葡糖苷酶的多肽。所述纖維素分解酶組合物還可以是商業製備物。適用於本發明的商業纖維素分解酶製備物的實例包括，例如，CELLUCLAST(可獲自NovozymesA/S)和NOVOZYM188(可獲自NovozymesA/S)。其它可用的商品化製備物包括CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(NovozymesA/S)，LAMINEX禾PSPEZYMECP(GenencorInt.)，ROHAMENT7Q69W(R6hmGmbH)，和FIBREZYME⑧LDI，FIBREZYMELBR，或VISCOSTAR⑧150L(DyadicInternational,Inc.，Jupiter，FL，USA)。可用於本發明的其它纖維素分解蛋白在下列文獻中有記載EP495，257、EP531，315、EP531，372、WO89/09259、WO94/07998、W095/24471、WO96/11262、WO96/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、WO2000/009707、WO2002/050245、WO2002/0076792、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利4，435，307、美國專利5，457，046、美國專利5，648，263、美國專利5，686，593、美國專利5，691，178、美國專利5，763，254、和美國專利5，776，757。本發明的方法中使用的纖維素分解蛋白可以通過利用本領域已知的程序，用含有合適的碳源及氮源和無機鹽的營養培養基發酵上文提到的微生物菌株來加以生產(參見例如Bennett,J.W.禾口LaSure，L.(編車葺)，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress,CA，1991)。合適的培養基可以從供應商獲得，或者可以依照公開的組成(例如美國典型培養物保藏中心的目錄中)來製備。適於生長和纖維素分解蛋白產生的溫度範圍及其它條件是本領域已知的(參見例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals，McGraw-HillBookCompany,NY，1986)。發酵可以是任何培養細胞而導致纖維素分解蛋白的表達或分離的方法。因此，發酵可以理解為包括在實驗室或工業發酵罐中實施的搖瓶培養、或小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)，其在合適的培養基中，在容許纖維素分解蛋白表達或分離的條件下進行。依照上述方法所得的纖維素分解蛋白可以從發酵培養基回收並通過如本文描述的常規程序加以純化。酶促水解優選在合適的含水環境中於本領域技術人員可容易確定的條件下進行。在一個優選的方面，水解在適合於一種或多種酶的活性的條件，即對一種或多種酶而言最適的條件下進行。水解可以作為補料分批或者連續過程進行，例如經預處理的含纖維素材料(底物)被逐漸添加到例如含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌槽式反應器或發酵罐中在受控的pH、溫度和混合條件下進行。合適的過程時間、溫度和pH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如，糖化可持續最多達200個小時，但通常進行優選約12個到約96個小時，更優選約16個到約72個小時，最優選約24個到約48個小時。溫度範圍為優選約25°C-約70°C，更優選約30°C-約65°C，更優選約40°C-60°C，尤其是約50°C。pH範圍為優選約3-約8，更優選約3.5-約7，最優選約4-約6，尤其是大約pH5。幹固形物含量範圍為優選約5-約50wt^，更優選約10-約40wt%，最優選約20-約30wt%。具有纖維素分解增強活性的酶和多肽的最適量取決於數種因素，包括但不限於作為成分的纖維素分解蛋白的混合物，含纖維素底物，含纖維素底物的濃度，含纖維素底物的一種或多種預處理，溫度，時間，PH，以及發酵生物的選用(例如用於同時糖化和發酵的酵母)。42在一個優選的方面，一種或多種纖維素分解蛋白對含纖維素材料的有效量為大約0.5-約50mg，優選約0.5-約40mg，更優選約0.5-約25mg，更優選約0.75-約20mg，更優選約0.75-約15mg，進一步更優選約0.5-約10mg，最優選約2.5-約10mg每克含纖維素材料。在另一個優選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對含纖維素材料的有效量為約0.5-約50mg，優選約0.5-約40mg，更優選約0.5-約25mg，更優選約0.75-約20mg，更優選約0.75-約15mg，進一步更優選約0.5-約10mg，最優選約2.5-約10mg每克含纖維素材料。在另一個優選的方面，具有纖維素分解增強活性的一種或多種多肽對含纖維素材料的有效量為約0.01-約50.Omg，優選約0.01-約40mg，更優選約0.01-約30mg，更優選約0.01-約20mg，更優選約0.01-約10mg，更優選約0.01-約5mg，更優選約0.025-約1.5mg，更優選約0.05-約1.25mg，更優選約0.075-約1.25mg，更優選約0.1-約1.25mg，進一步更優選約0.15-約1.25mg，最優選約0.25-約1.Omg每克含纖維素材料。在另一個優選的方面，一種或多種具有纖維素分解增強活性的多肽對纖維素分解蛋白的有效量為約0.005-約1.Og，優選約0.01-約1.Og，更優選約0.15-約0.75g，更優選約0.15-約0.5g，更優選約0.1-約0.5g，進一步更優選約0.1-約0.5g，最優選約0.05-約0.2g每克一種或多種纖維素分解蛋白。皿.對於從經過預處理和水解的含纖維素材料獲得的可發酵糖，可以用一種或多種能夠直接或間接將糖發酵為期望的發酵產物的發酵微生物來加以發酵。"發酵"或"發酵過程"是指任何發酵過程或任何包含發酵步驟的過程。發酵過程還包括生物燃料工業、食用酒精工業(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(例如發酵乳產品)、皮革工業及菸草工業上使用的發酵過程。發酵條件取決於期望的發酵產物及發酵生物，可以由本領域技術人員容易地予以確定。在發酵步驟中，作為預處理和酶促水解步驟的結果從含纖維素材料釋放的糖被發酵生物如酵母發酵成產物，例如乙醇。水解(糖化)和發酵可以分別或同時進行。這樣的方法包括，但不限於，分別水解和發酵(SHF)、同時糖化和發酵(SSF)、同時糖化和共發酵(SSCF)、混合水解和發酵(HHF)、SHCF(分別水解和共發酵)、HHCF(混合水解和發酵)、以及直接微生物轉化(匿C)。任何合適的經水解的含纖維素材料都可以用於本發明實施中的發酵步驟。如本領域中公知的，所述材料的選擇通常基於期望的發酵產物，即要通過發酵獲得的物質，以及所採用的過程。術語"發酵培養基"在本文中理解為指添加一種或多種發酵微生物之前的培養基，例如由糖化過程得到的培養基，以及例如在同時糖化和發酵過程(SSF)中使用的培養基。"發酵微生物"是指適合在期望的發酵過程中使用來產生發酵產物的任何微生物，包括細菌和真菌生物。發酵微生物可以是Ce和/或Cs發酵生物，或它們的組合。Ce和G發酵生物都是本領域中公知的。合適的發酵微生物能夠將糖類，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖，直接或間接發酵，即轉化成期望的發酵產物。Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642記載了產生乙醇的細菌及真菌發酵微生物的例子。能夠發酵C6糖的發酵微生物的例子包括細菌和真菌生物，如酵母。優選的酵母包括酵母屬一些種，優選釀酒酵母的菌株。能夠發酵C5糖的發酵微生物的例子包括細菌和真菌生物，如酵母。優選的發酵C5的酵母包括畢赤酵母屬的菌株，優選樹幹畢赤酵母(Pichiastipitis)，如樹幹畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬的菌株，優選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、芸苔假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產朊假絲酵母(Candidautilis)。其它發酵生物包括發酵單孢菌屬(Zymomonas)如運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬(Hansenula)如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬如脆壁克魯維酵母(K.fragilis)的菌株；裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母的菌株；以及大腸桿菌，尤其是已經過遺傳修飾而改善了乙醇產率的大腸桿菌菌株。在一個優選的方面，所述酵母是酵母屬的一些種(Saccharomycesspp)。在一個更優選的方面，所述酵母是釀酒酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是糖化酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優選的方面，所述酵母是克魯維酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxia皿s)。在另一個更優選的方面，所述酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優選的方面，所述酵母是假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是芸苔假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是產朊假絲酵母。在另一個優選的方面，所述酵母是棍孢屬(Clavispora)。在另一個更優選的方面，所述酵母是葡萄牙棍孢(Clavisporalusitaniae)。在另一個更優選的方面，所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaop皿tiae)。在另一個優選的方面，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優選的方面，所述酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolenta皿ophilus)。在另一個優選的方面，所述酵母是畢赤酵母。在另一個更優選的方面，所述酵母是樹幹畢赤酵母。在另一個優選的方面，所述酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個更優選的方面，所述酵母是克勞森酒香酵母(Breta翻mycesclausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,在Wyman，C.E.編的《HandbookonBioethanol-ProductionandUtilization》中，Taylor&Francis，Washington,DC，179-212)。能夠高效地將己糖和戊糖發酵成乙醇的細菌包括，運動發酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996，同上文)。在一個優選的方面，所述細菌是發酵單胞菌。在一個更優選的方面，所述細菌是運動發酵單胞菌。在另一個優選的方面，所述細菌是梭菌。在另一個更優選的方面，所述細菌是熱纖維梭菌。適用於乙醇生產的商品化酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可獲自Fermentis/Lesaffre，USA)、FALI(可獲自Fleischmann，sYeast，USA)，SUPERSTART和THERM0SACC鮮酵母(可獲自EthanolTechnology,WI，USA)、BI0FERMAFT和XR(可獲自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation，GA，USA)、GERTSTRAND(可獲自GertStrandAB，44Sweden),以及FERMI01"(可獲自DSMSpecialties)。在一個優選的方面，所述發酵微生物經過了遺傳修飾來提供發酵戊糖的能力，例如利用木糖的、利用阿拉伯糖的、以及共利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過克隆異源基因到各種發酵微生物中，已經構建出了能夠將己糖和戊糖轉化為乙醇(共發酵)的生物(Chen和Ho，l993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingSaccharomycescerevisiaeandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852—1859;KotterandCiriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKL1andTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664;Beall等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli，Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，Metabolicengineeringof即entosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose_fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)。在一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是釀酒酵母。在另一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是運動發酵單胞菌。在另一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是大腸桿菌。在另一個優選的方面，所述經過了遺傳修飾的發酵微生物是產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。通常將一種或多種發酵微生物添加到經降解的纖維素或水解產物中，進行約8小時至約96小時，例如約24-約60小時的發酵。溫度通常為約26°C-約60°C，尤其是約32°C或50°C，pH為約3-8，如大約pH4-5，6，或7左右。在一個優選的方面，將一種或多種發酵微生物施加到經降解的纖維素或水解產物，並進行大約12小時至大約96小時，如通常24-60小時的發酵。在一個優選的方面，溫度優選為大約2(TC至大約6(TC，更優選大約25t:至大約5(TC，最優選大約32。C至大約50°C，特別是大約32t:或5(rC，pH—般為大約pH3至大約pH7，優選pH4_7左右。然而，某些發酵微生物如細菌發酵生物，具有更高的最適發酵溫度。一種或多種發酵微生物施加的量優選為每ml發酵液大約105至1012，優選大約107至101Q，特別是大約2xl08個活細胞計數。關於使用酵母進行發酵的更多指導可見例如"TheAlcoholTextbook"(K.Jacques,T.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)，本文援弓l併入該文獻。為了生產乙醇，在發酵之後將經發酵的漿液蒸餾以提取乙醇。依照本發明的方法獲得的乙醇可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇即可飲用酒精(potableneutralspirits);或工業乙醇。發酵剌激物(fermentationstimulator)可與本文描述的任何酶促過程組合使用以進一步改進發酵方法，特別是發酵微生物的性能，諸如速率提高和乙醇產量。"發酵剌激物"指用於發酵微生物特別是酵母的生長的剌激物。優選的用於生長的發酵剌激物包括維生素和礦物質。維生素的實例包括多種維生素(multivitamins)、生物素、泛酸、煙酸、內消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、及維生素A、B、C、D禾口E。參見例如Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess，Springer-Verlag，2002，本文援引併入該文獻。礦物質的實例包括能夠提供營養的礦物質和礦物質鹽，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。^M^ll:發酵產物可以是任何來源於發酵的物質。所述發酵產物包括，但不限於，醇類(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、l，3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮類(例如丙酮)；醛類(例如甲醛)；胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如甲烷、氫(H》、二氧化碳(C02)和一氧化碳(CO))。發酵產物還可以是作為高價值產物的蛋白質。在一個優選的方面，所述發酵產物是醇。應理解的是術語"醇"涵蓋含有一個或多個羥基部分的物質。在一個更優選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優選的方面，所述醇是l，3-丙二醇。在另一個更優選的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一個更優選的方面，所述醇是木糖醇。參見例如Gong，C.S.、Cao，N.J.、Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，Sch印er，T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany,65:207-241;Silveira，M.M.，禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam，P.，禾口Singh，D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol_asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji，T.C.、Qureshi，N.禾口Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping,WorldjournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603。在另一個優選的方面，所述發酵產物是有機酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是富馬酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見例如Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63_65:435—448。在另一個優選的方面，所述發酵產物是酮。可以理解的是術語"酮"涵蓋含有一個或多個酮部分的物質。在另一個更優選的方面，所述酮是丙酮。參見例如Qureshi和Blaschek，2003，同上文。在另一個優選的方面，所述發酵產物是醛。在另一個更優選的方面，所述醛是甲醛。在另一個優選的方面，所述發酵產物是胺基酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優選的方面，所述胺基酸是穀氨酸。在另一個更優選的方面，所述胺基酸是甘氨酸。在另一個更優選的方面，所述胺基酸是賴氨酸。在另一個更優選的方面，所述胺基酸是絲氨酸。在另一個更優選的方面，所述胺基酸是蘇氨酸。參見例如Richard,A.，禾卩Margaritis，A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers，BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。在另一個優選的方面，所述發酵產物是氣體。在另一個更優選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優選的方面，所述氣體是4。在另一個更優選的方面，所述氣體是(》2。在另一個更優選的方面，所述氣體是CO。參見例如Kataoka，N.、A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria，WaterScienceandTechnology36(6_7):41-47;及GunaseelanV.N.，BiomassandBioe證gyVol.13(1-2)，第83-114頁，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。回收.任選地可以使用任何本領域已知的方法從發酵培養基回收一種或多種發酵產物，這些方法包括但不限於層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳程序(例如製備性等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉澱)、蒸餾、或萃取。例如，從經過發酵的含纖維素材料通過常規蒸餾方法分離乙醇並純化。可以獲得純度最高達約96vol%的乙醇，它可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇即可飲用酒精(po)，或工業乙醇。信號月太本發明還涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因可操作地連接於編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包含SEQIDN0:2的胺基酸1-15或者由SEQIDNO:2的胺基酸1-15組成，其中所述基因對所述核苷酸序列而言是外來的。在一個優選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1_45或者由SEQ47IDN0:1的核苷酸1-45組成。本發明還涉及包含這樣的核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發明還涉及用於產生蛋白質的方法，所述方法包括(a)在適合於蛋白質產生的條件下培養這樣的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。所述蛋白質對於宿主細胞而言可以是天然的或者異源的。術語"蛋白質"在本文中並不意指被編碼產物的具體長度，因此涵蓋了肽、寡肽和蛋白質。術語"蛋白質"還涵蓋結合形成被編碼產物的兩個或更多個多肽。蛋白質還包括雜合多肽，其包含從至少兩種不同蛋白質(其中一種或多種(數種)可以是對宿主細胞而言為異源或天然的)獲得的部分或完整多肽序列的組合。蛋白質還包括上述蛋白質和雜合蛋白的天然存在的等位變化形式以及工程改造的變化形式。優選的，所述蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報導分子。在一個更優選的方面，所述蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。在一個進一步更優選的方面，所述蛋白質是氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、其他脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。所述基因可以從任何原核、真核或其他來源獲得。下面用實施例進一步描述本發明，這些實施例不應解釋為對本發明範圍的限制。實施例材料用作緩衝劑和底物的化學品是至少試劑級的商品。培養基PDA平板的組成為每升39克馬鈴薯葡萄糖瓊脂。NNCYP培養基的組成為每升5.0gNH4N03、0.5gMgS047H20、0.3gCaCl2、2.5g擰檬酸、1.0g細菌用蛋白腖(BactoP印tone)、5.0g酵母提取物，lmlCOVE痕量金屬溶液、以及足量的K2HP04使最終pH達到約5.4。NNCYPmod培養基的組成為每升1.0gNaC1、5.0gNH4N03、0.2gMgS047H20、0.2gCaCl2、2.0g檸檬酸、1.0g細菌用蛋白腖、5.0g酵母提取物，lmlofCOVE痕量金屬溶液、以及足量的K2HP04使最終pH達到約5.4。COVE痕量金屬溶液的組成為每升0.04gNa2B40710H20、0.4gCuS045H20、1.2gFeS047H20、0.7gMnS04.H20、0.8gNa2Mo022H20^P10gZnS047H20。LB平板的組成為每升10g胰蛋白腖、5g酵母提取物，5g氯化鈉、和15g細菌用瓊脂(BactoAgar)。MDU2BP培養基的組成為每升45g麥芽糖、lgMgS047H20、lgNaCl、2gK2HS04、12gKH2P04、2g尿素、和500ii1AMG痕量金屬溶液，然後將pH調整到5.0，用0.22ym過濾元件進行過濾除菌。AMG痕量金屬溶液的組成為每升14.3gZnS047H20、2.5gCuS045H20、0.5gNiCl26H20、13.8gFeS04H20、8.5gMnS047叫、禾口3g擰檬酸。S0C培養基的組成為2X胰蛋白腖、0.5%酵母提取物、10慮NaCl、2.5mMKCl、10mMMgC^和10mMMgS(V然後在高壓蒸汽滅菌後添加經過濾除菌的葡萄糖至20mM。冷凍培養基的組成為60%SOC和40%甘油。2XYT培養基的組成為每升16g胰蛋白腖、10g酵母提取物，5gNaCl、和15g細菌用瓊脂。實施例1:從土生梭孢殼NRRL8126鑑定G朋1F多肽從在NNCYPmod培養基(添加有1%SIGMACELLType20纖維素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO，USA))上培養土生梭孢殼NRRL8126所得的新鮮平板取瓊脂糖塊，接種到50ml添加了1%葡萄糖的NNCYPmod培養基中，45°C、200rpm溫育25小時。然後對15個500ml燒瓶和兩個250ml燒瓶分別接種2ml上述的培養物，其中每個500ml燒瓶和250ml燒瓶分別含100ml和50ml添加有2%SIGMACELLType20纖維素的NNCYPmod培養基。將這些燒瓶在45°C、200rpm條件下溫育4天。將培養物合併後於3000xg離心10分鐘，將上清液通過NALGENE⑧玻璃纖維預濾器(NalgeNuncInt'1.，Rochester,NY，USA)過濾。濾液冷卻到4t:保存。二維聚丙烯醯胺凝膠電泳.取1ml濾液，添加100y1飽和(4°C)三氯乙酸(TCA)，在冰上溫育10分鐘，然後添加9ml冰冷的丙酮，再在冰上溫育20分鐘，來加以沉澱。將經過沉澱的溶液在10，OOOxgfC離心10分鐘，傾去上清液，用冰冷的丙酮洗滌離心沉澱兩次，讓其風乾。將乾燥的離心沉澱溶於0.2ml等電聚焦(IEF)樣品緩衝液。IEF樣品緩衝液的組成為9.0M尿素、3.0Xw/v3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基-銨]-l-丙磺酸鹽(3_[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonium]_l_propanesulfonate)(CHAPS，PierceChemicalCo.Rockford，IL，USA)、1%(v/v)pH4-7兩性電解質、1%P_巰基乙醇，和0.005%溶於蒸餾水的溴酚藍。尿素儲液用八0501^8(0)，20-5-目，混合床樹脂(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)去離子。去離子後的溶液保存在_20°C。將所得的混合物在LABQUAKE(g).搖床(LabIndustries,Berkeley,CA，USA)上輕柔混合數小時讓其溶解。將樣品緩衝液-蛋白質混合物加到IPG復水皿(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ，USA)中的11cmIPG凝膠條(strip)(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)上。在IPG凝膠條上覆蓋一層750ill等份的幹凝膠條覆蓋液(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，USA)以防止蒸發，讓其在2(TC復水12小時，與此同時使用IPGPHOR⑧等電聚焦單元(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，USA)施加30伏電壓。該IPGPHOR⑧被編程以提供恆定電壓且使每條凝膠條的最大電流為50A。復水12小時後，等電聚焦條件如下200伏1小時，500伏1小時，和1000伏1小時。然後施加從1000伏到8000伏歷時30分鐘的梯度，編程使等電聚焦在8000伏運行並在達到>30，000伏小時完結。在第二維分析之前將IPG凝膠條還原並烷基化，方法是首先用每10mlSDS平衡緩衝液lOOmg的二硫蘇糖醇還原15分鐘，然後在黑暗中用每10ml平衡緩衝液250mg的碘乙醯胺烷基化15分鐘。SDS平衡緩衝液的組成為50mMTrisHClpH8.8、6.0M尿素、2%w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)、30%甘油、以及0.002%w/v溴酚藍。將IPG凝膠條在SDS-PAGE運行緩衝液(Invitrogen/Novex，Carlsbad,CA，USA)中快速清洗，放在一條llcm，l孔8_16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)上，用CRITERJON⑧電泳單元(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)以50伏電泳直到樣品進入凝膠，然後增加電壓到200伏，運行直到溴酚藍染料達到凝膠底部。多肽檢測.二維凝膠用螢光SYPRO必橙色蛋白染色劑(MolecularProbes,Eugene,0R，USA)染色。螢光染色方法來自Malone等，2001，Electrophoresis,22，919-932並經過優化和調適。在平臺式振蕩器上將SDS-PAGE凝膠在40%乙醇、2%乙酸和0.0005%SDS中固定1小時到過夜。通過重複3次洗滌步驟來去除並更換固定溶液，每個步驟由2%乙酸和0.0005%SDS，30分鐘構成。將凝膠在黑暗中用2%乙酸、0.0005%SDS和0.02%SYPRO⑧橙色蛋白染色劑染色l.5小時到過夜。在HOEFER⑧processorplus"染色單元(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ，USA)上對染色禾口脫色進一步優化以改善再現性和自動化。在MOLECULARDYNAMICSSTORM860成像系統(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，USA)上進行掃描，使用藍色螢光，像素大小200iim，光電倍增管增益800V，以獲得經過螢光染色的SDS-PAGE凝膠的圖像。用IMAGEQUANT⑧軟體第5版(AmershamBiosciences，Piscataway,NJ，USA)觀察和調整圖像。進一步將凝膠在使用橙色濾光片的DARKREADER(g)藍光透照儀上可視化。用2mmACU-PUNCH⑧活檢衝孔器(AcudermInc.，Ft.Lauderdale,FL，USA)切出觀察到的蛋白凝膠斑點，保存在預先用含0.1%三氟乙酸(TFA)的60%乙腈洗滌、再用HPLC級水洗滌過兩次的96孔板中。經過染色的二維凝膠斑點在預洗過的平板上的25-50ml的水中保存於_201:直到消化。凝膠內多肽消化用於肽測序.使用MULTIPROBE11液體操作機器人(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA，USA)進行凝膠內消化。將含有感興趣多肽的二維凝膠斑點用50iU含lOmM二硫蘇糖醇(DTT)的100mM碳酸氫銨、pH8.0室溫還原30分鐘。還原之後，將凝膠片用50ill含55mM碘乙醯胺的lOOmM碳酸氫銨、pH8.0烷基化20分鐘。讓乾燥的凝膠片在組成為6ng測序級胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)/iU50mM碳酸氫銨pH8的胰蛋白酶消化溶液中室溫溶脹30分鐘，然後在4(TC消化8小時。上述每個反應步驟之後都按照生產商的標準規程用合適的溶液進行多次洗滌和預洗滌。在反應與反應之間用50iU乙腈使凝膠脫水，在步驟和步驟之間將凝膠片風乾。用含1^甲酸/2^乙腈的HPLC級水抽提肽兩次，歷時30分鐘。將肽抽提液轉移到已冷卻至10-15°C的THERMO-FAST96孔帶裙邊小規格PCR平板(skirtedPCRlowprofileplate)(ABGene，Rochester,NY，USA)中並蓋上96孑L板蓋(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA，USA)以防止蒸發。進一步將平板保存在4。C直到能夠進行質譜分析。採用串聯質譜的肽測序.對於採用串聯質譜的肽測序，使用Q-TOFMICRO混合正交四極飛行時間質譜儀(WATERSMICROMASSMSTechnol0gies，Milford，MA，USA)進行LC-MS/MS分析。Q-TOFMICRO質譜儀配置有ULTIMATE毛細管和納米流HPLC系統(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)，該系統耦聯於FAMOS微型自動採樣器(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)和SWITCHOSII柱切換裝置(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)用於樣品的濃縮和脫鹽。將6iU自凝膠內消化回收的肽溶液加載到設置於注射環中的保護柱(300iimIDx5cm，C18PEPMAP,Dionex，Sunnyvale,CA，USA)上，利用SWITCHOSII泵(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)用含0.1%甲酸的水以40yl/min洗滌2分鐘。在一根75iimIDxl5cm、C18、3iim、100APEPMAP⑧納米流融合型毛細管柱(nanoflowfusedcapillarycol醫)(Dio證，Sunnyvale,CA，USA)上分離肽，其中流速為175nl/min，來自用NAN-75校準器(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)產生的175iU/min的分流。線性洗脫梯度為從含5%乙腈到含60%乙腈的0.1%甲酸，在45分鐘的時間段內施加。對柱洗脫液在215nm進行監測，並將其通過設置在納米噴射界面上的電噴射離子源引入Q-TOFMICRO質譜儀中。質譜儀完全由微處理器控制，使用MASSLYNXTM軟體第3.5版(WATERSMICROMASSMSTechnologies,Milford，MA，USA)。數據獲取在全範圍掃描(surveyscan)模式下進行，質量範圍從50-2000m/z，設有從MS到MS/MS的切換標準，採納大於10.0個離子/秒的離子強度及+2、+3和+4的電荷狀態。能夠獲得多達4個共洗脫類型的掃描時間1.9秒、掃描間隔時間0.1秒的分析譜。典型地使用65伏的錐孔電壓(conevoltage)，並對碰撞能量(collisionenergy)編程使其依照洗脫肽的質量和電荷狀態在10-60伏的範圍內變化。將所得的多個譜合併、平滑化、並自動集中生成一個峰列表。利用R0TEINLYNXGlobalServer1.1軟體(:WATERSMICROMASSMSTechnologies,Milford，MA，USA)將所得的峰列表對選定的資料庫進行搜索。對PROTEINLYNXTM檢索結果進行評估，對於未鑑定的蛋白通過評估每個感興趣離子的MS/MS譜加以進一步分析，並通過鑑定y和b離子序列並將質量差與合適的胺基酸匹配來確定從頭序列。將一個對應於近似分子量40kDa、近似等電點4.5的2D凝膠點用胰蛋白酶進行凝膠內消化，進行如所述的從頭測序。一個431.782m/z的二價電荷胰蛋白酶肽離子被確定為Gly-Pro-[Ile/Leu]-Ala-Tyr-[Ile-Leu]-Lys(SEQIDNO:2的胺基酸98-105)。另一個570.976m/z的二價電荷胰蛋白酶肽離子被確定為His-Thr-[Ile/Leu]-Thr-Ser-Gly-Pro-Asp-Asp-Val-Met-Asp-Ala-Ser-His-Lys(SEQIDNO:2的胺基酸82-97)。第三個825.9517的二價電荷胰蛋白酶肽離子被確定為Val-Asp-Asp-Ala-[Ile/Leu]-Thr-Asp-Thr-Gly-[Ile/Leu]-Gly-Gly-Gly-Trp-Phe-Lys(SEQIDNO:2的胺基酸107-122)。實施例2:表達序列標籤(EST)cDNA文庫構建用來自土生梭孢殼NRRL8126的24小時液體培養物(50ml添加了1%葡萄糖的NNCYPmod，於250ml燒瓶中45。C溫育，200rpm)的2ml等份試樣接種裝有100ml添加了2%SIGMACELLType20纖維素的NNCYPmod培養基的500ml燒瓶。培養物在45°C、200rpm溫育3天。用帶有玻璃纖維預濾器(Nalgene，RochesterNY，USA)的布氏漏鬥過濾收集菌絲體，用10mMTris-HCl-lmMEDTApH8(TE)洗滌兩次，然後在液氮中速凍。用下述方法收集總RNA。將冷凍的土生梭孢殼NRRL8126菌絲體在電動咖啡磨中磨碎。將磨碎的材料在50mlFALCON⑧管中以1:1v/v與20mlFenazo1(Ambion，Inc.，Austin,TX，USA)混合。一旦菌絲體被懸浮，即用氯仿抽提它們，再用苯酚_氯仿_異戊醇的25:24:1v/v/v混合物抽提3次。從所得的水相中通過添加1/10體積的3M乙酸鈉pH5.2和1.25倍體積的異丙醇將RNA沉澱出來。在12，000xgfC離心30分鐘收集沉澱的RNA。最終的離心沉澱用冷的70%乙醇洗滌、風乾、並重懸於500ml用焦碳酸二乙酯處理過的水(DEPC水)中。用2100Bioanalyzer(生物分析儀)(AgilentTechnologies,Inc.，PaloAlto，CA，USA)評估純化的RNA的數量和質量。藉助POLY(A)PURISTMAGKit(Ambion，Inc.，Austin,TX，USA)，依照供應商的說明，從360yg總RNA中分離出聚腺苷酸化mRNA。為了產生cDNA文庫，採用CLONEMINERKit(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)來構建不需要使用限制酶克隆的定向文庫，從而減少嵌合克隆的數目和大小偏好。為了保證cDNA的成功合成，用兩種不同濃度的mRNA(2.2禾P4.4iigpoly(A)+mRNA)平行進行兩個反應。將mRNA樣品與Biotin-attB2-01igo(dt)引物(CLONEMINERKit,Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，IX第一鏈緩衝液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，2ii10.1M二硫蘇糖醇(DTT)，10mM每種dNTP、以及水混合至終體積分別為18和16yl。小心地混合反應混合物，然後加入2ill和4illSUPERSCRIPT逆轉錄酶(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，45。C溫育60分鐘以合成第一互補鏈。第二鏈合成是向每個第一鏈反應加入30ii15X第二鏈緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)、3ii1的10mM各種dNTP、10單位大腸桿菌DNA連接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，40單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，和2單位的大腸桿菌RNaseH(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，總體積為150yl。然後在16"將混合物溫育2小時。在2小時溫育之後將2ii1T4DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)加入每個反應中，16。C溫育5分鐘以生成平末端cDNA(bunt-endedcDNA)。對cDNA反應物用苯酚_氯仿_異戊醇25:24:1v/v/v混合物抽提，並在20iig糖原、120ii15M乙酸銨及660乙醇的存在下沉澱。12，OOOxg4。C離心30分鐘後用冷70%乙醇洗滌cDNA離心沉澱，真空乾燥2_3分鐘，並重懸於18iUDEPC水中。向每個重懸的cDNA樣品中加入105X銜接緩衝液(adaptedbuffer)、10iig的每種attBl銜接子(CLONEMINERKit中提供)、7ii10.1MDTT、和5單位T4DNA連接酶。將連接反應物在16。C溫育過夜。過量的銜接子通過用lmlSEPHACRYLS-500HR樹脂(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ，USA)進行大小排阻層析來予以去除。根據試劑盒的說明收集柱級分，將第3-14個級分用AGILENT⑧2100Bioanalyzer進行分析來確定attBl銜接子開始被洗脫的級分。該分析顯示銜接子大約在第10或11個級分開始被洗脫。第一文庫合併了第6-11個級分，第二文庫合併了第4-11個級分。依照GATEWAY⑧技術(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)通過同源DNA重組來進行cDNA克隆，使用BPCLONASE(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)作為重組酶。每個BPCL0NASETM重組反應物含有大約70ng被attB側翼包圍的cDNA、250ngpDONR222、2iU5XBPCL0NASETM緩衝液、2iUTE和3iUBPCL0NASE。將重組反應在25。C溫育過夜。然後將熱滅活的BP重組反應物分成6個等份，電穿孔到ELECTROMAXDH10B電感受態細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)中，其中電穿孔使用GENEPULSERIIElectroporationSystem(GENEPULSERII電穿孔系統)(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)，參數如下電壓2.0kV，電阻200Q，電容25iiF。將經過電穿孔的細胞重懸在lmlSOC培養基中，在恆定振蕩(200rpm)下於37。C溫育60分鐘。溫育期之後，將經轉化的細胞合併，並以l:l與冷凍培養基混合。取出200iU等份用於實驗室滴定，然後將每個文庫剩餘的部分等份分到1.8ml冷凍管(WheatonScienceProducts，Millville，NJ，USA)中，-80。C冷凍保存。每個文庫製備了四個系列稀釋度1/100、1/1000、1/104、1/105。從每個稀釋度取100ii1塗布到每ml添加有50iig卡那黴素的150mmLB平板上，37"溫育過夜。計算每個稀釋物平板上菌落的數目，用它來計算每個文庫中轉化子的總數。第一文庫顯示有大約540萬個獨立克隆，第二文庫顯示有大約900萬個獨立克隆。實施例3:模板製備和cDNA克隆的核苷酸測序將來自兩個文庫的等份試樣混合併塗布到每ml添加有50iig卡那黴素的25x25cmLB平板上。藉助QPixRobot(GenetixInc.，Boston,MA，USA)將菌落個體排列(array)到含100ill每ml添加有50iig卡那黴素的LB培養基的96孔板上。對於總共4320個克隆個體，獲得了45個96孔板。將這些平板37t:、200rpm振蕩下溫育過夜。溫育之後，向每個孔裡加lOOii1無菌50%甘油。藉助一種96針工具(Boekel，Feasterville，PA，USA)將轉化子影印到第二組深盤型(de印-dish)96孔微量培養板(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation，Gaithersburg，MD，USA)中，後者每孑L中含有lml添力口了50ug/ml卡那黴素的MAGNIFICENTBROTH(MacConne11Research,SanDiego，CA，USA)。將第一組微量滴定板冷凍保存在-8(TC。將第二組深盤型平板在迴轉搖床上劇烈振蕩(300rpm)下37t:溫育過夜。為了防止灑出和交叉汙染，且容許充分的通氣，第二組的每個培養板都用聚丙條墊板(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg，MD，USA)禾口塑茅鬥微量滴定盤蓋加以覆蓋。用Robot-Smart384(麗GBiotechInc.，HighPoint,NC，USA)禾口MONTAGEPlasmidMinipr印96Kit(MONTAGE質粒小量製備96型試劑盒)(Millipore，Billerica，MA，USA)製備質粒DNA。測序反應使用BIGDYE⑧Terminatorv3.0ReadyReactionCycleSequencingKit(BIGDYE⑧終止物v3.0就緒反應循環測序試劑盒)(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)，採用終止物化學(terminatorchemistry)(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38:47—60)禾口如下所示的M13Forward(正向)(一20)測序引物進行。5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(SEQIDNO:3)測序反應使用Robot-Smart384(麗GBiotechInc.，HighPoint,NC，USA)以384孑L規格進行，並用MULTISCREENSeq384SequencingClean-upKit(MULTISCREENSeq384測序清潔試劑盒)(Mi11ipore，Bi1lerica，MA，USA)去除終止物。反應物包含6ill質粒DNA和4ill測序預混劑，其中預混劑含1yl5X測序緩衝液(Millipore，Billerica，MA，USA)、lii1BIGDYE⑧終止物(AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA，USA)、1.6皮摩爾M13正向引物和1ii1水。用ABIPRISM3700DNASequencer(ABIPRISM3700DNA測序儀)(AppliedBiosystems,FosterCity，CA，USA)進行單程(Single-pass)DNA測序。實施例4:cDNA克隆的DNA序列數據的分析藉助PHRED/PHRAP軟體(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)進行鹼基判定(basecalling)、特性值指定(qualityvalueassignment)禾口載體修剪(vectortrimming)。用TranscriptAssemblerv.2.6.2.軟體(Paracel，Inc.，Pasadena,CA，USA)對EST進行聚類分析。對EST聚類的分析顯示有395個獨立的簇。將組裝的EST序列面向多個資料庫(如PIR)進行序列同源性分析，該分析通過Blastx程序(Altschulet.al.，1990，J.Mol.Biol.215:403-410)在一個32節點的Linux集群(Paracel，Inc.，Pasadena,CA，USA)上實施，使用BL0SUM62矩陣(Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)。它們中的246個命中了公共或專有蛋白資料庫中的已知基因，149個在這些資料庫中沒有顯著的命中。在這246個基因中，有13個命中了已知的糖基水解酶基因。實施例5:編碼具有纖維素分解增強活性的家族61多肽(GH61F)的cDNA克隆的鑑定首先根據其與一種來自粗糙脈孢菌的家族61蛋白(UniProtQ7S439)的同一性鑑定了一個編碼具有纖維素分解增強活性的家族61多肽(GH61F)的cDNA克隆。該初始分析顯示這兩種蛋白質在蛋白質水平上有57.67%的同一性，分布在一段211個胺基酸(663個鹼基對)的序列上。在該初始分析之後，從原始的凍存平板上取得克隆Tterl8A8，在添加了50yg/ml卡那黴素的LB平板上劃線。將平板37t:溫育過夜，第二天用來自平板上的一個單菌落接種添加了50iig/ml卡那黴素的3mlLB。將該液體培養物37。C溫育過夜，用BIOROBOT⑧9600(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)製備質粒DNA。利用上文所述的BIGDYE⑧終止物化學對克隆Tter08C4質粒DNA再次測序，使用所述M13正向引物及如下所示的Poly-T引物來對該克隆的3'端測序。5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'(SEQIDN0:4)其中V=G、A、C;N=G、A、C、T對新序列信息的Blastp同源性分析顯示，由克隆Tterl8A8編碼的蛋白質與一種粗糙脈孢菌假定蛋白NCU02240.l(UniRefQ7S439)相似。這兩種蛋白有74%同一性，分布在一段316個胺基酸的序列上。用Interproscan禾呈序(Zdobnov禾口Apweiler，2001，Bioinformatics17:847-848)分析克隆18A8的推定蛋白質序列顯示，克隆18A8編碼的基因含有家族61蛋白的序列籤名。該序列籤名名稱為Pfam模式F03443(Bateman，A.等，2002，NucleicAcidsResearch30:276-280)，在距離起始胺基酸甲硫氨酸119個胺基酸處被發現，這確證了克隆Tterl8A8編碼土生梭孢殼家族61蛋白。該分析還表明該蛋白包含一個真菌纖維素結合域(34個胺基酸長)，其位於距離起始胺基酸甲硫氨酸283個胺基酸處。cDNA序列(SEQIDN0:1)和推定的胺基酸序列(SEQIDNO:2)如圖1所示。該cDNA克隆編碼317個胺基酸的多肽。該基因的cDNA克隆的％G+C含量為64.9%，成熟蛋白編碼區(SEQIDNO:1的核苷酸46-955)的％G+C含量也是64.9%。用SignalP軟體程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6)預測了一條15個殘基的信號肽。預測的成熟蛋白含302個胺基酸，分子量為31.14kDa。使用ClustalW法(Higgins，1989，同上文)確定了家族61序列的比較性比對，其中使用矢量NTIAdvance10.3軟體(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)的AlignX模i央，使用blos咖62mt2評分矩陣和下列多重比對參數K-元組大小(K-tuplesize)1;最佳對角線(bestdiagonals)5;窗口大小(windowsize)5;缺口罰分(gappenalty)5;缺口形成罰分(g即openingpenalty)10;缺口延伸罰分(g即extensionpenalty)0.1。該比對顯示成熟土生梭孢殼gh61f基因的推定胺基酸序列與具有纖維素分解增強活性的土生梭孢殼Cel61G多肽(W02005/074647)的成熟區域具有43%的同一性。確認了克隆Tterl8A8的身份之後，將一份O.5iU的來自該克隆的質粒DNA(命名為pTer61F，見圖2)轉移到一小管ONESHOT⑧大腸桿菌T0P10細胞(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中，輕柔混合，在冰上溫育10分鐘。然後將細胞42。C熱激30秒，再在冰上溫育2分鐘。將細胞重懸在250ii1S0C培養基中，在恆定震蕩(200rpm)下37。C溫育60分鐘。溫育期之後，取兩個30ii1等份塗布在添加了50iig/ml卡那黴素的LB平板上，37t:溫育過夜。第二天挑取單菌落，在含有約1.5ml添加了50iig/ml卡那黴素的LB瓊脂糖的1.8ml冷凍小管上劃線。小管用PETRISEAL(DiversifiedBiotech,Boston,MA，USA)密封，保藏於北方區域研究中心農業研究機構專利培養物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria，IL，USA，保藏號為NRRLB-50044，保藏日為2007年5月25日。實施例6:克隆家族gh61f基因到米麴黴表達載體中設計了兩條合成寡核苷酸引物(如下所示)來從編碼家族GH61F具有纖維素分解增強活性的多肽的土生梭孢殼ESTTterl8A8PCR擴增全長可讀框。使用IN-FUSIONPCRCloningKit(IN-FUSIONPCR克隆試劑盒)(BDBiosciences，PaloAlto，CA，USA)將該片段直接克隆到質粒pAlLo2(W02004/099228)中。正向引物5'-ACTGGATTTACCATGAAGGGCCTCAGCCTCCTCG-3'(SEQIDNO:5)反向引物5'-TCACCTCTAGTTAATTAATTACTGGCATTGCGAGTAATAG-3'(SEQIDNO:6)加粗的字母代表編碼序列。其餘的序列與pAlLo2的插入位點相比含有序列同一性。將上述引物各50皮摩爾用於終體積為50iU的PCR反應物中，其中包含50ngpTterl8A8DNA;1XPfx擴增緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA);6ii1dATP、dTTP、dGTP及dCTP的10mM合劑；2.5單位PLATINUMPfxDNA聚合酶(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA);lyl50mMMgS04;和5110XpCRxEnhancerSolution(加強溶液)(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)。用如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧5333(EppendorfScientific，Inc.，Westbury，NY，USA)擴增該片段98。C2分鐘循環一次，而後94t:30秒、62.1°C30秒、68t:1.0分鐘循環35次。35個循環後，將反應物在68°C溫育10分鐘，然後在l(TC冷卻備用。使用40mMTris鹼_20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉(TAE)緩衝液和0.1g/ml的溴化乙錠在0.8XSEAKEM⑧GTG⑧瓊脂糖凝膠(CambrexBioproducts，EastRutherford,NJ，USA)上分離了一個984bp的PCR反應產物。藉助DARKREADER(ClareChemicalResearch,Dolores,C0，USA)顯現DNA條帶以避免UV誘發的突變。用一次性剃刀片切下DNA條帶，用UL丁RAFREE⑧-DA轉杯(Millipore，Billerica，MA，USA)根據製造商的說明加以純化。通過NcoI和PacI消化來使質粒pAlLo2線性化。通過如上所述進行的凝膠電泳和超濾來純化片段。用IN-FUSIONPCRCloningKit將純化後的PCR片段克隆到經過線性化和純化的pAlLo2中。反應物(201)包含211XIN-FUSION⑧緩衝液、21IXBSA、11IN-FUSION⑧酶(1:10稀釋的)、100ng經NcoI和PacI消化的pAlLo2，和100ng土生梭孢殼gh61f純化PCR產物。將反應物在室溫溫育30分鐘。使用該反應物的2y1樣品依照製造商的說明轉化大腸桿菌XL10SOLOPACKGold細胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。經過一段恢復期之後，將來自轉化反應物的兩個100等分試樣塗布到添加有100iig/ml氨苄青黴素的150mm2XYT平板上。將平板37。C溫育過夜。從選擇平板上收集4個推定的重組克隆，從每一個克隆使用BIOROBOT⑧9600(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)製備質粒DNA。通過PstI限制性消化分析這些克隆。然後對兩個具有預期的限制性消化模式的克隆進行測序來確認克隆的插入序列中沒有突變存在。測序用ABIPRISM3130x1DNASequencer(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)進行。選擇第3號克隆並命名為pAlLo23(圖3)。實施例7:米麴黴JaL250中土生梭孢殼家族gh61f基因的表達根據Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422的方法製備米麴黴JaL250(W099/61651)原生質體。用5微克的pAlLo23(以及作為質粒對照的pAlLo2)轉化米麴黴JaL250原生質體。用pAlLo22轉化米麴黴JaL250產生了大約50個轉化子。將8個轉化子分離到單獨的PDA平板上，在34"溫育5天。匯合孢子平板用5ml0.01%TWEEN80洗滌，用孢子懸液接種125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養基。轉化子培養物在200rpm恆定震蕩下於34。C溫育。接種後第五天，將培養物6000xg離心，收集它們的上清液。將每種上清液7.5微升與等體積的2X上樣緩衝液(10%13-巰基乙醇)混合，上樣到1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上，用BI0-SAFETMCoomassieBlueG250(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)染色。培養液的SDS-PAGE概貌顯示，8個轉化子中的7個具有一條大約45kDa的新蛋白條帶。選擇了第4號轉化子用於進一步研究，並將其命名為米麴黴JaL250AlLo23。實施例8:米麴黴JaL250AlLo23的發酵將100ml搖瓶培養基加入500ml搖瓶中。搖瓶培養基的組成為每升50g蔗糖、10gKH2P04、0.5gCaCl2、2gMgS04*7H20、2gK2S04、2g尿素、10g酵母提取物、2g檸檬酸、和0.5ml痕量金屬溶液。痕量金屬溶液組成為每升13.8gFeS04*7H20、14.3gZnS047H20、8.5gMnS04*H20、2.5gCuS04*51120和3g檸檬酸。在所述搖瓶中接種兩個來自米麴黴JaL250AlLo23固體平板培養物的瓊脂塊，在迴轉搖床上200rpm34。C溫育24小時。將50ml搖瓶培養液接種到含1.8升發酵分批培養基的3升發酵容器，所述發酵分批培養基的組成為每升10g酵母提取物、24g蔗糖、5g(NH山S(V2gKH2P04、0.5gCaCl22H20、2gMgS04.7H20、lg檸檬酸、2gK2S04、0.5ml消泡齊U、和0.5ml痕量金屬溶液。痕量金屬溶液組成為每升13.8gFeS047H20、14.3gZnS047H20、8.5gMnS04H20、2.5gCuS0^5H20、和3g檸檬酸。發酵補料培養基組成為麥芽糖和消泡劑。發酵補料培養基以0-4.4g/l/hr的速率在185小時的時間內定量添加。發酵容器保持在34。C的溫度，pH控制在6.1+/-0.1的固定點。以lvvm的速率向容器中通入空氣，並用轉速為1100-1300rpm的Rushton葉輪攪拌發酵液。發酵結束時，從容器中收集所有發酵液，3000xg離心去除生物質。上清液無菌過濾後保存在35-40°C。實施例9:pMJ04表達載體的構建使用如下所示的引物993429(反義)和993428(有義)從裡氏木黴RutC30基因組DNAPCR擴增裡氏木黴外切纖維二糖水解酶1基因(cbhl，CEL7A)終止子，構建了表達載56體pMJ04。經過工程改造，所述反義引物在5'末端具有一個PacI位點，有義引物在3'末端具有一個Spel位點。引物993429(反義):5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO:7)引物993428(有義):5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3，(SEQIDNO:8)用DNEASY⑧PlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)分離裡氏木黴RutC30基因組DNA。擴增反應物(50ill)的組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反應緩衝液)(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA，USA)、0.3mMdNTP、100ng裡氏木黴RutC30基因組DNA、0.3iiM引物993429、0.3iiM引物993428、和2單位的VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA，USA)。將這些反應物在如下編程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育進行94。C30秒、50。C30秒、72。C60秒的循環5次，然後進行94°C30秒、65。C30秒、72。C120秒的循環25次(最終延伸5分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下229bp的產物條帶，使用QIAQUICKGelExtractionKit(:QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)依照生產商的說明進行純化。所得的PCR片段用Pad和Spel消化後，用RapidLigationKit(快速連接試劑盒)(Roche，Indian即olis，IN，USA)連接到經相同的限制酶消化過的pAlLol(WO05/067531)中，產生pMJ04(圖4)。實施例10:pCaHj568的構建從pCaHjl70(美國專利5，763，254)和pMT2188出發構建質粒pCaHj568。質粒pCaHj170包含特異腐質黴內切葡聚糖酶V(CEL45A)全長編碼區(SEQIDN0:9，編碼SEQIDNO:10的胺基酸序列)。pMT2188的構建最先是用如下所示的引物142779和142780從pCaHj483(W098/00529)PCR擴增出pUC19複製起點。引物142780在PCR片段中引入Bbul位點。142779:5'-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3，(SEQIDNO:11)142780:5'-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3，(SEQIDNO:12)該擴增使用EXPANDPCRSystem(RocheMolecularBiochemicals，Basel,Switzerland)依照製造商的說明進行。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)(Ge謹ed，Wielandstr，Germany)分離並純化出一個1160bp的片段。使用如下所示的引物140288和142778，利用EXPAND⑧PCRSystem從通用釀酒酵母克隆載體pYES2(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中擴增出URA3基因。引物140288在PCR片段中引入一個EcoRI位點。140288:5'-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3'(SEQIDNO:13)142778:5'-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3'(SEQIDNO:14)在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)分離並純化出一個U26bp的片段。通過混合所述兩個PCR片段並用如上所示的引物142780和140288依照重疊剪接(overl即splicing)法(Horton等，1989，Gene77:61-68)進行擴增，將這兩個片段融合起來。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)分離並純化出一個2263bp的片段。所得的片段用EcoRI和Bbul消化，並使用標準規程連接到用相同的限制酶消化過的pCaHj483的最大片段中。將連接混合物轉化到依照Mandel和Higa，1970，J.Mol.Biol.45:154的方法製成感受態的pyrF陰性大腸桿菌菌株DB6507(ATCC35673)中。在每升添加了lg酪蛋白胺基酸、500iig硫胺素和10mg卡那黴素的M9培養基(Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress)上選擇轉化子。分離了來自於一個轉化子的質粒，命名為pCaHj527(圖5)。使用EXPAND⑧PCRSystem並依照製造商的說明，通過PCR對pCaHj527上存在的NA2-tpi啟動子進行定點誘變。利用如下所示的誘變引物141223，將核苷酸134-144從GTACTAAAACC(SEQIDNO:15)轉變為CCGTTAAATTT(SEQIDNO:16)。引物141223:5'-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3，(SEQIDNO:17)利用如下所示的誘變引物141222，將核苷酸423-436從ATGCAATTTAAACT(SEQIDNO:18)轉變為CGGCAATTTAACGG(SEQIDNO:19)。引物141222:5'-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3，(SEQIDNO:20)[O459]所得的質粒命名為pMT2188(圖6)。將特異腐質黴內切葡聚糖酶V編碼區從pCaHjl70作為BamHI-SalI片段轉移到用BamHI和XhoI消化過的pMT2188中，生成pCaHj568(圖7)。質粒pCaHj568包含與特異腐質黴內切葡聚糖酶V全長編碼序列可操作地連接的突變的NA2-tpi啟動子。實施例11:pMJ05的構建質粒pMJ05的構建是通過使用如下所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R從pCaHj568PCR擴增出915bp的特異腐質黴內切葡聚糖酶V全長編碼區。HiEGV-F(有義)5'-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3'(SEQIDNO:21)HiEGV-R(反義)5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'(SEQIDNO:22)擴增反應物(50ii1)的組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反應緩衝液)、0.3mMd證、10ng/ii1pCaHj568、0.3iiMHiEGV-F引物、0.3yMHiEGV-R引物、和2單位VentDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育進行94°C30秒、5(TC30秒、72t:60秒的循環5次，然後進行94°C30秒、65。C30秒、72。C120秒的循環25次(最終延伸5分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下937bp的產物條帶，使用QIAQUICKGelExtractionKit依照生產商的說明進行純化。用937bp的純化片段作為模板DNA繼續用下述引物進行擴增HiEGV-R(反義)5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'(SEQIDNO:23)HiEGV-F-overl即(有義)5，-ACCGCGGACTGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3,(SEQIDNO:24)斜體表示的引物序列與裡氏木黴纖維二糖水解酶I基因(cbhl)啟動子的17bp同源，下劃線的引物序列與特異腐質黴內切葡聚糖酶V編碼區的29bp同源。啟動子和編碼序列之間36bp的重疊使得包含裡氏木黴cbhl啟動子的994bp片段能夠精確的融合於包含特異腐質黴內切葡聚糖酶V編碼區的918bp片段。擴增反應物(50ill)的組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反應緩衝液)、0.3mMdNTP、1ii1純化的937bpPCR片段、0.3iiMHiEGV-F-overl即引物、0.3iiMHiEGV-R引物、和2單位VentDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER5333中溫育進行94。C30秒、50。C30秒、72。C60秒的循環5次，然後進行94°C30秒、65。C30秒、72。C120秒的循環25次(最終延伸5分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下945bp的產物條帶，使用QIAQUICKGelExtractionKit依照生產商的說明進行純化。另外使用如下所示的引物(該有義引物經工程改造在5'末端具有一個Sail限制位點)進行PCR，來從裡氏木黴RutC30基因組DNA擴增裡氏木黴cbhl啟動子序列，該序列從所述基因的ATG起始密碼子上遊994bp開始延伸。裡氏木黴RutC30基因組DNA是用DNEASYPlantMaxiKit分離的。TrCBHIpro-F(有義)5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO:25)TrCBHIpro-R(反義)5'-GATGCGCAGTCCGCGGT-3，(SEQIDNO:26)擴增反應物(50ii1)的組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反應緩衝液)、0.3mMdNTP、lOOng/ii1裡氏木黴RutC30基因組DNA、0.3iiMTrCBHIpro-F引物、0.3iiMTrCBHIpro-R引物、和2單位VentDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育94°C30秒、55°C30秒、72°C120秒的循環30次(最終延伸5分鐘)。將反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下998bp的產物條帶，使用QIAQUICK⑧GelExtractionKit(:QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。用純化的998bpPCR片段作為模板DNA繼續用下述引物進行擴增。TrCBHIpro-F:5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3'(SEQIDNO:27)TrCBHIpro_R_overlap:5，-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT-3，(SEQIDNO:28)斜體表示的序列與裡氏木黴cbhl啟動子的17bp同源，下劃線的序列與特異腐質黴內切葡聚糖酶V編碼區的29bp同源。啟動子和編碼序列之間36bp的重疊使得包含裡氏木黴cbhl啟動子的994bp片段能夠精確的融合於包含特異腐質黴內切葡聚糖酶V全長編碼區的918bp片段。擴增反應物(50ii1)的組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反應緩衝液)、0.3mMdNTP、lii1純化的998bpPCR片段、0.3iiMTrCBHlpro-F引物、0.3yMTrCBHlpro-R-overl即引物、和2單位VentDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育進行94°C30秒、50。C30秒、72。C60秒的循環5次，然後進行94°C30秒、65。C30秒、72。C120秒的循環25次(最終延伸5分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下1017bp的產物條帶，使用QIAQUICK⑧GelExtractionKit(:QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。用1017bp裡氏木黴cbhl啟動子PCR片段和945bp特異腐質黴內切葡聚糖酶VPCR片段作為模板DNA繼續用下述引物進行擴增，以利用重疊PCR精確地將994bpcbhl啟動子融合於918bp內切葡聚糖酶V全長編碼區。TrCBHIpro-F:5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO:29)HiEGV-R:5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'(SEQIDNO:30)擴增反應物(50ii1)的組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反應緩衝液)、0.3mMdNTP、0.3iiMTrCBHlpro-F引物、0.3iiMHiEGV-R引物和2單位VentDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧5333中溫育進行94。C30秒、50。C30秒、72。C60秒的循環5次，然後進行94°C30秒、65。C30秒、72t:120秒的循環25次(最終延伸5分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下1926bp的產物條帶，使用QIAQUICK⑧GelExtractionKit(QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。將所得的1926bp片段使用ZEROBLUNTTOPOPCRCloningKit('ZEROBLUNTTOPOPCR克隆試劑盒)(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)依照製造商的規程克隆到pCR-Blunt-II-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中。所得的載體用NotI和SalI消化，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)凝膠純化1926bp片段，然後使用T4DNA連接酶(Roche,Indianapolis,IN，USA)連接到pMJ04(其也用同樣兩種限制酶消化過)中，產生pMJ05(圖8)。質粒pMJ05包含與特異腐質黴內切葡聚糖酶V全長編碼序列可操作地連接的裡氏木黴纖維二糖水解酶I啟動子及終止子。實施例12:pSMail30表達載體的構建從作為模板的pJaL660(W02002/095014)用如下所示的引物993467(有義)和993456(反義)PCR擴增了米麴黴P_葡糖苷酶全長編碼序列(cDNA序列SEQIDNO:31;推定的胺基酸序列SEQIDNO:32;大腸桿菌DSM14240)中從ATG起始密碼子直到TAA終止密碼子的2586bp的DNA片段。一個SpeI位點被工程構建到反義引物的5'末端以便於連接。斜體字的引物序列與裡氏木黴cbhl啟動子的24bp同源，下劃線的序列與米麴黴P-葡糖苷酶編碼區的22bp同源。引物993467:5，-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3,(SEQIDNO:33)[O499]引物993456:5'-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3，(SEQIDNO:34)擴增反應物(50ii1)的組成為Pfx擴增緩衝液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，0.25mMdNTP，lOngpJaL660，6.4iiM引物993467，3.2iiM引物993456，ImMMgCl2和2.5單位PfxDNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)。將這些反應物在如下編程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育進行94°C60秒、55°C60秒、72t:180秒的循環30次(最終延伸15分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下2586bp的產物條帶，使用OIAQUICK⑧GelExtractionKit(:QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。另外使用如下所示的引物993453(有義)和引物993463(反義)進行PCR，來擴增裡氏木黴cbhl啟動子序列(其從該基因ATG起始密碼子上遊lOOObp處開始延伸)，產生一個1000bp的PCR片段。引物993453:5，-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3'(SEQIDNO:35)引物993463:5，-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3,(SEQIDNO:36)斜體表示的引物序列與裡氏木黴cbhl啟動子的24bp同源，下劃線的引物序列與米麴黴P_葡糖苷酶全長編碼區的22bp同源。啟動子和編碼序列之間46bp的重疊使得包含裡氏木黴cbhl啟動子的lOOObp片段能夠精確的融合於包含米麴黴13-葡糖苷酶編碼區的2586bp片段。擴增反應物(50iU)的組成為Pfx擴增緩衝液、0.25mMdNTP、lOOng裡氏木黴RutC30基因組DNA、6.4iiM引物993453、3.2iiM引物993463、lmMMgCl2和2.5單位PfxDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧5333中溫育進行94°C60秒、55t:60秒、72。C180秒的循環30次(最終延伸15分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下1000bp的產物條帶，使用QIAQUICKGelExtractionKit(:QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。用純化的片段作為模板DNA，進一步通過使用上文所示的引物993453(有義)和引物993456(反義)的重疊PCR進行擴增，來將包含裡氏木黴cbhl啟動子的1000bp片段精確地融合於包含米麴黴P_葡糖苷酶全長編碼區的2586bp片段。擴增反應物(50ii1)的組成為Pfx擴增緩衝液、0.25mMdNTP、6.4yM引物99353、3.2iiM引物993456、lmMMgCl2和2.5單位PfxDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧mastercycLER⑧5333中溫育進行94"60秒、60。C60秒、72。C240秒的循環30次(最終延伸15分鐘)。將所得的3586bp片段用SalI和SpeI消化，並連接到用同樣兩種限制酶消化過的pMJ04中，產生pSMail30(圖9)。質粒pSMail30包含與米麴黴天然P_葡糖苷酶信號序列及編碼序列(即全長米麴黴P-葡糖苷酶編碼序列)可操作地連接的裡氏木黴纖維二糖水解酶I基因啟動子及終止子。實施例13:pSMail35的構建從作為模板的pJaL660利用如下所示的引物993728(有義)及引物993727(反義)PCR擴增出從Lys-20到TAA終止密碼子的米麴黴P-葡糖苷酶成熟編碼區(減去天然信號序列，見圖10;SEQIDNO:37和38代表信號肽和它的編碼序列)。引物993728:5'-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCAAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3'(SEQIDNO:39)引物993727:5'-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3'(SEQIDNO:40)斜體字的序列與特異腐質黴內切葡聚糖酶V信號序列的20bp同源，下劃線的序列與米麴黴P-葡糖苷酶編碼區的22bp同源。將一個SpeI位點工程化到反義引物的5'端中。擴增反應物(50ii1)的組成為Pfx擴增緩衝液、0.25mMd證、10ng/iilpjal660、6.4iiM引物993728、3.2iiM引物993727、lmMMgCl^P2.5單位PfxDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧5333中溫育進行94°C60秒、55°C60秒、72t:180秒的循環30次(最終延伸15分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下2523bp的產物條帶，使用QIAQUICK⑧GelExtractionKit(QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。另外使用如下所示的引物993724(有義)和引物993729(反義)進行PCR擴增來擴增裡氏木黴cbhl啟動子的1000bp和特異腐質黴內切葡聚糖酶V信號序列的63bp(ATG起始密碼子到Ala-21，圖11，SEQIDNO:41和42)。引物993724:5，-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3'(SEQIDNO:43)引物993729:5，-GGGAGTACGCGAGATCATCCTTGGCAAGGGCCAACACCGGCA-3,(SEQIDNO:44)斜體字的引物序列與特異腐質黴內切葡聚糖酶V信號序列的20bp同源，下劃線的引物序列與米麴黴P_葡糖苷酶編碼區的22bp同源。用包含cbhl啟動子控制下的特異腐質黴內切葡聚糖酶V編碼區的質粒pMJ05作為模板，產生了一條包含裡氏木黴cbhl啟動子和特異腐質黴內切葡聚糖酶V信號序列片段的1063bp片段。裡氏木黴cbhl啟動子和特異腐質黴內切葡聚糖酶V信號序列與米麴黴P_葡糖苷酶成熟編碼序列之間有42&。的重疊，以提供所述啟動子與2523bp米麴黴13-葡糖苷酶編碼區的ATG起始密碼子之間的完美連結。擴增反應物(50ii1)的組成為Pfx擴增緩衝液、0.25mMd證、10ng/iilpMJ05、6.4iiM引物993728、3.2iiM引物993727、lmMMgCl^P2.5單位PfxDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧5333中溫育進行94°C60秒、6260°C60秒、72t:240秒的循環30次(最終延伸15分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下1063bp的產物條帶，使用QIAQUICK⑧GelExtractionKit(QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。用純化的重疊片段作為模板，用如上所述的引物993724(有義)和引物993727(反義)進行擴增，通過重疊PCR將所述包含裡氏木黴cbhl啟動子和特異腐質黴內切葡聚糖酶V信號序列的1063bp片段精確地融合於所述包含米麴黴P-葡糖苷酶成熟編碼區框的2523bp片段。擴增反應物(50ii1)的組成為Pfx擴增緩衝液、0.25mMdNTP、6.4yM引物993724、3.2iiM引物993727、lmMMgCl2和2.5單位PfxDNA聚合酶。將這些反應物在如下編程的EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧5333中溫育進行94。C60秒、60。C60秒、72°C240秒的循環30次(最終延伸15分鐘)。反應產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用TAE緩衝液分離，從凝膠上切下3591bp的產物條帶，使用QIAQUICK⑧GelExtractionKit(QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)依照生產商的說明進行純化。將所得的3591bp片段用SalI和SpeI消化，連接到用相同的限制酶消化過的pMJ04中產生pSMai135(圖12)。質粒pSMail35包含可操作地連接於特異腐質黴內切葡聚糖酶v信號序列和米麴黴e-葡糖苷酶成熟編碼序列的裡氏木黴纖維二糖水解酶I基因啟動子和終止子。實施例14:帶有特異腐質黴內切葡聚糖酶V分泌序列的米麴黴P-葡糖苷酶的表達通過PEG-介導的轉化(Penttila等，1987，Gene61155-164)將編碼與特異腐質黴內切葡聚糖酶V分泌序列連接的成熟米麴黴P-葡糖苷酶的質粒pSMail35(圖11)導入裡氏木黴RutC30中。該質粒含有構巢麴黴amdS基因，使得轉化子可以利用乙醯胺作為唯一氮源生長。將裡氏木黴RutC30在25ml添加了2%(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培養基中27。C、90rpm條件下培養17個小時。用Vac誦DrivenDisposableFiltrationSystem(—次性真空驅動過濾系統)(Millipore，Bedford,MA，USA)過濾收集菌絲體，用去離子水和1.2M山梨醇各洗滌兩次。將經過洗滌的菌絲體重懸在含15mg/mlGLUCANEX(NovozymesA/S，Bagsvard，Denmark)禾口0.36單位/ml殼多糖酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO，USA)的20ml1.2M山梨醇中，90rpm輕柔震蕩下34。C溫育15-25分鐘來生成原生質體。400xg離心7分鐘收集原生質體，用冷的1.2M山梨醇洗滌兩次。原生質體用血細胞計數器計數後重懸於STC中至終濃度1X108個原生質體/ml。多餘的原生質體在Cryo1CFreezingContainer(1C冷凍櫃)(Nalgene，Rochester,NY，USA)中-80。C保存。將大約7iig經PmeI消化的pSMai135加入100ii1原生質體溶液中，輕柔混合，然後加入260ii1PEG緩衝液，混合，室溫溫育30分鐘。然後加入STC(3ml)，混合，將轉化溶液塗布到使用構巢麴黴amdS選擇的COVE平板上。將平板在2『C溫育5_7天。將轉化子分培到C0VE2平板上，使其在28t:生長。將用pSMail35獲得的67個轉化子(稱為SMA135)分培到含有乙醯胺的新鮮平板上，讓它們在28t:產生孢子7天。將這67個SMA135裡氏木黴轉化子在含25mlpH6.0纖維素酶誘導培養基的125ml帶擋板燒瓶中培養，其中用所述轉化子的孢子接種培養基，在28°C、200rpm條件下溫育7天。用裡氏木黴RutC30作為對照。在第7天取出培養液樣品。將每種培養液lml在微量離心管中15，700xg離心5分鐘，將上清液轉移到新管中。樣品保存在4t:直到進行酶測定。用對硝基苯基-P-D-吡喃葡萄糖苷作為底物測定上清液的P-葡糖苷酶活性，如下所述。|3-葡糖苷酶活性測定在環境溫度下進行，使用25ii1等份的在50mM琥珀酸鹽(succinate)pH5.0中1:10稀釋過的培養上清液，在作為底物的200iUO.5mg/ml對硝基苯基-p-D-吡喃葡萄糖苷(溶於50mM琥珀酸鹽pH5.0)中實施。溫育15分鐘後加入100iil1MTris-HClpH8.0終止反應，用分光光度計讀取405nm吸光度。l個單位的P-葡糖苷酶活性對應於環境溫度、pH5.0條件下每升每分鐘產生liimol對硝基苯。用黑麴黴P-葡糖苷酶(NOVOZ預TM188，NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)作為酶標準品。若干個SMA135轉化子顯示了比裡氏木黴RutC30高數倍的P-葡糖苷酶活性。轉化子SMA135-04產生了最高的P-葡糖苷酶活性。用CRITERION系統(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)使用CRITERIONTris-HCl(5%分離型)凝膠(Bio-Rad，Hercules,CA，USA)進行SDS-PAGE。將5ii1第7天上清液(見上文)重懸在2X濃度的LaemmliSampleBuffer(Laemmli樣品緩衝液)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中，在5%P_巰基乙醇存在下煮沸3分鐘。將上清液樣品加載到聚丙烯醯胺凝膠上，用IXTris/甘氨酸/SDS作為運行緩衝液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)進行電泳。所得的凝膠用BIO-SAFE(DCoomassieStain(考馬斯染料)染色。總的說來，38個裡氏木黴SMA135轉化子中的26個產生了一個大約110kDa的蛋白質，其未見於作為對照的裡氏木黴RutC30中。轉化子裡氏木黴SMA135-04產生的P-葡糖苷酶水平最高。實施例15:裡氏木黴SMA135-04的發酵將100ml的下述搖瓶培養基加入500ml搖瓶中。搖瓶培養基的組成為每升20g葡萄糖、10g玉米浸漿固形物、1.45g(NH4)2S04、2.08gKH2P04、0.36gCaCl2、0.42gMgS047H20和0.42ml痕量金屬溶液。痕量金屬溶液的組成為每升216gFeCl3*6H20、58gZnS04*7H20、27gMnS04H20、10gCuS045H20、2.4gH3B03和336g擰檬酸。用來自裡氏木黴SMA135-04固體平板培養物的兩塊瓊脂塊接種搖瓶，在迴轉搖床上200rpm2『C溫育48小時。用50ml的該搖瓶培養液接種含1.8升發酵分批培養基(fermentationbatchmedium)的3升發酵容器，所述發酵分批培養基的組成為每升30g纖維素、4g葡萄糖、10g玉米浸漿固形物、3.8g(NH4)2S04、2.8gKH2P04、2.64gCaCl2、1.63gMgS04.7H20、1.8ml消泡劑和0.66ml痕量金屬溶液。痕量金屬溶液組成為每升216gFeCl36H20、58gZnS047H20、27gMnS04*H20、10gCuS04*5H20、2.4gH3B0^P336g擰檬酸。發酵補料培養基(fermentationfeedmedium)由葡萄糖和纖維素組成，以0_4g/l/hr的速率定量添加165小時。發酵容器保持在28t:的溫度，pH控制在4.75+/-0.1的設定點。以lvvm的速率向容器中通入空氣，並用轉速為1100-1300rpm的Rushton葉輪攪拌發酵液。發酵結束時，從容器中收集所有發酵液，3000xg離心去除生物質。上清液無菌過濾後保存在35-40°C。實施例16:具有纖維素分解增強活性的土生梭孢殼GH61F多肽的表徵玉米秸稈在美國能源部國立可再生能源實驗室(NREL)，Golden,CO使用稀硫酸進行預處理。預處理使用下述條件0.048g硫酸/g幹生物量、19(TC、25Xw/w幹固形物、歷時大約1分鐘。據NREL稱，經預處理的玉米秸稈(PCS)中的水不溶性固形物含有53.2%纖維素、3.2%半纖維素和31.5%木質素。通過下述方法測定纖維素和半纖維素使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002(NREL標準分析流程002號)，在二階段硫酸水解後通過高效液相層析來分析糖。木質素的測定是使用NRELStandardAnalyticalProcedure糾03(NREL標準分析流程003號)，在用硫酸水解了纖維素和半纖維素部分之後通過重量分析測定的。在酶促水解之前，用大量的去離子水洗滌PCS以去除酸預處理過程中產生的可溶性化合物。如實施例7中所述在米麴黴中表達土生梭孢殼GH61F多肽，將培養液9500xg離心，然後將上清液通過O.22iim濾器(Millipore，Billerica，MA，USA)過濾。經過過濾的培養液用ECONO-PAC10DG柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)脫鹽。如實施例15所述獲得了一種含米麴黴13-葡糖苷酶(W002/095014)的裡氏木黴纖維素酶製備物，下文中稱其為Tr/AoBG。PCS(45mg/ml，於50mM乙酸鈉pH5.0緩衝液中)的水解使用96孔深孔型平板(AxygenScientific,Inc.，UnionCity，CA，USA)進行，這些平板用ALPS300自動化實驗室用平板密封儀(ABgeneInc.，Rochester,NY，USA)密封，總反應體積為l.Oml。測試了土生梭孢殼G朋1F多肽增強含米麴黴13-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物的水解能力的能力。PCS的水解如下進行，每克纖維素使用2.25、4.5和6.75mg含米麴黴P-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物，分別添加了每克纖維素0.25、0.5和0.75mg的土生梭孢殼GH61F多肽，與分別為每克纖維素2.5、5.0及7.5mg的單獨的含米麴黴P-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物比較。在TSAutoflowC02WaterjacketedIncubator(TS自動流程式C02水蒸汽保溫箱)(NuAireInc.，Plymouth,MN，USA)中於50。C和60。C進行PCS水解。反應一式三份進行，在水解過程中取等份樣品。通過將每個水解產物的20iU等份樣品與180ill0.l麗aOH(終止試劑)混合來終止PCS水解反應。為每個樣品製備合適的系列稀釋物，並利用一種適用於96孔微量板規格的對羥基苯甲酸醯肼(para-hydroxybenzoicacidhydrazide)(PHBAH，SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0，USA)測定法來測定還原糖量，該測定法如下所述。簡單地說，將1001等份的合適稀釋的樣品置於96孔錐底微量平板中。加入50iil溶於0.5MNa0H的1.5%(w/v)PHBAH到每個孔中啟動反應。平板不加蓋95t:加熱10分鐘。讓平板冷卻到室溫(RT)，向每個孔中加入50iU蒸餾水。從每個孔取100ii1等份轉移到平底96孔板中，用SPECTRAMAX⑧MicroplateReader(微量平板讀數器)(MolecularDevices,Sunnyvale,CA，USA)測定410nm吸光度。用葡萄糖標準品(0.l-0.0125mg/ml，用0.1M氫氧化鈉稀釋)製作標準曲線，用來將所得的A41Qnm值換算成葡萄糖當量。用所得的當量來計算每個反應的PCS纖維素轉化率百分比。用下面的等式計算纖維素轉化為還原糖的程度(轉化率，％):轉化率(％)=RS(叫局xl00x162/(纖維素(mg/nil)X180)==RS(mg/nil)X100/(纖維素(Dlg/m"xl.ll"在該等式中，RS是以葡萄糖當量(mg/ml)計的溶液中還原糖濃度，因子1.Ill反映纖維素到葡萄糖的轉化中的重量增加。單獨的含米麴黴13-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物(2.5、5和7.5mg/g纖維素)或者有10%替換成土生梭孢殼GH61F多肽(2.25+0.25，4.5+0.5，6.75+0.75mg/g纖維素)的纖維素轉化率總結於表l。表l.單獨或添加有土生梭孢殼GH61F多肽的含米麴黴P-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物在5(TC及60°C、pH5.0條件下120小時的纖維素轉化率表l中所示的結果顯示，土生梭孢殼GH61F多肽增強了含米麴黴P_葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物對PCS的活性。該土生梭孢殼GH61F多肽自身(0.75mg/g纖維素)在5(TC和6(TC下120小時後分別產生了1.6%和0.9%的纖維素轉化。在5(TC和60°C下，向6.75mg含米麴黴13-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物添加0.75mg土生梭孢殼GH61F多肽都產生了比7.5mgTr/AoBG高的纖維素轉化，表明含米麴黴P-葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物對PCS的活性被土生梭孢殼GH61F多肽增強，並且含米麴黴13_葡糖苷酶的裡氏木黴纖維素酶製備物與土生梭孢殼GH61F多肽之間有協同作用。生物材料的保藏下列生物材料已經根據布達佩斯條約的規定保藏於北方區域研究中心農業研究機構專禾U培養物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)，1815UniversityStreet,Peoria，Illinois,61604，並被給予下列保藏號保藏物保藏號保藏日大腸桿菌pTter61FNRRLB-500442007年5月25日該菌株在這樣的條件下被保藏，以確保在本專利申請的審批過程中，由美國專利與商標局長根據聯邦法規彙編第37編第1.14節及美國法典第35編第122條的規定確定為有資格者可獲取該培養物。該保藏物是被保藏菌株的基本上純的培養物。本主題申請在其他國家提交了對應申請或其子申請的，該保藏物可應這些國家專利法的要求予以提供。然而應當理解，提供保藏物並不構成對於實施本發明而損害由政府授予的專利權的行為的許可。本文中所描述並要求保護的發明的範圍不應受到本文中公開的具體方面的限制，因為公開這些方面是為了舉例說明本發明的一些方面。任何等同的方面都應落入本發明的範圍。事實上，除了本文中顯示和描述的那些之外，本領域技術人員根據前面的說明書可以容易地想到本發明的各種修改。這些修改也應落入本發明的範圍。在衝突的情況下，應以包括定義在內的本公開內容為準。6權利要求一種具有纖維素分解增強活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有優選至少60％，更優選至少65％、更優選至少70％、更優選至少75％、更優選至少80％、更優選至少85％、進一步更優選至少85％、最優選至少90％、進一步最優選至少95％同一性之胺基酸序列的多肽；(b)由與(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列、(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈在優選至少低嚴緊度條件，更優選至少中等嚴緊度條件，進一步更優選至少中-高嚴緊度條件，最優選至少高嚴緊度條件下雜交的多核苷酸所編碼的多肽；(c)由包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有優選至少60％、更優選至少65％、更優選至少70％、更優選至少75％、更優選至少80％、更優選至少85％、進一步更優選至少85％、最優選至少90％、進一步最優選至少95％同一性之核苷酸序列的多核苷酸所編碼的多肽；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽包含一個或多個(數個)胺基酸的取代、缺失和/或插入的變體。2.權利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有纖維素分解增強活性的片段，或者由SEQIDN0:2的胺基酸序列或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。3.權利要求2的多肽，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽或者由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。4.權利要求1的多肽，其由大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50044中包含的質粒pTter61F中所含的多核苷酸所編碼。5.—種分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-4中任一項之多肽的核苷酸序列。6.—種核酸構建體，其包含與一個或多個(數個)指導所述多肽在表達宿主中產生的控制序列可操作連接的權利要求5的多核苷酸。7.包含權利要求6的核酸構建體的重組表達載體。8.包含權利要求6的核酸構建體的重組宿主細胞。9.一種產生權利要求l-4中任一項的多肽的方法，包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養在其野生型形式中產生所述多肽的細胞，和(b)回收所述多肽。10.—種產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列，和(b)回收所述多肽。11.一種產生親本細胞的突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列，導致該突變體產生的所述多肽比親本細胞少。12.通過權利要求11的方法產生的突變細胞。13.權利要求12的突變細胞，其還包含編碼天然或異源蛋白的基因。14.一種產生蛋白質的方法，包括(a)在有助於產生該蛋白質的條件下培養權利要求13的突變細胞，和(b)回收該蛋白質。15.權利要求5的分離的多核苷酸，其是通過下述方式獲得的(a)在優選至少低嚴緊度條件，更優選中等嚴緊度條件，進一步更優選中_高嚴緊度條件，最優選至少高嚴緊度條件下使DNA群體與(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列之基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈雜交，和(b)分離發生雜交的多核苷酸，其編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。16.—種產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，包括(a)在有助於產生所述多肽的條件下培養包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。17.用編碼權利要求1-4中任一項的多肽的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。18.—種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，包含權利要求5的多核苷酸的子序列，其中任選地該dsRNA是siRNA或miRNA分子。19.權利要求18的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其長度為大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或更多個雙鏈體核苷酸。20.—種抑制細胞中多肽的表達的方法，包括對細胞施用或在細胞中表達權利要求18或19的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子。21.—種核酸構建體，其包含與編碼信號肽的核苷酸序列可操作連接的編碼蛋白質的基因，所述信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1-15或者由SEQIDNO:2的胺基酸1_15組成，其中所述基因對於所述核苷酸序列而言是外源的。22.包含權利要求21的核酸構建體的重組表達載體。23.包含權利要求21的核酸構建體的重組宿主細胞。24.—種產生蛋白質的方法，包括(a)在有助於產生所述蛋白質的條件下培養權利要求23的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。25.—種降解或轉化含纖維素材料的方法，包括在有效量的權利要求1-4中任一項所述的具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，其中與不存在所述具有纖維素分解增強活性的多肽時相比，該具有纖維素分解增強活性的多肽的存在增加含纖維素材料的降解。26.—種用於產生發酵產物的方法，包括(a)在有效量的權利要求1-4中任一項所述的具有纖維素分解增強活性的多肽的存在下，用有效量的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中與不存在所述具有纖維素分解增強活性的多肽時相比，該具有纖維素分解增強活性的多肽的存在增加含纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發酵微生物將步驟(a)的經糖化的含纖維素材料發酵以產生發酵產物；和(c)從發酵回收發酵產物。全文摘要本發明涉及具有纖維素分解增強活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用這些多肽的方法。文檔編號C12N15/11GK101784659SQ200880101361公開日2010年7月21日申請日期2008年5月30日優先權日2007年5月31日發明者丁晗澍,金伯利·布朗,阿爾弗雷多·洛佩斯德利昂申請人:諾維信股份有限公司