一種新的人分泌蛋白hPAP21的製作方法
2023-06-16 00:25:06 1
專利名稱：一種新的人分泌蛋白hPAP21的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、基因工程學、腫瘤學、細胞生物學領域。具體地，本發明涉及一種新的分泌蛋白hPAP21蛋白及其核酸序列。本發明還涉及該蛋白和核酸序列的製備方法和用途。
背景技術：
分泌蛋白是一類功能非常重要的蛋白，對多細胞生物的生長、發育、細胞分化增殖、凋亡、細胞通訊、信號傳導中發揮著重要作用。人體中分泌蛋白佔人類蛋白質組的十分之一，它們參與了信號途徑、血液凝固、免疫防禦、癌症發生等多種過程，如消化酶、胞外基質與血漿中的很多主要因子，以及激素、神經肽、細胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潛在的臨床應用價值，並已在實際上得到了廣泛的應用，如生長激素、幹擾素和白細胞介素等分泌蛋白是由信號肽(signal peptide)介導，進入內質網，然後分泌到細胞外。蛋白質分子中的信號肽研究開始於20世紀60年代，這方面的工作是在研究分泌蛋白的基礎上進行的，當時的研究旨在了解，在核糖體上合成的新生肽鏈是通過何種途徑被分泌到細胞外的。德裔美國科學家布洛貝爾(G.Blobel)，因對蛋白質分子中信號肽的開創性研究，獲得了1999年度諾貝爾生理學或醫學獎。
分泌蛋白區別於其他胞質蛋白的唯一共同的特徵就是氨基末端信號肽序列。信號肽在各個蛋白中都不相同，但有一些較類似的性質。起始的甲硫氨酸後是一些多為親水的帶正電荷的殘基，該區為n區，然後是7-15個殘基的疏水區h區，該區富含亮氨酸、丙氨酸和纈氨酸，最後的c區包含信號肽蛋白酶的剪切位點。在剪切位點的-1和-3多為傾向為丙氨酸或其他帶短側鏈的胺基酸，而在-4和-6位則為有助於剪切的脯氨酸。因此針對信號肽發展了許多遺傳算法來進行信號肽的分析預測。預測信號肽和蛋白質結構域近年來得到迅猛發展，這極大地歸功於機器學習方法的改善和更多的序列信息來訓練這些算法。這其中比較有效的模型就是神經網絡模型和隱藏的馬科夫模型。
SignalP是目前最有效的預測信號肽和剪切位點的方法。該軟體綜合了神經網絡模型和隱藏的馬科夫模型，前者預測是否含信號肽蛋白，後者預測剪切位點。通過大量的序列樣本進行訓練(非同源的原核生物蛋白266個革蘭氏陰性菌序列，141個革蘭氏陽性菌序列；真核生物蛋白1011個非同源蛋白序列)，得到較高的準確性，真核生物準確性為78％，原核生物為89％。
用SignalP2.0對人蛋白資料庫進行信號肽預測，結合pSORT分析，初步確定後選基因。RT-PCR獲得目的基因，構建到真核表達載體中使其表達，WESTERN BLOT驗證生物信息學分析結果，確定基因是否表達分泌蛋白。
通過上述生物信息學預測與實驗驗證結合的方法，獲得了1個新分泌蛋白hPAP21。而且通過其保守的功能結構域預測，hPAP21可能是一個新的胞外蛋白酶。通過去糖基化酶、糖鏈抑制劑處理，及定點突變分析進一步確定hPAP21是糖蛋白，而且糖鏈對蛋白的分泌很重要。
發明內容
本發明的目的在於提供了一種新的人分泌蛋白hPAP21；本發明的另一目的在於提供了上述新的人分泌蛋白hPAP21的製備方法；本發明的再一目的在於提供了與上述新的人分泌蛋白hPAP21特異結合的抗體。
本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的本發明公開了一種分離的人分泌蛋白hPAP21，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示胺基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。優選的，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示胺基酸序列。
本發明還公開了一種製備上述的分離的人分泌蛋白hPAP21的方法，其特徵在於，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hPAP21活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成hPAP21蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成hPAP21蛋白的重組細胞；(c)在適合表達hPAP21蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有hPAP21蛋白活性的多肽。
優選的，上述步驟(a)中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸。
本發明還公開了能與權利要求1所述的人分泌蛋白hPAP21多肽特異性結合的抗體。
本發明的hPAP21可能是一個新的胞外蛋白酶。通過去糖基化酶、糖鏈抑制劑處理，及定點突變分析進一步確定hPAP21是糖蛋白，而且糖鏈對蛋白的分泌很重要。並且分泌蛋白是一種功能非常重要的蛋白，在多細胞生物的生長、發育、細胞分化增殖、凋亡、細胞通訊、信號傳導中發揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應用價值。
圖1是本發明實施例1的SignalP2.0(SignalP-NN)分析的信號肽結果；圖2是本發明實施例1的SignalP2.0(SignalP-HMM)分析的信號肽結果；圖3是本發明實施例1的hPAP21基因及蛋白基本結構；圖4是本發明實施例1的hPAP21同源蛋白的胺基酸序列比較結果(黑色為保守區域，灰色為相似區域)；圖5是本發明實施例1的hPAP21同源蛋白進化樹分析結果圖；圖6是本發明實施例2的Q9BHPAP21基因的克隆瓊脂糖凝膠電泳圖；圖7是本發明實施例2的Western blotting驗證hPAP21基因的分泌特性及糖基化修飾結果圖；圖8是本發明實施例3的Western blotting驗證N-糖基化對hPAP21蛋白分泌特性的影響結果圖；圖9是本發明實施例4搜索genecard網站得到的hPAP21晶片雜交的表達譜；圖10是本發明實施例4搜索genecard網站得到的hPAP21電子Northern表達譜；圖11是本發明實施例4的人類多組織RNA印跡膜對hPAP21基因的組織分布結果圖；圖12是本發明實施例5的免疫螢光顯示hPAP21蛋白在細胞中的分布圖像；圖13是本發明實施例5的hPAP21蛋白的亞細胞定位圖像；圖14是本發明實施例6的菌落的PCR鑑定。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。
實施例1人hPAP21蛋白生物信息學分析序列相似性比對及進化樹分析，採用軟體Alignment，6eneDoc，Treeview。信號肽、穿膜區域預測、亞細胞定位分析分別採用網上的共享web軟體SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/，SOSUI http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html及PSORT http//psort.nibb.ac.jp/。
功能結構域和基元(motif)預測，採用了
PROSITE http//us.expasy.org/prosite/，InterPro Scan http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html，ProfileScan，http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN以及NCBI的CDART(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)，http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml。
修飾位點分析採用了http//au.expasy.org/tools/。
結果1.hPAP21蛋白由C2orf7基因(GenBank accession No.NM032319)編碼，在基因組上定位於2p13.2上，成熟mRNA共1103鹼基，翻譯後蛋白由188個胺基酸組成。
核酸及胺基酸序列見SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其中，胺基酸序列中，N端1-20個胺基酸為信號肽區域，65-156個胺基酸為PA結構域。
2.利用SignalP2.0軟體分析該蛋白疏水性，根據結果(圖1和圖2)，該蛋白N端序列為信號肽的可能性為99.9％。信號肽剪切位點最可能是20位和21之間，即胺基酸CVA-AH間。軟體計算結果如下SignalP-NN result＞Sequence length＝70# Measure Position Value Cutoff signal peptide？max. C 22 0.884 0.33 YESmax. Y 22 0.848 0.32 YESmax. S 11 0.986 0.82 YESmean S 1-210.891 0.47 YES# Most likely cleavage site between pos.21 and 22VAA-HGSignalP-HMM result＞SequencePredictionSignal peptideSignal peptide probability1.000Signal anchor probability0.000Max cleavage site probability0.447 between pos.20 and 21
3.從SOSUIsignal Result的結果來看，hPAP21的N端有一段長20個胺基酸的信號肽段，沒有穿膜區域。用PSORT軟體分析預測HPAP21的分布為66.7％位於細胞外(包括細胞壁)，22.2％位於液泡，11.1％位於線粒體中。
4對hPAP21基因成熟mRNA(907bp)BLAST人基因組序列得到基因在基因組上的分布，如圖3A所示基因有5個外顯子，共跨越5,222bp。hPAP21蛋白結構簡單(圖3B)，N端1-20aa為信號肽區域，65-156aa為PA結構域。
5.以hPAP21的蛋白序列在NCBI的nr資料庫中進行序列同源性搜索，發現在小鼠中有一同源性達到97％的同源蛋白(序列號XP_132652)但是該蛋白也是功能未知的。另外還有一些同源性較低的蛋白，分別有來自非洲爪蟾，果蠅，瘧蚊和線蟲等，見表1。
表1hPAP21的同源蛋白
這些同源蛋白的序列比對採軟體Alignment，經GeneDoc軟體處理後，結果如圖4。
進化樹分析顯示人與小鼠、爪蟾的進化關係最近，其次是線蟲，最後才是果蠅和瘧蚊。雖然果蠅和瘧蚊的序列同源性較線蟲更高。結果見圖5。
6.用PROSITE http//us.expasy.org/prosite/分析hPAP21，發現了2個N糖基化位點分別在121、171位；1個0糖基化位點在186位；9個磷酸化位點分別在36、42、47、60、125、132、133、150、155位；2個N-豆蔻醯化位點分別在54、160位。
實施例21hPAP21基因的克隆和hPAP21-pcDNA3.1A-真核載體的構建1.1設計引物hPAP21-pCDNA3.1A-FCCGGATCCATGGTCCCCGGCGC(SEQ ID NO.3)(含BamHI限制性內切酶切點)hPAP21-pCDA3.1A-RCCAAGCTTCCAGAAGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.4)(含HindIII限制性內切酶切點)
1.2PCR反應
從國家人類基因組南方研究中心構建的Q9BHPAP21克隆載體中擴增Q9BHPAP21基因全長ORF片段，擴增出的片段大小為581bp。2％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖6所示。
PCR條件94℃5min；94℃45s，42℃45s，72℃1min，35cycle；72℃7min.
1.3BamHIHindIII雙酶切PCR產物、質粒
37℃酶切5hr，70℃熱失活15min1.4連接
16℃連接16hr。
1.5電轉化以參數電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω進行電轉化，將1μl連接產物轉化至感受態細胞中，37℃，250rpm於LB培養液中振蕩培養1hr，塗平板。
菌落PCR鑑定在長有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個菌落作PCR鑑定，PCR反應體系與上述PCR的體系相同。
質粒提取將經PCR鑑定陽性克隆質粒hPAP21-pcDNA3.1A，採用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)試劑盒抽提。所得質粒經核酸測序驗證插入片段正確(由申友公司完成)。
2Western blotting驗證hPAP21基因的分泌特性及糖基化修飾2.1轉染真核細胞1)鋪細胞預熱DMEM(無血清，無抗生素)培養基和胰酶(0.1％trypsin)，37℃；COS-7細胞接種密度是1-1.5×105/35mm培養皿；37℃，5％CO2培養5-24小時，使細胞貼壁；2)轉染A質粒用量1~2ug，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；B脂質體Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；A+B，混勻，室溫靜置15-45min，一般30min；培養細胞去上清，用DMEM(無血清，無抗生素)洗一次，加800ul DMEM(無血清，無抗生素)，滴入轉染混合液，搖勻；如細胞貼壁性不好或不耐受無血清培養液，可用完全培養基；37℃，5％CO2培養5-24小時，換液為DMEM(10％FCS)，繼續培養至總轉染時間為48-72小時。
2.2Western Blotting1)樣品處理上清處理收集細胞培養盤中的上清，13000rpm，8min。收集離心上清，取200ul純化。
細胞處理用PBS(pH7.4)2ml洗盤中細胞兩次，加200ul裂解緩衝液，冰上20分鐘裂解。然後刮下細胞，將裂解液於4℃離心12000rpm，8min，回收上清，進行純化。
TALON樹脂預處理將1體積的TALON樹脂貯存液於5000rpm離心5分鐘，去上清，用1×E/W緩衝液洗兩次，然後加等體積的1×E/W緩衝液得到50％的樹脂混合液。
樣品純化在樣品中加入適量的預處理過的50％Slurry，加入800ul1×E/W緩衝液，4℃結合2小時。8000rpm離心5分鐘去上清，用1×E/W緩衝液洗3-4次，去除非特異結合的蛋白。
2)蛋白電泳及轉膜常規蛋白電泳分離樣品；15％分離膠，60V 30min，160V 1hr20min。PVDF膜用甲醇浸溼10min，去離子水衝洗，再轉移到轉移緩衝液中平衡20分鐘；電泳膠置轉移緩衝液中平衡20分鐘；厚紙墊板也置於轉移緩衝液中平衡。按下列順序放置轉膜儀負極—墊板—電泳膠—PVDF膜—墊板—正極。轉膜半小時，電壓15伏。
3)膜的封閉3％脫脂牛奶2％BSA/PBST 50ml，水平搖床，室溫封閉4小時；也可以先室溫封閉若干時間，再放入4℃冰箱，過夜；4)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封閉液稀釋一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀釋倍數1000倍；將膜完全沒於一抗稀釋液中。水平搖床，室溫2小時，也可過夜。
5)洗滌先用PBST短暫地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗10分鐘；3*10分鐘，室溫洗滌；6)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封閉液稀釋二抗，10000倍稀釋；水平搖床，室溫2小時。
7)洗滌先用PBST短暫地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗10分鐘；3*10分鐘，室溫洗滌；8)檢測將檢測試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開前平衡至室溫；將檢測試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測試劑的用量為0.1ml/cm2；膜置於吸水紙上乾燥，蛋白面朝上，檢測試劑加在膜上，覆蓋整個膜表面；室溫2分鐘；用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸乾多餘的檢測試劑；膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時間10秒；先用10秒時間多壓幾張，再延長時間壓一張或幾張，延長時間壓片的時候，洗最先壓的片子。
2.3去糖基化分析2.3.1肽N-糖苷酶F(PNGase F)(New England Biolabs)酶切1)蛋白樣品處理見Western Blot樣品處理方法；2)在1×糖蛋白變性緩衝液中100℃煮沸10分鐘，使糖蛋白變性；3)加1/10體積的10×G7緩衝液及10％NP-40；4)加入1ulPNGase F，37℃，過夜；5)電泳，Western Blot檢測。
2.3.2糖苷內切酶H(Endo H)(New England Biolabs)酶切1)蛋白樣品處理見Western Blot樣品處理方法；2)在1×糖蛋白變性緩衝液中100℃煮沸10分鐘，使糖蛋白變性；3)加入1/10體積的10×G5緩衝液；4)加入1ul Endo H，37℃，過夜；5)電泳，Western Blot檢測。
以上實驗結果見圖7。
如圖所示，CL表示為細胞裂解液；CM表示細胞培養上清。可以初步判斷為分泌蛋白，但分子量較預測的大，可能是因為翻譯後修飾，特別是N-糖基化。為證實這一猜測，選擇C2orf7蛋白穩定表達的轉染CHO細胞株A3進行分析。細胞分盤培養3天，長到80-90％滿，收細胞與培養上清，蛋白純化、電泳、去糖基化酶處理，western blot檢測。結果顯示蛋白的確被N-糖基化，而且糖基化程度在胞內與胞外的狀態不同。胞內蛋白主要以高甘露糖鏈存在(c箭頭所示)能被肽-N糖苷酶F與糖苷內切酶H完全切下，蛋白條帶遷移變快，至d箭頭位置；少量的以新合成的未被糖基化蛋白形式存在(d箭頭所示)。胞外分泌型蛋白主要以複雜糖鏈存在(a，b箭頭所示)只能被肽-N糖苷酶F切下；少量的以高甘露糖鏈存在(c箭頭所示)，能被肽-N糖苷酶F與糖苷內切酶H完全切下。
實施例3N-糖基化對hPAP21蛋白分泌特性的影響3.1衣黴素(tunicamycin)(TM)處理1)二甲基亞碸(DMSO)溶解衣黴素成5mg/ml；2)穩定轉染細胞株以5×105/35mm培養皿密度接種；2)培養24小時後，培養細胞去上清，PBS(pH7.4)洗一次，換液為加有2ug/ml的衣黴素的DMEM/10％FCS培養基；陰性對照，換液為加有相同體積的DMSO的DMEM/10％FCS培養基；3)培養24小時後，收蛋白，Western Blot檢測。蛋白樣品處理見Western Blot樣品處理方法。
3.2突變體構建採用基於重疊PCR的定點突變方法。設計突變位點序列居中的正向與反向引物(mutant F-P，mutant R-P)，以野生型基因序列為模板，mutant F-P與野生型(wild type)R-P；wild type F-P與mutant R-P為引物，分別PCR。電泳，割膠純化PCR產物，等量混合作為第二次PCR的模板，以wild type F-P與wild type R-P為引物，二次PCR，得到突變體PCR產物。構建到合適載體中。突變體蛋白結構示意圖見圖3B。
一般分泌蛋白的糖基化對蛋白的分泌很重要。這裡為分析N-糖基化是否會影響蛋白分泌，首先在培養液中加入衣黴素(2μg/ml)繼續培養24小時後，收蛋白，western blot檢測(圖8A)。衣黴素可抑制N-糖鏈形成，加入衣黴素，hPAP21蛋白的分泌被抑制，蛋白穩定表達降低。初步證明了N-糖基化對分泌及表達的重要性。
為更進一步分析N-糖基化對分泌的影響，把糖基化位點Asn-Xaa-Ser/Thr中的Asn突變為Gln，構建了突變體。野生型與突變體分別瞬轉CHO細胞，western blot檢測(圖8B)。突變體-1(Asn121Gln)的蛋白條帶與野生型的遷移一致，說明121位在野生型中沒有被糖基化。突變體-2(Asn171Gln)與突變體-3(Asn121Gln Asn171Gln)的蛋白條帶遷移一致，而且較野生型遷移快，遷移位置與野生型蛋白被肽-N糖苷酶F處理後的一致，說明171位被糖基化，又一次證明了121位沒有被糖基化。突變體都能分泌，但分泌效率有差異，灰度掃描後量化野生型及各突變體的分泌效率(圖8B)，與野生型相比，突變體-2(Asn171Gln)與突變體-3(Asn121Gln Asn171Gln)降低了約40％，說明N-糖基化對hPAP21蛋白的分泌的確很重要，至少是對蛋白的高效分泌是必要的。另一方面，突變體-2(Asn171Gln)與突變體-3(Asn121Gln Asn171Gln)的蛋白穩定表達量也有顯著的降低。
實施例4人hPAP21基因的組織表達譜4.1電子Northern表達譜4.1.1搜索genecard網站http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/，分別得到hPAP21晶片雜交的表達譜(圖9)與電子Northern表達譜(圖10)。
4.1.2搜索SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch，可得到unigene的表達信息。
4.2Northern印跡4.2.1材料和試劑隨機引物標記試劑盒(random primer DNA labeling kit)購自寶生物工程(大連)有限公司)；人類多組織RNA印跡膜和快速雜交液(ExpressHyb hybridization solution)均購自Clontech公司；20×SSC(PH＝7.0)NaCl 175.32g檸檬酸鈉88.23g，同位素P32購自PE公司。
洗膜溶液wash solution I2×SSC；0.05％SDS；加水到1000ml20×SSC--------100ml20％SDS--------2.5ml加水到1000mlwash solution II0.1×SSC；0.1％SDS；加水到1000ml20×SSC--------5ml20％SDS--------5ml加水到1000ml採用Clontech公司的人類多組織RNA印跡膜對該基因的組織分布進行研究。該印跡膜含12種組織，腦、心、骨骼肌、結腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺、外周血白細胞。
由Northern印跡結果(圖11)，可以看出該基因轉錄水平的表達較為廣泛，各個組織中均有一定表達，在骨骼肌、心臟和肝臟中表達最高。
實施例51hPAP21蛋白的亞細胞定位將帶有外源基因的質粒轉染單層培養貼壁細胞，外源基因以融合或非融合的形式在細胞中表達，用針對融合或非融合蛋白的抗體處理細胞，再用FITC標記的二抗處理，隨後在螢光顯微鏡下觀察，細胞內結合有螢光二抗的部分會在單色光的激發下，發出螢光，從而可以判斷表達的蛋白在細胞中的分布。
材料選取COS-7細胞或Hela細胞，100×PLA(多聚賴氨酸)一抗Tag抗體(mouse-anti-human c-myc 9E10)或特異抗體，1∶50-1∶200稀釋(PBS/5％BSA)，二抗驢抗兔CyTM2IgG，1∶50稀釋(PBS/5％BSA)結果見圖12，免疫螢光顯示hPAP21蛋白分布在除細胞核以外的細胞質中。
2hPAP21蛋白的分泌途徑分泌蛋白的一般分泌途徑有兩種經過內質網、高爾基細胞器然後分泌；不經過內質網、高爾基細胞器，直接分泌。為分析hPAP21蛋白的分泌途徑，將pcDNA3.1-hPAP21-Myc和pEYFP-Golgi(Clontech)質粒共轉到CHO細胞中，進行螢光共定位分析(圖13)(方法同上，二抗使用驢抗兔CyTM5 IgG)。pEYFP-Golgi質粒有高爾基細胞器膜定位信號，使表達的融合蛋白定位在高爾基體上，通過共聚焦螢光顯微鏡分析判斷hPAP21蛋白是否定位在高爾基體內。圖A表示pEYFP-Golgi的YFP融合蛋白的細胞定位情況(綠色)，B圖表示標有Cy5的二抗對目的基因的亞細胞定位的檢測(紅色)，C圖表示A與B圖的重疊。在C圖中黃色表示A、B圖中的蛋白共定位。如圖所示hGH，P28分別做為陽性和陰性對照。P28蛋白已知定位於細胞核內，沒有黃色顯現，人生長激素(hGH)是通過高爾基細胞器分泌的分泌蛋白。所以hPAP21蛋白的確部分定位在高爾基體內，說明hPAP21蛋白的分泌途徑是典型的或是依賴內質網、高爾基細胞器的分泌。
實施例6人hPAP21基因原核細胞表達、純化及抗體製備與純化在該實施例中，將全長的人hPAP21編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1基因片段的克隆1.1材料表達載體pGEX-5x-1Pharmacia公司產品，全長4969bp，為含穀胱甘肽轉硫酶(glutathione S-transferase，GST)的融合表達載體。含Ptac啟動子，氨苄青黴素抗性，GST後接多克隆位點，含三個讀框的終止碼，GST與目的基因之間有Factor Xa識別位點。
合成引物正向引物CCGAATTCGCCCACGGCTTCCGTAT(SEQ ID NO.5)，含酶切位點EcoRI；反向引物CGGCTCGAGCTACCAGAAGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.6)，酶切位點XhoI。以上引物均由上海申友公司合成。
菌株E.coli DH5α1.2方法直接以先前構建的pcDNA3.1A-hPAP21質粒為模板，設計合適引物擴增基因片段，設計引物時使擴增出的片段去掉編碼信號肽的一段。這樣通過原核細胞表達出的蛋白才與真核細胞中分泌到胞外的蛋白相同。終止密碼子採用基因本身的終止密碼子。
(1)PCR反應
採用相應引物根據下列組分進行PCR反應成分 體積
94℃3min；94℃變性30s，54℃退火40sec，72℃延伸1min，共30個循環；72℃總延伸7min。
(2)膠回收採用QIAGEN公司的Gel Extraction Kit參照操作手冊割膠回收。
(3)酶切載體片段和擴增片段根據下列組分進行酶切反應成分體積
37℃酶切12hr，70℃熱失活15min(4)連接酶切好的載體和擴增片段根據下列組分進行連接反應成分 體積
16℃連接12hr。
(5)轉化參見分子克隆實驗指南(6)菌落的PCR鑑定在長有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個菌落作PCR鑑定，PCR反應體系與上述PCR的體系相同。電泳圖像見圖14。
(7)質粒小抽採用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)參照產品操作手冊抽提質粒，質粒測序，插入片段正確。
2hPAP21蛋白的原核表達和純化2.1材料Glutathione Sepharose 4B購買自Pharmacia公司；Factor Xa購買自Pharmacia公司；E.coli BL21；上述構建好的pGEX5x-hPAP21質粒。
2.2方法(1)小量表達構建的表達菌種接種於5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm過夜培養。過夜培養的飽和菌1∶50接種於5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培養至OD600＝0.6。不同濃度的IPTG誘導，繼續培養3-5hr。8000rpm離心10min，去上清，加500ml1×PBS，重懸菌體。取出20ul走SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。
(2)大量表達及樣品處理根據小量表達的條件放大，菌體重懸。加入1M DTT至最終濃度為5mM，PMSF至最終濃度為100ug/ml。冰浴超聲裂解細胞成勻漿。加20％Triton X-100至終濃度1％，冰浴30min。12000rpm離心10min，分裝上清，-20℃儲存。
(3)純化將凍存細胞上清13000rpm，4℃，離心10分鐘，取上清。加入適量50％GlutathioneSepharose 4B Slurry，4℃搖動混勻2hr。Glutathione Sepharose 4B的預處理方法見該試劑盒的操作手冊。3000rpm離心5分鐘，去上清，重懸於PBS中，重複洗滌四次，上柱。用PBS洗滌至所測OD值接近空白對照PBS。換用GST Elution buffer洗脫，測每一收集管的OD值。收集洗脫後的蛋白，裝入透析帶透析，期間適當換透析液1×PBS。透析後收集袋內液體，測蛋白濃度，並用蛋白電泳檢測。
3hPAP21蛋白的抗體製備和純化3.1材料Protein A Sepharose CL-4B購自Pharmacia公司3.2方法(1)所得蛋白免疫兔子，制多克隆抗體。此部分工作由上海生物工程中心動物房完成(2)收集的免疫後兔子血離心收集上清，得到抗血清，Western檢測所得抗體的效果和特異性。
(3)用Protein A Sepharose CL-4B純化所得抗血清，並用結合有GST蛋白的Glutathione Sepharose 4B出去其中的抗GST抗體。
預處理Protein A Sepharose CL-4B，見產品說明。用Wash/binding buffer(20mM磷酸鈉溶液，150mM NaCl，pH＝7.4)配製50％的Slurry。樣品準備，血清樣品用Wash/binding buffer 1∶1稀釋。將平衡好的50％Slurry倒入柱子填充，使樹脂在重力作用下自然沉降。用10倍柱體積的Wash/binding buffer平衡柱子。上樣，樣品加至樹脂頂部。流出液重複上柱三遍。用10倍柱體積的Wash/binding buffer洗，直到280nm的光吸收接近空白。用4倍柱體積的Elution Buffer(100mM Glycine-HCl，pH＝3.0)洗脫，收集流出液，每管200ul，測定280OD值。直至無蛋白洗出。再生柱子，4倍Elution Buffer繼續洗脫後用Wash/binding buffer大量洗。
實施例7CHO hPAP21蛋白穩定表達細胞株構建2μg真核表達質粒用脂質體轉染到CHO細胞(35mm培養皿)，培養48小時；消化至100mm培養皿，加G418至終濃度1000μg/ml(CHO)培養2-3星期直至有克隆形成；去培養皿內的培液，PBS洗兩次，胰酶浸泡過的無菌濾紙片覆蓋於克隆上，消化數分鐘後轉移至24孔培養皿，繼續培養；Western blot鑑定表達目的蛋白的克隆。
序列表110上海人類基因組研究中心120一種新的人分泌蛋白hPAP21130NP-13481606170PatentIn version 3.221012111103212DNA213Homo sapiens220
221CDS222(69)..(635)220
221sig_peptide222(69)..(128)220
221polyA_signal222(1033)..(1038)220
221polyA_signal222(1058)..(1063)4001gtcctgcgag cgacgcgcgg cggggcggcg agaggaaacg cggcgccggg ccgggcccgg 60ccctggag atg gtc ccc ggc gcc gcg ggc tgg tgt tgt ctc gtg ctc tgg 110Met Val Pro Gly Ala Ala Gly Trp Cys Cys Leu Val Leu Trp1 5 10ctc ccc gcg tgc gtc gcg gcc cac ggc ttc cgt atc cat gat tat ttg158Leu Pro Ala Cys Val Ala Ala His Gly Phe Arg Ile His Asp Tyr Leu15 20 25 30tac ttt caa gtg ctg agt cct ggg gac att cga tac atc ttc aca gcc206
Tyr Phe Gln Val Leu Ser Pro Gly Asp Ile Arg Tyr Ile Phe Thr Ala35 40 45aca cct gcc aag gac ttt ggt ggt atc ttt cac aca agg tat gag cag 254Thr Pro Ala Lys Asp Phe Gly Gly Ile Phe His Thr Arg Tyr Glu Gln50 55 60att cac ctt gtc ccc gct gaa cct cca gag gcc tgc ggg gaa ctc agc 302Ile His Leu Val Pro Ala Glu Pro Pro Glu Ala Cys Gly Glu Leu Ser65 70 75aac ggt ttc ttc atc cag gac cag att gct ctg gtg gag agg ggg ggc 350Asn Gly Phe Phe Ile Gln Asp Gln Ile Ala Leu Val Glu Arg Gly Gly80 85 90tgc tcc ttc ctc tcc aag act cgg gtg gtc cag gag cac ggc ggg cgg 398Cys Ser Phe Leu Ser Lys Thr Arg Val Val Gln Glu His Gly Gly Arg95 100 105 110gcg gtg atc atc tct gac aac gca gtt gac aat gac agc ttc tac gtg 446Ala Val Ile Ile Ser Asp Asn Ala Val Asp Asn Asp Ser Phe Tyr Val115 120 125gag atg atc cag gac agt acc cag cgc aca gct gac atc ccc gcc ctc 494Glu Met Ile Gln Asp Ser Thr Gln Arg Thr Ala Asp Ile Pro Ala Leu130 135 140ttc ctg ctc ggc cga gac ggc tac atg atc cgc cgc tct ctg gaa cag 542Phe Leu Leu Gly Arg Asp Gly Tyr Met Ile Arg Arg Ser Leu Glu Gln145 150 155cat ggg ctg cca tgg gcc atc att tcc atc cca gtc aat gtc acc agc 590His Gly Leu Pro Trp Ala Ile Ile Ser Ile Pro Val Asn Val Thr Ser160 165 170atc ccc acc ttt gag ctg ctg caa ccg ccc tgg acc ttc tgg tag 635Ile Pro Thr Phe Glu Leu Leu Gln Pro Pro Trp Thr Phe Trp175 180 185aagagtttgt cccacattcc agccataagt gactctgagc tgggaagggg aaacccagga 695attttgctac ttggaatttg gagatagcat ctggggacaa gtggagccag gtagaggaaa 755agggtttggg cgttgctagg ctgaaaggga agccacacca ctggccttcc cttccccagg 815gcccccaagg gtgtctcatg ctacaagaag aggcaagaga caggccccag ggcttctggc 875
tagaacccga aacaaaagga gctgaaggca ggtggcctga gagccatctg tgacctgtca935cactcacctg gctccagcct cccctaccca gggtctctgc acagtgacct tcacagcagt995tgttggagtg gtttaaagag ctggtgtttg gggactcaat aaaccctcac tgacttttta1055gcaataaagc ttctcatcag ggttgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 11032102211188212PRT213Homo sapiens4002Met Val Pro Gly Ala Ala Gly Trp Cys Cys Leu Val Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Ala Cys Val Ala Ala His Gly Phe Arg Ile His Asp Tyr Leu Tyr Phe20 25 30Gln Val Leu Ser Pro Gly Asp Ile Arg Tyr Ile Phe Thr Ala Thr Pro35 40 45Ala Lys Asp Phe Gly Gly Ile Phe His Thr Arg Tyr Glu Gln Ile His50 55 60Leu Val Pro Ala Glu Pro Pro Glu Ala Cys Gly Glu Leu Ser Asn Gly65 70 75 80Phe Phe Ile Gln Asp Gln Ile Ala Leu Val Glu Arg Gly Gly Cys Ser85 90 95Phe Leu Ser Lys Thr Arg Val Val Gln Glu His Gly Gly Arg Ala Val100 105 110Ile Ile Ser Asp Asn Ala Val Asp Asn Asp Ser Phe Tyr Val Glu Met
115 120 125Ile Gln Asp Ser Thr Gln Arg Thr Ala Asp Ile Pro Ala Leu Phe Leu130 135 140Leu Gly Arg Asp Gly Tyr Met Ile Arg Arg Ser Leu Glu Gln His Gly145 150 155 160Leu Pro Trp Ala Ile Ile Ser Ile Pro Val Asn Val Thr Ser Ile Pro165 170 175Thr Phe Glu Leu Leu Gln Pro Pro Trp Thr Phe Trp180 185210321122212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4003ccggatccat ggtccccggc gc 22210421124212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4004ccaagcttcc agaaggtcca gggc24
210521125212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4005ccgaattcgc ccacggcttc cgtat25210621128212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4006cggctcgagc taccagaagg tccagggc 28
權利要求
1.一種分離的人分泌蛋白hPAP21，其特徵在於，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示胺基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。
2.如權利要求1所述的一種分離的人分泌蛋白hPAP21，其特徵在於，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示胺基酸序列。
3.一種製備權利要求1的分離的人分泌蛋白hPAP21的方法，其特徵在於，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hPAP21活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成hPAP21蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成hPAP21蛋白的重組細胞；(c)在適合表達hPAP21蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有hPAP21蛋白活性的多肽。
4.如權利要求3所述的一種製備人分泌蛋白hPAP21的方法，其特徵在於，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸。
5.一種抗體，其特徵在於，所述抗體是能與權利要求1所述的人分泌蛋白hPAP21多肽特異性結合的抗體。
6.一種含有權利要求1的人分泌蛋白hPAP21的藥物組合物。
全文摘要
本發明公開了一種人類新的分泌蛋白hPAP21。本發明的hPAP21可能是一個新的胞外蛋白酶。通過去糖基化酶、糖鏈抑制劑處理，及定點突變分析進一步確定hPAP21是糖蛋白，而且糖鏈對蛋白的分泌很重要。分泌蛋白是一種功能非常重要的蛋白，在多細胞生物的生長、發育、細胞分化增殖、凋亡、細胞通訊、信號傳導中發揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應用價值。
文檔編號C12N15/11GK1721534SQ20041005284
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月14日 優先權日2004年7月14日
發明者周宇波, 朱智東, 朱弘, 黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心