膜透過型nfat抑制肽的製作方法
2023-06-29 20:51:41 4
專利名稱：膜透過型nfat抑制肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及到含有生物膜通過信號序列的新型肽化合物。另外本發明還涉及到由數個精氨酸殘基和VIVIT構成的NFAT活性的抑制劑、免疫抑制劑以及心肥大抑制劑。
背景技術：
以往，對於移植手術後的排斥反應或特應性皮炎等免疫疾病使用各種各樣的化合物作為免疫抑制劑。例如環孢菌素A(CysA)以及FK506是眾所周知的免疫抑制劑，人們也都知道當將這些抑制劑用於動物時，會產生腎功能低下、高血壓、胰島素分泌量低下或神經毒性等副作用。另外，就CysA以及FK506以外的免疫抑制劑產生的副作用也進行了研究，人們一直期盼副作用更少的免疫抑制劑。
現在，除了利用上述合成化合物進行治療外，將含有外源基因的載體用於人的基因治療引人注目，現正在就各種各樣的疾病進行臨床階段的研究。然而，對於基因治療中使用的載體，例如，在將載體用於人時的向細胞內的導入效率、從給藥到蛋白質表達必需的時間以及副作用等要解決的問題還有很多。雖然各種各樣的肽製劑等都正在研究中，但目前可用於臨床的還沒有。
心肥大是由於遺傳背景或壓負荷等造成心臟比通常大的狀態，可能與心功能不全有關。然而，對於心肥大，防止其發展或促進其退縮的心肥大抑制劑現在還沒有銷售的。這是因為現在所知道的心肥大抑制劑具有很強的副作用，實際上還不能應用於人的緣故。因此，人們渴望抑制或改善心肥大、而且沒有副作用等問題的藥劑。
發明內容
本發明的課題就是要解決上述那樣的以往的問題，提供從給藥到實際發揮效果的期間短、沒有副作用和抗原性的肽化合物。尤其是提供針對免疫疾病和心肥大的治療劑。另外，本發明也提供NFAT活性的抑制劑。
在專利申請2000-358442中公布了由9個～13個精氨酸殘基，特別是由11個精氨酸殘基構成的肽作為生物膜通過信號序列是非常有效的。進一步研究，初步發現將9個～13個精氨酸殘基與核內T細胞活化因子(Nuclear Factor Activated T cell)NFAT的活性抑制肽融合後的肽化合物用在體內時，可以獲得很好的免疫抑制效果。此外還發現，將該肽投與心肥大大鼠時，也很好地改善了心肥大症狀，從而完成了本發明。
即本發明是涉及到由含有9個～13個精氨酸殘基和序列號1胺基酸序列的肽化合物構成的NFAT活性的抑制劑。
另外本發明涉及到由含有9個～13個精氨酸殘基和序列號1胺基酸序列的肽化合物作為有效成分的免疫抑制劑。
另外本發明涉及到由含有9個～13個精氨酸殘基和序列號1胺基酸序列的肽化合物作為有效成分的心肥大抑制劑。
附圖的簡單說明
圖1是表示在添加各種濃度11R-VIVIT、FK506以及11R-VEET後進行培養的細胞中IL-2基因的轉錄量的圖。縱軸表示IL-2基因相對於GAPDH的相對RNA量。
圖2是表示只在含有10％胎牛血清的RPMI培養基中培養60小時的Jurkat細胞、添加了11R-VIVIT後培養13小時、18小時、24小時、36小時以及60小時的Jurkat細胞以及添加FK506後培養60小時的Jurkat細胞中IL-2基因的轉錄量的圖。縱軸表示IL-2基因相對於GAPDH的相對RNA量。
圖3是表示在淋巴細胞混合試驗中，整合到細胞中的[3H]TdR的放射活性的圖。
圖4是表示在使用由給予11R-VIVIT、FK506以及11R-VEET的小鼠獲得的細胞的淋巴細胞混合試驗中，整合到細胞中的[3H]TdR的放射活性的圖。
圖5是表示用卡普蘭-邁耶存活曲線(法)(Kaplan-Meier)對移植的β細胞的存活率進行評價的圖。
圖6是表示對移植的β細胞進行免疫染色的結果的顯微鏡照片。1表示BALB/c鼠的β細胞。2表示糖尿病模型鼠的腎臟。
圖7是以相對於對照的相對值表示由進行各種處理的細胞產生的胰島素分泌量的圖。圖7(a)以相對於對照的相對值表示由進行各種濃度的11R-VIVIT處理的細胞產生的胰島素分泌量的圖。圖7(b)以相對於對照的相對值表示由進行各種濃度的FK506處理的細胞產生的胰島素分泌量的圖。圖7(c)以相對於對照的相對值表示由進行各種濃度的11R-VEET處理的細胞產生的胰島素分泌量的圖。
圖8是以相對於對照的相對值表示由進行各種處理的細胞的增殖的圖。圖8(a)是以相對於對照的相對值表示由用11R-VIVIT處理的細胞的增殖的圖。圖8(b)是以相對於對照的相對值表示由用FK506處理的細胞的增殖的圖。圖8(c)是以相對於對照的相對值表示由用11R-VEET處理的細胞的增殖的圖。
圖9利用超聲波回聲對大鼠的心室中隔以及左室全壁的厚度進行解析得到的結果圖。圖9(a)是表示對照、AoB、給予CysA的AoB以及給予11R-VIVIT的AoB的心室中隔厚度的圖。圖9(b)是表示對照、AoB、給予CysA的AoB以及給予11R-VIVIT的AoB的左室全壁厚。
圖10是大鼠心臟的組織標本的顯微鏡照片。圖10(a)是表示正常大鼠的心臟切片的顯微鏡照片。圖10(b)是表示AoB的心臟切片的顯微鏡照片。圖10(c)是表示給予CysA的AoB的心臟切片的顯微鏡照片。圖10(d)是表示給予11R-VIVIT的AoB的心臟切片的顯微鏡照片。3表示左心室，4表示右心室。
圖11是表示大鼠的血液檢查結果的圖。圖11(a)是表示對照、AoB、給予CysA的AoB以及給予11R-VIVIT的AoB的ANP的圖，圖11(b)是表示對照、AoB、給予CysA的AoB以及給予11R-VIVIT的AoB的BNP的圖。
具體實施例方式
以下就本發明的肽化合物以及其用途進行詳細說明。
本申請發明的肽化合物含有數個精氨酸連續的胺基酸序列和序列號1的胺基酸序列。
作為連續的精氨酸殘基數，優選9～13個殘基，最優選11個殘基。當連續的精氨酸殘基數在8個以下或14個以上時，本申請發明的肽化合物對細胞的導入效率有變壞的傾向。
本申請發明的肽化合物還含有NFAT的活性抑制肽VIVIT。所謂NFAT是通過鈣調素(カルシニュ一リン)脫磷酸化活化的轉錄調節因子，形成包括NFAT1、NFAT2、NFAT3以及NFAT4等在內的家族。VIVIT是由MAGPHPVIVITGPHEE(序列號1)表示的胺基酸序列構成的肽。VIVIT不影響鈣調素的磷酸酶活性，而是有選擇地抑制屬於NFAT家族的蛋白質和鈣調素的相互作用(Aramburu，J.等人、Science、第285卷、2129～2133頁、1999年)。在序列號1所示的胺基酸序列中，各胺基酸殘基只要是抑制NFAT的，也可以取代為生物學同等的胺基酸序列，只要是具有與VIVIT同等生物學活性的，也可以付加、缺失數個胺基酸殘基。
另外，本發明的肽化合物只要是具有同等生物學活性的，除了上述的數個精氨酸連續的胺基酸序列和序列號1的胺基酸序列以外，也可以付加、缺失或取代數個胺基酸殘基。
另外，本發明的肽化合物也可以含有用於確認被導入細胞內事實的標記物。標記物沒有特別限定，例如可以使用異硫氰酸酯螢光素(以下略稱為FITC)、GFP以及羅丹明等。
本發明的肽化合物可以通過通常的人工合成法、或通過一般銷售的人工合成儀製造。或者，使用基因工程手法也可以製造本發明的肽化合物。例如，製作插入了編碼含有由數個精氨酸連續的序列和VIVIT構成的序列的肽序列的DNA的重組載體，將重組載體導入適當的宿主細胞後，對該宿主細胞進行培養。然後通過回收培養物，可以得到本發明的肽化合物。製造本發明的肽化合物後，得到的肽化合物也可以用眾所周知的方法進行純化。這些肽化合物的製造法以及純化法是本領域中的一般手法，同行人很容易實施。
本發明的肽化合物可以用作NFAT活性的抑制劑。NFAT活性的抑制劑可以用作起因於NFAT的活性的疾病的治療劑。作為起因於NFAT的活性的疾病如有過敏性疾病和心肥大等。
本發明的肽化合物具有誘導免疫抑制的作用，可以用作移植時的免疫抑制劑。另外，本發明的免疫抑制劑也可以用作免疫疾病等的治療劑。作為具體的免疫疾病，如有移植手術後的排斥反應、特應性皮炎等。
本發明的免疫抑制劑可以通過靜脈內、皮下、肌肉內、經皮、直腸內等非口服途徑給藥。特別是，由於通過將肽化合物直接導入血流，可以防止肽化合物的分解，所以優選靜脈內給藥或皮下給藥。
本發明的免疫抑制劑的劑型可以根據給藥的方法適當設定。具體來說，如水溶液和乳液等液劑和軟膏。
本發明的免疫抑制劑的有效量可以在考慮了給藥方法、適用的患者的年齡、體重、病情等後進行適當設定，換算為有效成分，通常是1～10mg/kg。然而，作為有效成分的本發明的肽化合物的量可變更，並不限定於這些範圍。
本發明的免疫抑制劑只要是作為有效成分含有本發明的肽化合物，沒有特別限定，也可以添加適當的藥學上的賦形劑、適當的載體、溶劑、凝膠形成劑、抗氧化劑、稀釋劑、等滲劑、載體、pH穩定劑等在本技術領域中通常使用之外的成分。這些添加劑通常可以由同行人適當選擇。
本發明的肽化合物作為心肥大抑制劑是有效的。本發明的心肥大抑制劑可以通過靜脈內、皮下、經皮、直腸內等非口服途徑給藥。特別由於將肽化合物直接導入血流，在防止肽化合物的分解上很重要，所以優選靜脈內給藥。
本發明的心肥大抑制劑的劑型可以根據給藥的方法適當設定。具體來說，如水溶液和乳液等液劑和軟膏。
本發明的心肥大抑制劑的給藥量可以根據給藥方法、適用的患者的年齡、體重、病情等進行適當設定，換算為有效成分，通常是0.1～2mg/kg。然而，作為有效成分的本發明的肽化合物的量可變更，並不限定於這些範圍。
本發明的心肥大抑制劑只要是作為有效成分含有本發明的肽化合物，並沒有特別限定，也可以添加適當的藥學上的賦形劑、適當的載體、溶劑、凝膠形成劑、抗氧化劑、稀釋劑、等滲劑、載體、pH穩定劑等在本技術領域中通常使用之外的成分。這些添加劑通常可以由同行人適當選擇。
以下通過實施例，對本發明的肽化合物進行更詳細說明，只要是不脫離本發明的宗旨，本發明並不限定於這些實施例。
實施例1人工合成含有連續11個精氨酸殘基、VIVIT和FITC的肽化合物(Sigma Genosin Japan，Inc.製造)，通過分級反相HPLC純化該肽。以下將由連續11個精氨酸殘基和付加了3個甘氨酸的VIVIT構成的肽略稱為11R-VIVIT。序列號2表示11R-VIVIT的肽序列。而FITC被付加在11R-VIVIT的氨基末端。
實施例2對於6周齡的C3H/HeN小鼠H-2k(CLEA Japan，Inc.生產)，將溶解了實施例1製造的由11R-VIVIT和FITC構成的肽化合物10mg/kg量的0.5ml的林格氏溶液作為注射劑實施腹腔內注射。注射後6小時，從各個小鼠摘出脾臟、淋巴節、肝臟、腎臟和心臟，將他們在3ml的ヒストプレツプ(Fisher Scientific生產)中於-80℃下冷凍。然後，在恆冷切片機上製作10～50μm的切片，用Zeiss顯微鏡(Zeiss公司生產)進行分析。而作為對照，使用未處理的C3H/HEN小鼠的切片。
分析結果，在來自給予複合肽的小鼠的脾臟、淋巴節、肝臟、腎臟和心臟的切片上都可以觀察到FITC的螢光。這表明通過腹腔內給藥，11R-VIVIT至少被導入到了脾臟、淋巴節、肝臟、腎臟和心臟的細胞中。
實施例3IL-2基因的轉錄對11R-VIVIT的濃度依賴的效果的研究。
使用含有1nM、10nM、100nM或1μM的11R-VIVIT的1ml的含有10％胎牛血清RPMI(Invitorogen公司生產)，將1×105個細胞的Jurkat細胞在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱(山洋電器株式會社生產)中培養1小時。然後，添加含有2μM的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)(Sigma公司生產)和40μM的離子黴素(Sigma公司生產)的100μl的RPMI，再培養12小時。然後回收細胞，使用得到的細胞，通過下面的實時定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)測定IL-2基因的轉錄量。在實時定量RT-PCR中，將已知的管家基因GAPDH作為內部標準物質使用。另外，將在不含有11R-VIVIT的培養基中培養的Jurkat細胞用作對照細胞，實施同樣的實時定量RT-PCR。
按照程序使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN生產)，從細胞中提取總RNA。使用得到的總RNA，於22℃下進行10分鐘，然後於42℃下溫育20分鐘實施逆轉錄反應。
接下來使用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I試劑盒(Rhoche Molecular Biochemicals生產)，製備20μl的反應混合液(轉錄產物的十分之一量，4mM MgCl2、4種引物各0.5μM、2μl的10×LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I)用於擴增反應。作為對於人IL-2的引物，使用競爭定量RT-PCR試劑盒(Competitive Quantitative RT-PCR Kit)(フナコシ株式會社生產)內含有的引物。作為對GAPDH的引物使用5』-CTGACCAGGGTCCTATTCCA-3』(序列號5)和5』-TGGTTATCCCAAGCAAGAGG-3』(序列號6)(都是Geneset公司生產)。擴增反應在於95℃下溫育10分鐘後，實施每一循環為在94℃下溫育15秒鐘、57℃下溫育5秒鐘和72℃下溫育10秒鐘的60次循環。然後，以0.2℃/秒間隔使溫度上升至95℃。在解離曲線解析中使用LightCycler軟體(Rhoche Molecular Biochemicals生產)。圖1給出了作為解析結果的對得到的GAPDH的相對RNA量(n＝3)。
11R-VIVIT將IL-2基因的轉錄抑制到未處理時的12％。IL-2基因是在由於過敏或排斥反應使得T細胞活化時促進轉錄的基因。因此，該結果表明11R-VIVIT可以抑制T細胞活化。
比較例1與實施例1一樣，人工合成、純化由連續11個精氨酸殘基、附加3個甘氨酸殘基的VIVIT構成的肽化合物(以下略稱為11R-VEET)。VEET是由MAGPPHIVEETGPHVI(序列號3)表示的胺基酸序列構成的肽。序列號4給出了11R-VEET的肽序列。以下將11R-VEET作為11R-VIVIT的陰性對照使用。
除了代替11R-VIVIT使用含有100nM的FK506(藤澤藥品工業株式會社生產)或1μM的11R-VEET的培養基之外，與實施例3同樣操作，培養Jurkat細胞，使用得到的細胞實施RT-PCR。結果如圖1所示。
11R-VIVIT對IL-2基因的轉錄水平沒有影響。
實施例4根據對IL-2轉錄的抑制活性對T細胞中11R-VIVIT的半衰期進行研究。
使用含有1μM的11R-VIVIT的1ml的含有10％胎牛血清RPMI，將1×105個細胞的Jurkat細胞在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱中培養1小時。然後，在添加含有2μM PMA和40μM的離子黴素的100μl的RPMI中再繼續培養12小時、17小時、23小時、35小時或59小時。另外作為對照細胞使用在不含有11R-VIVIT的10％胎牛血清RPMI中與上述一樣培養1小時，在添加了含有2μM PMA和40μM的離子黴素的100μl的RPMI後再繼續培養12小時、17小時、23小時、35小時或59小時的Jurkat細胞。
接下來，除了用得到的各個細胞作為樣品外，其他與實施例3同樣操作，通過實施RT-PCR以及實時定量RT-PCR，進行解析，測定對GAPDH的相對RNA量。結果如圖2所示(n＝3)。圖2所示的時間指的是培養總體時間。
11R-VIVIT的半衰期大約是30小時。添加11R-VIVIT 60小時之後看不到他的IL-2轉錄抑制活性。
比較例2使用含有1μM的FK506的1ml含有10％胎牛血清RPMI，將1×105個細胞的Jurkat細胞在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱中培養1小時。然後，在添加含有2μM PMA和40μM的離子黴素的100μl的RPMI後再繼續培養12小時、17小時、23小時、35小時或59小時。除了使用得到的培養細胞外，用與實施例3同樣的方法，實施RT-PCR以及實時定量RT-PCR。從添加FK506的60小時後的相對IL-2 mRNA水平如圖2所示。
FK506即使在60小時後也沒有代謝，強烈抑制IL-2的轉錄。
實施例5通過淋巴細胞混合試驗研究11R-VIVIT對T細胞的活化以及增殖的效果。
從6～8周齡的C3H/HeN小鼠和6～8周齡的BALB/c小鼠H-2d(清水實驗材料株式會社生產)取出脾臟細胞。BALB/c脾臟細胞用絲裂黴素C(協和發酵工業株式會社生產)處理，用作刺激細胞。
將含有1pM、1nM或1μM的11R-VIVIT的RPMI添加到平底96孔板(イワキ株式會社生產)中。然後將上述刺激細胞和來自C3H/HeN小鼠的脾臟細胞以1∶5混合後的混合細胞添加到各個孔中(每孔5×105個)，在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱中培養90小時。另外，作為對照，向只有培養基的孔中添加混合細胞，進行同樣培養。
然後添加0.5Ci/孔的3H甲基胸腺嘧啶(以下略稱為[3H]TdR。Amersham Pharmacia Biotech株式會社生產)，培養6小時。然後，將細胞置於直徑1cm的濾紙上，通過β計數器(ベツクマン公司制)測定整合到細胞的[3H]TdR放射活性。結果如圖3所示。
1μM的11R-VIVIT與對照相比，對淋巴細胞的增殖的抑制達43％。圖3中，*意味著與對照相比P＜0.05，**意味著無論哪一個都是P＜0.001。
比較例3除了代替11R-VIVIT使用含有1pM、1nM或1μM的FK506或含有1μM的11R-VEET的RPMI之外，通過與實施例5同樣的方法，對混合細胞進行培養，通過β計數器測定整合到細胞的[3H]TdR放射活性。結果如圖3所示。
11R-VEET在1μM時對淋巴細胞的增殖沒有影響。
比較例4使用不含有11R-VIVIT的RPMI作為培養基，除了代替混合細胞只使用來自C3H/HeN小鼠的脾臟細胞之外，通過與實施例5同樣的方法，對細胞進行培養，添加[3H]TdR，通過β計數器測定整合到細胞的[3H]TdR放射活性。結果如圖3所示。
實施例6將溶解了10mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液用作注射劑，研究11R-VIVIT在體內對T細胞的活性和增殖的效果進行研究。
向6周齡的C3H/Hen小鼠腹腔內注射上述注射劑，1日1次，注射2日。
從第2次注射6小時後，通過外科手術摘出脾臟。對得到的脾臟細胞(1×104個)與用絲裂黴素C處理的BALB/c小鼠的脾臟細胞(1×105個)一起添加到平底96孔板上，在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱中培養90小時。培養基使用RPMI。另外，作為對照，向只有培養基的孔中添加混合細胞，進行同樣培養。
然後添加0.5μCi/孔的[3H]TdR，培養6小時。接下來，將細胞置於直徑1cm的濾紙上，通過β計數器測定整合到細胞的[3H]TdR放射活性。結果如圖4所示。**意味著無論哪一個與對照比較都是P＜0.001。
在體內，10mg/kg的11R-VIVIT相對於對照表現出30％的抑制效果。
比較例5除了代替11R-VIVIT使用1mg/kg的FK506或10mg/kg的11R-VEET的RPMI之外，通過與實施例6同樣的方法，對C3H/Hen小鼠實施腹腔內注射，取出脾臟細胞進行培養，添加[3H]TdR，通過β計數器測定整合到細胞的[3H]TdR放射活性。結果如圖4所示。
11R-VEET在1μM時對淋巴細胞的增殖沒有影響。
比較例6使用不含有11R-VIVIT的RPMI作為培養基，除了代替混合細胞只使用來自C3H/HeN小鼠的脾臟細胞之外，通過與實施例6同樣的方法，對細胞進行培養，添加[3H]TdR，通過β計數器測定整合到細胞的[3H]TdR放射活性。結果如圖4所示。
實施例7將溶解了10mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液用作注射劑，對11R-VIVIT在β細胞的移植中的效果進行研究。移植時，作為施主使用6周齡的BALB/c小鼠，作為接受者用6周齡的C3H/HeN小鼠。
對於C3H/HeN小鼠，通過腹腔內注射一次220mg/kg的鏈脲黴素(シグマ-アルドリツチ日本株式會社)，製作糖尿病模型小鼠。注射鏈脲黴素6日後，將葡萄糖值超過350mg/dl的小鼠判斷為是高血糖症。
另外，取出BALB/c小鼠的胰臟，實施不連續ficoll密度梯度離心後，通過通常的膠原酶消化分離β細胞。
將分離的約500個β細胞移植到上述糖尿病模型小鼠的左腎的被膜下。移植後，每日一次，向小鼠腹腔內注射10mg/kg的11R-VIVIT(n＝6)。作為對照向移植了β細胞的小鼠注射不含有11R-VIVIT的生理鹽水(n＝4)。測定血糖，當該值2天內連續超過200mg/dl時作為移植組織排斥。圖5是表示用卡普蘭-邁耶存活曲線(法)進行評價的結果。
通過給予11R-VIVIT，與對照相比，存活率顯著地上升(P＜0.005)。
比較例7除了代替11R-VIVIT使用10mg/kg的11R-VEET之外，通過與實施例7同樣的方法，研究11R-VEET對β細胞移植的效果。結果如圖5所示。
11R-VEET與對照一樣對移植組織的存活沒有任何影響。
實施例8使用實施例1中給予11R-VIVIT的小鼠，對移植的β細胞的功能進行研究。
通過外科手術摘出β細胞移植50天後的腎臟。然後使用冷凍ミトクロ-ム(カ-ルツアイス公司生產)，製作30μm的腎臟切片。然後對得到的切片，用針對胰島素的多克隆抗體(サンタクル-ズ公司生產)和抗生物素蛋白、生物素過氧化物酶法(ベクタ-公司生產)實施免疫染色。
圖6給出了免疫染色的結果。在圖6中，1是被移植的β細胞個數，2是接受者的腎臟。移植的β細胞由於被胰島素抗體染色，所以確認移植細胞產生胰島素。
實施例911R-VIVIT對βTC6細胞的胰島素分泌的效果的研究。βTC6細胞是通過葡萄糖應答性分泌胰島素的胰島的細胞系。
將βTC6細胞(American Type Culture collection，CRL-11506)接種到96孔板(5×104個細胞/孔)，使用含有10、100、1000或10000nM的11R-VIVIT的1ml的含有10％胎牛血清RPMI，在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱中培養96小時。培養基每隔24小時與含有11R-VIVIT的新鮮培養基交換。96小時後，換成新鮮培養基後再培養1小時，回收培養上清。作為對照除了使用不含有11R-VIVIT的培養基之外，同樣對βTC6細胞進行培養。
然後用回收的培養上清，按照使用程序使用小鼠胰島素ELISA(TMB)試劑盒(シバヤギ生產)，對分泌的胰島素進行分析。圖7(a)以相對於對照的相對值給出了用11R-VIVIT處理的細胞產生的胰島素分泌量。
βTC6細胞的胰島素分泌量在11R-VIVIT處於0～1μM的範圍內幾乎與對照相同，在10μM時為對照的71％(P＝0.042)。
比較例8除了代替11R-VIVIT，使用含有1、10、100或1000nM的FK506，或者含有10、100、1000或10000nM的11R-VEET的完全培養基之外，通過與實施例9同樣的方法，對βTC6細胞進行培養，對βTC6細胞產生的胰島素分泌的效果進行研究。圖7(b)和圖7(c)給出了研究的結果。
βTC6細胞的分泌胰島素由於FK506的作用而顯著減少，但11R-VEET沒有影響。
實施例1011R-VIVIT對βTC6細胞的增殖的效果的研究。
將βTC6細胞接種到96孔板(5×104個細胞/孔)，使用含有10、100、1000或10000nM的11R-VIVIT的完全培養基，在設定於37℃、5％二氧化碳濃度的二氧化碳培養箱中培養88小時。培養基每隔24小時與含有11R-VIVIT的新鮮培養基交換。然後添加1μCi/孔的[3H]TdR，再培養8小時。作為對照除了使用不含有11R-VIVIT的培養基之外，同樣對βTC6細胞進行培養。然後，將細胞置於直徑1cm的濾紙上，通過β計數器測定整合到細胞中的[3H]TdR放射活性。圖8(a)以相對於對照的相對值給出了用11R-VIVIT處理的細胞的增殖的狀況。
關於βTC6細胞的增殖，當11R-VIVIT處於0～1μM範圍內幾乎與對照相同，在10μM時為對照的73％(P＝0.075)。
比較例9除了取代11R-VIVIT使用含有1、10、100、或1000nM的FK506，或者含有10、100、1000或10000nM的11R-VEET的完全培養基之外，通過與實施例10同樣的方法，對βTC6細胞進行培養，對βTC6細胞增殖的效果進行研究。圖8(b)和圖8(c)給出了研究的結果。
FK506和11R-VEET對βTC6細胞的的增殖沒有表現出抑制效果。
實施例1111R-VIVIT對心肥大的效果的研究。
對於心肥大模型大鼠，將溶解了1.5mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液隔日進行皮下注射(n＝6)。而心肥大模型大鼠是通過對體重200～250g的7周齡的雄性Wister大鼠(清水實驗材料株式會社生產)的大動脈結紮的心臟加負荷製作的。在本說明書中，將心肥大模型大鼠略稱為AoB。
然後，用以下的方法於0、1、2、3、4以及5周後對大鼠的心臟進行評價。而作為對照使用沒有給予11R-VIVIT的正常大鼠。
對於對照和給予11R-VIVIT的AoB，象以下那樣實施超聲波回聲檢查(ULC)、組織標本製作和血液檢查。
ULC通過對大鼠的心室中隔和左室全壁的厚度進行超聲波回聲(日立株式會社生產)，用小孩用探針進行解析。結果如圖9(a)和圖9(b)所示。結果確認通過給予11R-VIVIT，AoB中的心室中隔和左室全壁的厚度都有改善。
組織標本通過用外科手術摘出大鼠的心臟，用冷凍ミクロト一ム製作5μm的切片，用蘇木精曙紅對得到的切片進行染色製作。得到的組織標本用顯微鏡觀察(圖10(d))。在圖10中3表示左心室，4表示右心室。該結果確認給予11R-VIVIT症狀可以改善到接近正常的狀態。
心房性鈉利尿肽(ANP)和B型鈉利尿肽(BNP)的測定藉助於日本エスア-ルエル株式會社。結果如圖11(a)和圖11(b)所示。該結果確認給予11R-VIVIT，AoB中的ANP和BNP的值都被改善了。
比較例10除了使用沒有給予11R-VIVIT的AoB之外，與實施例11同樣，實施ULC的測定、組織標本的製作和血液檢查。結果如圖9(a)、圖9(b)、圖10(b)、圖11(a)和圖11(b)所示。
比較例11除了代替11R-VIVIT使用5mg/kg的CysA之外，與實施例11同樣，研究CysA對心肥大的效果。結果如圖9(a)、圖9(b)、圖10(c)、圖11(a)和圖11(b)所示。
試驗例1使用給予11R-VIVIT的AoB研究11R-VIVIT對肝功能和腎功能的毒性。
將溶解了1.5mg/kg量的11R-VIVIT的0.5ml的林格氏溶液隔日對AoB進行皮下注射4周(n＝6)。得到的AoB藉助於日本エスア-ルエル株式會社進行以下測定。
作為肝功能檢查測定穀草轉氨酶(GOT)和谷丙轉氨酶(GPT)，作為腎功能檢查測定肌酸酐(Cr)和尿素氮(BUN)。而作為對照使用沒有給予11R-VIVIT的正常大鼠和AoB。結果如表1所示。
表1
測定結果表明本發明的肽化合物不會影響肝臟和腎臟的功能。
產業上利用的可能性本發明的肽化合物可以用作副作用極少的起因於NFTA的活性的疾病的治療劑。具體來說，例如，由於可作為免疫抑制劑和心肥大抑制劑使用，所以非常有用。
序列表自由文字說明序列號2融合肽序列序列號4融合肽序列序列表110日本科學技術公司110松井秀樹110松下正之120膜透過型NFAT抑制肽130FP-8321PCT1606210121116212PRT213人4001Met Ala Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu1 5 10 15210221130212PRT213人工序列223人工序列描述融合肽序列4002Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala1 5 10 15Gly Pro His Pro Val Ile Val Ile Thr Gly Pro His Glu Glu20 25 302103
21l16212PRT213人4003Met Ala Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile1 5 10 15210421130212PRT213人工序列223人工序列描述融合肽序列4004Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Met Ala1 5 10 15Gly Pro Pro His Ile Val Glu Glu Thr Gly Pro His Val Ile20 25 30210521120212DNA213人4005ctgaccaggg tcctattcca 20210621120212DNA213人
4006tggttatccc aagcaagagg 20
權利要求
1.含有9個～13個精氨酸殘基和序列號1的胺基酸序列的肽化合物。
2.權利要求1所述肽化合物，其中精氨酸是11個殘基。
3.由權利要求1或2所述的肽化合物構成的NFAT活性化的抑制劑。
4.以權利要求1或2所述的肽化合物作為有效成分的免疫抑制劑。
5.以由權利要求1或2所述的肽化合物作為有效成分的心肥大抑制劑。
全文摘要
本發明涉及一種膜透過型NFAT抑制肽，目的在於通過對免疫疾病、心肥大或起因於NFAT的活化的疾病的患者，提供從給藥到實際發揮效果的期間短、沒有副作用和抗原性的肽化合物，解決了以往的問題。本發明提供含有數個連續的精氨酸和NFAT的活化抑制肽序列的膜透過型NFAT抑制肽、由該肽構成的NFAT活性的抑制劑，以及以該肽化合物作為有效成分的免疫抑制劑和心肥大抑制劑。
文檔編號A61P43/00GK1639190SQ0380473
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月26日 優先權日2002年2月28日
發明者松井秀樹, 松下正之 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 松井秀樹, 松下正之