導入核酸的方法

2023-06-30 03:32:51 2

專利名稱：導入核酸的方法
技術領域：
本發明涉及導入核酸的方法，更具體來說，涉及通過電穿孔將核酸導入細胞的方法。
背景技術：
將基因導入細胞的方法被用來闡明基因的功能和基因編碼的蛋白的性質，以及用於大量地生產重組蛋白。此外，將基因導入細胞的方法也用於將目的酶或細胞因子的基因導入受試者的細胞，通過基因在體內產生目的物質，從而提供對疾病的治療。
人類基因組DNA的測序已經接近完成，可以預料到存在具有各種未知功能的基因。今後，對新的人類基因的功能分析是研究中的極大挑戰，但是為了對多達幾萬種基因進行功能分析，需要能夠過量表達和徹底地敲除基因、並且是高通量的方法。
將基因導入細胞的技術可以粗略地分成生物學方法、也就是利用來自腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒的病毒載體的導入方法、利用物理學方法例如脂轉染方法(脂質體方法)的導入方法、電穿孔方法(電穿孔方法)、微注射方法和微粒槍方法。
在這些方法中，利用病毒載體的方法具有高的基因導入效率，但是也具有缺點，病毒載體的製備複雜，在安全性方面發現有問題。儘管脂轉染方法安全性高，它們的缺點是基因導入效率低、細胞毒性強等。
直接的導入方法例如微注射方法和微粒槍方法的缺點在於細胞損傷嚴重、有效導入基因的條件的最適化煩瑣，為了用於技術操作需要特別的技術和儀器。
此外，常規的電穿孔方法採用的方法是在電極例如平行板之間安排了培養基，其中懸浮有基因和細胞，然後在兩個電極之間施加電脈衝，以便在細胞膜中產生小孔，並在它們恢復之前將外源基因導入細胞(非專利文獻1EMBO Journal，1982，Vol.1，第841-845頁；非專利文獻2Bioelectrochem.Bioenerg.，1999，Vol.48，第3-16頁)。儘管該方法導入基因的效率高，其缺點是細胞損傷嚴重，導入基因的時機和位點難以自由選擇等。
此外，最近已經開發了轉染陣列，其中將細胞培養在已經印刷(print)了表達質粒的玻璃基材上，通過脂轉染方法將基因導入細胞，以高通量地分析基因的功能(非專利文獻3Nature 2001，Vol.411，第107-110頁)。因為該方法使用了脂轉染方法進行轉染，上面提到的由脂轉染方法引起的缺點仍然存在。
另一方面，報導了另一種吸附方法，該方法將生物分子例如核酸和蛋白以保持活性的狀態固定在基材的表面上(非專利文獻4Biosensors Bioelectronics，1994，Vol.9，第677-684頁)。該方法通過將具有不同靜電荷的聚合物交替地吸附到基材上，繼而通過靜電相互作用層壓聚合物薄膜(形成聚合高分子電解質複合物)，但是應用這種方法導入基因的例子還沒有報導。
發明公內容本發明解決的問題本發明的一個目的是提供一種導入基因的方法以解決常規的電穿孔方法的問題，更具體來說，提供了一種方法，其中不僅可以將基因有效地導入細胞，而且基因的導入可以在所需的時間和所需的位點進行，並且不損傷細胞。此外，本發明的另一個目的是提供能夠執行上述基因導入的方法，該方法使用了能夠在細胞的顯微觀察中提供良好觀察環境的電極基材。
解決問題的方法本發明人試圖改進通過常規的電穿孔導入基因的方法，結果發現通過將核酸放置在電極表面，使細胞附著到獲得的裝載核酸的電極表面，然後對附著的細胞施加電脈衝，不僅能夠有效地將基因導入細胞，而且可以在所需的時間和所需的位點導入基因，並且不損傷細胞。此外，本發明人研究了更多的方法，結果發現當使用透明的半導體電極作為電極時，細胞的顯微鏡觀察可以被執行得很好。基於上述的發現本發明人完成了本發明。
也就是說，本發明是(1)一種通過電穿孔將核酸導入細胞的方法，包括步驟(A)將核酸裝在電極的表面上；步驟(B)將細胞附著在獲得的裝載核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈衝，(2)一種通過電穿孔將核酸導入細胞的方法，包括步驟(a)提供具有陽離子表面的電極；步驟(b)將核酸吸附並裝在電極的陽離子表面上；步驟(c)將細胞附著在步驟(b)中獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(d)對細胞施加電脈衝，(3)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的陽離子表面電極，其中有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，陽離子聚合物吸附在單層的表面上，(4)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的電極，其中有在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或矽烷化劑形成的單層，陰離子聚合物吸附在單層的表面上，陽離子聚合物進一步吸附在它的表面上，
(5)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是透明的電極，其上吸附了陽離子聚合物，(6)上面(2)的方法，其中步驟(b)的執行是通過一次直接將核酸吸附在電極的陽離子表面上，或者將核酸和陽離子聚合物通過交替吸附方法按照核酸、陽離子聚合物和核酸的次序交替吸附在表面上，(7)上面(3)或(4)的方法，其中的電極是使用從鉑、金和鋁中選擇的金屬製成的，(8)上面(3)或(4)的方法，其中的電極是金電極基材，(9)上面(8)的方法，其中的金電極是其上沉積有金的玻璃基材或透明塑料基材，(10)上面(5)的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫、氧化銦、摻有鋁的氧化鋅或摻有銻的氧化錫的玻璃基材或透明塑料基材，(11)上面(5)的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫的玻璃物基材或透明塑料基材，(12)上面(3)的方法，其中的在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物是通式(1)所示的硫醇化合物R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數)，(13)上面(12)的方法，其中的R1是從羧酸、磷酸、磺酸基團和膦酸中選擇的基團，(14)上面(12)的方法，其中的由通式(1)代表的硫醇化合物是從11-巰基-十一烷酸、8-巰基-辛酸和15-巰基棕櫚酸中選擇的巰基烷酸，(15)上面(3)、(4)或(5)的方法，其中的陽離子聚合物是從聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙縮醛化的聚乙烯醇、在側鏈末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、酸處理的明膠、魚精蛋白、聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、殼聚糖、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和聚醯胺型胺類枝狀聚合物中選擇的聚合物。
(16)上面(4)的方法，其中的在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物是通式(2)所示的硫醇化合物R2(CH2)n-SH(2)
(其中R2代表陽離子官能團，n代表1-40之間的整數)，(17)上面(16)的方法，其中的R2是氨基基團(18)上面(1)或(2)的方法，其中的核酸是DNA、RNA、反義核酸、siRNA或它們的表達載體，(19)上面(1)或(2)的方法，其中的核酸是編碼蛋白的DNA或其一部分，(20)上面(1)的方法，其中步驟(B)是通過在含有核酸的電極表面上溫育細胞來進行的，(21)上面(2)的方法，其中的步驟(c)是通過在含有核酸的電極的表面上溫育細胞來進行的，(22)上面(1)的方法，其中步驟(C)是通過在附著了細胞的含有核酸的電極的對面提供對電極、然後在兩個電極之間產生電脈衝來進行的，(23)上面(2)的方法，其中步驟(d)是通過在附著了細胞的含有核酸的電極的對面提供對電極、然後在兩個電極之間產生電脈衝來進行的，以及(24)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是具有微型圖案(micropatterned)表面的電極。
此外，本發明是(25)具有陽離子表面的電極，其中有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，陽離子聚合物吸附在單層的表面上，以及(26)具有陽離子表面的電極，其中由通式(1)所代表的硫醇化合物的單層形成在通過在玻璃基材上沉積金而製成的金電極的表面上，陽離子聚合物然後被吸附在單層的表面上R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數)。
本發明的效果本發明提供了通過電穿孔將核酸導入細胞的方法，通過該方法不僅能夠將核酸有效地導入到細胞中，而且核酸的導入可以在所需的時間和所需的位點進行，並且不損傷細胞。
附圖簡述

圖1顯示了用於對在裝載有核酸的金電極上的附著細胞進行電穿孔的裝備以及電脈衝系統。
圖2顯示了HEK293細胞在施加電脈衝(電場強度75V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝數1)48小時後的相差顯微照片(A)和螢光顯微照片(B)。比例尺200μm。
圖3是一個條形圖，顯示了電場強度對轉染效率的影響。
圖4顯示了細胞存活率與電場強度之間的關係。
圖5顯示了聚乙烯亞胺和聚烯丙胺的分子量對轉染效率的影響。
圖6顯示了裝載於具有各種不同陽離子聚合物的電極上的DNA的量。
圖7顯示了在電脈衝後從具有各種不同陽離子聚合物的電極上釋放的DNA的量。
圖8顯示了轉染效率與釋放的DNA的量之間的相關性。
圖9顯示了HEK293細胞在電脈衝48小時後的螢光照片。電脈衝的施加是在細胞接種於裝載有DNA的電極後(A)24、(B)48和(C)72小時。
圖10顯示了在施加電脈衝前細胞溫育時間改變時的轉染效率。
圖11顯示了原代海馬神經元在裝載有pEGFP和pDsRed混合物的表面上電脈衝48小時後的相差顯微照片(左)和螢光顯微照片(中，右)。上部和下部的照片顯示了不同視野的圖象，電穿孔在同樣的條件下進行。
圖12顯示了HEK293細胞在裝載有pEGFP或pDsRed的表面上在限定位點進行電穿孔48小時後的相差顯微照片(左)和螢光顯微照片(右)。
圖13顯示了在不同的交替吸附循環數後獲得的ITO表面的ATR紅外吸收光譜。
圖14顯示了交替吸附循環數和磷酸基團的兩個吸收帶的峰面積之間的關係。
圖15顯示了交替吸附循環數與ITO表面的水接觸角度之間的關係。
圖16顯示了HEK293細胞在裝載有DNA的ITO表面上進行電脈衝(電場強度250V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝數1)48小時後的相差顯微照片(A)和螢光顯微照片(B)。
圖17顯示了電場強度對裝載有DNA的ITO表面上的轉染效率和細胞存活率的影響。
圖18顯示了交替吸附循環數對裝載有DNA的ITO表面上的轉染效率和細胞存活率的影響。
圖19顯示了在不同的交替吸附循環數後裝載到ITO表面上的DNA的量。
圖20是顯示了轉染效率和釋放的DNA的量之間的關係的相關性圖。
圖21顯示了海馬神經元在裝載有pEGFP和pDsRed混合物的ITO表面上電脈衝48小時後的相差顯微照片(左)和螢光顯微照片(中，右)。上部和下部的照片顯示了不同視野的圖象，電穿孔在同樣的條件下進行。
圖22是HEK293細胞在ITO表面上電脈衝48小時後的螢光顯微照片，在ITO表面上以陣列的形式吸附有不同的質粒(pEGFP或pDsRed或二者的混合物)。
代碼描述圖1中的符號的意義如下A電穿孔儀B電穿孔緩衝液C細胞D核酸-陽離子聚合物複合層 E金薄膜電極(陰極)F金電極(陽極)G矽酮間隔物實施本發明的最佳方式本發明的一個方面是通過電穿孔將核酸導入到細胞的方法，包括步驟(A)將核酸裝在電極的表面上；步驟(B)將細胞附著在獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈衝，上面提到的相應步驟繼續說明如下。
步驟(A)為了在電極上裝載核酸，可以採取例如(A1)提供具有陽離子表面的電極，然後將核酸吸附到電極的陽離子表面上的方法，(A2)提供具有陽離子表面的電極，然後將核酸和陽離子聚合物交替地吸附到電極的陽離子表面上，並形成例如陽離子聚合物-核酸-陽離子聚合物-核酸等的多層的方法。
(陽離子表面電極基材的描述)具有陽離子表面的電極可以從電極的表面具有正電荷的電極中選擇，這樣的電極的例子包括(a1)電極，其上有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，陽離子聚合物被吸附在單層的表面上，(a2)電極，其上有在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或矽烷化劑形成的單層，陰離子聚合物被吸附在單層的表面上，陽離子聚合物進一步吸附在其表面上，(a3)電極，其上有陽離子聚合物吸附在表面上，等。
上述的具有陽離子表面的電極(a1)可以通過例如下面的方法來產生1)在電極基材表面上形成在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物的單層，以及2)在單層表面上吸附陽離子聚合物。
此外，上述的具有陽離子表面的電極(a2)可以通過例如下面的方法來產生1)在電極基材的表面上形成在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物、硫化物或矽烷化劑的單層，2)在單層表面上吸附陰離子聚合物，以及然後3)在陰離子聚合物表面上吸附陽離子聚合物。
此外，上述的具有陽離子表面的電極(a3)可以通過例如在電極的表面上吸附陽離子聚合物來產生。
電極由基材(substrate)來支持，例如平板、晶片(包括微晶片)、陣列等。構成成它們的基本材料沒有具體的限制，只要它們是能夠支持電極的絕緣材料就行，例如可以使用無機絕緣材料例如玻璃、雲母、石英、礬土、藍寶石、鎂橄欖石、碳化矽、二氧化矽和氮化矽；有機絕緣材料例如聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和的聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚醯胺、酚醛樹脂、尿素樹脂、環氧樹酯、三聚氰胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚碸。
在這些物質當中，具有上述(a1)和(a2)的陽離子表面的電極的基材的基本材料優選為無機絕緣材料，例如玻璃、雲母、石英、礬土、藍寶石、鎂橄欖石、碳化矽、二氧化矽和氮化矽，或者是透明的塑料。具有上述(a3)的陽離子表面的電極的基材的基本材料優選為玻璃或透明塑料，而玻璃是特別優選的。對上述的透明塑料沒有具體的限制，只要它是沒有自身螢光的透明聚合物材料就行，可以是已知的材料。作為透明塑料，例如上述的有機材料等是示例性的，但是在其中，聚對苯二甲酸乙二酯是優選的。
另一方面，對電極沒有特別的限制，只要它是可以在電穿孔方法中使用的電極就行，但是由金屬材料例如鉑、金和鋁製成的電極是優選的。此外，透明電極被優選提及，以便利細胞的顯微鏡觀察。透明電極包括氧化銦錫(ITOIn2O3-SnO3)、摻有鋁的氧化鋅(ZnO)、摻有銻的氧化錫(SnO3)等，氧化銦錫是特別優選的。
包含上述的「基材」和「電極」的優選的電極基材包括了那些電極，其中在玻璃基材、塑料基材或雲母基材的一側提供了金屬電極例如鉑、金或鋁電極或透明電極基材基材基材。前者的優選例子包括在玻璃基材、雲母基材或透明塑料基材的一側提供了金電極基材基材基材的電極，後者的優選例子包括在透明基材例如玻璃基材和透明塑料基從的一側提供了氧化銦錫透明電極基材基材基材的電極。
可以按照現有的方法執行以在基材的一側提供電極，例如提到了使用現有程序的一種方法，其中上述的金屬被加熱或/和壓在將被結合的無機絕緣基材上。此外，除了上述的方法之外，真空鍍膜方法、噴鍍方法、離子注射方法、電鍍法等也被提及。
對於被用來在電極表面形成單層的在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物來說，提及了例如由下面的通式(1)代表的硫醇化合物R1(CH2)n-SH(1)(其中的符號具有前面定義的同樣的意義)。化合物(1)的優選的例子包括了那些化合物，其中代表陰離子官能團的R1是羧酸、磷酸、磺酸或膦酸，n是1到40，優選為7到18。
此外，為了代替硫醇化合物(1)，也可以使用由下面的通式(1A)或(1B)代表的二硫化物或硫化物R1(CH2)n-S-S-(CH2)m-R1(1A)R1(CH2)n-S-(CH2)m-R1(1B)(其中R1和n具有上面定義的同樣意義，m代表1到40的整數)。儘管二硫化物或硫化物可以是對稱型或非對稱型的，優選的為對稱型的，因為可以形成均勻的單層。
優選化合物(1)或其二硫化物或硫化物的具體的例子包括例如11-巰基-十一烷酸、8-巰基-辛酸和15-巰基棕櫚酸、10-羧基癸基二硫化物等。
此外，對於被用來在電極表面形成單層的在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物來說，示例了例如由下面的通式(2)代表的硫醇化合物R2(CH2)n-SH(2)(其中R2代表了陽離子官能團，n具有上面定義的同樣意義)。對於R2代表的陽離子官能團而言，示例的為例如氨基基團；n是1到40的整數，優選為7到18。
此外，為了代替硫醇化合物(2)，也可以使用由下面的通式(2A)或(2B)代表的二硫化物或硫化物R2(CH2)n-S-S-(CH2)m-R2(2A)R2(CH2)n-S-(CH2)m-R2(2B)(其中R2和n具有上面定義的同樣意義，m代表1到40的整數)。儘管二硫化物或硫化物可以是對稱型或非對稱型的，優選使用對稱型的，因為它可以形成均勻的單層。
優選化合物(2)或其二硫化物或硫化物的具體的例子優選包括例如11-氨基-1-十一烷硫醇等。
對於被用來在電極表面形成單層的在末端具有陽離子官能團的矽烷化劑來說，示例了例如由下面的通式(3)代表的矽烷化合物R2(CH2)p-Si(OR)3(3)(其中R2具有上面定義的同樣的意義，p代表1到40的整數，OR代表烷氧基團)。對於R2代表的陽離子官能團而言，提及了例如氨基基團。p被提及是1到40的整數，優選為7到18，OR被提及是具有碳原子數為1到6、優選為1到3的低級烷氧基團。
可以執行常規的方法以在電極表面形成單層。例如，將電極基材浸泡在硫醇化合物(通式1或2)、它的二硫化物(通式1A或2A)、硫化物(通式1B或2B)或矽烷化劑(3)的溶液中，從而在電極上形成具有高密度和高方向性的單層。
當在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物(1)或其二硫化物或硫化物(1A或1B)被用作硫醇化合物時，具有上面提到的陽離子表面的電極(a1)是通過在這些化合物的單層表面上吸附陽離子聚合物而獲得的。
本文使用的「陽離子聚合物」可以是通過與在電極表面上形成的單層之間的靜電相互作用(例如離子鍵)而吸附到單層的表面上的陽離子聚合物。這樣的陽離子聚合物的例子包括聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙縮醛化的聚乙烯醇、在側鏈末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物(例如聚(N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸)等)、酸處理的明膠、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、多聚精氨酸、魚精蛋白、殼聚糖、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和聚醯胺基氨類枝狀聚合物(陽離子性枝狀聚合物)等。其中聚乙烯亞胺和聚烯丙胺是特別優選的。
陽離子聚合物的平均分子量是500到5000000，優選為600到100000。例如，在聚乙烯亞胺的情況下，其平均分子量優選為200到25000，特別優選的是500到10000。此外，在聚烯丙胺的情況下，其平均分子量優選為500到150000，特別優選的是1000到70000。
陽離子聚合物吸附到單層的表面可以通過將陽離子聚合物溶液帶到單層表面上來執行。例如，它可以優選通過將陽離子聚合物溶解在適當緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液)中形成的溶液加入到單層的表面上並將其保留在室溫下來執行。對陽離子聚合物的濃度沒有特別的限制，但是優選為0.1％到10％。因此，單層和陽離子聚合物通過離子相互作用吸附，並提供了具有上述的陽離子表面的電極(a1)。
當在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物(2)或其二硫化物或硫化物被用作硫醇化合物時，或當在末端具有陽離子官能團的矽烷化劑(3)被用作矽烷化劑時，陰離子聚合物首先被吸附到這些化合物的單層表面上。
本文使用的「陰離子聚合物」可以是通過與在電極表面上形成的單層之間的靜電相互作用(例如離子鍵)而吸附到單層的表面上的陰離子聚合物。這樣的陰離子聚合物的例子包括合成的聚合物例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚2-丙烯醯胺基-2-甲基丙磺酸，以及天然的聚合物例如褐藻酸(arginic acid)、透明質酸、硫酸軟骨素和鹼處理的明膠。
陰離子聚合物吸附到單層的表面可以通過將陰離子聚合物溶液帶到並與單層表面相接觸來執行。例如，它可以優選通過將陰離子聚合物溶解在適當緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液)中形成的溶液加入到單層的表面上並將其保留在室溫下來執行。
然後，具有上面提到的陽離子表面的電極(a2)通過將陽離子聚合物吸附到被吸附的陰離子聚合物的表面上而獲得。對於本文使用的陽離子聚合物來說，可以使用與上述的那些相同的陽離子聚合物，吸附也可以以與上述相同的方式來進行。
此外，例如當上述的透明電極如氧化銦錫和氧化銦被用作電極時，在電極表面吸附了陽離子聚合物的上述具有陽離子表面的電極(a3)可以通過用陽離子聚合物處理電極基材的表面而獲得。對於這裡所用的陽離子聚合物而言，可以使用與上述相同的陽離子聚合物，用陽離子聚合物的處理可以優選通過將陽離子聚合物溶液加入到電極基材的表面上並將其保留在室溫下來執行。
(將核酸裝載於具有陽離子表面的電極上)裝載有核酸的電極是通過將核酸裝載於如上述提供的電極的陽離子表面上而獲得的。
本發明中使用的「核酸」可以是多核苷酸或寡核苷酸，可以是DNA或RNA。DNA可以是質粒DNA、cDNA、基因組DNA或合成的DNA。「核酸」包括DNA衍生物和RNA衍生物。衍生物是指具有硫代磷酸酯鍵的核酸或在核苷酸間的磷酸部分、糖基部分和鹼基部分進行了化學修飾以防止酶降解的核酸。
「核酸」包括了編碼具有生物學活性能夠有效治療或改善疾病症狀的蛋白的質粒DNA、編碼能夠誘導免疫反應有效阻止、治療或改善疾病症狀的蛋白的質粒DNA、以及這些DNA的一部分。
核酸也包括反義核酸。「反義核酸」是與特定的mRNA分子的至少一部分互補、通過被導入細胞而與相應的mRNA雜交、從而形成雙鏈分子的DNA分子或RNA分子。因為細胞不翻譯雙鏈mRNA，反義核酸幹擾了RNA的翻譯。「核酸」還包括siRNA(刺激RNA幹擾的小幹擾RNA)。此外，「核酸」包括了用於反義核酸和siRNA的表達載體。
當核酸是編碼蛋白的質粒DNA時，優選的質粒被構建成能夠在核酸導入細胞後在細胞中表達遺傳密碼，它含有表達目的基因所需的片段例如啟動子。此外，當需要證實目的基因是否被導入到細胞中時，除了目的基因之外可能還需要在DNA中包含報告基因。
對「核酸」的大小沒有特別的限制，但是一般來說它是10bp到200kbp，優選為15bp到100kbp。
將核酸裝載於電極的陽離子表面可以通過將核酸溶液與電極的陽離子表面接觸來進行，例如，可以優選通過將核酸溶解在適當的緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液)中形成的溶液加入到電極的陽離子表面上並在室溫放置來進行。未吸附的核酸可以通過用適當的緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液)淋洗電極表面來除去。因此獲得了裝載有核酸的電極基材。
此外，裝載有核酸的電極可以通過將核酸和陽離子聚合物按照核酸、陽離子聚合物和核酸的次序交替吸附在電極的陽離子表面上來獲得。這裡，所執行的核酸和陽離子聚合物的交替吸附可以以與上述相同的方式來進行。
步驟B本步驟是一個將細胞附著於前面獲得的裝載有核酸的電極的表面上的步驟。
本發明中使用的「細胞」可以是來自生物體的任何細胞，只要它具有粘附性就行，例如，可以是任意種類(例如細菌、酵母)或多細胞生物(例如動物如脊椎動物、無脊椎動物)、植物(例如單子葉植物、雙子葉植物)等。例如，可以使用來自脊椎動物(例如盲鰻、七鰓鰻、軟骨魚(chondrichtian)、硬骨魚綱、兩棲動物、爬行動物、鳥綱、哺乳動物等)的細胞。更具體來說，可以使用來自哺乳動物(例如單孔類動物、有袋動物、貧齒目動物、皮翼目動物、翼手目動物、食肉目動物、食蟲目動物、長鼻類動物、奇蹄目動物、偶蹄目動物、管齒目動物、鱗甲目、海牛目動物、鯨目動物、靈長目動物等)的細胞。在一個實施方案中，使用了來自靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴和人類)的細胞，特別是來自人類的細胞。人類來源細胞的具體例子包括例如人類來源的已建立的細胞株例如人類宮頸癌細胞(HeLa)；人類來源的原代培養細胞例如人類胎腎細胞、人類臍帶靜脈血管壁內皮細胞、人類血管壁內皮細胞、人類動脈平滑肌細胞、人類肝細胞、人類成纖維細胞、人類角膜上皮細胞和人類角膜內皮細胞；來自人的幹細胞例如間質幹細胞、胚胎幹細胞和神經幹細胞。
將細胞附著於裝載有核酸的電極表面的方法沒有特別的限制，例如可以通過在電極上加入細胞懸浮液來進行，或將細胞懸浮於適當的培養基中，將獲得的細胞懸浮液滴加電極上，在對細胞適合的條件下溫育。但是，從細胞種群的轉染效率和對轉染位點的限制的視角來看優選的是在裝載有核酸的電極上進行細胞的培養。通過培養細胞，它們附著在電極表面並繁殖。在優選情況下未附著的細胞在施加電脈衝前應該除去。未附著細胞的除去可以通過例如用適當的緩衝液更換培養基來進行。
步驟C對細胞施加電脈衝可以通過放置其上附著了細胞的裝載有核酸的電極(稱為第一電極)、面對第一電極上的細胞提供對電極(稱為第二電極)、然後使用電穿孔儀在第一和第二電極之間產生電脈衝來進行。這時，儘管可以使用交流電或直流電來產生電脈衝，一般來說優選通過直流電產生電脈衝。
當用直流電產生電脈衝時裝載有核酸的第一電極被用作陰極(-)，第二電極被設為陽極(+)，或與此相反。優選情況下第一電極被設為陰極(-)，第二電極被設為陽極(+)。對第二電極的材料沒有特別的限制，只要它是導電的就行，但是包括金屬例如金、鉑、銅、鋁、不鏽鋼、鎢、鈦、鈷-鉻合金、鈷-鉻-鉬合金(活合金(vitallium))、或透明的電極材料例如ITO(氧化銦錫)和氧化銦。
至於電脈衝的條件，電場強度、電脈衝的時間長短、施加的脈衝的數量等可以依賴電極材料、細胞、導入的核酸、基材上的陽離子聚合物等的種類來進行適當的選擇。通常來說，電場強度是10到500V/cm，優選為25到300V/cm，電脈衝的時間長度是1到99毫秒，優選為1到50毫秒，施加的脈衝的數量是1到99，優選為1到5，但是它們不受限於此。
對施加電脈衝的時間沒有特別的限制，可以被適當地選擇。也就是說，在細胞被接種於裝載有核酸的電極、溫育並附著於基材後，通常不應該馬上施加電脈衝，但是可以在任何時間施加，只要這個時間在細胞接種後大約4到5天之內就行。通過施加電脈衝，核酸被有效地導入到細胞中。
圖1顯示了一套帶有裝載有核酸的電極的電脈衝裝置，用於執行上面提到的本發明的方法。本發明的詳細情況使用附圖來說明。例如，金薄膜電極(E)形成在玻璃基材的表面上。核酸-陽離子聚合物複合層(D)形成在電極上，細胞(C)附著於層的表面上。此外，細胞被例如矽酮間隔物(G)分隔開，孔中充滿電穿孔緩衝液(B)。作為對電極的金電極(F)被放置在矽酮間隔物(G)上，與帶有細胞的底部電極(E)平行。第一電極(E)和第二電極(F)被連接到電穿孔儀(A)上，它能產生電脈衝(A)。在本實施例中，第一電極(E)和第二電極(F)之間的距離被設置為2mm，孔的面積被設定為13×13mm2。至於電脈衝的極性，第一電極(E)被設置為陰極(-)，第二電極(F)被設置為陽極(+)。通過用電穿孔儀(A)產生電脈衝將核酸(DNA)導入細胞(C)。
作為本發明的另一方面，上述的核酸導入方法可以使用具有微型圖案表面的基材來進行。微型圖案的製作可以通過已知的方法來進行。具有微型圖案的含有核酸的電極可以通過用適當的方法分隔電極的陽離子表面、將多種核酸分別裝載到各部分來製備。此外，電極基材的表面用有機矽烷化合物(例如十八烷基三乙氧基甲矽烷)或烷基硫醇來處理以形成它們自我裝配的單層，覆蓋上光學屏蔽物，用紫外光照射以分解自我裝配的單層，從而獲得具有微型圖案的電極基材；從而可以使用基材來排列核酸。因此，當使用上述的具有微型圖案的裝載有核酸的電極執行本發明時，核酸導入的位點可以被限定。
在下面通過實施例將對本發明進行進一步解釋，但是應該解釋的是本發明的技術範圍不受這些實施例的限制。
實施例1製備具有陽離子表面的電極用於靜電吸附DNA。首先在一個玻璃板上形成在末端具有羧基基團的硫醇化合物(11-巰基十一烷酸，由Sigma-Aldrich Co.生產)單層，玻璃板在一側沉積有金薄膜。在單層上加入含有聚乙烯亞胺的磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4)，聚乙烯亞胺的平均分子量為800(在以後稱為PEI800，Aldrich Co.，Ltd.生產)，濃度為1％，在室溫放置30分鐘。獲得的基材表面用水充分清洗，在氮氣下乾燥，以獲得具有陽離子表面的金電極。
然後，將用乙醇消毒的矽酮間隔物(內部面積1.3×1.3cm2，高度2mm)固定到前面獲得的金電極的陽離子表面上。然後，含有0.05mg/ml編碼綠色螢光蛋白的質粒DNA(pEGFP-C1由Clontech Laboratories Inc.生產)的磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4)加入到矽酮間隔物中金電極的陽離子表面，在室溫放置2小時以便將DNA靜電吸附到表面上。用磷酸鹽緩衝液充分清洗表面以除去沒有吸附的DNA，從而獲得裝載有DNA的金電極基材。
來自人類胚胎腎臟的細胞(HEK293從人類科學基金會獲得)被懸浮在含有血清的培養基中(培養基成分最低基本培養基(MEM)(GibcoLife Technology)、10％胎牛血清、100單位/ml青黴素、0.1mg/ml鏈黴素)，將懸浮液鋪在裝載有DNA的金電極的表面上。細胞在37℃和5％CO2環境下溫育以附著到電極表面。24小時後，用4℃的磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4)代替培養基以除去沒有附著的細胞，再在表面上加入新鮮的磷酸鹽緩衝液。然後，將一側沉積有金薄膜的玻璃基材固定在矽酮間隔物上作為第二電極。它們的排列顯示在圖1中。
然後，裝載有DNA的金電極被設置為陰極(-)，第二電極被設置為陽極(+)。它們被連接到高壓脈衝產生裝置(Electrosquarereportor T820，由Genetronics Inc.的BTX分部製造)上並施加電脈衝，條件為電場強度75V/cm，脈衝時間10毫秒，執行電穿孔施加的脈衝數為1。在施加脈衝後，將細胞在室溫保溫5分鐘，然後用事先在37℃保溫的含血清培養基替換磷酸鹽緩衝液，在37℃和5％CO2環境下培養細胞。
在電穿孔48小時後分析導入的基因的瞬時表達。在螢光顯微鏡下計數由於表達了綠色螢光蛋白(EGFP)而發射綠色螢光的細胞，轉染效率被定為總細胞數中EGFP陽性細胞的數量。
圖2顯示了HEK293細胞在電穿孔48小時後的相差顯微照片(A)和螢光顯微照片(B)。從照片中可以看出，電極表面的細胞表達了EGFP，沒有可察覺的損傷。EGFP陽性細胞的百分數、即轉染效率是80％。這個結果清楚地表明本發明的方法是允許有效地導入基因的方法。
實施例2採用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞接種在裝載了DNA的金電極上以便附著。然後對細胞施加電脈衝以進行電穿孔。這時，電脈衝的電壓被改變並研究了電場強度對轉染效率的影響。此外，除了電壓之外的施加脈衝的條件與實施例1相同(脈衝時間10毫秒，脈衝次數1次)。轉染效率被評估為施加電脈衝48小時後的EGFP陽性細胞百分數。結果顯示在圖3中。此外，電場強度對細胞存活率的影響被同時研究。細胞存活率通過錐蟲藍染料排斥方法來評估，其中細胞在施加電脈衝後3小時用錐蟲藍處理並回收細胞。也就是說沒有被錐蟲藍染色的細胞數量(活細胞數)被確定，然後按照下面的公式計算存活率。結果顯示在圖4中。
(公式1) 如圖3所示，當沒有施加電脈衝時，EGFP完全不表達。相反，在電脈衝過的細胞中觀察到了轉染。轉染效率通過下面的公式計算，使用了從亮視野顯微鏡圖象確定的附著的細胞數和從螢光顯微鏡圖象確定的表達螢光蛋白的細胞數。
(公式2) 在電場強度為75V/cm時轉染效率最高。當施加200V/cm或以上的電脈衝時，轉染效率顯著降低。此外，如圖4所示，對於通過錐蟲藍染料排斥方法來估計的施加電脈衝後的細胞存活率來說，當電場強度是100V/cm或以下時細胞存活率高。在150V/cm或以上時，施加電脈衝後許多細胞脫離並死亡。還觀察到保留在電極上的細胞受到明顯損傷。沒有脈衝時觀察不到轉染這個結果說明電脈衝使DNA從電極表面釋放，釋放的DNA通過由電脈衝導致的不穩定的細胞膜或由脈衝在細胞膜上形成的微孔被導入到細胞中。
實施例3採用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞接種並附著在裝載了DNA的金電極上。然後施加電脈衝(電場強度75V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝數為1)以進行電穿孔。在裝載有核酸的的電極的製備中，具有不同分子量的陽離子聚合物被裝載，以研究陽離子聚合物的分子量對轉染效率的影響。作為陽離子聚合物，使用了分子量為800、25000和750000的聚乙烯亞胺(被稱為PEI800、PEI25000和PEI750000，它們都是由Aldrich Co.生產的)和分子量為15000和70000的聚烯丙胺鹽酸(稱為PAA15000和PAA70000，它們都是由Aldrich Co.生產的)。
圖5顯示了轉染效率與聚乙烯亞胺和聚烯丙胺的分子量之間的關係。從圖中可以看出，隨著聚乙烯亞胺分子量的增加轉染效率降低了。圖6顯示了裝載於這些表面上的DNA的量。此外，在施加電脈衝(電場強度75V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝數為1)後，從表面上釋放的DNA的量通過用PicoGreen測量上清液中含有的DNA的量來估計。結果顯示在圖7中。從這些圖中可以明顯看出，當陽離子聚合物的分子量變高時裝載的DNA的量增加，但是在施加電脈衝後從表面釋放的DNA的量，當陽離子聚合物具有較高分子量時比具有較低分子量時少。儘管在用低分子量聚乙烯亞胺(PEI 800)製備的表面上裝載的DNA的量少，在施加電脈衝後有大約30％裝載的DNA被釋放。
圖8顯示了用不同陽離子聚合物製備的表面上的轉染效率與施加脈衝後釋放的DNA量之間的關係。從圖中可以明顯看出，觀察到在轉染效率和釋放的DNA的量之間的正相關。結果表明在本發明中轉染效率強烈地依賴於從電極表面釋放的DNA的量。
實施例4採用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞接種並附著在裝載了DNA的金電極基材上，然後對細胞施加電脈衝以進行電穿孔。在本實驗中，施加電脈衝前的培養時間被改變以研究培養時間對轉染效率的影響。
圖9顯示了在細胞接種後24、48和72小時時施加電脈衝48小時後細胞的相差顯微照片。從圖中可以看出，在電脈衝之前培養了24、48和72小時的細胞中基因被有效地表達。此外，圖10顯示了電脈衝前的培養時間與轉染效率(％)之間的關係。結果表明，細胞在電脈衝前培養了12、24、48和72小時任何一種情況下都能夠達到有效的轉染，因此可以在所需的時間將基因導入到附著的細胞中。
實施例5(原代細胞的實驗驗證)從大鼠胚胎腦中收集海馬以獲得神經細胞。採用與實施例1相似的方式將編碼EGFP或紅色螢光蛋白(DsRed)的質粒DNA導入原代神經細胞。
也就是說，採用與實施例1相同的方式，編碼綠色螢光蛋白(EGFP)和紅色螢光蛋白(DsRed)的質粒DNA(pEGFP和pDsRed由ClontechLaboratories Inc.生產)被裝載到金電極的陽離子表面上(陽離子聚合物PEI 800)，原代神經細胞在表面上培養3天，施加電脈衝(125V/cm，10毫秒，單次脈衝)。被導入的基因的瞬時表達分析在施加電脈衝後48小時時進行。
(結果)圖11顯示了海馬神經元在電脈衝48小時後的相差顯微照片(左相差)和螢光顯微照片(中EGFP，右DsRed)。從相差照片中可以看出在電穿孔後細胞沒有可以注意到的損傷。此外，從中間(EGFP)和右邊(DsRed)的顯微照片可以看出pEGFP和pDsRed都被導入到細胞中，被這些質粒編碼的螢光蛋白EGFP和DsRed得到了表達。這些結果顯示多個基因可以通過本方法有效地導入到原代培養細胞中。
當採用與HEK293細胞的情況相似的方式測定時，對海馬神經元的轉染效率是20％。當通過常規的脂轉染方法(參考下面描述的對比實施例1)和電穿孔方法(參考下面描述的參比實施例2)將pEGFP和pDsRed導入原代神經細胞作為對比時，轉染效率是10％到20％，在這些方法和本發明之間沒有觀察到明顯的區別。但是在常規的方法中觀察到極大程度的細胞損傷，許多細胞死亡了。死亡細胞百分率達到20％到30％。另一方面，使用本發明的基因導入方法完全沒有觀察到細胞損傷。
(對比實施例1)收集的海馬神經元被接種到用聚L-賴氨酸包被的24孔板中至70％到80％滿底，使用Lipofectamine 2000(由Invitrogene Inc.生產)進行基因導入。使用1μg質粒DNA和2μl Lipofectamine 2000。Lipofection2000和DNA分別用50μl Opti-MEM(無血清培養基)稀釋。這些溶液被混合，在室溫保溫20分鐘，然後將溶液加入到細胞中以進行脂轉染。在脂轉染48小時後使用螢光顯微鏡分析EGFP的表達。如上所述，轉染效率是10％到20％。
(對比實施例2)海馬神經元用PBS清洗，懸浮在PBS中使濃度為1×106細胞/ml。在懸浮液(200μl)中加入15μg質粒DNA(pEGFP)，然後混合。將懸浮液注射到電穿孔杯中，在冰上放置10分鐘。然後進行電穿孔，條件為電場強度625V/cm(電極間的距離4mm)、脈衝時間10毫秒、脈衝數1。在脈衝後，將懸浮液保留在杯中，在室溫放置10分鐘，然後接種於60mm的PLL包被的細胞培養皿。電穿孔48小時後，使用螢光顯微鏡分析EGFP的表達。如上所述，轉染效率是10％到20％。
實施例6在以與實施例1中相似的方式製備的電極的陽離子表面上，將兩種質粒(pEGFP或pDsRed)分別裝載在小的區域(直徑5mm)內。採用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞附著並生長在裝載了DNA的金電極上，在細胞接種後24小時移除未附著的細胞，然後施加電脈衝(75V/cm，10毫秒，脈衝數1)。
圖12顯示了電脈衝48小時後HEK293細胞的相差顯微照片(左)和螢光顯微照片(右)。照片在低放大倍數下獲得以便觀察電極上的較大區域(大約1.5×1.5cm2)。可以看到細胞均勻地附著到電極表面上。此外，獲得了裝載pEGFP和pDsRed的區域的螢光照片。這些照片被合併並顯示在右圖中。可以看出，在裝載了相應基因的區域觀察到了來自EGFP和DsRed的螢光。這些結果表明本發明的方法允許在限定的位點進行導入。
實施例7使用等離子體發生器(型號PA300AT，Okuma Engineering Co.生產)用氧等離子體(輸出功率30W，壓力5Pa)在室溫處理一側沉積有氧化銦錫(在以後稱為ITO)的玻璃基材5分鐘，以便從表面除去雜質。
然後在ITO表面上加入含有聚乙烯亞胺的磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4)，聚乙烯亞胺的平均分子量為800(在以後稱為PEI800，AldrichCo.，Ltd.生產)，濃度為1％，在室溫放置30分鐘。ITO表面用水充分清洗，在氮氣下乾燥，以獲得具有陽離子表面的ITO。然後，將用乙醇消毒的矽酮框架(內部面積1.3×1.3cm2，高度1mm)固定到前面獲得的ITO電極的陽離子表面上。然後，含有0.05mg/ml編碼綠色螢光蛋白的質粒DNA(pEGFP-Cl由Clontech Laboratories Inc.生產)的磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4)加入到矽酮框架中ITO電極的陽離子表面，在室溫放置30分鐘以便將DNA靜電吸附到ITO表面上。然後用磷酸鹽緩衝液充分清洗表面以除去沒有吸附的DNA。然後，將PEI 800和DNA以相似的方式交替吸附，然後用磷酸鹽緩衝液充分清洗表面，從而獲得含有DNA的透明電極基材。
接下來，未處理的ITO電極的交替吸附循環數被引用為零，每個吸附PEI和DNA的步驟被計算為1個循環。也就是說，具有PEI800-DNA-PEI800的表面的交替吸附循環被表示為3。其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO表面的原子組成通過X-射線光電子能譜(XPS)來確定。結果顯示在表1中。

所得有機發光器件在10mA/cm2正向電流密度下顯示3.57V驅動電壓。另外，基於1931 CIE彩色坐標觀察到x＝3.94，y＝0.56處的特定Alq3綠光譜。器件在上述驅動電壓下的該發光行為表明，置於發光層與陰極之間的層內所含的通式1-1化合物可起電子注入/傳輸材料作用。
對比例1除採用真空沉積法將用於電子注入和傳輸的常規化合物Alq3替換通式1-1化合物以200厚度塗覆於發光層上用以形成電子注入/傳輸層之外，重複實施例1從而製得有機發光器件。
所得有機發光器件在10mA/cm2正向電流密度下顯示4.12V驅動電壓。另外，基於1931 CIE彩色坐標觀察到x＝0.34，y＝0.56處的特定Alq3綠光譜。
如下表1顯示了對於實施例1和對比例1所得有機發光器件，其依賴於電流的驅動電壓變化結果。
表1

從表1可看出，採用通式1-1化合物形成用於有機發光器件的電子注入/傳輸層時，與採用起電子注入/傳輸層作用的常規材料Alq3的有機面的接觸角度比後面的吸附PEI800的表面的接觸角度小。可能第一層PEI800沒有完全地覆蓋ITO表面，基本材料的基底ITO表面被部分暴露。
實施例8在按照實施例7製備的裝載有DNA的ITO電極上進行細胞的電穿孔。首先，人類胚胎腎細胞(HEK293從人類科學基金會獲得)被懸浮在含有血清的培養基中(培養基成分最低基本培養基(MEM)(GibcoLife Technology)、10％胎牛血清、100單位/ml青黴素、0.1mg/ml鏈黴素)，將懸浮液加入到含有DNA的透明電極(層數＝5，基底材料為聚對苯二甲酸乙二酯(PET))的表面上。細胞在37℃和5％CO2環境下培養以吸附到電極表面。24小時後，用4℃的磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4)代替培養基以除去沒有附著的細胞。用磷酸鹽緩衝液充滿矽酮框架的孔，然後將一側沉積有金薄膜的玻璃板放置在矽酮框架上作為第二電極。它們的排列顯示在圖1中(在本實施例中假設符號E是ITO電極)。
然後，裝載有DNA的ITO電極被設置為陰極(-)，上部的金電極被設置為陽極(+)。它們被連接到高壓脈衝產生裝置上(Electrosquarereportor T820，由Genetronics Inc.的BTX分部製造)並施加電脈衝，條件為電場強度250V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝數為1，從而進行電穿孔。在施加脈衝後，將細胞在室溫保溫5分鐘。然後用事先在37℃保溫的含血清培養基替換孔中的磷酸鹽緩衝液，在37℃和5％CO2環境下培養細胞。
在電穿孔48小時後分析導入的基因的瞬時表達。在螢光顯微鏡下計數由於表達了綠色螢光蛋白(EGFP)而發射綠色螢光的細胞，轉染效率被定為總細胞數中EGFP陽性細胞的數量。
圖16顯示了HEK293細胞在電穿孔48小時後的相差顯微照片(A)和螢光顯微照片(B)。從圖中可以看出，全部細胞中有大約70％表達了EGFP。這個結果清楚地顯示本發明的方法允許有效地導入基因。此外，在使用螢光和相差顯微鏡觀察細胞時獲得了具有高解析度的明亮的圖像(當玻璃被用作基底材料時)。這強調了通過使用透明電極可以更好地進行細胞的觀察。
實施例9按照實施例8相似的方式，將HEK293細胞接種在裝載有DNA的透明電極上並附著，然後施加電脈衝以進行電穿孔。改變電脈衝的電壓以研究電場強度對轉染效率的影響。除了電壓之外施加脈衝的條件與實施例8中相同(脈衝時間10毫秒，脈衝次數1次)。轉染效率被評估為施加電脈衝48小時後EGFP陽性細胞的百分數。此外，同時研究了電場強度對細胞存活率的影響。細胞存活率通過錐蟲藍染料排斥方法來評估，其中細胞在施加電脈衝48小時後用錐蟲藍處理並收穫。也就是說沒有被錐蟲藍染色的活細胞數被確定，並計算它在沒有施加電脈衝時獲得的活細胞數(對照)中佔的比例。使用下面的公式計算細胞存活率。
(公式3) 結果顯示在圖17中。如圖17所示，當沒有施加脈衝時沒有EGFP表達。另一方面，經過電脈衝的細胞中表達了EGFP。轉染效率按照下面的公式計算，使用了用錐蟲藍染料排斥方法確定的電極上的總活細胞數和通過螢光圖像確定的表達螢光蛋白的細胞數。
(公式4) 隨著電場強度的增加轉染效率線性增加。當施加300V/cm或以上的電脈衝時，轉染效率達到平臺水平(大約80％)。另一方面，在電場強度為250V/cm或以下時在施加電脈衝後細胞存活率保持較高。在300V/cm或以上時，施加電脈衝後許多細胞脫離並死亡。不施加脈衝時觀察不到轉染，這個結果表明施加電脈衝後DNA從電極上釋放，以及對細胞膜去穩定化以產生微孔，這兩種機制同時發生增進了DNA向細胞內的導入。
實施例10按照實施例8相似的方式，將HEK293細胞接種在裝載有DNA的ITO電極(吸附循環數＝5，基底材料為PET)上並附著，然後施加電脈衝(電場強度250V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝次數1次)以進行電穿孔。在本實施例中，改變了PEI 800和DNA的吸附循環數以研究循環數對轉染效率的影響。
圖18顯示了轉染效率與循環數之間的關係。從圖中可以看出，較大的吸附循環數能夠導致更有效的轉染，同時保持了細胞存活率。圖19顯示了經過不同的吸附循環數後表面上裝載的DNA的量。可以看出裝載的DNA的量隨著吸附循環數的增加而增加。
在施加電脈衝(電場強度200-300V/cm，脈衝時間10毫秒，脈衝數為1)後，從表面上釋放的DNA的量通過用PicoGreen(由Molecular ProbeInc.生產)測量上清液中含有的DNA的量來估計。圖20顯示了對不同樣品測定的脈衝後的轉染效率與從這些表面釋放的DNA的量之間的關係。可以看出，釋放的DNA的量隨著吸附循環數的增加而增加。在施加電脈衝後有大約10％-30％裝載的DNA被釋放。從圖中可以明顯看出，轉染效率與釋放的DNA的量有正相關性。因此，這表明本發明中的轉染效率主要由從表面釋放的DNA的量來控制。
實施例11(原代細胞的實驗驗證)
從大鼠胚胎腦中製備海馬神經元。採用與實施例8相似的方法用編碼EGFP或紅色螢光蛋白(DsRed)的質粒DNA對原代神經元進行細胞的電穿孔。
也就是說，採用與實施例8相似的方式，編碼綠色螢光蛋白(EGFP)和紅色螢光蛋白(DsRed)的質粒DNA(pEGFP和pDsRed由ClontechLaboratories Inc.生產)被裝載到透明ITO電極(吸附循環數＝5，電極ITO，基底材料為玻璃)的表面上，原代神經元在表面上培養3天，然後施加電脈衝(200V/cm，10毫秒，單次脈衝)。EGFP和DsRed的瞬時表達分析在施加電脈衝48小時後進行。
(結果)圖21顯示了在電脈衝後48小時時的相差顯微照片(左相差)和螢光顯微照片(中EGFP，右DsRed)。從左邊的顯微照片中可以看出在電穿孔後沒有觀察到細胞的損傷。螢光顯微照片(圖21中中間和右邊的照片)顯示pEGFP和pDsRed都被導入到細胞中，螢光蛋白EGFP和DsRed在細胞中得到了表達。此外，這些圖表明不同的基因可以通過本方法有效地導入。該結果還表明在脈衝前細胞即使被溫育3天，電穿孔也可以被成功地執行，表明本方法可以用於在細胞接種後有利的時間進行轉染。
實施例12(在ITO電極的表面安排核酸陣列，以及在陣列上電穿孔)ITO電極(基底材料為玻璃)的表面用氧等離子體處理來清潔。然後，將ITO電極浸泡在十八烷基三乙氧基矽烷(LS-6970，Shin-EtsuChemical Co.，Ltd.)的1％甲苯溶液中，在室溫放置2小時。在用甲苯和乙醇充分清洗後，將電極在80℃加熱12小時。然後，在電極表面放置其中鉻圖案沉積在玻璃基底上的光學屏蔽物，用紫外光在室溫照射圖案1小時。除去光學屏蔽物後，將基材用乙醇清洗以除去由紫外線照射而分解的有機矽烷層。結果獲得了有圖案的表面，其中含有疏水有機矽烷單層區域以及親水的ITO表面被暴露的孤立區域。PEI 800和質粒DNA(pEGFP，pDsRed或二者的混合物)通過將這些溶液手工滴加到有圖案的ITO電極上的不同ITO斑點上(ITO被暴露的環形斑點，直徑1mm，10×10個斑點)而被交替吸附(吸附循環數＝5)。按照與實施例8相同的方式將HEK293細胞附著到裝載有DNA的陣列上，在細胞接種24小時後、移除未附著的細胞之後施加電脈衝(200V/cm，10毫秒，1次脈衝)。
圖22顯示了電脈衝48小時後的螢光顯微照片。照片在低放大倍數下獲得以便觀察陣列上的全部區域(大約1.7×7cm2)。對EGFP和DsRed分別進行記錄的螢光照片被合併並顯示在圖22中。在裝載了相應質粒的位點觀察到了螢光。此外，兩個基因被混合的位點上的細胞共表達了兩種蛋白。這些結果表明本發明可以提供限定轉染區域的方法。
工業實用性本發明的方法可用於有效地將基因導入細胞而不引起細胞損傷。本方法還能夠使我們在限定的時間和位點轉染細胞。結果，本發明的導入核酸的方法可用於在細胞水平對基因和基因產物進行功能分析、促進細胞生物學、後基因組和蛋白質組學研究以及醫學護理的發展。
權利要求
1.一種通過電穿孔將核酸導入細胞的方法，包括步驟(A)將核酸裝載至電極的表面上；步驟(B)將細胞附著在獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈衝。
2.一種通過電穿孔將核酸導入細胞的方法，包括步驟(a)提供具有陽離子表面的電極；步驟(b)將核酸吸附並裝載至電極的陽離子表面上；步驟(c)將細胞附著在步驟(b)中獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(d)對細胞施加電脈衝。
3.權利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的電極，其上有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，以及陽離子聚合物吸附在單層的表面上。
4.權利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的電極，其上有在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或矽烷化劑形成的單層，陰離子聚合物吸附在單層的表面上，而陽離子聚合物進一步吸附在它的表面上。
5.權利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是透明的電極，其上吸附了陽離子聚合物。
6.權利要求2的方法，其中步驟(b)是通過僅一次直接將核酸吸附在電極的陽離子表面上，或者將核酸和陽離子聚合物採用交替吸附方法按照核酸、陽離子聚合物和核酸的次序交替吸附在表面上來進行的。
7.權利要求3或4的方法，其中的電極是使用從鉑、金和鋁中選擇的金屬製成的。
8.權利要求3或4的方法，其中的電極基材是金電極基材。
9.權利要求8的方法，其中的金電極是其上沉積有金的玻璃基材或透明塑料基材。
10.權利要求5的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫、氧化銦、摻有鋁的氧化鋅或摻有銻的氧化錫的玻璃基材或透明塑料基材。
11.權利要求5的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫的玻璃基材或透明塑料基材。
12.權利要求3的方法，其中在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物是通式(1)所示的硫醇化合物R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數)。
13.權利要求12的方法，其中的R1是從羧酸基團、磷酸基團、磺酸基團和膦酸基團中選擇的基團。
14.權利要求12的方法，其中由通式(1)代表的硫醇化合物是從11-巰基-十一烷酸、8-巰基-辛酸和15-巰基棕櫚酸中選擇的巰基烷酸。
15.權利要求3、4或5的方法，其中的陽離子聚合物是從聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙縮醛化的聚乙烯醇、在側鏈末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、酸處理的明膠、魚精蛋白、聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、殼聚糖、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和聚醯胺型胺類枝狀聚合物中選擇的聚合物。
16.權利要求4的方法，其中在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物是通式(2)所示的硫醇化合物R2(CH2)n-SH(2)(其中R2代表陽離子官能團，n代表1-40之間的整數)。
17.權利要求16的方法，其中的R2是氨基基團。
18.權利要求1或2的方法，其中的核酸是DNA、RNA、反義核酸、siRNA或它們的表達載體。
19.權利要求1或2的方法，其中的核酸是編碼蛋白的DNA或其一部分。
20.權利要求1的方法，其中步驟(B)是通過在裝載有核酸的電極上溫育細胞來進行的。
21.權利要求2的方法，其中的步驟(c)是通過在裝載有核酸的電極表面上溫育細胞來進行的。
22.權利要求1的方法，其中步驟(C)是通過在其上附著了細胞的裝載有核酸的電極的對面提供對電極，然後在兩個電極之間產生電脈衝來進行的。
23.權利要求2的方法，其中步驟(d)是通過在附著了細胞的裝載有核酸的電極的對面提供對電極、然後在兩個電極之間產生電脈衝來進行的。
24.權利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是具有微型圖案表面的電極。
25.具有陽離子表面的電極，其中在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成單層，以及陽離子聚合物吸附在單層的表面上。
26.具有陽離子表面的電極，其中由通式(1)所代表的硫醇化合物的單層形成在通過在玻璃基材上沉積金而製成的金電極基材的表面上，以及陽離子聚合物被吸附在單層的表面上R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數)。
全文摘要
本發明涉及通過電穿孔將核酸導入細胞的方法，包括步驟(A)核酸裝載至電極的表面上；步驟(B)細胞附著在獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈衝。按照本方法，不僅可以將基因有效地導入細胞，而且基因的導入可以在所需的時間和所需的位點進行，並且不損傷附著的細胞。
文檔編號C12N15/87GK1863910SQ20048002959
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月20日 優先權日2003年10月8日
發明者巖田博夫, 加藤功一, 山內文生 申請人:國立大學法人京都大學