由母體血液中分離胎兒細胞的方法來實現產前診斷的製作方法

2023-06-15 17:10:26 2

專利名稱：由母體血液中分離胎兒細胞的方法來實現產前診斷的製作方法
技術領域：
本發明涉及從妊娠哺乳動物血液中分離滋養層(胎盤)細胞的方法，以提供重要的起始材料即源於胎兒的細胞，以使獲得胎兒的遺傳和/或生物化學信息，更具體地，本發明涉及利用對哺乳動物滋養層上的膜蛋白標誌特異的單克隆抗體從母體血液中分離出滋養層細胞。這些細胞然後可被用於獲得妊娠初期胎兒的遺傳和/或生物化學信息。本發明與檢測人胎兒的異常特別有關。
目前，產前檢查是用羊膜穿刺術或絨毛膜絨毛採樣(CVS)得到的胎兒細胞實現的。羊膜穿刺一般在妊娠16周左右進行，該方法是由技術熟練人員把注射針刺入胎兒的羊膜囊內抽取20-30毫升的羊水，羊水中含有胎兒細胞，使以後的檢查能實現。這種獲取胎兒細胞的方法伴隨著引起自發性流產的危險，此外，如果隨後進行的胎兒的遺傳診斷揭示出異常胎兒，中期三個月要進行妊娠中止既對母親帶來心理上的壓力又伴隨著某些生理上的危險。
絨毛膜絨毛採樣也要求由技術熟練人員從妊娠8-12周胎兒的胎盤上取下一小塊活組織，儘管任何染色體異常的早期診斷使得該方法比羊膜穿刺術更具有吸引力，但是這種方法也有可能造成自發性流產的危險。然而，需要技術熟練人員和這兩種方法會造成自發性流產的可能性都表明現行的產前遺傳評價法只能對被認為是可能懷有染色體缺陷的胎兒的妊娠婦女進行。
本發明的方法提供一種更為簡單的方法，它包括從妊娠哺乳動物如孕婦的手臂靜脈上抽取血液並提取胎兒細胞，這些細胞通常是從胎盤脫落到母體的循環血液中。獲得這種血樣不需要專門的專家，而且胎兒細胞的這種非侵入性的分離方法不存在引起自發性流產的危險。血液可以在與絨毛膜絨毛採樣相同的妊娠時間被採取，因此，得到了早期診斷的好處。
雖然在母體外周血液中存在著滋養層細胞一直是一些爭論的主題，如Goodfellow和Taylor(1982)已經報導了利用差示離心法提取在妊娠期外周血液中循環的滋養層細胞。Covone等人(1984)研究了用單克隆抗體H315(Johnson等，1981)從不同妊娠階段孕婦的外周血液中探測滋養層細胞的可能性，然而，在以後的報導中(Pool等人，1987，Adinolfi等，1989)提出分離H315陽性細胞作為胎兒異常的出生前診斷的一種診斷材料來源是不現實的。最近的資料提出，在母體循環中的胎兒細胞的出現率(妊娠12-36周)低於十萬分之一(Adinolfi等，1989，Schwinger等，1989)。
按照本發明的一個方面，提供了一種從妊娠母體的血樣中分離滋養層細胞的方法，該方法包括使所說的血液與一有效結合量的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞的特異抗體接觸一定的時間。所說的接觸是在足以使所說的抗體結合到靶細胞上的條件下進行的，然後從所說的血樣中分離由所說的抗體結合了的所說的細胞。
本發明的另一個方面是針對一種用於在妊娠哺乳動物中獲得胎兒遺傳和/或生物化學信息的方法，該方法包括從所說的妊娠哺乳動物體分離出一個血樣，並使所說血樣與一個結合有效量的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞特異抗體在足以使所說的抗體結合到所說的細胞上的條件下接觸一段時間，然後從所說的血樣中分離由所說抗體結合了的細胞，然後從該分離的細胞獲得遺傳和/或生物化學信息。
本發明的另一個方面涉及用於妊娠哺乳動物的血樣中分離滋養層細胞的試劑盒，以及也可以是用於獲取所說細胞的遺傳和/或生物化學信息的試劑盒，它包括隔室形式的第一容器，該容器適合於容納一種絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞的特異抗體;一個可附加選擇的第二容器，它適合於接收和放置來自所說的妊娠哺乳動物的血樣;和一個可附加選擇的第三個容器，它適合於容納用於從被分離的細胞中獲取遺傳和/或生物化學信息的裝置。
在本發明的一個最佳實施例中，哺乳動物是懷孕的婦女，並且使用抗體FDO161G或FDO66Q或FDO338P中的一個或幾個。
本發明還有一個方面是涉及這種均勻的或接近均勻的抗原，FDO161G或FDO66Q蛋白質和FDO338P蛋白質，或者它們的衍生物。
本發明參照

圖1進一步說明，該圖是從妊娠婦女的外周血液中分離出來的滋養層細胞的PCR產品分析的照片。分析是在15%(W/V)聚丙烯醯胺凝膠中進行的。圖中痕跡1和8DNA分子大小標誌(pUC19/HpaⅡ消化物;從頭到尾為501、489、404、331、242、190、147、111、110、67、34bp);痕跡2和3從懷有男孩的兩個不同婦女血液中分離出來的滋養層細胞;痕跡4和5從懷有女孩的兩個不同婦女血液中分離出來的滋養層細胞;痕跡6沒有DNA的空白;痕跡7從男孩的足月胎盤中獲得的對照滋養層細胞。
本發明是針對從妊娠哺乳動物的血樣中分離滋養層(胎盤)細胞的方法，這樣分離出的滋養層細胞是遺傳和/或生物化學物質的一個方便的來源，從該物質來源可以對諸如潛在的胎兒異常等進行胎兒分析。滋養層細胞的分離是基於使用絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞的特異抗體，特別是單克隆抗體，儘管並不限於此。因此，本發明的一個方面提供了一種從妊娠哺乳動物的血樣中分離滋養層細胞的方法，該方法包括使所說血樣與結合有效量的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞的特異抗體在足以使所說的抗體結合到細胞上的條件下接觸一段時間，然後分離由所說的抗體結合了的細胞。
只是為了舉例說明的目的。本發明是用來自妊娠婦女的血液分離人的胎盤細胞來描述的。然而，不難理解，本發明可以推廣到所有的哺乳動物，但在推廣到人以外的哺乳動物中的時候，必須改變滋養層結合抗體的特異性。因此，除了對人的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞特異的抗體外，本發明擴展到所有這樣的一些抗體。
在說明書和權利要求書中所用的術語「一個結合有效量的抗體」意指足以結合到靶細胞上去用以分離這樣一些細胞的抗體的量，本發明的一個最佳實施例是抗體被耦合到一種基質上，諸如預先塗有抗鼠IgG(Fc片段)血清的磁性聚苯乙烯的小珠上(Dynabeads M-450，Dynal AS，Oslo，Norway)。然而，其它的基質也可使用，諸如螢光藥品。血樣與一有效量的珠接觸，即每毫升全血大約2000-10000個珠，最好是4000個珠/毫升(亦即約每25毫升血樣105個珠)，並在4℃溫度下保溫過夜，通過對滋養層有活性的特異抗體而連接有滋養層細胞的小珠用鈷-釤磁鐵(Dynal AS)取出。這些方法就性能和/或方法而論代表了一個最佳方案，但可以經受各種變化以適合於特定的情況。但這些仍在考慮了所有這些變化的本發明範圍之內。
因此，本發明涉及用於從孕婦血樣分離滋養層細胞的方法，該方法包括使該血樣與絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞的特異抗體接觸，然後從所說的血樣中分離由所說抗體結合了的細胞。
從哺乳動物血樣中如此分離出的胎兒滋養層細胞，就可以用已知的診斷技術來評估他們的遺傳和/或生物化學特徵。
無論是單克隆或多克隆抗體或它們的組合都可以用於從血樣中分離滋養層細胞的步驟中，然而最好使用單克隆抗體。
在本發明特別推薦的實施例中，已使用了三種抗體來分離滋養層細胞，它們被稱為FDO161G(Muellex等人，1987)，FDO66Q和EDO338P。
這些抗體的每一種都是由在組織培養中無限生長的並能在液氮中冷凍儲藏的各個雜交瘤細胞系分泌的小鼠單克隆抗體，在此將給出這些單克隆抗體和生產它們的詳細細節。這三種單克隆抗體的每一種具有重鏈亞類G和輕鏈Kappa，其它單克隆抗體的來源均由本發明所包括。
單克隆抗體FDO161G和FDO66Q對滋養層膜蛋白相同的或密切相關的抗原決定基(以後稱為「FDO161G/FDO66Q蛋白或抗原)具有明顯的特異性，該抗原決定基存在於人的前三個月和足月的胎盤的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞上和侵入人的蛻膜內的非絨毛細胞滋養層細胞上。
無論用FDO161G抗體還是FDO66Q抗體，還沒有在絨毛細胞滋養層細胞上檢測到該蛋白，它在有限數目的人的其他組織上被檢測，這些組織是成熟的卵巢卵泡的膜和粒膜細胞、睪丸間質細胞、腎上腺皮質的帶束/小球細胞，但它不能在廣泛範圍的人的其他組織和細胞上被檢測，包括外周血液細胞和絨毛間質。這些結果已列在表1和表2中，然而由FDO161G抗體識別的膜蛋白抗原決定基(以及由FDO66Q識別的同樣的或極有關的抗原決定基)在狒狒和狨的胎盤上被檢測到。它也存在於經過培養的人的前三個月的滋養層細胞和人的絨毛膜癌系JEG-3上。
表1單克隆抗體對人體組織的反應活性Mab克隆FDO161GFDO338P(FDO66Q)(FDO78/93P)組織6-12周胎盤++++++足月胎盤++++蛻膜--子宮內膜(增殖的)--子宮肌層--卵巢 +1-睪丸 +2-腎--肝--脾--肝--肺--腎上腺 +3-
胰--皮膚--紋狀肌--甲狀腺--垂體--胃--直腸--結腸--注1.與在成熟的卵泡內的thecal細胞和黃體反應。
2.與間質細胞反應3.與皮質細胞(帶束/小球)反應表2單克隆抗體與人體細胞懸浮液的反應活性細胞單核粒性 T-ALL1粒膜白細胞白細胞細胞Mab克隆FDO161G(FDO66Q)---+++FDO338P(FDO78P)--NT-(FDO93P)FDO 81C2+++ +++ +++ +++
注NT未試驗1T-急性淋巴性白血病(JM系)2FDO81C與所有細胞起反應，用於陽性對照。
單克隆抗體FDO338P檢測到一個存在於人的滋養層膜上的一種蛋白的抗原決定基(「FDO338P蛋白質或抗原)，這種抗原決定基在人的前三個月胎盤和足月胎盤的絨毛合胞體滋養層上被表達。該抗原決定基也存在在人蛻膜的侵入的非絨毛細胞滋養層細胞上，但密度甚低。它不能在人的胎盤的絨毛細胞滋養層細胞上或者在絨毛間質中被檢測到，這種由FDO338P抗體識別的膜蛋白抗原決定基在廣泛範圍的人體其他組織或細胞上檢測不到，包括外周血細胞和血清成分。這些結果已列入表1和表2中，雖然由FDO338P所確定的抗原決定基在狒狒和狨的滋養層上未被檢測到，但存在一種相關的糖蛋白類似物，這種類似物可以由在本發明人實驗室中生產的針對人的FDO338P抗原上的其它抗原決定基的其它單克隆抗體、即FDO78P和FDO93P來鑑別。
由FDO161G或FDO66Q單克隆抗體，和FDO338P或者FDO78P或者FDO93P單克隆抗體所檢測到的滋養層膜蛋白的細胞和組織的分布彼此是各不相同的，並且與以前描述的其它滋養層抗原也不相同。
因此，由Johnson等人(1981)所描述的與合胞體滋養層起反應的單克隆抗體也能識別蛻膜腺細胞(H315)或淋巴細胞(H316)。抗體NDOG1(Sunderland等人，1981)與合胞體滋養層和細胞滋養層結合，並識別一種糖類抗原決定基，由Lipinski等人所描述的Trop.1和Trop.2能與合胞體滋養層和絨毛細胞滋養層兩者結合，由Loke和Day(1984)描述的單克隆抗體與絨毛細胞滋養層和子宮內膜腺(Anderson等人，1987)結合，單克隆抗體FDO161G、FDO66Q和FDO338P，與提交給1986年舉行的世界衛生組織贊助的專題討論會的抗體的特異性作比較，它們都是有區別的(Anderson等人，1987)。
因此，在本發明的一個最佳實施例中，用於分離滋養層細胞的方法包括用一種對滋養層膜蛋白的抗原決定基特異的抗體，最好是單克隆抗體接觸該母體的血樣，接著從所說的血樣中分離由所說抗體結合了的細胞，最好是三種單克隆抗體中的一個，即抗體FDO161G和FDO66Q，它們與位於絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞上的膜蛋白抗原決定基結合，而抗體FDO338P與位於絨毛合胞體滋養層上的一個不同的膜蛋白抗原的抗原決定基結合，並以更低的程度與非絨毛細胞滋養層細胞上的一種不同的膜蛋白抗原的抗原決定基結合。因此，在發明人的實施室裡產生的這些抗體是對下面將要說明的兩種不同的膜蛋白抗原，FDO161G/FDO66Q蛋白質和FDO338P蛋白質特異的。因此，結合使用多於一種抗體也在本發明的範圍內。所以可以使用一種或多種抗體。
用單克隆抗體FDO161G或FDO66Q和FDO338P檢測的蛋白抗原已由人的足月胎盤製備，胎盤組織用一種洗滌劑(CHAPS)增溶，以釋放各個膜蛋白。FDO161G或FDO66Q或者FDO338抗體共價結合的瓊脂糖(Sepharose)珠然後被加入該混合物中，在適當保溫後，回收這些小珠，被結合到該單克隆抗體上的各個抗原然後用一個酸溶液從該抗體上被離解。
已經用親和凝膠色譜法從用洗滌劑增溶的人的足月滋養層膜中分離出FDO161G/FDO66Q蛋白。它在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酸醯胺凝膠電泳中作為單獨一個實體遷移，成為具有分子量為43千道爾頓的二硫蘇糖醇還原蛋白。未還原蛋白以相似的分子量遷移，表明該蛋白不是由多肽的亞單位組成。在被培養的滋養層細胞表面上，用免疫化學分析法，而在人的卵巢粒膜細胞中用螢光分析法檢測到該蛋白，表明這是一種被糖基化的蛋白質。
用酶和化學裂解相結合的方法確定出連結到FDO161G/FDO66Q蛋白質的多肽主鏈上的該糖鏈的性質。用糖苷內切酶F，一種裂解鄰近於胺基酸，天冬醯胺的高甘露糖，雜化的和複合聚糖(亦即所有的N-鏈碳水化合物)，觀察不到分子量的減少。這表明FDO161G/FDO66Q蛋白質不含N-鏈聚糖。使用三氟甲烷磺酸，一種從多肽主鏈上裂解N-和O-鏈聚糖的試劑，可以觀察到分子量明顯減少(從43KDa到31KDa)，這表明FDO161G/FDO66Q蛋白質只含O-鏈聚糖(即連結到絲氨酸或者連結到蘇氨酸)。因為寡聚糖的每個鏈引起2000-4000道爾頓的分子量差。可以估計，FDO161G/FDO66Q蛋白質每個分子有3-6個寡聚糖鏈。
這種蛋白質抗原的胺基酸定序是用標準方法對該分子的N-末端和一個內部的鏈段這兩者進行的，後者是用在磷酸緩衝劑中的蛋白酶V8(得自金黃色葡萄球菌V8)蛋白分解(消化)後得到的，這種絲氨酸蛋白酶在這些條件下在Glu(穀氨酸)的羰基部位和ASP(天冬氨酸)殘基上裂解。胺基酸序列是用自動氣相序列分析儀和傳統的Edman降解化學來確定的，獲得了下列序列FDO161G/FDO66Q蛋白質N端序列Thr〔1〕-Gly-Trp-Ser-His-Leu-Val-Thr-Gly-Ala〔10〕-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Gln-(Arg)-Ile-(Ile)-(Arg)〔20〕-Leu-(Leu)-Val-Lys-(Lys)〔25〕從FDO161G/FDO66Q蛋白質的蛋白酶V8消化獲得的內部序列-Phe〔1〕-(X)-Leu-Arg-Leu-Glu-Ser-Arg-(X)-Ser〔10〕-Phe-Pro-Leu-(Ser)-(X)-Met-Tyr-(X)-Ile〔19〕。
除了圓括號中(以後稱為Y)的以外，排布被認為是清楚的。標誌(X)的排布表示沒有胺基酸被釋放，並且可能是O-鏈的糖基化部位(即胺基酸或者是Ser，或者是Thr)。
上述兩個序列已經與以下的數據基準作了比較NBRF標準數據基準;NBRF輔助數據基準、京都數據基準;瑞士數據基準;Newat數據基準(總共4525個序列-1，116，976個胺基酸殘基)。相關係數定在0.75。這些數據基準中只有兩個蛋白質超出這個水平，即對於N-端序列是PaperWasp(PolistesJadwigae)，對內部的用蛋白酶V8消化的片段是小鼠的α-2u-球蛋白前體。由於相關係數僅分別為0.764(超過14個胺基酸)和0.779(超過9個胺基酸)，可得出結論，由FDO161G或FDO66Q單克隆抗體所確定的蛋白質以前還沒有被定序過。
在SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，用親和色譜法(如前所述)製備的FDO338P抗原以一系列分子量範圍從30KDa到最大值67KDa的實體遷移。相同的譜帶在還原或非還原條件下都可以看到，表明該蛋白不具有或者在內的或者內鏈的二硫化物鍵。兩個最大的和最豐富的種類，即63和67KDa帶已經用電洗脫法從SDS聚丙烯醯胺凝膠中分離出來，成為表觀均勻物質。從FDO 338P凝膠洗脫的蛋白質被表明含有糖類殘基。該糖類用三氟甲烷磺酸去除，引起該蛋白質的分子量降到30KDa。假定每個寡聚糖鏈對SDS-PAGE凝膠上的表觀分子量的貢獻在2000-4000Da之間，估計FDO 338P糖蛋白具有8-16個寡聚糖鏈。連結到多肽鏈的寡聚糖的性質是用糖苷內切酶F和H進行研究的。糖苷內切酶F裂解複合的和高的甘露糖N-連結的(即天冬醯胺殘基)，但不是O-連結(即絲氨酸/蘇氨酸殘基)的寡聚糖。用這種酶的裂解把兩個主要帶的分子量從63和67KDa分別降到43和48KDa。糖苷內切酶H只裂解高甘露糖型的N-連結的寡聚糖。用這種酶處理之後，看不到分子量的減少，表明不存在高甘露糖鏈。因此，FDO 338P糖蛋白似乎具有3-6之間的O-連結的寡聚糖鏈和5-10複合的N-連結的寡聚糖鏈。
因此，本發明延伸到均勻的或接近均勻的FDO161G/FDO66Q蛋白質和FDO338P蛋白質和/或它們的衍生物。衍生物意指對胺基酸和/或糖類序列或者所說的蛋白質的成份的任何變換，諸如增加、刪去和/或替代，並延伸到與不同分子有關的蛋白質和它的組成部份(例如脂類，其它蛋白質等等)。所有這些蛋白質和用於它們的抗體、單克隆或多克隆都為本發明所包括。術語「均勻或接近均勻」意指相對於其它蛋白質至少是70%純的製劑，最好是80-90%純。
本發明的用於在血樣中分離胎兒滋養層細胞的步驟包括，例如用鼠的單克隆抗體FDO 161G或者FDO 66Q或者FDO 338P偶聯到一種基質、如磁性小球上。商售的並已發現是有效的這樣一種基質由一些均勻的磁性聚苯乙烯小珠組成，小珠的表面共價結合了親和法提純的綿羊的抗鼠IgG。每個單克隆抗體(MAb)由一個單獨的雜交細胞系分泌，所說的細胞系是由融合了產生抗體的鼠脾臟細胞的鼠骨髓瘤細胞(P3×63-Ag8-653)產生的，使每個感興趣的雜交細胞系保存不滅。在培養物中生長後，每個細胞系分別把MAb分泌到培養介質中，它們可以被收集並作為抗體的一個來源。這種培養物的上層清液利用在示例2所描述的方法被用於塗到磁性小珠上，為了從孕婦的血液中提取滋養層細胞，使用MAb FDO 161G、FDO66Q或FDO 338P、以使它們特異地結合到母體血液中的滋養層細胞上，而不與任何其它的循環血液細胞結合。由此，MAb特異地連接到如前所述的由每個MAb所確定的攜有滋養層膜蛋白的細胞和/或細胞碎片上。然後，可以用磁鐵從血液細胞懸浮物中提取出連接有滋養層細胞的小珠，在另一種分離方法中，MAb可以用一種螢光標記做記號，而由螢光標記的MAb結合了的滋養層細胞在一個螢光激活細胞分選儀中從該血樣中被鑑別和取出。
無論用哪種方法分離的滋養層細胞都可以被檢查，以獲取遺傳的和/或生物化學的信息。許多已知技術都可以用於獲得遺傳信息，特別是用於確定胎兒性別和遺傳異常。一種這樣的技術包括使用核酸片段作為探針或引物。
核酸探針可以被雜交到被分離的滋養層細胞的核酸中。這種方法是基於在脫氧核糖核酸(DNA)的雙螺旋中的兩個互補的鏈可以通過變性作用被分離，然後在有利於鹼基對的氫鍵鍵合的條件下再退火(雜化)。因此，如果正確的互補核酸序列出現在被分離的滋養層細胞的核酸鏈上，就引起該核酸探針的雜化，就能測量到一個適當的信號。由於胎兒滋養層細胞的數目很少，所以希望一個放大該信號的技術。例如通過使用DNA引物，可以利用聚合酶鏈反應，在這種方法中，由DNA引物瞄準的特定核酸序列通過一種酶、Taq聚合酶被多次複製。這就能夠用在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠上的電泳法檢測被放大了的產品。在用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色之後用紫外光可以對該DNA進行目視觀察，或者通過由放射性同位素示蹤標記的核苷酸而來的放射性同位素示蹤產品的探測來實現對其目視觀察。此外，分離的滋養層細胞可以用於生物化學分析。
為了說明使用單克隆抗體FDO161G或FDO66Q或FDO338P和磁性聚苯乙烯小珠從血液中分離的滋養層細胞的實用性，已使用聚合酶鏈反應(PCR)來區別雄性或雌性來源的細胞。為了確定探測的靈敏度。採用了外周血液淋巴細胞。使用Y染色體特異引物，在PCR和30個放大周期之後，由少至6個雄性淋巴細胞已經可以復現地獲得一個信號。通過用同樣的方法的相等數目的雌性細胞或者沒有產生可探測的放大了的產品(更為通常)，或者產生少量的很易於區別於雄性細胞產品的略微更小尺寸的產品。
為了探測胎兒遺傳異常，從大概要經受絨毛膜絨毛活檢的孕婦取得血樣(約25毫升)，如上所述，用塗有MabFDO161G或FDO338P的磁性小珠從所取的血樣分離出胎兒滋養層細胞，附著到小珠上的被分離的細胞用Y染色體特異引物通過PCR處理，就能預測胎兒性別，在被處理的十一個試樣中，在一個不相關的實驗室裡獨立地進行的絨毛膜絨毛樣品的常規染色體分析證實了這十一例的預測(P＜0.0005)。該結果說明這個方法的實用性。因而證實1.確實兩種獨立的人的滋養層膜蛋白的抗體FDO161G或FDO66Q或FDO338P能被用於分離胎兒細胞。
2.被分離的細胞是來源於胎兒的，因為雄性細胞在七個情況下被鑑別。
3.被分離的細胞隨後可以用適當的探針進行探測遺傳標記的過程。
本發明的另一個方面是在培養該分離的細胞之後用染色體檢查法探測遺傳異常和/或胎兒性別。例如，這將能探測通常的遺傳失調，Down氏綜合症，對於這種綜合症，似乎不大可能在不久的將來有可供利用的遺傳探針。
用磁性小珠技術分離的細胞可以放在塑料培養器皿內，並通過加入由其他培養細胞獲得的生長因子引起分裂。最佳的細胞培養物是取自選擇中止妊娠婦女的蛻膜細胞和為試管授精收集卵過程中獲得的人的粒膜細胞，從這些細胞培養物得到的沒有細胞的上清液以適當的濃度加到被分離的滋養層細胞懸浮液中。可以在適當的時間通過加入已知的試劑、如秋水仙鹼來抑制細胞的分裂，然後用標準的細胞遺傳診斷技術來分析染色體。
本發明也延伸到用於從妊娠哺乳動物的血樣中分離滋養層細胞、和附加地用於獲得關於所說細胞的遺傳和/或生物化學信息的試劑盒(Kit)，它包括隔室形式的第一容器，適合於安放對絨毛合胞滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞特異的抗體;可附加有的第二容器，適用於接收和盛放來自所說妊娠哺乳動物的血樣，和可附加有的第三容器，適合於容納用於由分離的滋養層細胞獲得遺傳和/或生物化學信息的裝置。
第一個容器內的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體或者它們的組合，而最好是FDO161G或者FDO66Q或FDO338P和/或它們的組合。諸如前面講到過的先被結合到磁性聚苯乙烯小珠這樣的基質上的單克隆抗體是一個最佳實施例。
下面的例子詳細說明本發明用於人的滋養層膜蛋白的單克隆抗體的生產和這些抗體的使用，以說明本發明的效用。用於這個說明中的方法是示例性的，而不是對本發明的限制，應當理解，在本發明的範圍之內，可能作出各種不同的改進。
例1單克隆抗體的生產a.合胞體滋養層的製備前三個月的胎盤是從選擇中止妊娠的明顯健康孕婦得到的，在懷孕6至10周時通過抽吸得到的，仔細地將凝集的血液和任何附著的蛻膜從胎盤上分開，合胞體滋養層通過在一個250目的篩子上輕輕地梳理胎盤被分離，這些合胞體滋養層片顯然比汙染的細胞要大，很容易在單位重力下在Earle氏平衡鹽溶液(FlowLaboratories，Sydney，Australia)中沉積，沉積約2分鐘，輕輕倒出上層清液，這些細胞被再懸浮在新鮮的溶液中，這種清洗程序要進行三次，然後細胞或者用於小鼠免疫，或者放入培養液內。滋養層的成功分離是在三天保溫後在培養液中用合成的人的絨毛膜促性腺激素證實的。人絨毛膜促性腺激素的濃度是用固相的兩位免疫放射測定法測量(Hybritech，California，USA)。
用0.5毫升的滋養層細胞懸浮液以腹膜注射方式對Balb/C小鼠進行免疫。免疫原是在首次注射後停滯三周後的六周內以一周的間隔給藥的。
b.絨毛膜癌細胞懸浮液的製備絨毛膜瘤細胞系JEG-3是從美國典型培養物收藏中心(ATCC)提供。細胞在37℃溫度下、在空氣含5% CO2的溼潤氣氛下、在6井器皿中、在補充有10%(V/V)熱失活的牛胎血清，L-穀氨醯胺(2mM)，青黴素(100國際單位/毫升)和鏈黴素(100微克/毫升)的RPMI-1640中培養。當這些培養物被匯集在一起時，細胞從2個井中被挖出，再懸浮在0.5毫升不添加的RPMI-1640中，並進行腹膜內注射。這種免疫原以一周的間隔通過腹膜內注射進入Bal b/c小鼠，持續六周。
C.麥胚外源凝集素洗脫液的製備麥胚外源凝集素洗脫液是用前三個月的胎盤製備的，胎盤膜蛋白是通過以1∶10(W/V)的比例加入在20mMTris-HCl、具有0.02%(W/V)疊氮化鈉的pH8.0的緩衝液，5mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1mM苯基甲磺醯氟(PMSF)中的8mM3-〔(膽醯胺丙基)二甲胺〕1-丙基磺酸酯(3-〔cholamidopropyl)dimethylammonio〕1-propanesulphonate)(CHAPS)溶液被增溶。在4℃下攪拌17小時後，以2000g離心15分鐘去除不溶性物質。用增溶了的胎盤製劑(約30毫升)在攪拌17小時下，分批地培養共價方式結合到瓊脂糖小珠(約1毫升的充填小珠)上的麥胚外源凝集素。然後在200g下離心5分鐘回收小珠，並轉移到一個柱上，以便用三倍體積的在均勻化緩衝劑中的200mMN-乙醯氨基葡萄糖清洗。對於Balb/c小鼠的最初免疫，提取物用Freund氏完全佐劑(1∶1，V/V)乳化。1/2毫升的乳化液被皮下注射到Balb/c小鼠的幾個部位上，最初免疫後三周，三次每周單獨0.5毫升提取液的加強免疫通過腹內注射給藥。
d.免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤的融合在融合處理的前5天，向鼠腹內注射0.5毫升的Freund氏不完全佐劑，在接下來那天，施用最後一次輔助劑，免疫小鼠的脾細胞用小鼠骨髓瘤P3×63.Ag8.653細胞融合，融合的細胞混合物最初以脾細胞濃度2×107細胞·毫升被分配到24井的培養器皿內，並使其能在有RPMI1640(Flow Laboratories)的情況下在空氣含5%CO2的溼潤氣氛中、在37℃溫度下生長約10天，該介質包含了10%(V/V)熱失活的牛胎血清(Flow Laboratories)，1×10-7氨基碟呤、1.6×10-5M胸苷，2mM L-穀氨醯胺，100單位/毫升青黴素和100微克/毫升鏈黴素。取出每個雜交克降的少量細胞，並轉移到另外的24井培養皿的各個井中。為了使分離克隆分泌識別糖類抗原決定基的Mab的概率最小並促進在免疫親和凝膠中使用對滋養層有反應活性的Mab的可能性，IgG分泌克隆用一種抗原俘獲ELIST技術來識別。簡要地說，ELISA培養皿用抗鼠Ig和由所加的每個雜交克隆得到的培養物上清液塗覆。在適當的培養時間和清洗之後，結合了第二抗體的IgG類特異酶被加入，並用適當的酶基質發展。所有IgM分泌克隆被廢棄，含IgG或A的培養物上清液用一種免疫過氧化酶技術(見下)在前三個月胎盤的冷凍切片上篩選抗體結合活性。感興趣的培養物然後用限制稀釋法被克隆二次，並在培養物中進一步擴大。
e.用冷凍切片的免疫過氧化酶染色確定單克隆抗體的組織特異性用一個美國光學低溫箱(AmericanOpticalCryostat)在-20℃下切割冷凍組織的切片。5微米厚的切片在塗有鉻-鋁明膠的玻璃片上空氣乾燥2小時，這些組織切片用含抗體的細胞培養物的上清液在室溫下保溫1-2小時或者在4℃下保溫過夜。被結合的抗體通過用生物素標記了的馬的抗小鼠IgG抗體、接著由抗生物素-生物素化的過氧化酶複合物(VectorLaboratories，Burlingame，CA)揭示。在20mM咪唑緩衝溶液中(pH7.0)的具有0.01%過氧化氫的二氨基聯苯胺(DAB)是該酶的基質。切片是用Mayer氏的蘇木精明礬(Haemalum)復染色。然後用Depex將蓋片固定到空氣乾燥的切片上。
對於包含相當數量內源生物素的組織，如肝和腎，使用一種間接的免疫過氧化酶技術。一種標記了山羊抗鼠IgG的過氧化酶的適當稀釋液減少了用抗生物素一過氧化酶複合技術時發現的高的背景染色。
人的組織是如下獲得的前三個月的胎盤和蛻膜是從選擇終止妊娠婦女得到的，在分娩一小時內的足月胎盤，而子宮內膜、子宮肌層、卵巢、子宮頸、胃、結腸和直腸是在外科手術時得到，其餘的是在死亡6小時內得到的。這些組織在液氮中冷凍，然後在-70℃下貯存，不多於2個月。
在發明人實驗室中產生的單克隆抗體(FDO114G)，它與Ⅳ型膠原反應，在所有組織上起陽性對照的作用。
f.單克隆抗體對人的滋養層膜蛋白的選擇性本發明中所述的單克隆抗體是按下列標準為基礎選擇的1.它們屬於IgG類2.分泌各種抗體的細胞系是穩定的，並在培養液中快速生長、連續分泌有關的Mab，細胞系可以在液氮中冷凍貯存，且能從冰凍狀態回復。
3.單克隆抗體是與整個懷孕過程中的人胎盤上的合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層強烈地起反應的，但不與胎盤的間質細胞起反應。FDO161G和FDO66Q與人的其它組織具有非常有限的反應活性，FDO338P不與任何大塊的其它試驗人組織起反應。也不與人的外周血液細胞或血清成分起反應。
4.這些單克隆抗體確定的蛋白抗原，即FDO161G/FDO66Q蛋白質和FDO338P蛋白質，是糖蛋白，因此，其抗原決定基很可能是在滋養層細胞的表面膜上被表達。
應用這些直觀的標準意味著所選的Mab具有提取以極低的出現率在妊娠母體血液中循環的滋養層細胞的最佳能力。
例2滋養層細胞從母體血樣中的分離和證實a.偶聯了抗體的基質的製備每種Mab的來源是標準條件下(補充有10%(V/V)熱失活牛胎血清，2毫升L-穀氨醯胺，100單位/毫升青黴素和100微克/毫升鏈黴素的RPMI 1640介質，在空氣含5%CO2的溼潤氣氛下，溫度為37℃)培養的各個細胞系的無細胞的培養物上清液。上清液是從井生長的培養物收集的，用離心法去除細胞並貯存冷凍在-20℃下。
所使用的基質是用商業上可得到的配製品，預先用綿羊的抗鼠IgG(Fc碎片)血清塗在表面的磁性聚苯乙烯小珠(DynabeadsM-450，DynalAS，OSlo，Norway)。
1毫升滅菌的上清液與2千萬個小珠混合，並於室溫下在混合器上自一端到另一端地轉動試管。然後，塗復了的小珠在4℃條件下貯存。使用之前，小珠在含1%(V/V)熱失活牛胎血清的磷酸鹽緩衝的鹽水中清洗3次(每次清洗2分鐘)。每次用鈷-釤磁鐵從清洗溶液中收集小珠，試管靜放在磁鐵上幾分鐘，使小珠能沉積在試管放在磁鐵上的內表面上。倒掉清洗液，小珠最終被重新懸浮在含L-穀氨醯胺(2mM)的冰冷RPMI 1640培養介質中，使得達到大約2.5×105珠/毫升。
b.滋養層細胞從血樣中的分離從孕婦的肘前靜脈抽取25毫升的血樣進入含每毫升全血10個國際單位鋰肝素的注射器中，該血液用含2mM的L-穀氨醯胺、青黴素(100國際單位/毫升)、鏈黴素(100微克/毫升)和肝素(10國際單位/毫升)的冰冷RPMI1640介質稀釋10倍，輕輕地攪拌。並在小珠如前所述正被清洗時被保持在4℃的溫度下。稀釋的血液和洗滌過的小珠輕輕地被攪拌(4000個珠/毫升全血，即每25毫升血樣105個)並在4℃條件下保溫過夜。這些通過對滋養層反應的特異抗體而附著了滋養層細胞的小珠用鈷-釤磁鐵(DynalAS)取出。大量的這種混合物可以連續地處理(由通過在磁鐵上流動)或者分批處理以取出這些小珠。在分批處理的情況下，含有小珠的介質容積通過接連的提取和清洗，最終被減至0.4毫升。此時，小珠-細胞混合物或者可以作為DNA序列放大用，或者可被放入培養物中。
c.探測含有Y染色體的細胞的方法為了證明由連接有結合到滋養層膜蛋白上的Mab的小珠所分離的細胞真是來源於胎兒的細胞，採用一個Y染色體特異信號用於檢測被分離細胞中的Y染色體，由於細胞以很少的數目存在，所以可以應用聚合酶鏈反應(PCR)。將一對DNA引物用到一個Y染色體的重複序列上，已經獲得了雄性特異信號。找出了給出滿意特異性和信號強度的這種引物，被命名為WYR7和WYR8。放大了的DNA序列的大小是124鹼基對(bp)。這些引物的序列如下WYR75′TGGGCTGGAATGGAAAGGAATGGAAAC3′WYR85′TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA3′已使用的方案如下1.連到磁性小珠上的細胞可等分放入一些含鹽水的0.5毫升的Eppendorf試管中，鹽水的體積已被減至最小，雖然對於25微升的PCR緩衝液混合物，反應能容忍到鹽水高達至少10微升的體積。
2.在鹽水中的細胞在一個100℃的水浴槽內加熱10分鐘被溶胞，該細胞懸浮液用一石蠟油層蓋住，且試管在這種處理過程中被蓋住。
3.然後加入PCR緩衝液(到25微升)。在反應混合液中各試劑的最終濃度是67mM Tris-HCl(在25℃時pH8.8)，2.0mM MgCl2，0.01%(W/V)明膠，10mM β-巰基乙醇，16.6mM硫酸銨，17微克/毫升牛血清清蛋白，10%的二甲亞礬，0.1mM三磷酸脫氧核苷酸，每種引物0.25微克以及0.2單位的Taq DNA聚合酶(Thermophilns aquaticus)。
4.然後如下進行PCR的30次循環變性步驟94℃1分鐘退火步驟55℃1分鐘聚合酶擴大步驟72℃1分鐘每一輪放大是相同的，所不同的是(ⅰ)第一次變性步驟是6分鐘，(ⅱ)最後一個循環的擴大步驟是10分鐘。
5.PCR產品是在瓊脂糖或聚丙烯醯胺中用標準方法電泳，在該凝膠已用溴化3，8-三氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色後在紫外線下進行目視觀察。
連接到磁性小珠上的滋養層細胞已用顯微鏡精確地定量，Y染色體特異信號可以在PCR的30個周期後從只有6個雄性淋巴細胞中可復現地獲得。用於相同PCR的等量的雌性細胞不產生出可探測的信號或者產生很容易與雄性細胞產生的信號相區分開來的極其微弱的信號。
圖1說明了從一個足月男嬰胎盤得到的對照滋養層細胞以及由Mab塗復小珠分離的用CVS(絨毛膜絨毛採樣)證實的男、女胎兒細胞得到的信號。發明人的實驗室已處理了經受絨毛膜絨毛採樣活檢的孕婦的十一個血樣，在這十一例中，胎兒性別的預測十一例都被證實(P＜0.0005)。
d.分離的胎兒滋養層細胞的培養用小珠連接的滋養層細胞被放入48井的底部有蓋片的塑料培養器皿內，並用1∶1∶1的以下培養基的混合物組成的複合培養介質覆蓋，這些培養基是(a)由選擇早期妊娠中止的婦女獲得的人的蛻膜細胞培養物的上清液，(b)人的粒膜細胞培養物的上清液(在試管授精計劃中收集卵過程中獲得的);(c)含10%(V/V)正常的婦女血清，2mM L-穀氨醯胺，100單位/毫升青黴素和100微克/毫升的鏈黴素的標準培養介質RPMI1640，在空氣含5%CO2的溼潤氣氛下，溫度為37℃下培養。培養14至21天後，滋養層細胞培養物已達到足以進行染色體研究的細胞密度。這種研究是按細胞遺傳學診斷中執行的標準技術進行的。培養物的上清液(a)和(b)是由標準介質中的蛻膜細胞和粒膜細胞得到的;收集該培養物的上清液，離心去除細胞並貯存在-20℃溫度下。
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權利要求
1.一種用於從妊娠哺乳動物血樣中分離滋養層細胞的方法，該方法包括使所說血樣與對結合是有效量的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞特異抗體在足以使所說抗體結合到靶細胞上去的條件下接觸一段時間，然後從所說血樣中分離由所說抗體結合了的細胞。
2.按權利要求1所述的方法，其中哺乳動物是人類女性。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其中該抗體是對位於絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞上的滋養層膜蛋白的抗原決定基是特異的。
4.按權利要求3所述的方法，其中該抗體是對位於絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞上的滋養層膜蛋白的抗原決定基是特異的，但該抗原決定基不存在於母體或胎兒來源的任何其它血載細胞或任何血清成份中。
5.按權利要求4所述的方法，其中該滋養層膜蛋白的前體根據十二烷基硫酸鈉聚丙稀醯胺凝膠上的電泳，具有從約30KDa到70KDa的分子量。
6.按權利要求4所述的方法，其中該蛋白是一種表面表達的滋養層膜蛋白，根據十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠上的電泳，它具有約60KDa到70KDa的分子量。
7.按權利要求4所述的方法，其中該蛋白是一種糖蛋白，且沒有N-鏈的高甘露糖鏈，但每個分子具有3至6個O-鏈和5至10個複合N-鏈的寡聚糖鏈，或者其中糖蛋白沒有N-鏈、但每個分子具有3至6個O-鏈的糖蛋白鏈。
8.按權利要求7所述的方法，其中該滋養層膜蛋白具有大約43KDa的分子量，具有一個N-末端序列為Thr-Gly-Trp-Ser-His-Leu-Val-Thr-Gly-Ala-Gly-Gly-phe-Leu-Gly-Gln-(Y)-Ile-(Y)-(Y)-Leu-(Y)-Val-Lys-(Y)，具有一個部分內部序列是-Phe-(X)-Leu-Arg-Leu-Glu-Ser-Arg-(X)-Ser-Phe-Pro-Leu-(Y)-(X)-Met-Tyr-(X)-Ile-，其中X和Y是如前所定義的。
9.按前面任何一個權利要求所述的方法，其中該抗體或是單克隆抗體，或者是多克隆抗體，或者是它們的組合。
10.按權利要求9所述的方法，其中該抗體是FDO161G或FDO66Q或者FDO338P和/或它們的任何組合。
11.一種用於獲得妊娠哺乳動物中的胎兒遺傳和/或生物化學信息的方法，該方法包括取出妊娠哺乳動物的血樣，以及使所說血樣與對結合是有效量的絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞的特異抗體在足以使所說的抗體結合到靶細胞上的條件下接觸一段時間，然後從所說血樣中分離由所說抗體結合了的細胞，並從該分離的細胞獲得遺傳和/或生物化學信息。
12.按權利要求11所述的方法，其中所說的哺乳動物是人。
13.按權利要求11至12中任一個所述的方法，其中該抗體是對位於絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞上的滋養層膜蛋白的抗原決定基特異的。
14.按權利要求13所述的方法，其中該抗體是對位於絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞上的滋養層膜蛋白的抗原決定基特異的，但該抗原決定基不出現在母體或胎兒來源的任何其它血載細胞或任何血清成份中。
15.按權利要求14所述的方法，其中該滋養層膜蛋白前體根據十二烷基硫酸鈉聚丙烯酸醯胺凝膠上的電泳，具有約30至70KDa的分子量。
16.按權利要求13所述的方法，其中該蛋白是一種表面表達的滋養層膜蛋白，根據十二烷基硫酸鈉聚丙烯酸醯胺凝膠上的電泳，具有約60至70KDa的分子量。
17.按照權利要求13所述的方法，其中該蛋白是一種糖蛋白，它不具有N-鏈的高甘露糖鏈，但每個分子具有3至6個O-鏈和5至10個複合N-鏈的寡聚糖鏈，或者在其中，該糖蛋白沒有N-鏈，但每個分子有3至6個O-鏈的寡聚糖鏈。
18.按權利要求13所述的方法，其中該滋養層膜蛋白具有分子量約為43KDa，具有一個N-末端序列為Thr-Gly-Trp-Ser-His-Leu-Val-Thr-Gly-Ala-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Gln-(Y)-Ile-(Y)-(Y)-Leu-(Y)-Val-Lys-(Y)，和一個部分內部序列-Phe-(X)-Leu-Arg-Leu-Gln-Ser-Arg-(X)-Ser-Phe-Pro-Leu-(Y)-(X)-Met-Tyr-(X)-Ile-，其中X和Y如前所定義。
19.按權利要求9至14中任一個所述的方法，其中該抗體是單克隆抗體或多克隆抗體或它們的組合。
20.按權利要求19所述的方法，其中該抗體是FDO161G或FDO66Q或FDO338P和/或它們的任何組合。
21.按前述權利要求中任一個所述的方法，其中該抗體首先被結合到一固體基質上。
22.按權利要求21所述的方法，其中所說的固體基質由磁性小珠組成。
23.按權利要求22所述的方法，其中該基質由用綿羊的抗鼠IgG(Fc碎片)血清預塗了的磁性聚苯乙烯小珠組成。
24.按權利要求22所述的方法，其中從血樣中分離抗體結合了的細胞包括讓血樣連續地以水流方式通過一個磁鐵的步驟。
25.按權利要求1至20中任何一個所述的方法，其中該抗體首先被結合到一種螢光標記上。
26.按權利要求25所述的方法，其中該螢光標記是一種適合用於螢光激活細胞分選的螢光標記。
27.均勻或接近均勻的抗原FDO161G/FDO66Q蛋白，或它們的任意組合。
28.均勻或接近均勻的抗原FDO338P蛋白。
29.一種用於從妊娠哺乳動物血樣分離滋養層細胞，並附加地用於從所說的細胞獲取遺傳和/或生物化學信息的試劑盒，它包括按隔室形式的第一容器，適合存放對絨毛合胞體滋養層和非絨毛細胞滋養層細胞特異的抗體;附加的第二個容器，適合於接收和盛放妊娠哺乳動物的血樣;以及附加的第三個容器，適合於放置從該分離的滋養層細胞獲得遺傳和/或生物化學信息的裝置。
30.按權利要求29所述的試劑盒，其中在第一容器內的該抗體是單克隆抗體或多克隆抗體或它們的組合。
31.按權利要求30所述的試劑盒，其中該抗體是FDO161G或FDO66Q或FDO338P和/或它們的組合。
32.按權利要求29所述的試劑盒，其中用於獲得遺傳和/或生物化學信息的裝置包括用於培養該分離的滋養層細胞的裝置。
33.按權利要求29所述的試劑盒，其中用於獲得遺傳和/或生物化學信息的裝置包括DNA探針或引物。
34.按權利要求29所述的試劑盒，其中該抗體被結合到一固體基質上。
35.按權利要求34所述的試劑盒，其中該基質由用綿羊的抗鼠IgG(Fc碎片)血清預塗過的磁性聚苯乙烯小珠組成。
36.按權利要求29所述的試劑盒，其中該抗體被結合到一種螢光標記上。
37.按權利要求36所述的試劑盒，其中該螢光標記是一種適用於螢光激活細胞分選的螢光標記。
全文摘要
本發明涉及用於從妊娠哺乳動物的血液中分離滋養層(胎盤)細胞的方法，以便提供重要的起始材料，即來自胎兒的細胞，使能獲得有關將得到的胎兒的遺傳和/或生物化學信息。更具體地，本發明涉及使用對哺乳動物滋養層上的膜蛋白標誌特異的單克隆抗體，以便從母體血液中分離滋養層細胞。這些細胞然後可以用於在妊娠早期獲得胎兒的遺傳和/或生物化學信息。本發明特別與探測人胎兒的異常有關。
文檔編號C07K16/00GK1043788SQ89109789
公開日1990年7月11日 申請日期1989年12月6日 優先權日1988年12月6日
發明者烏茨·沃爾特·梅勒, 凱薩琳·斯特拉·霍斯 申請人:南澳大利亞·弗林德斯大學