獲得單體形式的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)的方法；重組凝血酶原激活...的製作方法

2023-06-15 10:00:06

專利名稱：獲得單體形式的重組凝血酶原激活蛋白酶 ( r L O P A P )的方法；重組凝血酶原激活 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及獲得單體形式的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)的方法；重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)及其胺基酸序列；這種蛋白酶用於消除血液纖維蛋白原以及作為凝血酶原血異常診斷試劑盒的用途。
背景技術：
由於其毒液穿過皮膚注入，已知Lonomia屬會引起全身毒害，呈現不同強度的出血現象，有時引起接觸的受試者死亡(Lorini，1999)。The Walker Lonomia obliqua物種(Lemaire，1972)自從1989年以來已經在巴西南部的限制區內引發了流行性規模的意外事件(RioGrande do Sul，Santa Catarina and Paraná)(巴西，1998)。
在各種症狀中，接觸的患者在1-48小時不等的時間後主要顯示血液體液不調徵候(血液成分比例的改變)，隨後有或無出血現象並且甚至能夠導致死亡(Kelen等人，1995；巴西，1998)。
最近，Zannin等人確定了105位患者的凝固參數和血漿纖維蛋白溶解，並且用一些現存資料證實了意外事件影響凝固和纖維蛋白溶解的機制。這些結果表明一種強消耗型凝血病，其可以歸因於存在於Lonomia obliqua幼蟲剛毛中的毒液成分，其具有強烈的促凝血作用和纖維蛋白溶解的繼發激活作用(Zannin等人，2002)。
Lonomia obliqua幼蟲毒液具有一些幹擾凝固系統的成分。已經描述了在L.obliqua剛毛提取物中存在凝血酶原激活物和X因子(Donato等人，1998；Kelen等人，1995)。
本發明的發明人分離並表徵了69kDa的凝血酶原激活蛋白酶，命名為Lopap(Lonomia obliqua凝血酶原激活蛋白酶)。它在大鼠中具有絲氨酸蛋白酶特徵和促凝血活性，消除血液中的纖維蛋白原並只改變血小板數目的30％，儘管其完全抑制通過膠原蛋白誘導的血小板的聚集功能以提高PGI2水平。
Lopap，當通過腹膜內給藥注射入大鼠中時，在小靜脈和小動脈中形成血栓，引發多形核白細胞遷移到肺和腎中(Reis等人，1999，Reis等人，2001a，b)。
最近可以證實Lopap在內皮細胞(HUVECs)中作為粘附分子例如ICAM-1和E-選擇素表達的誘導物，不過它並不表達VCAM。它也不誘導IL-8和PGI2的增多。不表達VCAM提示Lopap對於內皮細胞的促炎作用不能與TNF-α或凝血酶相比。高濃度的PGI2還可以起抗血小板聚集的作用。
還驗證了由Lopap產生的凝血酶是功能性的並且被抗凝血酶III(AT)所抑制，並且它能夠聚集血小板以及凝固血漿和纖維蛋白原，提示類似於α-凝血酶(Chudzinski-Tavassi等人，2001)。
L.obliqua剛毛提取物在大鼠中可以有效地實驗性預防靜脈血栓形成(Prezoto等人，2002)，證明利用純化的毒液級分闡明這種作用機制的研究是正確的。
在此研究過程中，在pGEM11zf+質粒中構建了cDNA文庫，並且通過使用獲自天然蛋白的N-末端部分的特異性簡併起始寡核苷酸，分離出與Lopap相應的克隆，並測定了其序列。將由cDNA推定的胺基酸序列與來自「GenBank」的CLUSTAL W程序的其它序列相比對。
Lopap呈現與菜青蟲(Pieris brassicae)的BBP-後膽色素結合蛋白37％的同一性；與人(Homo sapiens)的ApoD-載脂蛋白D前體34％的同一性；與菸草天蛾(Manduca sexta)的INS-A-蟲青素A 35％的同一性；與鉤蝦(Homarus gammarus)的CC-A2-A2甲殼藍蛋白A2亞單位22％的同一性；與鉤蝦的CC-C1.-C1甲殼藍蛋白C1亞單位26％的同一性，以及與原雞(Gallus gallus)的PURP.-羥基茜草素前體27％的同一性(gi 131549)。
lipocalins(來自希臘語「lipos」＝脂肪而「calyx」＝杯狀體)是大群組的一部分，出現在幾個物種中，總是擴展並顯示很大的功能和結構多樣性。通常它們是介於160至180個胺基酸之間的小蛋白，呈現共同的特徵(Flower等人，2000)。
這些蛋白彼此顯示少許相似性(20％左右)，不過它們包含兩個高度保守的結構域(通過氫鍵結合到″β-桶″區域的八個胺基酸殘基)，使得將它們分類為lipocalins。這些區域是造成其二級和三級結構高度相似性的原因。
lipocalins能夠將它們自身結合到分子上(特別是疏水性分子如視黃醇)來呈現疏水性″β-桶″類區域，其由裡面的空腔和外面的環組成，並且包含針對不同配體的結合位點。這些空腔和「環」的差異使得每種蛋白可能適應不同大小、形狀和化學特性的配體。
由通過cDNA獲得的序列，進行一種研究Lopap結構模型的方法，所述方法利用Swiss PDB Viewer 3.7(b2)程序和Swiss ModelServer。所發現的是典型的lipocalin家族結構，不過不可能通過這種建模看到絲氨酸蛋白酶位點。
文獻中並未描述Lipocalin家族成員蛋白具有凝血酶原激活蛋白酶的功能。與動物毒液的其它激活物不同，rLopap水解凝血酶原，獨立於其凝血酶原酶複合物成分而生成片段(前凝血酶2，凝血酶以及片段1.2和片段1和2)。這種片段化促進凝血酶較慢形成，能夠更好地控制它並阻止它的作用。另外，對於促進有關NO，PGI2的內皮表達水平的細胞反應，rLopap不同於其它已知的激活物，因為它能夠調節血小板聚集反應。除此之外，當與其它毒液凝血酶原激活物相比時，這種蛋白具有易於以其重組形式獲取的優點。
基於rLopap激活凝血酶原的能力，可以製備這些因子在血漿中的濃縮物的劑量試劑盒。在rLopap與稀釋的人血漿一起孵育後，通過水解特定的顯色或螢光底物(市售的有，例如Chromogenix的S2238，其序列為H-D-苯丙氨醯-L-哌啶醯-L-精氨醯-對-硝基苯胺，或者可以合成為Abz-FFNPRTFGSGQ-EDDnp的形式)來測定形成的凝血酶。參照在405nm處測量的顯色底物的吸光度，它顯示與樣品凝血酶原活性成比例，並且它可以與市售的標準人血漿曲線相比。
基於蛋白激活活性而不改變血小板數目的去血纖維蛋白質酶潛力和使得Lopap可以作為新的凝血酶原激活物的結構差異，相同的發明人提交了專利申請，涉及這種蛋白-PI 02002698。
概括地說，PI 0200269-8描述了來自Lonomia obliqua幼蟲剛毛的具有凝血酶原激活活性的可溶性蛋白的純化方法，所涉及的凝血酶原激活物的胺基酸序列的部分測定的方法，測定級分II以及凝血酶原激活物的這種凝血酶原激活活性的方法和這種激活物的用途。

發明內容
按照針對上述蛋白的相同研究方法，本發明人提供了重組形式的Lopap，其具有足夠的活性以便進行臨床藥理學測定。
根據本發明，將Lopap在表達載體中亞克隆並在大腸桿菌中表達。
為了實施本發明使用了下列物品菌系大腸桿菌；1)菌株DH5α80 dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rk-，mk+)SupE44，relA1，deoRΔ(lac ZYA-arg I)u169。
2)菌株BL21(DE3)F』，ampT，hsdSB(r8-，m8-)，dcm，gal(DE3)。DE3噬菌體包含在Lac UV5啟動子控制之下的T7噬菌體的RNA聚合基因，可通過異丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)進行誘導。
質粒1)pGEM-11Zf(+)用EcoRI e Not I消化的載體，用於質粒文庫構建。PROMEGA Technical Manual，1999。
2)「easy」pGEM-T「easy」pGEM-T質粒包含T7和SP6啟動子，其側翼為MCS(「多克隆位點」)區，用於亞克隆PCR產物。PROMEGA Technical Manual，1999。
3)pAE源自pRSETA(Invitrogen)和pET3-His(Chen，1994)的表達載體，在Institute Butantan的分子生物技術實驗室中構建(Ramos等，2003)。
pAE是高表達載體，其結合了T7啟動子的效率和高數目的pRSETA質粒拷貝，帶有六個組氨酸的N末端融合，其不能從pET3-His上除去，允許重組蛋白通過IMAC(「固定金屬親和色譜法」)進行純化。添加這種小的融合併不影響大多數所研究的重組蛋白的活性。
為了在PCR反應中合成起始寡核苷酸，如下進行該過程「有義」寡核苷酸(P1和P2)獲自蛋白的N-末端序列(圖1)。優選向這些寡核苷酸中加入BamHI限制性位點，隨後用於單方向性克隆。還使用「有義」和「反義」寡核苷酸。將它們全部稀釋在TE(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM)緩衝液中，終濃度為10-pmol/μl(100μM)。
對於mRNA製備，將程序確定如下提取和製備剛毛將幼蟲在CO2(乾冰)條件下麻醉並切下它們的針突(2.7g)並置於預先稱重的無菌塑料管中，浸於液氮中。用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理除去RNA酶後，在研缽中研磨針突，使用乾冰和液氮，直到變成精細粉末。
提取總RNA優選利用Triazol方法根據其生產商的手冊中介紹的方法將針突粉用於獲得總RNA。
總RNA的電泳圖譜電泳系統的附件用過氧化氫(H2O2)3％來處理，以消除RNA酶並用滅菌的DEPC處理的水洗滌。將10mM，pH 7.0磷酸鈉緩衝液中的1.5％瓊脂糖凝膠置於合格的系統中。在凝膠中施加包含10或15μl總RNA(16.7ng/μl)，5μl樣品緩衝液和DEPC處理的H2O的兩種樣品，最終體積為25μl。在5V/cm條件下進行樣品遷移，直到溴酚到達凝膠的2/3部分。
在低聚(dT)纖維素親和柱中純化mRNA
在用NaOH 0.1N洗滌和用1ml的Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，NaCl300mM，SDS 0.1％，pH 7.0緩衝液平衡的低聚dT纖維素親和柱中純化mRNA。
向總RNA中加入3ml的這種緩衝液，隨後於70℃孵育5分鐘，在冰中將它再冷卻5分鐘並施加到親和柱中。通過重力排乾所述柱並再用4ml的緩衝液進行洗滌以除去所有非mRNA的RNA。用1.5ml的Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，SDS 0.1％，pH 7.0緩衝液洗脫mRNA並收集在乾淨的處理過的試管中，於70℃加熱5分鐘並在冰中再冷卻5分鐘。將所述材料在室溫孵育20分鐘後，向其中加入90μl的NaCl5M，並再次將它施加到以所述緩衝液重新平衡過的柱中。在再次用4ml的緩衝液洗滌和用1.5ml洗脫緩衝液洗脫所述材料後將產物用90μl的NaCl 5M和3ml無水乙醇於-80℃「過夜」沉澱。隨後將所述材料於7000g 4℃離心20分鐘並棄去上清液。用1ml 75％的乙醇洗滌mRNA並於7000g 4℃離心2分鐘。
乾燥後，將沉澱的mRNA重懸於20μl的DEPC處理的H2O中並保持於-80℃。
mRNA的量化向498μl無菌H2O milli-Q中加入2μl mRNA，使終體積達到500μl。在500μl的石英比色杯中於260和280nm處讀取光密度值。利用下列公式來計算mRNA濃度[RNA]＝A260×D×40μg/ml其中D＝稀釋因子關於cDNA文庫的構建，執行下列程序由4.0μg分離的mRNA構建cDNA文庫，優選使用進行cDNA合成和質粒克隆的SuperScriptTM質粒系統(Life Technologies)改進的試劑盒。
第一鏈的合成將4.0μg mRNA稀釋於6μl DEPC處理的水中，其中加入1.5μl的NotI接頭引物並隨後將它在70℃加熱10分鐘，在冰浴中冷卻並快速離心。向試管中加入4μl的第一鏈緩衝液5x，2μl的DTT 0.1M，1μl的dNTP 10mM混合物和0.5μl的H2O。攪勻反應物，快速離心並在44℃平衡2分鐘。加入5μl的Super Script II RT酶並將混合物再於44℃孵育90分鐘。以4℃冷卻的步驟停止反應。
第二鏈的合成向第一鏈反應混合物中加入91μl的H2O，30μl的第二鏈緩衝液，3μl的dNTP 10mM混合物，1μl的大腸桿菌DNA連接酶10U/μl，4μl的大腸桿菌DNA聚合酶I 10U/ml和1μl的大腸桿菌RNA酶H(2U/μl)。輕輕渦旋混合物後，將它在16℃孵育2小時並向其中加入2μl的T4 DNA聚合酶I，於相同溫度下再進行5分鐘的孵育。通過冷卻步驟和通過添加10μl EDTA 0.5M停止反應。
在瓊脂糖凝膠中篩選片段大小將添加了17μl不含二甲苯腈藍的Ficoll的全部第二鏈反應物施加到瓊脂糖凝膠1％中，並且在樣品於80V在電泳系統中遷移了1cm後，將兩個條帶從凝膠中切出。一個條帶包含400-800pb的片段(低分子量-BA)而另一個條帶含有800pb以上的片段(高分子量-BB)。
優選利用Concert Gel Extraction Systems(Life Technologies)試劑盒從凝膠中純化DNA，用65℃加熱的50μl H2O洗脫cDNA並利用濃縮法減少到30μl。
將cDNA連接到EcoRI接頭上向反應試管中加入10μl的T4 DNA連接酶5X緩衝液，5μl的Eco RI(Amersham)接頭和5μl的T4 DNA連接酶，其後於16℃孵育16小時。緊接著將反應物於65℃加熱10分鐘並在冰中進行冷卻。加入2μl的ATP溶液和2μl的T4聚合酶激酶之後，將反應物在37℃孵育30分鐘。
利用55μl的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取cDNA，渦旋並於14000g室溫下離心5分鐘。將上面的水相轉移到另一個試管中並加入2倍體積的無水乙醇和1倍體積的3-M乙酸鈉並於-80℃冷卻1小時。於14000g離心20分鐘並用500μl 70％乙醇洗滌後，將cDNA流通乾燥大約5分鐘。
用NotI消化向沉澱物中加入41μl的H2O，5μl的REact反應緩衝液，4μl的NotI，輕輕勻化並隨後於37℃孵育2小時。
在瓊脂糖凝膠中進行第二次大小篩選將50μl反應物(高和低分子量片段)施加到瓊脂糖凝膠1％中並且在電泳後，將條帶從凝膠中切出。如第一次大小篩選(在瓊脂糖凝膠中篩選片段大小)中所述，純化高和低分子量的cDNA並用50μl H2O進行洗脫。
cDNA單方向性連接到pGEM11Zf(+)載體上向高和低分子量的兩種級分(14μl)中加入4μl的T4 DNA連接酶緩衝液，1μl的克隆載體，優選pGEM11Zf(+)(之前用EcoR I-NotI酶消化)(圖2)和1μl T4 DNA連接酶並於16℃孵育18小時。
本發明的細菌轉化過程遵循下面所述的程序感受態大腸桿菌DH5α的轉化將高和低分子量的DNA(2μl)加入到50μl鈣感受態細菌(DH5α)中，所述感受態細菌是根據Inoue等人(1990)的方法製備的，保持於-80℃並在使用前在冰中解凍15分鐘。將該溶液在冰中孵育30分鐘，然後在42℃熱激2分鐘並再次置於冰中5分鐘。
將350μl的SOC培養基加入到轉化的細菌中，隨後轉移到曝氣試管中，於37℃在渦旋條件(220rpm/分鐘)下孵育90分鐘。將200μl高和低分子量的cDNA置於含有2YT-氨苄青黴素培養基的平板中。將這些平板於37℃孵育18小時。將20個包含高分子量插入片段的菌落和20個包含低分子量插入片段的菌落於37℃在200rpm的渦旋條件下在兩個平板中孵育18小時，所述平板含有2.5ml的2YT-氨苄青黴素(100μg/ml)培養基。優選利用小量製備-Concert Rapid Plasmid(Life Technologies)試劑盒純化cDNA，用50μl TE於65℃進行洗脫。
為了分析有關質粒的文庫，採取下列步驟在存在1μl特定反應緩衝液，4μl水，0.5μl EcoRI(10U/μl)酶的條件下，將質粒(4μl)於37℃消化2小時。在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠1％中，分析0.5μl HindIII(10U/μl)和生成的片段。對所有分析的質粒進行測序。
為了實現文庫的擴增，將包含50μl DH5α鈣感受態細菌和5μl高或低分子量(BA或BB)的連接到克隆載體上的DNA的混合物在冰中孵育30分鐘，42℃孵育2分鐘。其後，將它們再放回冰中保持5分鐘。此後，向其中加入10ml的2YT/氨苄青黴素(100μg/ml)培養基。將這些溶液輕輕勻化並將2.5ml的等分試樣通過移液管轉移到脫氣試管中並於37℃孵育18小時。其後利用小量製備柱提取質粒DNA，用50μl的H2O於65℃洗脫並保持於-20℃。
聚合酶鏈反應(PCR)製備進行PCR「聚合酶鏈反應」的反應物，最終體積為50μl，包含1μl dNTPs 10mM，5μl Taq DNA聚合酶10x緩衝液，1.5μl MgSO450mM和0.5μl TaqDNA聚合酶2.5U。為了擴增編碼凝血酶原激活蛋白的cDNA，使用4μl擴增的質粒DNA，4μl寡核苷酸P1 10pM和2μl寡核苷酸SP6 10pM。將反應物在熱循環儀中孵育，其中開始於94℃進行變性程序3分鐘，30個變性循環(94℃ 45秒)，退火(50℃ 25秒)，延伸(72℃ 4分鐘)以及於72℃最後延伸15分鐘。其後，將樣品施加到瓊脂糖凝膠1％中。在80V下電泳遷移2小時後，從凝膠中切出對應於預期擴增產物的條帶並提取DNA，在30μl水中洗脫用於連接到第二種克隆載體上，優選「pGEM-T Easy載體系統」(PROMEGA)。
選擇下列方法將DNA連接到「easy」pGEM-T上連接反應在10μl的最終體積中於16℃進行18小時，其中包含6μl的PCR產物(1700pb)，1μl的pGEM-T載體(圖3)，2μl的T4 DNA連接酶5x緩衝液和1μl的T4 DNA連接酶1U/μl。
載體與插入片段的關係根據下式進行計算XIVR=Y]]>
其中X＝載體的ng；I＝插入片段的Kb；R＝插入片段/載體的摩爾關係；Y＝插入片段的ng；V＝載體的Kb。
將DH5α大腸桿菌菌株與5μl的載體-插入片段連接反應物一起孵育並置於平板中。從形成的菌落中，採集40個菌落，如同轉化DH5α-感受態大腸桿菌方案中所述的一樣，進行預接種和「小量製備」程序。
在瓊脂糖凝膠中篩選重組質粒在進行「小量製備」反應之前，根據Beuken等人(1998)所述的方法，對每種預接種物300μl進行快速的苯酚∶氯仿純化。其後，將每種樣品20μl施加到TAE 1X緩衝液中的瓊脂糖凝膠1％中。運行電泳後，用0.1μg/ml的溴化乙錠溶液對凝膠進行染色以便在紫外線下篩選較大的重組質粒(Sambrook，1989)。對前面步驟中的陽性克隆進行「小量製備」並用60μl水洗脫。
利用引物2(P2)進行PCR製備PCR反應物，最終體積10μl，包含0.2μl dNTPs 10mM，1.0μl Taq DNA聚合酶10x緩衝液，0.3μl MgSO450mM，0.1μl Taq DNA聚合酶5U/μl。為了進行cDNA擴增，使用2μl 1/50稀釋的前面步驟中純化的陽性克隆作為模板，和0.8μl寡核苷酸P2 10pM和0.4μlSP6 10pM作為引物。將反應物在Perkin-Elmer 9600型熱循環儀中孵育，開始於94℃進行變性程序3分鐘，30個變性循環(94℃ 45秒)，退火(50℃ 25秒)，延伸(72℃ 4分鐘)以及於72℃最後延伸15分鐘。其後，將樣品施加到瓊脂糖凝膠1％中。
用限制酶消化質粒DNA將純化的通過利用引物P1和P2的PCR擴增的克隆的DNA於37℃在溶液中消化2小時，所述溶液包含5μl質粒DNA，2μl特定反應緩衝液，0.5μl Hind III(10U/μl)，0.5μl BamH I(10U/μl)和12μl H2O，最終體積為20μl。
將相同的質粒DNA(5μl)在相同條件下與1μl特定反應緩衝液，1μl EcoR I(10U/μl)和12μl水一起孵育。
在瓊脂糖凝膠1％中分析消化產物。對該文庫的克隆和在「easy」pGEM-T中亞克隆的DNA進行測序。
選用二脫氧核苷酸鏈終止方法進行DNA測序，使其適應於自動測序方法。通過小量製備經過純化來製備400ng質粒DNA，在測序反應中將它用作模板。將T7和SP6用於所述的寡核苷酸反應中。在熱循環之後，在36cm長的DNA測序凝膠(在1XTBE和7M尿素中的4.25％丙烯醯胺∶雙丙烯醯胺，比例為19∶1)中分離擴增產物。這種裝置的檢測系統由雷射源和螢光檢測器組成，設置在測序凝膠的下部。每種dNTP發射由檢測器識別的特異性螢光，所述檢測器對計算機發出信號，計算機將自動記錄核苷酸在電泳圖譜中的位置。該程序運行7小時。將所有測序的DNA通過網站www.ncbi.nlm.nih.gov/，基於BLASTx和BLASTn程序的算法，或網站www.ebi.ac.uk/，基於FASTA程序與「GenBank」序列進行比較。
用於本發明中的重組蛋白的表達過程，優選大腸桿菌菌株BL21(DES)，遵循如下所列的程序連接到pAE載體上經測序的插入片段確認了Lopap序列的陽性克隆，在7ml LB/氨苄青黴素中於37℃孵育18小時，其後對它們進行小量製備並用50μl水洗脫。
將純化的DNA在溶液中於37℃消化5小時，所述溶液包含20μl質粒DNA，5μl特定的反應緩衝液，1.0μl EcoR I(10U/μl)，1.0μlBamH I(10U/μl)和23μl水，最終體積為50μl。
在製備性瓊脂糖凝膠1％中電泳後，將600pb左右的條帶從凝膠中純化出來，用30μl水洗脫並於45℃進行真空乾燥1小時。
將質粒重懸於10μl水中並將其中3.5μl於16℃與3.5μl pAE表達載體(圖4)，2μl DNA連接酶5x緩衝液和1μl DNA連接酶一起孵育18小時。對在pAE載體中亞克隆的克隆也進行測序。
誘導Lopap表達為了獲得大量可溶性重組蛋白，優選使用大腸桿菌BL21(DE3)菌株來表達這種蛋白。它提供了快速生長，易於培養和保持，並且它產生大量的重組蛋白。這種大腸桿菌菌株是溶源性的，沒有呈現翻譯後修飾系統。
將優選通過重組表達載體(pAE-克隆14.16)(圖4)轉化的大腸桿菌培養物接種在3ml LB/氨苄青黴素(100μg/μl)培養基中並於37℃孵育，直到獲得DO600nm0.5。對於未誘導的對照，將1ml預接種物保持於4℃。向剩餘體積中加入0.5mM IPTG並繼續孵育3小時。對於全部40μl的培養物，加入10μl的SDS-PAGE應用緩衝液，其中含有β-巰基乙醇0.1M。將樣品煮沸12分鐘並施用於聚丙烯醯胺凝膠12.5％中。其後，在50％甲醇中用0.25％的「考馬斯亮蘭」對凝膠染色18小時並用10％醋酸水溶液於室溫脫色3小時。
為了獲得本發明的蛋白(Lopap)的表達，採取下列步驟將以表達載體轉化的大腸桿菌培養物接種在100ml LB/氨苄青黴素(100μg/μl)培養基中並於37℃孵育直到獲得DO600nm0.5。將25ml的等分試樣在4個不同的瓶子中於37℃孵育90分鐘，所述瓶子含有500ml LB/氨苄青黴素(100μg/μl)。隨後加入IPTG至終濃度為1mM並繼續孵育4小時。隨後將培養基於12000rpm離心並在-70℃下冷凍18小時。將4瓶中的細胞重懸於70ml裂解緩衝液(NaH2PO450mM，NaCl 300mM，咪唑10mM)中，用2000GAGE的弗氏壓碎器處理三次並於4℃ 5000rpm下離心15分鐘。
將包含可溶性表達蛋白的上清液於15000rpm離心30分鐘至澄清，並施加到鎳-瓊脂糖親和柱中，所述親和柱預先用裂解緩衝液平衡過。用緩衝液(咪唑80mM，β-巰基乙醇5mM，NaCl 500mM，TrisHCl 50mM pH 6.8)洗滌該柱，並收集洗滌體積。利用Tris-HCl 50mMpH 8.0，咪唑1M，NaCl 100mM以1ml/5分鐘的流速來洗脫蛋白質。
對培養基的「沉澱物」(微粒)用弗氏壓碎器進行處理並離心，重懸於20ml的緩衝液(Tris-HCl 50mM，尿素1M，Triton X-1001％，pH 8.0)，以便除去疏水性成分並於4℃ 5000rpm下離心15分鐘。將分離的沉澱物在25℃室溫下與10ml緩衝液(Tris-HCl 50mM，NaCl 500mM，尿素8M，β-巰基乙醇10mM pH 8.0)一起孵育來溶解所述微粒。在4℃ 4000rpm下將這種材料再次離心20分鐘並將上清液逐滴加入到「再摺疊」緩衝液(Tris-HCl 50mM，NaCl 500mM，咪唑5mM和β-巰基乙醇5mM pH 8.0)中(作為獲得正確結構的蛋白質的備選方案。利用添加了CaCl2100mM的該緩衝液進行另一種方法來達到這種狀態)，同時於室溫不斷渦旋18小時。過濾所述材料並施加到鎳-瓊脂糖柱中72小時，所述鎳-瓊脂糖柱預先用裂解緩衝液平衡過。用180ml緩衝液Tris-HCl 50mM，NaCl 500mM，咪唑20mM pH 6.8洗滌該柱，並用Tris-HCl 50mM pH 8.0，咪唑1M，NaCl100mM以1ml/5分鐘的流速進行洗脫。
為了以正確形式分離全部rLopap，將可溶性蛋白和來自微粒的洗脫物都施加到苄脒-瓊脂糖柱中，所述苄脒-瓊脂糖柱在Tris-HCl 20mM，NaCl 500mM，pH 8.0的介質中，並用甘基酸50mM，pH 3,0進行洗脫。相對於NaCl 3mM對洗脫蛋白進行徹底透析48小時。
通過Bradford方法(1976)來計量洗脫蛋白以及純化過程中間階段的等分試樣並通過SDS-PAGE進行分析。
利用純化的凝血酶原和優選S-2238顯色底物(Chromogenix)對獲得的重組蛋白測試其凝血酶原激活能力。
Lopap的三級結構模型基於由cDNA獲得的序列，利用Swiss PDB Viewer 3.7(b2)程序和Swiss Model Server進行Lopap模型研究的方法。
重組Lopap的二級結構分析為了評估重組蛋白的「摺疊」，通過圓二色性光譜測定法分析其二級結構。
光譜(CD)分析在分光偏振計上於25℃在190至300nm波長之間進行。光譜以200nm/分鐘的速度，1nm的解析度累積8次。
將重組Lopap稀釋在Tris/HCl 20mM pH＝8.0緩衝液中，濃度為1.2mg/ml。數據基於蛋白質濃度表示為摩爾。
具體實施例方式
實施例1製備mRNA獲得7.0μg mRNA，將其中的4μg用於構建cDNA文庫。
獲得的mRNA顯示具有良好的質量(mRNA∶蛋白質＝1.5∶1)，瓊脂糖凝膠分析顯示出與mRNA對應的條帶(圖5)。
實施例2在質粒中構建cDNA文庫通過瓊脂糖凝膠電泳篩選質粒文庫，顯示出105個質粒/μg。在質粒中構建了兩個文庫一個的插入片段在400-800pb之間(BA)，另一個的插入片段大於800pb(BB)。
從每個文庫隨機挑選300個克隆，用限制性內切酶EcoR I和HindIII酶切後顯示出許多不同大小的插入片段。將這些插入片段中的一些用所述限制性酶酶切，從而在瓊脂糖凝膠中產生兩個條帶(圖6)。對cDNA BA和BB文庫中隨機挑選的300個克隆測序，這些克隆與「GenBank」中已有的蛋白質具有顯著同一性。
實施例3Lopap編碼cDNA的擴增用寡核苷酸P1和SP6擴增BA文庫(400-800pb)的產物顯示出一條約為600pb的條帶和另一條800pb左右的條帶，而在BB文庫(大於800pb)中則顯示出一條800pb左右的條帶(圖7)。將600pb的條帶(命名為C1)和800pb的條帶(命名為C2)從凝膠中切下進行純化。純化的cDNA優選在「easy」pGEM-T載體中亞克隆，並對DH5α感受態細胞進行轉化，將其置於平板中。
實施例4篩選重組質粒收集40個克隆(實施例3)，其中20個對應於C1條帶(命名為C1-1到C1-20)，其餘20個對應於C2條帶(命名為C2-1到C2-20)，對於插入片段的大小進行篩選，隨後通過小量製備來純化質粒DNA。如圖8中所示，對顯示有大片段插入的質粒進行純化，並且用引物P2進行了PCR試驗。
實施例5用引物P2進行PCR擴增用引物P2和SP6擴增上一步得到的陽性克隆，只有C1的第二個克隆和第三個克隆(C1-2和C1-3)是陽性的(圖9)，對其進行限制性酶切和測序。對應於C2條帶的克隆都是陰性的，沒有顯示。
實施例6用限制性內切酶酶切質粒DNA在BamH I位點和Hind III位點切割之後對在「easy」pGEM-T中亞克隆的DNA C1-2和C1-3進行比對，並且對在EcoR I位點切割後釋放出600pb左右的插入片段也進行比對(圖10)。
實施例7cDNA測序對600pb(C1-2和C1-3)的PCR產物的克隆以及連接到pAE載體上具有相同酶切圖譜的克隆進行測序，其包含起始寡核苷酸P1和P2的序列，與Lopap N端46個殘基對應的序列，以及之前測序得到的內部片段的序列。對561個核苷酸進行了測序，其對應於該蛋白質總序列的187個胺基酸(圖11)。
實施例8表達用限制性內切酶BamH I和EcoR I將插入片段從「easy」pGEM-T載體上切下，閱讀框帶有該載體的六個組氨酸的末端在pAE載體中亞克隆，其中閱讀框帶有該載體的六個組氨酸的末端。
重組蛋白質為21kDa，包括由pAE載體添加的6個組氨酸，在用IPTG誘導前進行表達，並且其產量隨著誘導而增加(圖12A)。儘管發現了可溶性表達蛋白，但Lopap大部分是由內含顆粒組成，將內含顆粒用尿素和β-巰基乙醇溶解和用鎳-瓊脂糖柱純化(圖12B)之後，將它施加到苄脒-瓊脂糖柱中，並通過改變pH值進行洗脫，以便分離出正確結構的蛋白質。
將rLopap相對於EDTA 3mM進行透析，在血小板存在的條件下，應用S-2238顯色底物測試它的凝血酶原激活活性。
實施例9分析Lopap序列推定出來的Lopap序列與lipocalin家族的幾種蛋白質具有約30％的同一性(圖13)。負責lipocalins所特有的三級結構的區域的高度相似性位於Leu118-Tyr128殘基和Asn149-Lys157殘基附近。
實施例10Lopap的三維結構模型通過模型構建分析和與資料庫比較得到了Lopap的三維結構，它與lipocalin家族蛋白質的特徵性結構相似(圖14)。它包括9個β-摺疊類區段，一個β-桶區域以及兩個α-螺旋，其中一個在N末端，而另一個在C末端區域。除此之外，還能觀察到形成兩個分子內二硫橋的可能性。
實施例11通過圓二色性研究重組Lopap的二級結構肽和蛋白質呈現二級結構的標準光譜，其可以通過圓二色性光譜測定法(CD)進行評估。最重要和最特徵化的標準是由兩個α-螺旋表現的(Holzawarth等人，1965)，其中我們可以在接近222nm和208nm處看到強度相當的兩條負帶以及在接近於190nm處看到一條正帶。
由β-摺疊表現出來的光譜強度較低，在217nm附近顯示一條負帶，在195nm附近有一條正帶，而另一條負帶在接近於180nm處(Brahms等人，1977)。
Lipocalin的特徵性結構成分為大約7％的α-螺旋，47％的β-摺疊以及45％的隨機結構(Flower，1996)。Lopap的圓二色性光譜(圖15)顯示出lipocalin家族的典型結構特徵，具有6.2％的α-螺旋，52.9％的β-摺疊和28.9％的隨機結構。
實施例12凝血酶原水解天然的Lopap和rLopap能優先利用S-2238底物激活凝血酶原。然而，在相同的濃度下，rLopap的功效較低(圖16)。這兩種蛋白質都不能在顯色底物中直接進行水解。
實施例13rLOPAP對凝血酶原的激活在5μM磷脂(磷脂醯絲氨酸磷脂醯膽鹼PS:PC)存在和缺乏的條件下，用rLopap(2μM)激活凝血酶原(10μM)，反應緩衝液為Tris-HCl0.02M，NaCl 0.15M pH 8.0以及CaCl215mM。在反應的不同時間(1分鐘；1小時30分鐘；5小時和18小時)收集10μl等分試樣，在10％的SDS-PAGE中進行分析(圖17)。
在非還原條件下，可以觀察到72kDa的條帶(凝血酶原)、可能對應於凝血酶原F1.2的52kDa條帶、對應於凝血酶或前凝血酶2的36kDa條帶，以及對應於凝血酶原片段1(F1)的24kDa條帶。在還原條件下，觀察到了52kDa的條帶(F1.2)、36kDa的條帶(前凝血酶2)、32kDa的條帶(凝血酶原的B鏈)和27kDa的條帶(F1)。
為了驗證凝血酶原酶複合物成分在r-LOPAP激活凝血酶原中的影響，在200pM Va因子存在和缺乏的條件下，用rLopap(2μM)和5mM的PS:PC激活凝血酶原(10μM)。使用的反應緩衝液為Tris-HCl0.02M、NaCl 0.15M pH 8.0和CaCl215mM。在培養的不同時間(1分鐘；1小時30分鐘；5小時和18小時)收集等分試樣(10μl)進行SDS-PAGE分析(圖18)。在因子Va存在和缺乏的條件下獲得了相同的水解水平。
實施例14體內研究rLopap的去纖維蛋白能力用rLopap以靜脈給藥的方式處理小鼠，根據動物體重劑量分別為125、250和500μg/kg，使實驗小鼠保持存活並且在處理後48小時顯示出良好的生命體徵。不過血液顯示不可凝性，並且在rLopap給藥後2小時和48小時用Clauss測試法測量均不能檢測到血漿中血纖維蛋白原的水平(表1)。500μg/kg的劑量並未對動物產生任何毒性作用，這種情況一直持續而沒有明顯變化，只是顯示凝固時間更長，至少持續48小時。
用低於125μg/kg的劑量進行處理能延長血纖維蛋白原的凝固時間，而不會引起微循環的劇烈改變。
表1.用rLopap處理過的小鼠血漿中血纖維蛋白原的含量

實施例15凝血酶原激活活性當使用凝血酶原和S-2238顯色底物時，通過凝血酶形成測定法來間接地確定天然Lopap的重組形式(rLopap)激活凝血酶原的能力。將15nM該蛋白質、5mM CaCl2和90nM凝血酶原(最終體積100μl)於37℃預孵育20分鐘之後，評估該蛋白質的凝血酶原激活活性。該反應發生在Tris-HCl 50mM，NaCl 100mM，pH 8.3中，包含咪唑150mM。用由Lopap形成的凝血酶，利用90nM凝血酶原對40μMS-2238進行水解，隨後於37℃，在405nm處進行分光光度計測量20分鐘。
實施例16為了驗證Lopap是否能用作凝血酶原劑量診斷試劑盒的一種成分，將50μl的人血漿在緩衝液TRIS-HCl 20mM，NaCl 100mM，pH 8.0中以1/40稀釋，與15μl 50mM CaCl2和40μl rLopap一起於37℃孵育5分鐘，rLopap的終濃度為5μg/ml。之後，向其中加入3mM S2238底物(Chromogenix)20μl，於37℃再孵育5分鐘。用30％的乙酸50μl停止該反應，並以分光光度計於405nm測量底物的水解。
根據標準曲線計算凝血酶原的濃度，該標準曲線是利用相同的方法稀釋標準人血漿(Dade-Behring)而得到的，稀釋度為1/30，1/40，1/80和1/160(活性分別為150，100，50和25％)。
人血漿樣品中凝血酶原濃度顯示93％的活性。使用從市場購買的對照品(正常的與病理學的-Dade-Behring)來驗證這一結果。結果，正常的對照品(活性為70-100％)的活性為86％，病理對照品(35％-50％)的活性達到41％。將缺乏凝血酶原的血漿用作對照，顯示凝血酶原濃度為5％。這些數據表明rLopap能用於確定患者血漿中的凝血酶原水平。


圖1.用於擴增與Lopap對應的克隆的簡併引物。
A＝腺嘌呤；C＝胞嘧啶；T＝胸腺嘧啶；G＝鳥嘌呤；M＝C或A Y＝T或C R＝A或G N＝A，T，C或G圖2.pGEM-11Zf(+)(Promega-TB075)的圖譜圖3.「easy」pGEM-T(Promega-A1360)的圖譜圖4.pAE(生物技術中心-Butantan研究所-Ramos等人，2003)的圖譜圖5.mRNAr的1％的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
1用作對照的降解RNA；2從剛毛中提取的mRNA。
圖6.質粒文庫的cDNA插入片段。
顯示從質粒文庫中隨機挑選的40個克隆與EcoR I和Hind III一起孵育兩小時後產生的片段的1％瓊脂糖凝膠電泳。(A)範圍在400-800pb的cDNA文庫(BA)和(B)插入片段大於800pb的cDNA文庫(BB)。
1Hind III標記；2-21任意克隆的切割產物圖7.編碼Lopap的cDNA擴增產物。1％的瓊脂糖凝膠。
1λ/Hind III標記；2BA中用寡核苷酸P1和SP6擴增的產物；3BB中用寡核苷酸P1和SP6擴增的產物。C1和C2是600pb和800pb的擴增片段。
圖8.在1％的瓊脂糖凝膠電泳中通過大小篩選重組質粒。
(A)基因組DNA；(B)具有大插入片段的重組質粒；(C)無插入片段的質粒或具有小插入片段的質粒；(D)RNA。*具有由引物1擴增的插入片段的陽性克隆。
圖9.利用引物2擴增插入片段。之前用P1擴增的對應於C1條帶的陽性克隆。只有克隆2和3是陽性克隆。
圖10.PCR切割產物的電泳圖譜。1λ/Hind III標記；2C1-2的質粒DNA；3用BanHI和Hind III酶切C1-2後釋放出來的載體(3,000pb)和插入片段(600pb)；4用EcoR I酶切C1-2後釋放出來的載體和插入片段；5C1-3的質粒DNA；6用BanH I和Hind III酶切C1-3後釋放出來的載體和插入片段；7用EcoR I酶切C1-2後釋放出來的載體和插入片段。
圖11獲得的rLopap的核苷酸序列以及推定的胺基酸序列。A)核苷酸序列，SEQ ID No.1黑體代表寡核苷酸P1(7-29)和P2(67-86)的序列，下劃線代表終止密碼子(562-564)的序列和多腺苷酸化位點(630等等)的序列。B)胺基酸序列SEQ ID No.2黑體代表的是由化學測序得到的胺基酸序列。最開始的兩個胺基酸對應於加在引物上的BamHI位點。
圖12.Lopap表達。在用IPTG誘導後在鎳-瓊脂糖柱中對在大腸桿菌中產生的重組蛋白進行純化。1和4標準；(A)rLopap表達-2加入IPTG前的表達；3加入IPTG後的表達；以及(B)rLopap純化；5-9在純化中洗脫的級分。
圖13.推定的Lopap胺基酸序列與Lipocalin家族其它成員的序列比對。
「GenBank」資料庫中得到的序列顯示出Lopap和lipocalin家族蛋白質的相似性。(pfam00061)得分＝49.3比特，E-值為2e-07。BBP-後膽色素結合蛋白，菜青蟲(Pieris brassicae)(gi1705433)；MUP-泌尿蛋白的主要前體，褐鼠(Rattus norvegicus)(gi 127533)；Prot-1-味腺蛋白1，褐鼠(gi 12621114)；ApoD-載脂蛋白D的前體，人(gi 4502163)；INS-A-A型蟲青素，菸草天蛾(Manduca sexta)(gi 124151)；CC-A2-甲殼藍蛋白A2的亞基A2，鉤蝦(Homarus gammarus)(gi 117330)；CC-C1.-甲殼藍蛋白的亞基C1，鉤蝦(gi 117420)；PURP.-紅紫素的前體，原雞(Gallusgallus)(gi 131549)。黑體表示高度相似性。突出顯示了與lipocalin特徵具有高度相似性的區域。
圖14.Lopap的三維結構。應用Swiss PDB Viewer 3.7(b2)和Swiss Model Server程序建立的結構模型。
圖15.rLopap的圓二色譜光譜。CD光譜是用分光偏振計在25℃，190到300nm波長範圍內掃描生成的。光譜在1nm的解析度下，以200nm/分鐘的速度掃描8次疊加而成。
圖16.凝血酶原激活。於37℃ 5μg激活物與90nM凝血酶原一起孵育，最終體積為100μl。
◆不含FII和激活物時的底物(空白)；■不含激活物的FII對照；▲rLopap和△天然Lopap。
圖17.rLopap引起的凝血酶原水解。在非還原條件(圖17a)和還原條件(圖17b)下進行考馬斯亮蘭染色的10％的SDS-PAGE。
分子量標準參照物[肌球蛋白(200Kda)，磷酸化酶B(97.4KDa)，BSA(67KDa)，卵清蛋白(43KDa)，碳酸酐酶(29KDa)，β-乳球蛋白(18.4KDa)，溶菌酶(14.3KDa)]；凝血酶原(PT)；1)PT+LOPAP(1分鐘inc)；2)PT+LOPAP+PS:PC(1分鐘inc)；3)PT+LOPAP(1小時30分鐘inc)；4)PT+LOPAP+PS:PC(1小時30分鐘inc)；5)PT+LOPAP(5小時inc)；6)PT+LOPAP+PS:PC(5小時inc)；7)PT+LOPAP(18小時inc)；8)PT+LOPAP+PS:PC(18小時inc)。
圖18.凝血酶原酶複合因子存在和缺乏條件下的凝血酶原水解。考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE。非還原條件(圖18a和圖18c)和還原條件(圖18b和圖18d)。
分子量標準參照物[肌球蛋白(200Kda)，磷酸化酶B(97,4KDa)，BSA(67KDa)，卵清蛋白(43KDa)，碳酸酐酶(29KDa)，b-乳球蛋白(18.4KDa)，溶菌酶(14.3KDa)]；1)凝血酶原(PT)；2)PT+LOPAP+PS:PC+Va(1分鐘inc)；3)PT+LOPAP+PS:PC+Va(90分鐘inc)；4)PT+LOPAP+PS:PC+Va(5小時inc)；5)PT+LOPAP+PS:PC+Va(18小時inc)；6)凝血酶，7)凝血酶原(PT)；8)PT+LOPAP+PS:PC(1分鐘inc)；9)PT+LOPAP+PS:PC(90分鐘inc)；10)PT+LOPAP+PS:PC(5小時inc)；11)PT+LOPAP+PS:PC(18小時inc)；12)凝血酶。
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序列表110申請人名稱Biolab Sanus Farmaceutica Ltda.；等120發明名稱獲得單體形式的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)的方法；重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)及其胺基酸序列；這種蛋白酶作為去纖維蛋白原酶製劑以及凝血酶原血異常診斷試劑盒的用途130案卷參考號PI0403882-7150在先專利申請BR PI0403882-7151在先專利申請日2004-08-24160SEQ ID NOs的數目2170軟體Microsoft Word 2000210SEQ ID NO1211長度675212類型PRT213生物體Lonomia obliqua220
223其它信息對於rLopap獲得的核苷酸序列和推定的胺基酸序列。核苷酸序列寡核苷酸P1(7-29)和P2(67-86)，終止密碼子(562-564)和多腺苷酸化位點(630-675)的序列400序列1ggatccgacg tagttataga tggtgcgtgt cctgacatga aggcggtatc gaaatttgac 60atgaatgctt atcaaggaac gtggtacgag atcaagaaat tccccgtggc taatgaagcg120aacggtgatt gtggaagtgt tgagtatacc cccgacaatg gactactgaa ggtgagagcg180ggacacgttg aagatgatat cgagaagttt gttgtcggag tcctcaccaa gaatgcagac240accagcgatg ctgagctcac tctcagcgtt gtagtcggcg actacgtccg cgttgcaccg300ctgtggattc tttctactga ttacgacaac tatgctatcg gctactcctg caaagactac360aagaagagca accaacacag ggtaaacatc tggattctct cgaggaccaa gactctcaac420gaaagttcca agtccactgt caacaagttc cttaaggagc actcaaagga gttcgatcaa480tcgaaatttg tcgagacaga tttctccgaa aaagcatgct tcttcaagaa atcacacgtg540tacactgtac cattcggagc ttaaattcga tttgtttggt ctagtgctaa taaaaggttt600ttgggttttt aaatttaatt aaccttataa gtggaattaa taataaataa gtgaaacaaa660aaaaaaaaaa aaaaa 675210SEQ ID NO2
211長度187212類型PRT213生物體Lonomia obliqua220
223其它信息對於rLopap獲得的核苷酸序列和推定的胺基酸。通過化學測序獲得的胺基酸序列(3-48；58-64；122-137；158-180)。開始兩個胺基酸對應於添加到引物上的BamHI位點400序列2Gly Ser Asp Val Val Ile Asp Gly Ala Cys Pro Asp Met Lys Ala Val5 10 15Ser Lys Phe Asp Met Asn Ala Tyr Gln Gly Thr Trp Tyr Glu Ile Lys20 25 30Lys Phe Pro Val Ala Asn Glu Ala Asn Gly Asp Cys Gly Ser Val Glu35 40 45Tyr Thr Pro Asp Asn Gly Leu Leu Lys Val Arg Ala Gly His Val Glu50 55 60Asp Asp Ile Glu Lys Phe Val Val Gly Val Leu Thr Lys Asn Ala Asp65 70 75 80Thr Ser Asp Ala Glu Leu Thr Leu Ser Val Val Val Gly Asp Tyr Val85 90 95Arg Val Ala Pro Leu Trp Ile Leu Ser Thr Asp Tyr Asp Asn Tyr Ala100 105 110Ile Gly Tyr Ser Cys Lys Asp Tyr Lys Lys Ser Asn Gln His Arg Val115 120 125Asn Ile Trp Ile Leu Ser Arg Thr Lys Thr Leu Asn Glu Ser Ser Lys130 135 140Ser Thr Val Asn Lys Phe Leu Lys Glu His Ser Lys Glu Phe Asp Gln145 150 155 160Ser Lys Phe Val Glu Thr Asp Phe Ser Glu Lys Ala Cys Phe Phe Lys165 170 175Lys Ser His Val Tyr Thr Val Pro Phe Gly Ala180 18權利要求
1.編碼重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)的核苷酸序列，其特徵在於由SEQ ID No1組成ggatccgacgtagttatagatggtgcgtgtcctgacatgaaggcggtatcgaaa54tttgacatgaatgcttatcaaggaacgtggtacgagatcaagaaattccccgtg 108gctaatgaagcgaacggtgattgtggaagtgttgagtatacccccgacaatgga 162ctactgaaggtgagagcgggacacgttgaagatgatatcgagaagtttgttgtc 216ggagtcctcaccaagaatgcagacaccagcgatgctgagctcactctcagcgtt 270gtagtcggcgactacgtccgcgttgcaccgctgtggattctttctactgattac 324gacaactatgctatcggctactcctgcaaagactacaagaagagcaaccaacac 378agggtaaacatctggattctctcgaggaccaagactctcaacgaaagttccaag 432tccactgtcaacaagttccttaaggagcactcaaaggagttcgatcaatcgaaa 486tttgtcgagacagatttctccgaaaaagcatgcttcttcaagaaatcacacgtg 540tacactgtaccattcggagcttaaattcgatttgtttggtctagtgctaataaa 594aggtttttgggtttttaaatttaattaaccttataagtggaattaataataaat648aagtgaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaa675。
2.根據權利要求1的重組凝血酶原(rLOPAP)的激活劑序列，其特徵在於具有下列SEQ ID No2的肽GSDVVIDGACPDMKAVSKFDMNAYQGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVEYTPDNGLLKVRA 60GHVEDDIEKFVVGVLTKNADTSDAELTLSVVVGDYVRVAPLWILSTDYDNYAIGYSCKDY 120KKSNQHRVNIWILSRTKTLNESSKSTVNKFLKEHSKEFDQSKFVETDFSEKACFFKKSHV 180YTVPFGA 187。
3.根據權利要求1的序列，其特徵在於它們包括寡核苷酸P1(7-29)，P2(67-86)，終止密碼子(562-564)和多腺苷酸化位點(630及其後)的序列。
4.根據權利要求2的序列，其特徵在於它們代表由化學測序得到的胺基酸序列。
5.根據權利要求2的序列，其特徵在於最開始的兩個胺基酸對應於限制性位點。
6.根據權利要求1-3的序列，其特徵在於其與lipocalin家族的幾種蛋白質具有約30％的同一性。
7.根據權利要求1-3的序列，其特徵在於就負責lipocalin蛋白質所特有的三級結構的區域而言其顯示很大的相似性。
8.單體形式的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)，其特徵在於顯示出lipocalin家族蛋白質所特有的三維結構。
9.根據權利要求8所述的蛋白酶，其特徵在於顯示出lipocalin家族所特有的圓二色性光譜。
10.根據權利要求8和9所述的蛋白酶，其特徵在於顯示出大約21kDa的分子量。
11.獲得單體形式的重組凝血酶激活蛋白酶(rLOPAP)的方法，其特徵在於具有以下步驟(a)獲得mRNA；(b)構建cDNA文庫；(c)將cDNA連接到接頭上；(d)將cDNA連接到克隆載體上，所述載體含有T7 RNA聚合酶轉錄起始位點和Lac Z操縱子起始序列；(e)在原核細胞中進行轉化；(f)擴增編碼凝血酶原激活劑蛋白質的cDNA；(g)將DNA連接到含有氨苄青黴素抗性基因序列的亞克隆載體上；(h)篩選重組質粒；(i)擴增cDNA；(j)用限制性內切酶消化質粒DNA；(l)DNA測序，和(m)重組蛋白質表達。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於mRNA的獲得按照下述方法進行(a)摘取L.obliqua的針突，將它們在極低溫度下冷凍；(b)用經處理除去了RNA酶的適當用具研磨針突，直到獲得細微粉末，向其中加入足量的苯酚和異硫氰酸胍溶液；(c)通過常規方法提取RNA。
13.根據權利要求12的方法，其特徵在於描繪總RNA的電泳圖譜。
14.根據權利要求12的方法，其特徵在於提取的RNA在低聚dT纖維素親和色譜柱上純化，該色譜柱用NaOH洗滌，在中性pH條件下用由Tris-HCl，EDTA，NaCl，SDS組成的連接緩衝液平衡，通過重力進行柱引流，再用連接緩衝液洗滌以除去任何非mRNA的RNA。
15.根據權利要求14的方法，其特徵在於在石英杯中於260和280nm處讀取光密度值從而對mRNA進行定量。
16.根據權利要求11的方法，其特徵在於進行下述步驟獲得cDNA文庫(a)用處理過的水稀釋mRNA以除去加有特定接頭的RNA酶，70℃加熱10分鐘，在冰浴中冷卻，然後快速離心；(b)獲得第一條cDNA鏈；(c)獲得第二條cDNA鏈。
17.根據權利要求16的方法，其特徵在於通過RT-PCR技術獲得cDNA。
18.根據權利要求16的方法，其特徵在於得到的cDNA具有低分子量的400-800pb的片段(BA)和高分子量的800pb以上的片段(BB)。
19.根據權利要求16的方法，其特徵在於第一次片段大小的篩選是在瓊脂糖凝膠中得到的。
20.根據權利要求16的方法，其特徵在於將高和低分子量的片段施加到瓊脂糖凝膠中，電泳後把條帶從凝膠中切下，並對高和低分子量的cDNA進行純化和洗脫。
21.根據權利要求20的方法，其特徵在於cDNA在60-70℃加熱，並在真空中濃縮。
22.根據權利要求11的方法，其特徵在於優選使用EcoR I接頭。
23.根據權利要求11的方法，其特徵在於cDNA與克隆載體的連接是單方向性的並且在16℃反應18小時。
24.根據權利要求23的方法，其特徵在於優選用EcoR I和NOT I酶消化克隆載體。
25.根據權利要求11的方法，其特徵在於使用的細胞優選為大腸桿菌的細胞。
26.根據權利要求11的方法，其特徵在於細菌是用Inoue方法轉化的。
27.根據權利要求26的方法，其特徵在於用抗生素篩選轉化的細菌。
28.根據權利要求27的方法，其特徵在於使用的抗生素是氨苄青黴素。
29.根據權利要求11的方法，其特徵在於克隆載體的酶切優選用EcoR I和Hind III進行以分析cDNA文庫，獲得的片段用溴化乙錠分析。
30.根據權利要求29的方法，其特徵在於對所有分析的質粒進行測序。
31.根據權利要求11的方法，其特徵在於採取下述步驟以擴增文庫(a)在冰中孵育DH5α感受態細菌以及與高和低分子量DNA連接的克隆載體的混合物25-35分鐘，於40℃，45℃孵育2-3分鐘，再在冰上孵育5分鐘；(b)加入含氨苄青黴素的2YT培養基，氨苄青黴素的濃度為10-200g/ml，並使溶液均質化；(c)將上述溶液等分到脫氣試管裡並於37℃孵育16-20小時；(d)提取質粒DNA。
32.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於應用PCR技術擴增編碼凝血酶原激活蛋白酶的cDNA。
33.根據權利要求32的方法，其特徵在於變性溫度為94℃；退火溫度為50℃；延伸溫度為72℃並且使用30個擴增循環。
34.根據權利要求11的方法，其特徵在於對所述的克隆載體進行酶切，將釋放出的DNA片段連接到亞克隆載體上，從而進行亞克隆。
35.根據權利要求11的方法，其特徵在於克隆載體和亞克隆載體能在市場上購得，並且表達載體顯示蛋白質純化的標記。
36.根據權利要求35的方法，其特徵在於克隆載體優選是pGEM11zf(+)。
37.根據權利要求35的方法，其特徵在於亞克隆載體優選是「easy」pGEM-T。
38.根據權利要求35的方法，其特徵在於優選用Hind III，BamH I和EcoR I消化克隆載體。
39.根據權利要求35的方法，其特徵在於提取和純化所述克隆載體釋放的DNA。
40.根據權利要求35的方法，其特徵在於編碼rLOPAP的DNA連接到亞克隆載體上的連接反應優選在大腸桿菌DH5α細菌中進行。
41.根據權利要求11的方法，其特徵在於表達載體優選是pAE。
42.根據權利要求30的方法，其特徵在於優選應用自動測序方法。
43.根據權利要求42的方法，其特徵在於應用獲自蛋白質N末端序列的起始寡核苷酸「有義」P1和P2。
44.根據權利要求42的方法，其特徵在於還使用寡核苷酸「有義」T7和「反義」SP6。
45.根據權利要求11的方法，其中蛋白質表達在原核細胞中進行。
46.根據權利要求45的方法，其特徵在於應用BL21(DE3)菌株來獲得高性能的重組蛋白和大量的可溶性重組蛋白。
47.根據權利要求46的方法，其特徵在於用來表達重組蛋白的菌株是溶源性的，沒有呈現翻譯後修飾系統，它生長得快並且易於培養和保持。
48.根據權利要求11的方法，其特徵在於通過利用色譜技術來純化重組蛋白。
49.根據權利要求48的方法，其特徵在於-色譜柱是鎳-瓊脂糖和/或苄脒-瓊脂糖的色譜柱；-鎳-瓊脂糖柱用NaH2PO450mM，NaCl 300mM，咪唑10mM平衡過，並在緩衝液Tris-HCl 50mM pH7.0-9.0，咪唑1mM，NaCl 100mM中洗脫。
50.根據權利要求48的方法，其特徵在於將苄脒-瓊脂糖柱在鹼性pH中平衡並在酸性pH中洗脫。
51.根據權利要求50的方法，其特徵在於鹼性pH為7.5-9.0，而酸性pH為2.0-4.0。
52.根據權利要求49的方法，其特徵在於洗脫緩衝液包含甘氨酸。
53.根據權利要求48的方法，其特徵在於可以獲得具有正確或變性結構的rLopap。
54.根據權利要求48的方法，其特徵在於通過Bradford方法計量純化的蛋白質並通過SDS-PAGE進行分析。
55.根據權利要求48-54的方法，其特徵在於優選利用S-2238顯色底物(Chromogenix)對獲得的重組蛋白測試其凝血酶原激活能力。
56.重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)，其特徵在於它是根據權利要求11-55所述的方法獲得的。
57.重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)，其特徵在於通過圓二色性光譜測定法來評估重組蛋白的二級結構。
58.根據權利要求57的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)，其特徵在於所述光譜(CD)是在分光偏振計中於25℃和在190-300nm的波長下測量的。
59.根據權利要求58的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)，其特徵在於CD光譜以200nm/分鐘的速度，1nm的解析度累積8次。
60.根據權利要求48-55的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)，其特徵在於將它稀釋在pH7.8-8.5的Tris-HCl緩衝液中並且數據基於蛋白質濃度以摩爾來表示。
61.根據權利要求11-55的方法獲得的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)的用途，其特徵在於它可以用於獲得凝血酶原診斷試劑盒以分析有出血性問題的患者的血漿。
62.根據權利要求11-55的方法獲得的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)作為血漿纖維蛋白原消耗或消除蛋白的用途。
63.根據權利要求11-55的方法獲得的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)作為凝血酶原激活物的用途。
64.根據權利要求11-55的方法獲得的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)在臨床藥理學測定中的用途。
65.根據權利要求11-55的方法獲得的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)作為長期持續的凝固時間(CT)延長劑的用途。
全文摘要
本發明涉及獲得單體形式的重組凝血酶原激活蛋白酶(rLopap)的方法；重組凝血酶原激活蛋白酶(rLOPAP)及其胺基酸序列。此外，本發明還涉及這種蛋白酶用於消除血液纖維蛋白原以及用作凝血酶原血異常診斷試劑盒的用途。本發明描述了21kDa的重組形式的凝血酶原激活蛋白酶的獲得和表徵，該蛋白酶被命名為rLopap(Lonomiaobliqua凝血酶原激活蛋白酶)，具有絲氨酸蛋白酶特徵，不過它顯示出如同lipocalin家族的保守胺基酸序列。該蛋白表現出促凝血活性，消除血液中的血纖維蛋白原並延長人血液/血漿的凝固時間。本發明介紹了重組形式的rLopap的獲得，該rLopap顯示出足夠的活性以便進行臨床藥理學測定。
文檔編號C07K14/435GK101068831SQ200580034449
公開日2007年11月7日 申請日期2005年8月24日 優先權日2004年8月24日
發明者阿尼婭·馬裡薩·丘迪辛斯基-塔瓦西, C·V·雷斯, P·L·霍, C·R·拉莫斯 申請人:生物實驗薩紐斯藥物有限公司, 聖保羅國情研究援助基金會, 阿尼婭·馬裡薩·丘迪辛斯基-塔瓦西