固定有抗原的免疫螢光載片的製備方法和由該方法製備的免疫螢光載片的製作方法

2023-09-20 14:53:05 1

專利名稱：固定有抗原的免疫螢光載片的製備方法和由該方法製備的免疫螢光載片的製作方法
技術領域：
本發明涉及製備抗原固定化免疫螢光載片的方法，所述方法包括將C反應蛋白固定在載片上製成蛋白晶片，將能夠特異結合靶蛋白的抗體與鏈黴親和素混合給抗體標記上螢光納米顆粒，通過競爭性混合使抗體進行免疫反應，用螢光照相機進行檢驗；並涉及用所述方法製備的免疫螢光載片。
背景技術：
生物晶片包括多種類型的固定在固體支持物單位表面上的探針，使用這類生物晶片時，僅需少量樣品，即可很方便地大規模進行疾病診斷、高通量篩選(HTS)和酶活測量。
多數將探針固定在載片上的方法包括將探針固定在用包被材料預先處理過的玻璃載片上。已有多種表面化學材料被提議用於這些方法，例如可以使用自組單層膜(韓國專利公開 2003-0038932)。這方面，作為提高被固定探針的量和維持探針活性的一個試驗，開發建立了三維(3D)固定方法(Gill and Ballesteros, Trends in Biotechnology 18:282，2000)。這類3D
固定方法的例子有使用Packard Bioscience的HydlOgel_'R包被載片的方法、使用Biocept
Company的基於聚乙二醇的水凝膠的方法和使用LG Chemical Co. , Ltd的solgel的方法
坐寸ο用於免疫傳感器的載片選自玻璃、矽、水凝膠、金屬、陶瓷和多孔膜。當前，根據抗原或抗體的特異反應性，通過將抗體或抗原固定在基片上製成的抗體或抗原探針板被廣泛用於檢測。這類應用中有代表性的試劑盒是快速檢驗試劑盒、常規檢驗試劑盒和生物晶片試劑盒。這些試劑盒被用於檢測固定化抗體探針或抗原探針所對應的靶抗原或靶抗體。某些情況中，多種反應基團被組裝到單個探針板上，這些反應基團中的每一個包括用於檢測抗原或抗體的測試條。同時，隨著Health Functional Food Act的生效，即使在韓國也有可能製造基於天然材料的食物物料和加工食品，並且獲得認可是健康功能性食品。然而，為了做到這一點，需要提供材料從技術上證明健康功能性食品的功能，例如預防心血管疾病、防衰老、預防癌症、預防肥胖、調節免疫功能或者預防胃腸道相關疾病。相應地，食品功能評估變得更重要，因此功能評估有更高的商業化價值。食品功能評估包括根據那六種功能類型進行的體外功能評估、用實驗動物(比如大鼠)進行的體內功能評估和臨床試驗。就食品工業來說，對開發體內功能檢測技術的需求增加，所述檢測技術可以利用實驗動物快速有效地對食物物料和功能性食品進行功能評估。要被認可為功能性食品，需要具有科學上證實的目標功能，比如心血管功能，食品功能評估的重要性如何強調都不為過(Kim et al. , Detecting C-reactive protein byusing direct binding quartz crystal microbalance immunosensor, Journal of TheKorean Society for Biotechnology and Bioengineering, Vol. 22，p. 443，2007)。傳統上，在臨床試驗前使用實驗動物進行的體內功能評估是為了評估身體因素，比如體重、血壓和器官狀況的變化。但是，這種方法產生的結果不一致，而且要求評估方案的變化性，技術高超的專業人員和高成本的檢測儀器。統一的體內食品功能評估方法是測量實驗動物(比如大鼠)中與特定疾病或代謝症狀相關的特定生物標記物的增加或減少。從這方面，含有希望被認可為功能性食品的食品被給予實驗動物。韓國專利10-921237公開的一種快速檢測食物物料和功能性食品的心血管功能方法是通過利用石英晶體微天平型免疫傳感器高靈敏度檢測C-反應蛋白的方法(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19, p. 1193, 2004;ClinicalChemistry，Vol. 47，p. 403，2001; New England Journal of Medicine，Vol. 340，p. 448，1999;Biochemical Journal, Vol. 327，p. 425，1997)，其中所述C-反應蛋白是一種已知是冠狀動 脈疾病、高血壓等的主要生物標記物的五聚體蛋白，其由白介素-6和白介素-I β誘導刺激 在哺乳動物肝臟內合成，具有大約118千道爾頓(kDa)的分子量。與檢測C反應蛋白的酶聯免疫分析法(ELISA) (American Journal of C ardiology, Vol. I, p. 155，2005; American Journal of Veterinary Research, Vol. 1，p. 62，2005;Journal of Clinical Laboratory Analysis，Vol. 18，p. 280，2004)相比，該方法易於使用，測量不需被著色物質幹擾，並且比其他典型傳感器測量方法有更好或等同的測量靈敏度(Biosensors and Bioelectronics,Vol. 22,p. 973, 2007;Biosensors and Bioelectronics，Vol. 21，p. 1987，2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21，p. 1631，2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1141, 2006;Analytical Biochemistry, Vol. 328, p.210，2004) o近年，使用生物傳感器的傳感器測量方法更常使用的是納米材料，比如金屬膠體、納米碳管、螢光二氧化矽納米顆粒或半導體量子點，這類納米材料的使用促使傳感器信號有更高的靈敏度、穩定性或選擇性(Analytical Chemistry, Vol. 79，p. 630-707，2007;Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21，p. 1900，2006; Langmuirj Vol. 22，p. 4357，2006; Nan
oLetters, Vol. 5, p. 113, 2005; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 20, p. 2454, 2005; Proceedings of the National Academy of Sciences,Vol. 100, p. 4984, 2003;Biochemicaland Biophysical Research Communications，Vol. 274，p.817，2000)。當使用生物傳感器通過測量實驗動物血液中存在的作為生物標記物的C反應蛋白來評估體內心血管功能時，傳感器靈敏度的提高仍是一個關鍵問題，人們不斷地追求便於操作的測量方法。發明詳述技術問題本發明提供了具有高傳感器靈敏度的一次性免疫傳感器載片，所述載片在沒有諸如生物晶片點樣儀或微陣列掃描儀的複雜儀器情況下，保證使用者能夠用微量移液槍將一定體積的抗原固定在載片上來製作或測量生物晶片從而在靶蛋白與抗體和螢光納米顆粒的結合體之間進行免疫反應，或者在免疫螢光載片的抗原包被位點處固定化抗原和包含螢光納米探針和特定靶分子的混合物之間進行免疫反應，然後利用螢光顯微鏡測量通過免疫反應特異結合在載片表面的納米探針的螢光強度或螢光顆粒數量，從而鑑定靶分子(比如身體指徵分子)的濃度。技術解決方案根據本發明，靶蛋白(抗原)被固定在載片上，與該抗原特異結合的抗體被標記了螢光物質，從標本中收集的靶蛋白與螢光標記抗體混合，混合物與載片上的固定化抗原位點反應，未反應的抗體和抗原用蒸餾水洗滌，載片被放置在培養箱中乾燥，利用螢光顯微鏡測量螢光顆粒的螢光強度或數量。根據本發明，為了對樣品進行檢測分析，使用了間接競爭分析形式。但是，本領域普通技術人員很容易知道本發明還可以利用直接競爭分析形式或三明治分析形式來體現。用於本發明實施方案的免疫傳感器可以選自玻璃、矽、水凝膠、金屬、陶瓷和多孔
膜，並且大小可以在20-40 X 70-80mm。雖然在本發明的實施方案中，C反應蛋白(下文以「CRP」指代)是作為靶樣品，對本領域技術人員顯而易見的本發明的方法也可以使用其他食品-功能生物標記物，包括心血管生物標記物，比如LDL、纖維蛋白原、血管緊張素II或心肌肌鈣蛋白；或者生物標記蛋白，其與抑制衰老、預防癌症、預防肥胖、免疫調節、預防胃腸道疾病有關。C反應蛋白抗體可以是通過利用C反應蛋白由哺乳動物，比如大鼠、小鼠、兔、猴或人誘導製備的任何一種抗體。由標本收集的樣品可以是任何一種參照溶液，其中C反應蛋白被溶解在反應緩衝液中，並可以是採自血液、血清、血漿、唾液、體液和肝臟的組織提取物。1-5%牛血清白蛋白(BSA)液、1_5%大鼠血清白蛋白(RSA)液、1_5%人血清白蛋白(HSA)液、1-5%小鼠血清白蛋白(MSA)液和1-5%山羊血清白蛋白(GSA)液中的任何一種都可以作為封閉載片表面不與抗原反應的部分的溶液。以下詳細描述了本發明方法的每個步驟。可以利用以下方法中的任一種將作為抗原的C反應蛋白固定在載片上。作為第一種固定方法，抗原的固定可以利用3-氨丙基三甲氧基矽烷(APTMS)進行。對於該方法，首先利用APTMS製備修飾的載片。為了進行修飾，將載片浸泡在食人魚(piranha)洗液(H2S04:H202=2:1_4:1)中至少5_15分鐘，然後用蒸餾水洗滌載片，在蒸餾水中超聲處理3-10分鐘，用溫度85-95°C的熱水水合洗滌30-90分鐘，然後在拭淨紙上室溫乾燥20-120分鐘。將表面洗滌過的載片放置在含有溶解在丙酮中的5-15%APTMS溶液的培養皿中，室溫下反應30-90分鐘。載片的前後面用丙酮、30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7.8)和蒸餾水順序洗滌三到四次，然後將載片在容有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。載片放在拭淨紙上室溫乾燥20-120分鐘，在對流式烤箱中以30-150°C的溫度加熱處理3_7小時，放置冷卻，然後以乾燥態保存在乾燥器中待用。將APTMS修飾過的載片浸泡在蒸餾水中10-20分鐘進行水合。浸泡過的載片放置在容有1-4%戊二醛溶液的培養皿中，反應30-90分鐘從而活化載片，使蛋白能夠結合到載片表面上。經過活化的載片前後表面用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)洗滌三到四次。然後將載片在裝有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。從燒杯中取出載片，放置在拭淨紙上，室溫乾燥20-120分鐘。以上使用的戊二醛是將l_4ml 30-70%戊二醛加入46-49ml蒸餾水中製備的，所制溶液使用了 30-70ml。為了固定靶蛋白，例如C反應蛋白，首先將O. 01-0. 5mg/ml C反應蛋白溶解在30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)中，製備用於固定的抗原溶液。裝有戊二醛活化載片的培養皿放在具有格子構型的點樣模板上，用1-100 μ I先前製備的抗原溶液在載片上對應點樣模板上樣點的部分進行點樣，然後給得到的結構蓋上蓋片，反應進行1-6小時來固定抗原。然後，載片的前後表面用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)洗滌三到四次，然後在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘。為了將戊二醛活化載片表面中要固定抗原的那部分(不與抗原在表面上反應的那部分)封閉，將載片放在小塑料培養皿中，所述培養皿含有溶於30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7. 8)的1_5%BSA溶液，然後，給得到的結構蓋上蓋片，反應進行1-5小時，待反應停止，用BSA封閉過的載片前後表面用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH
6.5-7. 8)洗滌三到四次，然後在裝有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。將載片放置在拭淨紙上，室溫乾燥20-120分鐘。作為第二種固定方法，抗原的固定化可以利用3-巰基丙基三甲氧基矽烷-N- Y -馬來醯亞胺基丁醯氧基琥珀醯胺酯(MPTMS-GMBS)進行。首先，為了清潔表面，將載片在含有濃鹽酸(18-36%)和甲醇(50-100%)的混合液(HCl :MtOH=l :1-1:2，體積比)中浸泡15-45分鐘，然後載片前後表面用蒸餾水洗滌三到四次。載片用85-95°C蒸餾水洗滌後，放置在拭淨紙上，室溫乾燥20-120分鐘。為了將這樣得到的載片矽烷化，製備50_500ml MPTMS溶液，其中在選自甲苯、二甲基甲醯胺和丙酮的有機溶劑液中溶解了 1-3%的MPTMS。將載片放在容有所述溶液的培養皿中，室溫反應1-3小時。載片前後表面用製備MPTMS溶液使用的相同有機溶劑洗滌三到四次，然後將載片放置在拭淨紙上，室溫乾燥20-120分鐘。為了活化載片表面，如下所述製備l_3mM GMBS溶液。將14_42mg GMBS樣品溶解在ΙΟΟμΙ N, N-二甲基甲醯胺(DMF; Sigma-Aldrich Company, USA)中，然後，向其中加入49. 9ml乙醇。經過矽烷化的載片被放在容有GMBS溶液的培養皿中，室溫下反應30-90分鐘。載片前後表面用蒸餾水和30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH6. 5-7.8)洗滌三到四次。然後將載片放置在拭淨紙上，室溫乾燥20-120分鐘。按照以下方式將CRP抗原固定。首先，將C反應蛋白以O. 01-0. 5mg/ml的濃度溶解在30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)中，製備用於固定化的抗原溶液。將容有GMBS活化載片的培養皿放在點樣模板上，然後用1-100 μ I先前製備的抗原溶液在載片上對應點樣模板上樣點的部分進行點樣，然後給得到的結構蓋上蓋片，反應進行1-6小時來固定抗原。然後，載片的前後表面用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)洗滌三到四次，載片在裝有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。為了提高分析的準確性，將載片放在容有1_5%BSA溶液的小塑料培養皿中，得到的結構蓋上蓋片，進行反應1-5小時。載片的前後表面用以上描述的磷酸鹽緩衝液洗滌三到四次。然後將載片在盛有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘，之後置於拭淨紙上，室溫乾燥20-120分鐘。圖I中示意了這兩種方法。為了用本發明免疫傳感器載片來分析具體蛋白質，對與載片上所固定的抗原特異結合的抗體進行標記。抗體的標記可以利用靈敏度和重複性高的螢光染色法進行，為此，根據本發明使用了螢光二氧化矽納米顆粒(下文以「FSNP」指代)。
以下簡要描述了製備FSNP的方法。用於對特異結合抗原的抗體進行標記的FSNP可以利用下述方法來製備，所述方法是染料捕獲法(其中在二氧化矽結構中包含有機螢光色素)、核殼法(其中活性有機螢光色素與氨基矽烷化合物共價結合，得到的結構包含在二氧化矽結構中)、或者反轉的核殼法(其中二氧化矽結構包含了有機螢光色素，形成的顆粒與有機矽烷化合物反應從而引入官能團獲得功能性)。這方面來說，這類有機螢光色素的例子是二氯三(1，10-鄰二氮雜菲)釕(II )水合物、螢光素、羅丹明B和5(6)-羧基四甲基羅丹明；活性有機螢光色素的例子是異硫氰酸螢光素、5 )-羧基四甲基羅丹明N-琥珀醯亞胺酯、四甲基羅丹明5-異硫氰酸酯、雙(2，2』 -聯吡啶)-4』 -甲基-4-羰基聯吡啶釕-N-琥珀醯亞胺酯雙(六氟磷酸酯)和雙(2，2』 -聯吡啶)-4，4』 - 二羧基聯吡啶釕雙(N-琥珀醯亞胺酯)雙(六氟磷酸酯)、氨基矽烷化合物的例子是(3-氨丙基)三乙氧基矽烷、有機矽烷化合物的例子是包含羧酸酯、胺基、胺基/膦酸酯、聚(乙二醇)和十八烷基、羧酸根/十八烷基諸官能團的化合物。以下描述了用FSNP標記抗體的方法。首先，需要用與生物素特異結合的鏈黴親和 素(SA)對FSNP進行修飾。進行該修飾使結合有SA的FSNP (下文另有描述)與生物素化的抗體結合。要用SA修飾FSNP，首先將FSNP與(3-巰基丙基)三甲氧基矽烷(MPTMS)反應，製備巰基修飾的FSNP。將l-5mg FSNP和5_15ml醇(比如乙醇、甲醇或丙醇)加入容量10-70ml的帶蓋試管中，充分搖勻混合液，然後超聲處理10-30分鐘使FSNP完全溶於醇。隨後，向該試管中加入30-70到200 μ I MPTMS,將所得混合液在室溫下以30_200rpm的低速攪拌，反應2-6小時。反應混合液在3-10°C的溫度下以7000-17000rpm的速度離心20-40分鐘，將得到的沉澱物用反應中使用的同樣的醇洗一到五次，每次洗滌後，按照以上描述的條件離心，獲得沉澱物。從試管上取下蓋子，用鋁箔輕輕覆蓋試管，室溫下乾燥。沉澱物溶於2-6ml 30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)中，製得巰基修飾的FSNP溶液。 向巰基修飾的FSNP中加入經馬來醯亞胺活化的SA來製備結合有SA的FSNP。具體來說，將O. 1-0. 5mg SA-馬來醯亞胺溶解在容量10-70ml的帶蓋試管中的3-7ml 30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7.8)中，製備SA-馬來醯亞胺溶液。然後，向其中加入O. 5-2. Oml巰基修飾的FSNP溶液，將混合液以30-200rpm的低速持續攪拌，室溫下反應1_3小時。反應產物在3-10°C的溫度下以7000-17000rpm的速度離心20-40分鐘，得到沉澱物。沉澱物用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7. 8)洗一到五次，每次洗滌後，按照以上描述的同樣的條件進行離心，獲得沉澱物。將沉澱物用l_5ml 30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH6. 5-7. 8)重懸。懸浮液加入帶蓋試管中，用鋁箔包裹冷藏，與下文描述的生物素化抗體反應。C反應蛋白抗體的生物素化可以利用下述方法之一進行。根據本發明實施方案的C反應蛋白抗體的生物素化方法包括給C反應蛋白抗體加入碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，得到含有C反應蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液；將生物素氨基己酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-LC-生物素)溶液與碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液反應，前一種溶液是溶解在有機溶劑二甲基甲醯胺中的生物素化試劑；並將獲得的溶液在氯化鈉溶液中透析以便除去未反應的生物素化試劑。具體來說，生物素化方法包括給C反應蛋白抗體添加碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，得到含有1.0-3. Omg/ml C反應蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，取30-100 μ INHS-LC-生物素溶液(溶解在二甲基甲醯胺中的l_5mg/ml NHS-LC-生物素)與25-75 μ I碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液在冰水中反應1-5小時，將75-175 μ I得到的溶液在O. 1-0. 3Μ氯化鈉溶液中透析過夜，除去未反應的生物素化試劑。根據本發明另一實施方案的C反應蛋白抗體生物素化方法包括給C反應蛋白抗體添加磷酸鹽緩衝液，製備含有C反應蛋白抗體的磷酸鹽緩衝液，將磺基琥珀醯亞氨基-6-(生物素 醯胺)己酸酯(磺基-NHS-LC-生物素)溶液(溶於重蒸水的水溶性生物素化試劑)與磷酸鹽緩衝液反應，將得到的溶液在磷酸鹽緩衝液中透析以除去未反應的生物素化試劑。具體來說，根據該實施方案的生物素化方法包括給C反應蛋白抗體加入磷酸鹽緩衝液，製備C反應蛋白抗體濃度在O. 5-3. Omg/ml範圍的磷酸鹽緩衝液，取5_20 μ I磺基-NHS-LC-生物素溶液(其中2-20mM磺基-NHS-LC-生物素溶於重蒸水)與30-800 μ I磷酸鹽緩衝液在冰水中反應1-5小時，將得到的溶液取55-820 μ I在O. 05-0. 25Μ磷酸鹽緩衝液中過夜透析，除去未反應的生物素化試劑。接下來，製備結合有納米材料的抗體。當SA修飾的FSNP與生物素化抗體被混合時，由於生物素和SA之間的特異結合，就製得標記了螢光材料的抗體。具體來說，將SA修飾的FSNP溶液超聲處理10_30分鐘，然後將200-600 μ I所得溶液加入l_3ml O. 05-0. 25mg/ml生物素化抗體溶液中。一方面混合液以30分鐘的間隔於30-200rpm的低速攪拌2_7分鐘，一方面使反應在室溫下進行1_3小時。反應產物在3_10°C的溫度以7000-17000rpm的速率離心20-40分鐘，棄去上清液，採用沉澱物。用30_70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)將沉澱物洗一到五次，每次洗滌後，在和以上描述的相同條件下離心，使用所得沉澱物。將沉澱物重懸於O. 4-1. 2ml 30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)中。圖2闡述了根據本發明，用螢光材料對特異結合CRP的抗體進行標記的示意性方法。利用本發明的免疫傳感器載片對具體蛋白進行檢測分析時，將由樣本獲得的靶蛋白與標記抗體混合。具體來說，用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7. 8)在Eppendorf管中製備不同濃度的C反應蛋白樣品液，並向各濃度的C反應蛋白樣品溶液中加入C反應蛋白抗體溶液，後者是通過生物素和SA之間的特異結合製備的並且結合有作為納米材料的FSNP，其中C反應蛋白抗體溶液和C反應蛋白樣品溶液的量是相同的，該混合液室溫下靜置5-300分鐘。然後，使混合液與固定在載片上的抗原進行反應。具體來說，將容有作為生物傳感器的載片的培養皿放在帶有格子結構的點樣模板上，其中所述載片上通過戊二醛方法或者MPTMS-GMBS方法固定了 C反應蛋白作為抗原並且通過胎牛血清白蛋白(BSA)封閉方法使非選擇性蛋白的吸附最小化；在固定有抗原的載片位置進行混合，然後取1-100 μ I混合液(在室溫下靜置了 5-300分鐘的包含由樣本獲得的靶蛋白和標記抗體)準確地點樣，給得到的結構蓋上蓋片，反應於室溫下進行O. 5-16小時，從而使固定在載片上的抗原和採集自樣本的抗FSNP標記抗體的靶蛋白之間發生間接競爭分析。終止反應後，通過用蒸餾水將載片前後面洗滌三到四次並將載片在含有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘來除去未反應的抗體和抗原。圖3描述的是解釋固定在載片上的抗原如何通過間接競爭分析結合螢光標記抗體的示意圖，圖4顯示了用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7. 8)代替採集自樣本的C反應蛋白與如上所述的標記抗體混合，然後將混合液點樣在固定在載片上的抗原上進行抗原-抗體反應時，結合在載片上的螢光顆粒數量隨時間的變化圖。載片在培養箱中乾燥20-120分鐘。利用螢光顯微鏡測量螢光強度和螢光顆粒的數量。當樣品中CRP的濃度高時，更多的CRP與螢光標記抗體反應。相應地，更少螢光標記抗體與載片上固定的抗原結合，因此螢光強度和螢光顆粒的數量下降。正如以上描述的，載片上固定的抗原和由樣本獲得的抗原競爭與螢光標記抗體相互作用，從而顯示出不同的螢光強度水平。因此，可以在相對短的時間內容易地測量CRP。有益的效果本發明提供了免疫傳感器載片，所述載片通過將C反應蛋白包被在載片上、並且使C反應蛋白與結合了螢光納米探針的抗體反應，在納摩爾水平上進行評估，以此來高度 靈敏地簡易測量作為體內食品功能指示物的生物標記物，其中所述C反應蛋白已知是冠狀動脈疾病、高血壓和炎症的主要生物標記物。本發明可以為將來超級靈敏地快速同時測量例如實驗動物血液中以較寬濃度範圍存在的生物標記物(除了 C反應蛋白以外，還比如低密度脂蛋白(LDL)、纖維蛋白原或者血管緊張素II)建立所需的與食品功能評估相關的基礎技術。附圖
描述圖I是解釋將C反應蛋白固定在載片的兩種方法的不意圖。圖2示意用螢光材料對特異結合CRP的抗體進行標記的方法。圖3是說明螢光標記的抗體通過間接競爭與固定在載片上的抗原結合的示意圖。圖4顯示了用30_70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6. 5-7. 8)代替採集自樣本的C反應蛋白與如上所述的標記抗體混合，然後將混合液點樣在載片上固定了抗原的地方進行抗原-抗體反應時，結合在載片上的螢光顆粒數量隨時間的變化圖。圖5A、5B和5C顯示的圖像表明在用食人魚洗液處理前載片表面存在的汙染物質(比如雜質)抑制點通過食人魚溶液處理被除去，即使在用APTMS矽烷化後，也觀察不到抑制點。圖顯示用2. 5%戊二醛溶液處理的基板圖像，其中沒有觀察到抑制點。圖5E顯示的圖像是抗原被固定後，載片表面用BSA封閉的部分沒有抑制點。圖5F顯示的圖像含有螢光二氧化矽納米顆粒標記的抗體的螢光點，所述結合在載片表面的抗體經過間接競爭反應。圖6展示了螢光檢測使用的儀器。圖7展不了固定有抗原的免疫突光載片和基於FSNP標記抗體的C反應蛋白的校準曲線圖。發明實施方式以下參照實施例對發明方法進行了詳細描述。但是，本發明的範圍不限於這些實施例。本試驗中使用的材料如下所述在小鼠骨髓瘤細胞系(NSO)中表達的帶有組氨酸標籤的重組CRP (純態)購自R&D Systems, Inc. (Miniapolice, MN, USA),貫穿在本試驗中使用。其同質五聚體結構由三個非共價亞基和兩個共價亞基構成。此外，由小鼠骨髓瘤和B細胞融合得到的雜交瘤所產生的單克隆抗大鼠CRP抗體(來自用純化NSO誘導的重組大鼠CRP免疫的小鼠)購自R&D Systems Inc。玻璃載片購自 Coring Inc. (Kennebunk, ME, USA) 水溶性生物素化試劑(磺基琥珀醯亞氨基-6-(生物素醯胺基)己酸酯磺基-NHS-LC-生物素)購自PierceBiotechnology, Inc. (Rockford, IL, USA)。3_ 氨丙基三甲氧基娃燒(APTMS),戍二醒和牛血清白蛋白(BSA)購自 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。以下試驗中使用的其他化合物由不同供應商提供，試驗過程使用雙蒸水。實施例I:抗原在用APTMS-GA處理過的載片上的固定如下將抗原固定在載片上。即為了清潔表面，將載片在食人魚洗液(H2SO4:H202=3:1，體積比)中浸泡10分鐘，用蒸餾水洗滌，在蒸餾水中超聲處理5分鐘，通過用溫度為90°C的熱水雜交來洗漆I小時,放置在拭淨紙(kimwipes)上,然後室溫乾燥30分鐘。為了進行矽烷化從而給載片表面引入固定抗原所需要的氨基基團(-NH2)，將表面 清潔過的載片置於含有APTMS溶液(溶於丙酮的10%APTMS)的培養皿中，室溫反應I小時。載片前後面用50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)和蒸餾水順序洗滌各三次，然後在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘。取出這樣生成的載片，然後在拭淨紙上室溫乾燥30分鐘，在對流型烤箱中於120°C熱處理5小時，靜置冷卻，獲取其螢光圖像(參見圖5A、5B和5C)。如圖5A、5B和5C所示，確認用食人魚洗液處理前載片表面上存在的汙染物質(比如雜質)抑制點通過食人魚溶液處理已被除去，即使在用APTMS矽烷化後，也未再觀察到抑制點螢光圖像。為了活化APTMS修飾過的載片，將載片在蒸餾水中浸泡15分鐘，取出置於含有戊二醛2. 5%溶液的培養皿中，反應進行I小時以便蛋白質結合到載片表面上。將活化後載片的前後表面用50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)洗滌三次，然後在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘。取出載片，放在拭淨紙上室溫乾燥30分鐘，其螢光圖像也顯示GA活化載片表面沒有抑制點(參見圖5D)。為了將抗原(CRP，C反應蛋白)固定在載片上，首先將C反應蛋白以0. lmg/ml的濃度溶解在50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中製備用於固定的抗原溶液。將含有戊二醛活化載片的培養皿放在具有格子結構的點樣模板上，用20μ I抗原溶液在載片上對應點樣模板上樣點的部分進行點樣，然後給培養皿蓋上蓋子，反應進行I小時來固定抗原。然後，載片的前後表面用50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4)洗滌三次，在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘。為了將戊二醛活化後要進行抗原固定的載片的表面上不與抗原反應的那部分封閉，將載片放在小塑料培養皿中，所述培養皿含有溶於50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)的1%牛血清白蛋白(BSA)溶液，然後，給培養皿蓋上蓋子，反應進行I小時。然後載片前後表面用50mM磷酸鹽緩衝液(PH 7. 4)洗滌三次，在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘，將載片放置在拭淨紙上，室溫乾燥30分鐘，其螢光圖像也顯示抗原固定後，在BSA封閉的載片表面沒有抑制點(參見圖5E)。實施例2:抗原在用MTS-GMBS處理過的載片上的固定通過以下過程將抗原固定在載片上。即為了清潔表面，將載片在含有體積比1:1的濃鹽酸(35%)和甲醇(70%)的混合液中浸泡30分鐘，然後載片用蒸餾水洗滌三次。在濃硫酸中浸泡30分鐘後，載片前後表面用蒸餾水洗滌三次，用沸騰的蒸餾水洗滌，放在拭淨紙上室溫乾燥30分鐘。為了進行矽烷化從而給載片表面引入固定抗原所需要的反應基團巰基(-SH)，將2ml(3-巰基丙基)三甲氧基矽烷(MPTMS)加入98ml甲苯，製備2%MPTMS溶液。將載片放在含有所述溶液的培養皿中，室溫反應2小時。之後載片用甲苯洗滌三次，然後放在拭淨紙上，室溫乾燥30分鐘。為了活化經MPTMS修飾的載片，將28mg GMBS溶於100 μ I N, N- 二甲基甲醯胺(DMF, chromoslIvrii Plus, St. Louis MO, USA, HPLC 彡 99. 9%)中，並向其中加入 49. 9ml 乙醇來製備2mM GMBS溶液。經過矽烷化的載片被置於含有2mM GMBS溶液的培養皿中，室溫反應I小時。載片的前後表面用蒸餾水和50mM磷酸鹽緩衝液(pH7. 4)洗滌三次，放在拭淨紙上室溫乾燥30分鐘。為了將抗原(CRP，C反應蛋白)固定在載片上，首先，將O. lmg/ml C反應蛋白溶 解在50mM磷酸鹽緩衝液(pH7. 4)中，製備用於固定化的抗原溶液。將含有GMBS活化載片的培養皿放在點樣模板上，用20 μ I抗原溶液在載片上對應點樣模板上樣點的部分進行點樣，然後給培養皿蓋上蓋子，反應進行I小時來固定抗原。然後，載片的前後表面用50mM磷酸鹽緩衝液(PH7.4)洗滌三次，在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘。為了將GMBS活化後要進行抗原固定的載片的表面上不與抗原反應的那部分封閉，將載片放在小塑料培養皿中，所述培養皿含有溶於50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)的1%牛血清白蛋白(BSA)溶液，給培養皿蓋上蓋子，反應進行I小時。然後載片前後表面用50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)洗滌三次，載片在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘，放在拭淨紙上，室溫乾燥30分鐘。在將抗原固定到MTS-GMBS處理過的載片的過程中的各個相應步驟(即表面清潔、矽烷化、活化、抗原固定和BSA封閉)獲取載片的螢光圖像。結果證實所有螢光圖像中都沒有顯示會抑制傳感器在載片表面進行的測量的抑制點，除了用含有濃鹽酸和甲醇(1:1，體積比)的混合液處理前的載片之外。實施例3: SA修飾的FSNP的製備將2mg FSNP和IOml乙醇加入容量為25ml的帶蓋試管中，混合液充分搖勻，然後超聲處理15分鐘使FSNP完全溶於乙醇。隨後，向該試管中加入100μ I MPTMS，室溫下以IOOrpm的低速攪拌，反應4小時。反應混合液在4°C的溫度下以13000rpm的速度離心30分鐘，將得到的沉澱物用乙醇洗三次，每次洗滌後，按照以上描述的同樣條件離心獲得沉澱物。從試管上取下蓋子，用鋁箔輕輕覆蓋試管，室溫下乾燥。每份沉澱物溶解在4ml 50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中，製備巰基修飾的FSNP溶液。將0. 25mg SA-馬來醯亞胺和5ml 50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4)加入容量25ml的帶蓋試管中，使SA-馬來醯亞胺溶解，製備SA-馬來醯亞胺溶液。然後，向其中加入Iml巰基修飾的FSNP溶液，將混合液以IOOrpm的低速持續攪拌，室溫下反應2小時。反應產物在40C的溫度下以IOOOOrpm的速度離心20分鐘得到沉澱物。沉澱物用50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)洗三次，每次洗滌後，按照以上描述的同樣條件進行離心。將沉澱物重懸在2ml 50mM磷酸鹽緩衝液(PH 7.4)中。得到的產物加入帶蓋試管中，用鋁箔包裹冷藏，與下文描述的生物素化抗體反應。實施例4:抗體的牛物素化將冷藏的Img管的水溶性生物素化試劑磺基琥珀醯亞氨基-6-(生物素醯胺基)己酸酯(磺基-NHS-LC-生物素)轉移到室溫條件，取30-700 μ I O. IM磷酸鹽緩衝液(pH
7.2)溶於30-700 μ g管單克隆抗大鼠CRP抗體。給Img管磺基-NHS-LC-生物素加入180 μ I蒸餾水，製備IOmM磺基-NHS-LC-生物素溶液，然後取6. 67 μ I混合液加入抗體溶液，將生物素對抗體的分子比率控制在20: I。將含有反應液的小管輕柔震蕩，然後放在Eppendorf管架上，置於冰水中反應2小時。然後將反應混合液加樣到slide-A-lyzer試劑盒(PierceBiotechnology, Inc)中，對O. IM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 2)透析過夜,除去未反應的試劑並回收透析膜內存留的透析液，然後利用和製備生物素化抗體使用的相同磷酸鹽緩衝液將透析液總體積控制在1ml。實施例5:結合納米材料的抗體的制 備將SA修飾的FSNP溶液超聲處理15分鐘，然後取400 μ I得到的溶液加入2ml
O.lmg/ml生物素化抗體溶液中，一方面以30分鐘的間隔於IOOrpm的低速進行攪拌，每次攪拌5分鐘，一方面使反應在室溫下進行2小時。將反應產物在4°C的溫度以IOOOOrpm的速率離心20分鐘，棄去上清液，收集沉澱物。用50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4)將沉澱物洗三次，每次洗滌後，在和以上描述的相同條件下離心獲得沉澱物。將沉澱物重懸於O. 8ml 50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4)中。實施例6:樣本溶液和標記抗體的混合向不同濃度的C反應蛋白樣品溶液中加入C反應蛋白抗體溶液，其中所述C反應蛋白抗體溶液是基於生物素和SA之間的特異結合製備的並且結合有作為納米材料的FSNP，所述C反應蛋白樣品溶液是用Eppendorf管中的50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 4)稀釋而製備的，其中C反應蛋白抗體溶液和C反應蛋白樣品溶液的量是相同的，將這些溶液混合，室溫下反應I小時。實施例7:間接竟爭反應將含有作為生物傳感器的載片的培養皿放在帶有格子結構的點樣模板上，其中根據實施例I和2所述載片上固定了作為抗原的C反應蛋白並且通過BSA封閉過程使非選擇性蛋白的吸附最小化；在固定有抗原的載片位置進行混合，然後取20μ I包含從標本採集的靶蛋白並且在室溫靜置了 I小時的混合液準確地點樣，將得到的結構蓋上，反應於室溫下進行2小時，從而使固定在載片上的抗原和採集自標本的抗FSNP標記抗體的靶蛋白之間發生間接競爭反應。反應終止後，通過用蒸餾水將載片前後面洗滌三次並將載片在含有蒸餾水的燒杯中浸泡I分鐘來除去未反應的抗體和抗原。實施例8:螢光圖像分析將按照實施例7進行了間接競爭反應的載片放在培養箱中乾燥。利用螢光顯微鏡對乾燥好的載片進行螢光圖像分析，並測量螢光強度和螢光顆粒的數量。圖6展示了螢光分析使用的儀器，獲取的螢光圖像顯示出結合在載片表面的經過間接競爭反應的FSNP標記抗體的螢光點(參見圖5F)。圖7顯示了利用FSNP標記抗體，通過測量由C反應蛋白的濃度依賴性螢光圖像獲得的相對螢光水平而得出的校準曲線圖。當樣本中CRP濃度提高時，更多CRP與標記抗體反應，因此固定在載片上的抗原和標記抗體之間的結合下降。此外，圖形在非常低的C反應蛋白濃度範圍內呈現線性。這表明，利用這種免疫螢光載片測量CRP時的檢測極限非常高，是O. l-1.0ng/ml。實施例9:免疫螢光載片的製備
根據實施例1-8，通過對30X70mm大小的顯微鏡用透明載片用3_氨丙基三甲氧基矽烷或3-巰基丙基三甲氧基矽烷-N- Y馬來醯亞胺基丁醯氧基琥珀醯亞胺酯進行表面修 飾、並在上面固定1-100 μ I O. 01-0. 5mg/ml C反應蛋白，來製備一次性免疫螢光載片。
權利要求
1.製備固定有抗原的免疫螢光載片的方法，所述方法包括將C反應蛋白固定在載片上製備蛋白晶片；用螢光納米顆粒標記能夠特異結合C反應蛋白的抗體；將由標本獲得的靶蛋白與螢光標記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應；以及通過利用螢光顯微鏡測量螢光強度或螢光顆粒的數量進行分析， 其中C反應蛋白在載片上的固定包括 用3-氨丙基三甲氧基矽烷修飾載片來製備經過修飾的載片； 將3-氨丙基三甲氧基矽烷修飾的載片水合； 利用戊二醛溶液活化修飾過的載片； 將靶蛋白以O. 01-0. 5mg/ml的濃度溶解在30_70mM磷酸鹽緩衝液(pH6. 5-7. 8)中從而製備用於固定的抗原溶液； 將包含載片的培養皿放在點樣模板上，在各個點樣點上加1-100μ I抗原溶液；和 在如上製備的載片上反應1-6小時以便固定抗原。
2.製備固定有抗原的免疫螢光載片的方法，所述方法包括將C反應蛋白固定在載片上製備蛋白晶片；用螢光納米顆粒標記能夠特異結合C反應蛋白的抗體；將由標本獲得的靶蛋白與螢光標記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應；以及通過利用螢光顯微鏡測量螢光強度或螢光顆粒的數量進行分析， 其中C反應蛋白在載片上的固定包括 通過將載片在包含濃鹽酸和甲醇的混合液(HCl=MtOH=I 1-1:2，體積比)中浸泡15-45分鐘來洗滌載片； 對載片進行娃燒化，方法是，製備3-疏基丙基二甲氧基娃燒溶液,其中將1_3%的3-疏基丙基三甲氧基矽烷溶液溶於選自甲苯和二甲基甲醯胺的有機溶劑中，用與製備3-巰基丙基三甲氧基矽烷溶液所用的相同的有機溶劑將載片的前表面和後表面洗三到四次； 用l-3mM N-y馬來醯亞胺基丁醯氧基琥珀醯亞胺酯溶液活化載片表面； 將O. 01-0. 5mg/ml的C反應蛋白溶解在30_70mM磷酸鹽緩衝液(pH6. 5-7. 8)中從而製備用於固定的抗原溶液； 將含有載片的培養皿放在點樣模板上，在各個點樣點上加1-100 μ I抗原溶液；和 在如上製備的載片上反應1-6小時以便固定抗原。
3.製備固定有抗原的免疫螢光載片的方法，所述方法包括將C反應蛋白固定在載片上製備蛋白晶片；用螢光納米顆粒標記能夠特異結合C反應蛋白的抗體；將由標本獲得的靶蛋白與螢光標記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應，以及通過利用螢光顯微鏡測量螢光強度或螢光顆粒的數量進行分析， 其中用螢光納米顆粒對抗體進行的標記包括 將3_疏基丙基二甲氧基娃燒與突光_■氧化娃納米顆粒反應從而製備疏基修飾的突光二氧化矽納米顆粒； 向巰基修飾的螢光二氧化矽納米顆粒加入經馬來醯亞胺活化的鏈黴親和素來製備結合有鏈黴親和素的螢光二氧化矽納米顆粒； 將C反應蛋白抗體生物素化；和 將鏈黴親和素修飾的螢光二氧化矽納米顆粒與生物素化抗體混合，製備標記有螢光材料的抗體。
4.權利要求3所述的方法，其中C反應蛋白抗體的生物素化包括 給C反應蛋白抗體加入碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，得到包含C反應蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液； 將溶於二甲基甲醯胺中作為生物素化試劑的生物素氨基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-LC-生物素)溶液與包含C反應蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液反應；和將反應溶液在氯化鈉溶液中透析以便除去未反應的生物素化試劑。
5.權利要求3所述的方法，其中C反應蛋白抗體的生物素化包括 給C反應蛋白抗體添加磷酸鹽緩衝液以獲得包含C反應蛋白抗體的磷酸鹽緩衝液；將溶於重蒸水中作為水溶性生物素化試劑的磺基琥珀醯亞氨基-6-(生物素醯胺基)己酸酯(磺基-NHS-LC-生物素)溶液與包含C反應蛋白抗體的磷酸鹽緩衝液反應；和將反應溶液在磷酸鹽緩衝液中透析以除去未反應的生物素化試劑。
6.製備固定有抗原的免疫螢光載片的方法，所述方法包括將C反應蛋白固定在載片上製備蛋白晶片；用螢光納米顆粒標記能夠特異結合C反應蛋白的抗體；將由標本獲得的靶蛋白與螢光標記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應，以及通過利用螢光顯微鏡測量螢光強度或螢光顆粒的數量進行分析， 其中用螢光納米顆粒對抗體進行的標記包括 將鏈黴親和素修飾的螢光二氧化矽納米顆粒溶液超聲處理10-30分鐘； 取所得溶液200-600 μ I加入l-3ml O. 05-0. 25mg/ml生物素化抗體溶液中，室溫反應1-3小時，期間以30分鐘的間隔於30-200rpm的低速進行攪拌，每次攪拌2_7分鐘； 反應溶液在3-10°C的溫度下以7000-17000rpm的速率離心20-40分鐘，棄去上清液，收集沉澱； 用30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)將沉澱物洗一到五次，每次洗滌後，在和以上描述的相同的條件下離心，獲取沉澱物；和 將沉澱物重懸於O. 4-1. 2ml 30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)中。
7.利用權利要求I所述方法製備的免疫螢光載片，其中所述免疫螢光載片是用3-氨丙基三甲氧基矽烷或3-巰基丙基三甲氧基矽烷-N- Y馬來醯亞胺基丁醯氧基琥珀醯亞胺酯進行表面修飾過的，並且包含1-100 μ I O. 01-0. 5mg/ml C反應蛋白。
8.利用權利要求7所述的免疫螢光載片測量標本中C反應蛋白的方法。
全文摘要
製備固定有抗原的免疫螢光載片的方法，所述方法包括:將C反應蛋白固定在載片上製備蛋白晶片；將能夠特異結合靶蛋白的抗體與鏈黴親和素混合從而給抗體標記上螢光納米顆粒；通過競爭混合與抗體免疫反應，利用螢光照相機分析，其中C反應蛋白在載片上的固定包括:用3-氨丙基三甲氧基矽烷修飾載片來製備經過修飾的載片；將3-氨丙基三甲氧基矽烷修飾的載片水合；利用戊二醛溶液活化修飾過的載片；將C反應蛋白以0.01-0.5mg/ml的濃度溶解在30-70mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5-7.8)中從而製備用於固定的抗原溶液；將容納載片的培養皿放在點樣模板上，在點樣點上加1-100μl抗原溶液；和在如上製備的載片上反應1-6小時以便固定抗原。利用所述方法製備的免疫螢光載片。
文檔編號G01N33/533GK102859359SQ201180019524
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月21日 優先權日2010年2月23日
發明者金南洙, 趙鏞珍, 金鐘泰 申請人:韓國食品研究院