一種抗體親和純化的洗脫新方法及其應用的製作方法

2023-09-13 11:37:55

一種抗體親和純化的洗脫新方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗體親和純化的洗脫新方法，在抗體親和純化洗脫的過程中，平衡層析柱採用12mM?PBS，pH7.4的平衡緩衝液，使用10～30mM?PBS，pH3.0作為洗脫緩衝液，並用200mM～500mM?PBS，pH11.0作為中和緩衝液中和洗脫樣本中的抗體。本發明的有益效果是，可以在抗體親和製備過程中減少一步操作，即緩衝液置換過程，縮短操作時間，節約材料、儀器及耗材等成本，並可降低由於增加純化步驟帶來的抗體活性損失的風險。本發明的抗體親和純化洗脫體系可在實驗室製備及工業生產中為操作者提供可操作性強的實驗方法，為抗體製備工藝改進提供幫助。
【專利說明】一種抗體親和純化的洗脫新方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗體親和純化的洗脫方法，尤其是在抗體的實驗室製備和工業生產中可操作的抗體親和純化洗脫方法。
【背景技術】
[0002]目前，抗體的親和純化多採用A型金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SPA)分離所得的一種細胞壁蛋白及G型鏈球菌分離而得的細胞壁蛋白作為偶聯配基，也有將抗原偶聯至活化的基質上進行抗體親和純化的，但在採用低PH值緩衝液對結合抗體進行洗脫時，多採用0.1M Gly-HCl, pH3.0左右的緩衝液進行洗脫，並用IM Tris-HCl, pH9.0中和洗脫抗體，但此洗脫方法在抗體進行後續使用前要進行緩衝液置換，即脫鹽至PBS等中性鹽緩衝液中，以排除Gly等對後續實驗的幹擾，保證抗體活性的穩定。

【發明內容】

[0003]為了克服現有方法在抗體親和純化後，要進行緩衝液置換的不足，本發明提供一種抗體親和純化的洗脫方法，該方法不僅可以達到與甘氨酸緩衝液相同的抗體收率，而且可以保持抗體活性不受影響。
[0004]本發明解決其技術問題採用的技術方案是:
[0005]在抗體親和純化洗脫的過程中，平衡層析柱採用12mM PBS, pH7.4的平衡緩衝液，使用10~30mM PBS，pH3.0作為洗脫緩衝液，並用200mM~500mM PBS，pHll.0作為中和緩衝液洗脫樣本中的抗體。
[0006]所述的平衡緩衝 液中包括150mM NaCl，IOmM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4,調 ρΗ7.4 ；
[0007]所述的洗脫緩衝液中包括150 ~200mM NaCl，5 ~20mM H3PO4, 2 ~IOmM NaH2PO4,濃 HCl 調 ρΗ3.0 ；
[0008]所述的中和緩衝液中包括150~200mM NaCl, 200~500mM Na2HPO4, IM NaOH調pHll.0。
[0009]該方法適用於IgG的親和純化。
[0010]所述新方法的實驗步驟如下:
[0011]I)樣本處理:
[0012]將樣本用平衡緩衝液將樣本體積稀釋一倍，經離心過濾後，平均分成兩份準備上柱；
[0013]2)抗體純化:
[0014]預裝柱:使用平衡緩衝液平衡GE MabSelect Sure5mL層析柱,流速2mL/min ；
[0015]上樣:當層析柱充分平衡、280nm吸光值曲線平穩且回歸基線後，上樣，上樣流速2mL/min,上樣量 20mL ；
[0016]平衡:使用平衡緩衝液平衡層析柱，至曲線回歸基線；
[0017]洗脫:使用洗脫緩衝液洗脫樣本中的抗體，流速lmL/min，收集洗脫峰，並用中和緩衝液中和洗脫峰至中性，中和緩衝液添加體積約為洗脫峰體積的10%。
[0018]本發明採用的樣本為人血漿和兔血清，將等量的人血漿(兔血清)分別使用兩種不同的洗脫方法進行分離純化，測定兩種洗脫方法所得抗體的量，並在相同條件下測定抗體的純度、活性等指標，並比較兩種洗脫方法的差異，確定本發明方法的可行性，以達到減少抗體親和純化步驟，提高效率的目的。
[0019]本發明的有益效果是，可以在抗體親和純化過程中減少一步操作，即緩衝液置換過程，縮短操作時間，節約材料、儀器及耗材等成本，並可降低由於增加純化步驟帶來的抗體活性損失的風險。本發明的抗體親和純化洗脫體系可在實驗室製備及工業生產中為操作者提供可操作性強的實驗方法，為抗體製備工藝改進提供幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為人IgG甘氨酸緩衝液洗脫層析圖；
[0021]圖2為人IgG磷酸鹽緩衝液洗脫層析圖；
[0022]圖3為兔IgG甘氨酸緩衝液洗脫層析圖；
[0023]圖4為兔IgG磷酸鹽緩衝液洗脫層析圖；
[0024]圖5 (a)為純化人IgG的SDS-PAGE電泳圖；
[0025]圖5 (b)為純化兔IgG的SDS-PAGE電泳圖；
[0026]圖5 (C)為純化人IgG/兔IgG分子量分析SDS-PAGE電泳圖；
[0027]其中，1為 al ;2 為 bl ;3 為 marker ；C 為 marker ；D 為 A2, E 為 B2。
[0028]圖6為人IgG洗脫峰膠體金法活性測定結果；
[0029]圖7為兔IgG洗脫峰膠體金法活性測定結果；
[0030]圖8為人IgG (兔IgG)洗脫峰ELISA法活性測定結果。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]本實施例目的在於比較兩種抗體洗脫體系在人IgG純化過程中對抗體收率及活性的影響，其中A洗脫體系為本發明提出的磷酸鹽緩衝液體系，B組洗脫體系為對照的甘氨酸緩衝液體系。驗證磷酸鹽洗脫體系在工藝過程中的優勢。
[0033]1 材料
[0034]1.1供試樣本:混合人血漿,20mL。
[0035]1.2主要實驗設備及耗材
[0036]1) GE AKTA purifier
[0037]2) QIAGEN ESEQuant development Kit (gold)
[0038]3)北京六一 DYY-6C型電泳儀電源
[0039]4) BECKMAN COULTER Avanti J-E 高效離心機
[0040]5) GE Sephadex G_25Fine 介質
[0041]6) GE MabSelect Sure 介質
[0042]7) Pierce BCA Protein Assay Kit
[0043]2 方法[0044]2.1溶液配製
[0045]平衡緩衝液(12mMPBS, ρΗ7.4):
[0046]NaCl:150mM
[0047]Na2HPO4: IOmM
[0048]NaH2PO4:2mM
[0049]調ρΗ7.4
[0050]A 組:
[0051]A-1 洗脫緩衝液(10-30mM PBS, ρΗ3.0)
[0052]NaCl:150 ~200mM
[0053]H3PO4:5 ~20mM
[0054]NaH2PO4:2 ~IOmM
[0055]濃HC1/1M NaOH 調 ρΗ3.0
[0056]Α-2 中和緩衝液(200mM PBS, pHll.0)
[0057]NaCl:150 ~200mM
[0058]Na2HPO4:200 ~500mM
[0059]IM NaOH 調 pHll.0
[0060]B 組:
[0061]B-1洗脫緩衝液(IOOmM甘氨酸，pH3.0)
[0062]Gly: IOOmM
[0063]濃HCl 調 ρΗ3.0
[0064]Β-2 中和緩衝液(IM Tris-HCl, ρΗ9.0)
[0065]Tris:1M
[0066]濃HCl 調 ρΗ9.0
[0067]2.2.2實驗方法
[0068]2.2.2.1樣本處理:人血漿樣本用平衡緩衝液將樣本體積稀釋一倍,經4000rpm，4°C,離心15min,0.45 μ m濾膜過濾後,平均分成兩份準備上柱。
[0069]2.2.2.2 抗體純化:
[0070]層析柱:GEMabSelect SureSmT,預裝柱
[0071]第一組:
[0072]平衡緩衝液平衡層析柱，流速2mL/min ；
[0073]上樣:充分平衡，280nm吸光值曲線平穩，且回歸基線後，上樣，上樣流速2mL/min，上樣量20mL ；
[0074]平衡:平衡緩衝液平衡層析柱，至曲線回歸基線；
[0075]洗脫:使用B-1洗脫抗體，流速lmL/min，收集洗脫峰，並用B_2中和洗脫峰至中性，體積約為洗脫峰體積的10% ；
[0076]第二組:
[0077]平衡緩衝液平衡層析柱，流速2mL/min ；
[0078]上樣:充分平衡，280nm吸光值曲線平穩，且回歸基線後，上樣，上樣流速2mL/min，上樣量20mL ；[0079]平衡:平衡緩衝液平衡層析柱，至曲線回歸基線；
[0080]洗脫:使用A-1洗脫抗體，流速lmL/min，收集洗脫峰，並用A_2中和洗脫峰至中性，體積約為洗脫峰體積的10% ；
[0081]脫鹽:將第一組洗脫的抗體用GE Sephadex G_25Fine介質置換至平衡緩衝液中。
[0082]上述兩組抗體樣本分別編號如下:
[0083]
【權利要求】
1.一種抗體親和純化的洗脫新方法，其特徵在於: 在抗體親和純化洗脫的過程中，平衡層析柱採用12mM PBS, pH7.4的平衡緩衝液，使用10~30mM PBS，pH3.0作為洗脫緩衝液，並用200mM~500mM PBS，pHll.0作為中和緩衝液洗脫樣本中的抗體。
2.根據權利要求1中所述的抗體親和純化的洗脫新方法，其特徵在於: 所述的平衡緩衝液中包括 150mM NaCl, IOmM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4，調 pH7.4 ； 所述的洗脫緩衝液中包括150~200mM NaCl，5~20mM H3PO4, 2~IOmM NaH2PO4,濃HCl調 ρΗ3.0 ； 所述的中和緩衝液中包括150~200mM NaCl，200~500mM Na2HPO4, IM NaOH調pHll.0。
3.根據權利要求1中所述的抗體親和純化的洗脫新方法，其特徵在於:該方法適用於IgG的親和純化。
4.根據權利要求1中所述的抗體親和純化的洗脫新方法，其特徵在於:所述新方法的實驗步驟如下: 1)樣本處理: 將樣本用平衡緩衝液將樣本體積稀釋一倍，經離心過濾後，平均分成兩份準備上柱； 2)抗體純化: 預裝柱:使用平衡緩衝液平衡GE MabSelect Sure5mL層析柱,流速2mL/min ；` 上樣:當層析柱充分平衡、280nm吸`光值曲線平穩且回歸基線後，上樣，上樣流速2mL/min,上樣量20mL ； 平衡:使用平衡緩衝液平衡層析柱，至曲線回歸基線； 洗脫:使用洗脫緩衝液洗脫樣本中的抗體，流速lmL/min，收集洗脫峰，並用中和緩衝液中和洗脫峰至中性，中和緩衝液添加體積約為洗脫峰體積的10%。
【文檔編號】C07K16/00GK103739705SQ201410001708
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】李文欣, 朱琳 申請人:遼寧邁迪生物科技有限公司