異黃酮類化合物的流動注射化學發光分析法的製作方法

2023-09-13 22:12:35

專利名稱：異黃酮類化合物的流動注射化學發光分析法的製作方法
技術領域：
本發明涉及化學分析技術，具體的，本發明涉及應用化學發光技術對異黃酮類化合物進行分析的方法，該方法包括將異黃酮類化合物用K3Fe(CN)6選擇性氧化，應用所得產物的化學發光特性及流動注射技術進行異黃酮類化合物的定性和/或定量分析。
該方法可用於異黃酮類化合物定量測定。因此，可用於食品或藥品中異黃酮類化合物含量的測定；用於含有異黃酮類的相關產品生產過程以及產品在流通過程中的質量控制分析；用於對生物體內異黃酮水平進行檢測，起到監控代謝的作用；也可以用於測定異黃酮類化合物的生物活性。
背景技術：
異黃酮是一種植物雌激素，可促進激素和生長因子的分泌，具有改善婦女絕經期綜合症、預防骨質疏鬆的活性。異黃酮的糖苷也具有醫用價值，但最具醫用價值的是沒有與糖結合的苷元。異黃酮類化合物存在於各種豆科植物，特別是在大豆當中。大豆中的異黃酮分為游離型的甙元(Aglycon)和結合型的糖苷(Glycosides)兩類，苷元佔總量的2％-3％，包括大豆苷元(Daidzein)、染料木素(Genistein)、黃豆黃素(Glycitein)。糖苷佔總量的97％-98％，主要含有大豆苷(Daidzin)、染料木苷(Genistin)、和黃豆黃苷(Glycitin)(參見家森幸男等，大豆ィソフラボン[M]，幸書房等)。
在生物體中異黃酮的代謝與激素相關聯，所以根據異黃酮含量變化可以對人、動物和微生物以及植物等生物體的代謝起到監控作用。以應用於人體健康為例，由於已知人體中異黃酮含量水平與癌症、抗氧化性以及婦女更年期綜合症相關，因此測定異黃酮含量可以了解與人體相關聯的健康程度。
因為上述原因，異黃酮類化合物在許多方面得到了廣泛的應用，例如在食品或藥品業的生產和應用，以及因此而出現的以異黃酮為目標的高和低含量植物栽培與育種等。
隨著大豆異黃酮在食品、藥品和畜牧業等領域中的廣泛應用，在生產和使用中，必須採用科學有效的快速檢測異黃酮類化合物的方法包括抗氧化活性的快速檢測。
目前，測定異黃酮的方法通常是利用異黃酮分子的環狀結構具有紫外吸收的特性，在下述三種波長下進行定性和定量分析在260nm下的紫外分光光度法和254nm紫外檢測器下的高效液相色譜法(參見吳道銀和羅紅林，「談大豆異黃酮的提取和分離」，糧食加工，2004，245-46)；在360nm下的分光光度法總黃酮測定(參見趙曉峰和吳榮書，「大豆異黃酮的保健功能及開發前景」，油脂工程，2004，839-41)。這些現有的分析方法存在著缺陷。因為不是測定羥基，所以不能準確地了解到羥基是否已經被氧化，因此難以掌握其生物活性的變化。
為了克服現有技術存在的缺陷，本發明人經過反覆實驗，發現應用本發明的流動注射化學發光分析技術可以快速而準確的定量測定異黃酮類化合物生物活性的含量。
流動注射化學發光分析法由於其靈敏度高，線性範圍寬，儀器設備簡單，越來越受人們青睞。到目前為止尚未見到化學發光測定異黃酮的報導。本發明人發現，在鹼性介質中，K3Fe(CN)6可以直接氧化異黃酮，將異黃酮的酚活性羥基(4′-OH)氧化成醌式結構，該氧化產物可吸收該反應所放出的化學能而被激發，產生化學發光，對其化學發光值進行測定可對所述化合物進行(生物活性)定量分析。該方法不僅有足夠的靈敏度，而且有很好的選擇性。

發明內容
本發明提供了一種分析異黃酮類化合物的新方法，具體的，本發明提供了一種應用流動注射技術和化學發光技術對異黃酮類化合物進行定性和/或定量分析的方法，該方法包括將所述異黃酮類化合物在鹼性條件下用K3Fe(CN)6進行選擇性氧化，並應用所得到產物的化學發光特性進行異黃酮類化合物的定性和/或定量分析。
另一方面，根據此方法對異黃酮類化合物進行定量分析，或用於測定異黃酮類化合物的生物活性。
本發明分析異黃酮類化合物的方法中，所述的異黃酮類化合物例如可以是下式(I)化合物 其中，R1和R2各自獨立地是氫、羥基或甲氧基。
優選的，當所述式(I)化合物中R1和R2均為氫時，該化合物是大豆苷元(Daidzein)；當所述式(I)化合物中R1為羥基，R2為氫時，該化合物是染料木素(Genistein)；當所述式(I)化合物中R1是氫，R2是甲氧基時，該化合物是黃豆黃素(Glycitein)。
在本發明所述分析方法中，所述的鹼性介質為氫氧化鈉水溶液，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.1-1.0mol/L，優選大約為0.5mol/L濃度。
為了獲得最大的化學發光值，上述方法中所述氧化劑K3Fe(CN)6的濃度通常為3.0-8.0×10-4mol/L，優選大約為5.0×10-4mol/L濃度。
在本發明分析異黃酮類化合物的方法中，其中所述異黃酮類化合物的K3Fe(CN)6氧化產物的化學發光可用測定化學發光的檢測系統進行，且所述異黃酮類化合物的K3Fe(CN)6氧化產物的最大發射波長在350-600nm之間。隨著所檢測的化合物不同，其最大發射波長會有所變化。
為了實施本發明的分析方法，必須有進行分析的專用設備，該設備包括具有進樣系統、可測定化學發光的檢測系統，以及對整個分析過程中的採樣、氧化反應和進樣，實驗數據的採集及進行自動化處理的軟體系統。
所述的進樣系統可採用儀器分析常規的進樣系統，優選流動注射進樣系統，特別是具有多通道的流動注射進樣系統。
在所述的進樣系統中完成本發明分析方法中的氧化反應過程，並在合適的時間將樣品，即進行氧化反應之後的氧化產物注入檢測系統；所述的檢測系統在接收檢測樣品後，能夠快速的將該樣品產生的光信號轉變成電信號，再進一步放大信號，並依據信號大小達到定量分析的目的。
在所述的進樣系統中，為了準確的測定異黃酮類化合物，必須準確的調整進樣速度，其選擇原則是調整進樣泵速和閥池距，使最大發光恰好能被光電倍增管完全檢測。
在該化學發光流動體系中，流速太慢導致最大發光在流通池之前；流速太快導致發光在流通池之後。以測定大豆異黃酮含量為例，根據鐵氰化鉀氧化大豆異黃酮產生化學發光的動力學曲線，從進樣到化學發光達到最大值時間約為4秒(s)，但是6秒時發光強度衰減至本底附近。因此進樣流速的選擇原則是，調整進樣泵速和閥池距，使樣品在進樣4秒，即達到最大發光時恰好能被光電倍增管完全檢測。
本發明方法的檢測樣品包括含有異黃酮類化合物的各種產品，例如由大豆等生產的大豆異黃酮，含有異黃酮類化合物的各種保健食品和藥品等；或是生物樣品，例如人的血液樣品等。在所述樣品中，可能會含有多種其他組分，例如蛋白質、無機鹽、糖類、皂苷等。本發明人對這些可能存在的物質對本發明分析方法的幹擾進行了實驗，實驗證明由於本發明方法的靈敏度和選擇性非常好，因此，對樣品的前處理要求不高，不需要進行複雜的純化處理。通常，在進行分析之前，將需要進行分析的樣品用一元伯醇類溶劑，例如乙醇進行萃取，製成醇溶液，供分析使用。
具體的，本發明分析異黃酮類化合物的方法包括(1)在一包括有進樣系統、可測定化學發光的檢測系統和可對整個分析過程和實驗數據的採集及處理進行自動化處理的軟體系統的分析儀器中，使所述的進樣系統與檢測系統直接連接；
(2)在所述的進樣系統中，使需要進行分析的、含有異黃酮類化合物的樣品在鹼性條件下與K3Fe(CN)6進行氧化反應；(3)用可測定化學發光的檢測系統測定上述步驟的氧化反應產物於350-600nm波長時的化學發光；(4)應用標準曲線計算分析樣品的異黃酮類化合物含量，或計算異黃酮類化合物的生物活性。
其中，在實施上述分析方法之前，首先將需要進行分析的樣品用醇類溶劑萃取，製成醇溶液。其中所述的醇類溶劑優選乙醇。
在上述步驟2的氧化反應中，所述的鹼性條件為氫氧化鈉溶液，特別是在氫氧化鈉水溶液的條件下，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.1-1.0mol/L，優選大約為0.5mol/L濃度。
在上述步驟2的氧化反應中，所述氧化劑K3Fe(CN)6的濃度通常為3.0-8.0×10-4mol/L，優選大約5.0×10-4mol/L。
本發明分析異黃酮類化合物的方法將物理學的流動注射和化學的化學發光相結合，利用化學物質在氧化還原反應過程中產生螢光或磷光的特性，將所產生的光信號轉變成電信號，再進一步放大信號，並依據信號大小達到定量分析的目的。本發明根據該原理提出一種測定異黃酮含量的化學發光新體系，並結合流動注射技術，建立起一種簡單快速測定異黃酮含量和/或異黃酮生物活性的新方法。該方法不僅有高靈敏度，而且有很好的選擇性。
應用儀器分析領域中已知的技術，可實現分析過程和計算過程的自動化，例如可應用現有分析儀器中常用的採樣和進樣系統、檢測系統以及實驗數據採集及處理系統使整個分析過程實現自動化。例如西安瑞邁電子有限公司生產的MPI-B型多參數化學發光分析測試系統，整個分析過程中的採樣、注樣、實驗數據採集及處理均由Windows XP系統下MPI-B型多參數化學發光分析測試系統軟體完成。
本發明的方法以異黃酮類化合物作為檢測對象，該方法可以滿足生物體中以及一切產品中有關異黃酮(生物活性)的定量分析。另外，根據該方法的工作原理，完全可以將該方法的應用擴展到黃酮類物質的分析測定，例如黃酮類物質的分析測定，或擴展到其它具有類似結構化合物，即具有可氧化成醌式結構的酚羥基的化合物的分析測定，例如與分子結構相近的激素類化合物的分析測定。
在進行上述分析之前，應將需要進行分析的樣品用醇類溶劑萃取，製成醇溶液其中所述的醇類溶劑是一元伯醇。由於本發明分析方法具有高靈敏度和高選擇性，因此分析樣品不需要進行複雜的提純步驟。
本發明的分析方法可以應用於食品或藥品中異黃酮類化合物含量的測定；用於含異黃酮類化合物的相關產品生產過程中以及產品在流通過程中的質量控制分析；用於以異黃酮為目標的高和低含量植物栽培與育種過程中的質量監控；以及對生物體中的異黃酮含量監控，以便根據異黃酮含量和/或異黃酮類化合物的生物活性的變化對人、動物和微生物以及植物等生物體的代謝起到監控作用，例如，由於已知人體中異黃酮含量水平與癌症、抗氧化性以及婦女更年期綜合症相關，因此測定異黃酮含量和/或異黃酮類化合物的生物活性可以了解與人體相關聯的健康程度。


圖1是鐵氰化鉀氧化大豆異黃酮產生化學發光的動力學曲線。其中，異黃酮的濃度是5.0×10-6g/mL，氫氧化鈉溶液的濃度是5mol/L，以及鐵氰化鉀溶液的濃度是5.0×10-4mol/L。
圖2是鐵氰化鉀濃度對化學發光的影響。結果表明，當鐵氰化鉀的濃度為5.0×10-4mol/L左右時，發光強度最大。
圖3是大豆異黃酮(a)、鐵氰化鉀(b)及大豆異黃酮+鐵氰化鉀(c)的發射光譜。
具體實施例方式
1、儀器設備的選擇1.1、儀器MPI-B型多參數化學發光分析測試系統，其中包括流動注射用多通道進樣系統，西安瑞邁電子有限公司製造。
整個分析過程中採樣、注樣、實驗數據採集及處理，均由WindowsXP系統下MPI-B型多參數化學發光分析測試系統軟體完成。
1.2、UV-1600紫外可見分光光度計北京瑞利分析儀器公司。
2.材料與試劑2.1、分析對象本實驗室提製備的大豆異黃酮，以0.5mol/LNaOH為溶劑，製成不同濃度的溶液；2.2、試劑鹼NaOH，製成濃度為0.5mol/L的溶液；鐵氰化鉀以0.5mol/L NaOH為溶劑，製成不同濃度的鐵氰化鉀溶液；大豆異黃酮標準溶液(0.5g/L)準確稱取大豆異黃酮(日本和光純藥工業株式會社)5.0mg溶於無水乙醇，用水定容於10mL棕色容量瓶中，備用。
(3)其餘試劑均為分析純，水為二次去離子水。
3.實驗方法3.1、MPI-B型儀器的主動泵的兩個通道分別將載流(H2O)和K3Fe(CN)6溶液，以45r/min的流速通過相應的通道進行三通混合，輸入分析系統。待基線平穩後，副動泵將大豆異黃酮溶液以35r/min的流速通過六通注射閥(注樣時間10秒)注入於載流中，與K3Fe(CN)6溶液混合，在流通池中產生化學發光，根據化學發光強弱採用外標法定量。
3.2、分別研究了下列各物質對異黃酮發光強度的影響氧化劑的種類、NaOH濃度、表面活性劑、流速以及幹擾實驗。
4.結果與討論4.1化學發光動力學曲線K3Fe(CN)6氧化大豆異黃酮產生化學發光(參見圖2)，從進樣到化學發光達到最大值時間約為4s，6s時發光強度衰減至本底附近。
4.2測定大豆異黃酮條件的選擇4.2.1氧化劑的選擇在酸性介質(1mol/L H2SO4)-KMnO4和鹼性介質(0.5mol/LNaOH)-K3Fe(CN)6或H2O2分別作為氧化劑進行直接氧化異黃酮產生化學發光的研究，研究表明，酸性介質-KMnO4和鹼性介質-K3Fe(CN)6做氧化劑時，產生化學發光。試驗結果表明，酸性介質中的KMnO4的氧化性強於鹼性K3Fe(CN)6，酸性KMnO4不僅可以氧化異黃酮，還可以氧化多羥基醇、糖、維生素C等物質，影響試驗結果。而K3Fe(CN)6在該體系中只可選擇性地氧化異黃酮。因此，本發明的方法優選使用鹼性介質-K3Fe(CN)6作為氧化劑測定大豆異黃酮。
4.2.2K3Fe(CN)6與NaOH濃度對化學發光的影響實驗證明，K3Fe(CN)6與NaOH的濃度對該體系的化學發光強度有很大的影響。
在固定了大豆異黃酮和鹼性介質的濃度下，詳細考察了不同濃度的K3Fe(CN)6(0～1.0×10-3mol/L)和NaOH(1.0～1.0×10-5mol/L)對該化學發光反應的影響。結果表明，當K3Fe(CN)6的濃度為5.0×10-4mol/L左右時，發光強度最大(如圖3)。K3Fe(CN)6隻有在鹼性介質中，才能氧化大豆異黃酮產生化學發光。試驗表明，NaOH的最佳濃度為大約0.5mol/L。
4.2.3進樣流速的影響在該化學發光流動體系中，流速太慢導致最大發光在流通池之前；流速太快導致發光在流通池之後。進樣流速的選擇原則是從進樣到化學發光達到最大值需要4s，調整進樣泵速和閥池距，使最大發光恰好能被光電倍增管完全檢測。
以主蠕動泵和副蠕動泵的每分鐘轉數為0～99，對它們的轉數進行了組合設定發現，最佳轉數分別為45r/min和35r/min。
4.2.4線性範圍、檢測限及靈敏度在上述最佳條件下，測定了峰面積與大豆異黃酮濃度的關係，結果表明，大豆異黃酮濃度在1.0×10-3～0.5g/L的範圍內具有良好的線性關係，其回歸方程為A＝193305C(mg/L)+229.97，r2＝0.9962對5.0×10-3g/L大豆異黃酮溶液連續測定，每次得3個峰值，重複7次，相對標準差為2.46％。根據IUPAC建議，該方法的檢出限為4.6×10-4g/L。
4.2.5幹擾實驗大豆異黃酮來源於大豆，在提取過程中共存其他組分(蛋白質、無機鹽、糖類、皂甙等)，它們可能對該化學發光體系測定大豆異黃酮有一定的影響。為此，研究了1000倍的Na+、Cl-、K+、Br-、CO32-、SO42-和NO3-；100倍的澱粉、糊精；10倍的葡萄糖、果糖、蔗糖；同倍的維生素C分別對5.0×10-6g/mL的大豆異黃酮進行幹擾測定實驗。結果表明，它們不幹擾測定。20種胺基酸的飽和溶液中只有半胱氨酸對測定信號有微弱幹擾(信噪比小於1)，不影響試驗結果；其他胺基酸無幹擾。因此，採用流動注射與化學發光法測定大豆異黃酮(生物活性)含量時，不需對樣品進行純化處理，即可準確定量。
4.2.6發光機理 雖然用鐵氰化鉀作為氧化劑直接氧化產生化學發光測定了蘆丁(參見李保新等，分析化學，2001，428)。但是該論文對於其發光機理沒有做深入研究。
為了更準確地揭示鐵氰化鉀對異黃酮氧化的發光機理，本發明作了如下實驗。用LS45螢光光度計分析了鐵氰化鉀、異黃酮標準液及鐵氰化鉀+大豆異黃酮混合液的發射光譜(圖3)，結果表明，大豆異黃酮有微弱的螢光，其最大發射波長為412nm(如圖a)。圖b是鐵氰化鉀反射波峰，並非螢光峰，與圖c中第一個峰相同。當加入鐵氰化鉀後，大豆異黃酮被鐵氰化鉀氧化，大豆異黃酮的螢光減弱，加入的鐵氰化鉀量越多，異黃酮的螢光就越弱，其氧化產物的最大發射波長為350～600nm(如圖b)。這說明該化學發光體系的發光體為異黃酮氧化的產物。氧化產物吸收了該反應所放出的化學能被激發，由激發態降到基態的這部分能量以光子的形式釋放。
4.2.7實際測定應用本發明的化學發光方法測定膠囊中大豆異黃酮，並以比色法作為對照。
從市場買來大豆異黃酮膠囊，隨機取1粒膠囊中的粉末，研細混勻，用無水乙醇溶解過夜。次日10000rpm離心10min，取出上清用無水乙醇定溶到100ml。分別用該化學發光方法和260nm比色法在線性範圍內測定，重複三次。本發明方法的測定結果分別為5.16mg/粒；比色法的測定結果為5.72mg/粒，說明與與已知方法相比，本發明的方法的準確性。
根據以上描述，可以確認的是於現有技術的方法相比，本發明應用異黃酮類化合物的化學發光特性以及流動注射技術進行異黃酮類化合物的定量分析方法具有更高的靈敏度和選擇性，因此而帶來的優點是分析樣品不需要進行複雜的提純步驟。因此，本發明的分析方法是非常實用的先進技術。
現在已經詳細描述了本發明的實施方案，對本領域技術人員來說很明顯可以做很多改進和變化而不會背離本發明的基本精神。所有這些變化和改進都認為是本發明的範圍之內，其特徵由上述說明書確定。
權利要求
1.異黃酮類化合物的分析方法，該方法包括在鹼性介質中，用K3Fe(CN)6氧化異黃酮類化合物，並應用所得到的氧化產物的化學發光，對異黃酮類化合物進行定性和/或定量分析。
2.按照權利要求1所述的分析方法，其中所述的異黃酮類化合物是下式(I)化合物 其中，R1和R2各自獨立地是氫、羥基或甲氧基。
3.按照權利要求2所述的分析方法，其中所述式(I)化合物中，R1和R2均為氫，或R1為羥基，以及R2為氫；或R1是氫，R2是甲氧基。
4.按照權利要求1所述的分析方法，其中該方法在分析儀器中進行，該分析儀器包括有進樣系統、可測定化學發光的檢測系統，以及對整個分析過程、實驗數據的採集及處理進行自動化處理的軟體系統。
5.按照權利要求4所述的分析方法，其中所述的進樣系統是流動注射進樣系統，以及其中所述的氧化反應在該進樣系統中進行。
6.按照權利要求5所述的分析方法，其中調整所述進樣系統的進樣流速，使異黃酮類化合物的氧化產物在達到最大發光時恰好能被檢測系統的光電倍增管完全檢測。
7.按照權利要求1所述的分析方法，其中所述異黃酮類化合物的K3Fe(CN)6氧化產物的最大發射波長為350-600nm。
8.按照權利要求1-7任意一項所述的分析方法，該方法包括(1)在一包括有進樣系統、可測定化學發光的檢測系統和可對整個分析過程和實驗數據的採集及處理進行自動化處理的軟體系統的分析儀器中，使所述的進樣系統與檢測系統直接連接；(2)在所述的進樣系統中，使需要進行分析的、含有異黃酮類化合物的樣品在鹼性條件下與K3Fe(CN)6進行氧化反應；(3)用可測定化學發光的檢測系統測定上述步驟的氧化反應產物於350-600nm波長時的化學發光；(4)應用標準曲線計算分析樣品中的異黃酮類化合物含量。
9.實施權利要求1-8任意一項所述分析方法的設備，該設備包括有進樣系統、可測定化學發光的檢測系統，以及對整個分析過程中的採樣、氧化反應、進樣、實驗數據的採集及處理進行自動化處理的軟體系統。
10.按照權利要求1-8任意一項所述的分析方法在異黃酮類化合物測定中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種應用流動注射化學發光技術對異黃酮類化合物進行定量分析的方法，該方法包括使所述的異黃酮類化合物在鹼性條件下用K
文檔編號G01N21/76GK1869663SQ200610078478
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月30日 優先權日2006年5月30日
發明者郝再彬, 楊丹, 王哲, 白志明, 一井真比古 申請人:黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責任公司